Summary
В настоящем исследовании представлен модифицированный протокол выделения синовиальных макрофагов и фибробластов из ткани воспалительного артрита мышей.
Abstract
Ревматоидный артрит – это аутоиммунное заболевание, которое приводит к хроническому воспалению суставов. Синовиальные макрофаги и синовиальные фибробласты играют центральную роль в патогенезе ревматоидного артрита. Важно понимать функции обеих клеточных популяций, чтобы выявить механизмы, лежащие в основе патологического прогрессирования и ремиссии при воспалительном артрите. В целом, условия эксперимента in vitro должны максимально имитировать среду in vivo . Первичные клетки тканевого происхождения были использованы в экспериментах, характеризующих синовиальные фибробласты при артрите. Напротив, в экспериментах, изучающих биологические функции макрофагов при воспалительном артрите, использовались клеточные линии, макрофаги костного мозга и моноцитарные макрофаги крови. Однако неясно, действительно ли такие макрофаги отражают функции тканерезидентных макрофагов. Для получения резидентных макрофагов предыдущие протоколы были модифицированы для выделения и расширения как первичных макрофагов, так и фибробластов из синовиальной ткани в мышиной модели с воспалительным артритом. Эти первичные синовиальные клетки могут быть полезны для анализа воспалительного артрита in vitro .
Introduction
Ревматоидный артрит (РА) – аутоиммунное заболевание, характеризующееся гиперплазией синовиальной оболочки, приводящей к разрушению сустава 1,2. Тканевые резидентные макрофаги и фибробласты присутствуют в здоровой синовиальной оболочке для поддержания гомеостаза суставов. У пациентов с РА синовиальные фибробласты (СФ) пролиферируют, а иммунные клетки, включая моноциты, проникают в синовиальную оболочку и суставную жидкость, процессы, связанные с воспалением 1,3,4. Синовиальные макрофаги (СМ), к которым относятся резидентные макрофаги и моноцитарные макрофаги периферической крови, а также СФ аберрантно активированы и играют важную роль в патогенезе РА. Недавние исследования показали, что межклеточное взаимодействие между СМ и СФ способствует как обострению, так и ремиссии РА 5,6.
Для понимания патогенеза РА было использовано несколько моделей воспалительного артрита грызунов, включая артрит с переносом сыворотки K/BxN, коллаген-индуцированный артрит и артрит, индуцированный антителами к коллагену. Клеточные анализы, как правило, необходимы для выяснения молекулярных функций при артрите. Поэтому первичные клетки животных моделей артрита были выделены. Метод выделения СФ из ткани мышиного артрита хорошо известен, и эти клетки внесли свой вклад в выяснение молекулярных механизмов патогенеза артрита 7,8. С другой стороны, макрофаги, полученные из костного мозга, макрофаги, полученные из моноцитов крови, и клеточные линии макрофагов часто использовались в качестве макрофагальных ресурсов для исследований артрита 9,10. Поскольку макрофаги могут приобретать функции, связанные с их микроокружением, общие источники макрофагов могут отсутствовать реакции, специфичные для тканей артрита. Кроме того, трудно получить достаточное количество синовиальных клеток путем сортировки, так как синовиальная оболочка мышей представляет собой очень маленькую ткань даже в моделях артрита. Отсутствие использования синовиальных макрофагов для исследований in vitro было ограничением в исследованиях артрита. Создание протокола для выделения и расширения синовиальных макрофагов было бы преимуществом для выяснения патологических механизмов при РА.
В предыдущем методе выделения СФ СМ отбрасывались7. Кроме того, сообщалось о способе выделения и распространения резидентных макрофагов из некоторых органов11. Поэтому существующие протоколы модифицировались в комплексе. Модификация направлена на получение первичной культуры как СМ, так и СФ высокой чистоты. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы выделить и расширить как SM, так и SF из ткани мышиного артрита.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты с участием животных были одобрены Комитетом по экспериментам на животных Университета Эхимэ и проводились в соответствии с Руководством Университета Эхимэ по проведению экспериментов на животных (37A1-1*16).
1. Подготовка инструментов, реагентов и питательных сред
- Приготовьте питательную среду следующим образом: дополните модифицированную орлиную среду (DMEM) Dulbecco 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% раствором антибиотика-антимикотика (анти-анти).
- Среду для переваривания готовят следующим образом: добавляют в питательную среду 1 мг/мл коллагеназы IV типа. Регулируйте концентрацию коллагеназы непосредственно перед использованием.
- Разбавить коллаген типа I-C до концентрации 0,15 мг/мл раствором HCl 1 мМ. Залейте чашки для культур (диаметром 40 или 60 мм) разбавленным раствором коллагена. Через 6-12 ч при комнатной температуре вынуть раствор коллагена из посуды и высушить при комнатной температуре. Блюда, покрытые коллагеновой оболочкой, можно хранить при комнатной температуре не менее 1 недели. Перед использованием вымойте предварительно покрытую посуду фосфатно-солевым буфером (PBS) или средством.
- Подготовьте стерильные хирургические инструменты, такие как ножницы, пинцет с зазубренными кончиками и пинцет с тонким концом. Перед употреблением замочить в 70% этаноле.
2. Подготовка синовитной ткани у мышей ( рис. 1А)
- Подготовьте мышку с воспалительным артритом задних лап.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола использовали самок мышей C57BL/6 (18-20 г) через 7-8 недель после рождения с артритом, индуцированным коллагеновыми антителами (CAIA) или артритом с переносом сыворотки K/BxN (STA)8. Выделение СМ из ненабухшей (т.е. здоровой) ткани может быть затруднено, так как количество клеток недостаточно. - Обезболивайте мышей внутрибрюшинной инъекцией 80 мг/кг кетамина и 16 мг/кг ксилазина. Очистите мышей 70% этанолом.
- Разрежьте ножницами грудную область, чтобы обнажить сердце. Разрежьте ножницами правое предсердие сердца, а затем воткните иглу-бабочку 23 G в левый желудочек через верхушку сердца, после чего последует рефлюкс 15-20 мл стерильного PBS с помощью шприца для ручного забора периферической крови (примерно 1 мл/2 с).
- Декортикируйте задние лапы, разрезая кожу ножницами и вытягивая кожу пинцетом с зазубренными кончиками.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага рекомендуется использовать пинцет для работы с образцами. Не прикасайтесь пальцами к декортикированной ткани, чтобы избежать прикрепления мышиной шерсти. - Вывихнуть плюснефаланговые суставы путем вытягивания с последующим разрезанием связок суставов с помощью ножниц для удаления пальцев ног.
- Обрежьте сухожилия мышц голени возле голеностопа с помощью ножниц. Возьмитесь за сухожилие пинцетом и отшлифуйте мышцы проксимально голени, чтобы обнажить большеберцовую кость. Удалите малоберцовую кость.
- Вывихнуть коленный сустав путем вытягивания с последующим перерезанием связок суставов с помощью ножниц отсоединить большеберцовую кость с опухшей задней лапой. Образцы хранят в ледяной питательной среде (0,3 мл/см2) до обработки до этапа 3.1.
3. Пищеварение синовитной ткани ( рис. 1Б)
- Аспирируйте питательную среду, избегая образца, а затем добавьте свежую питательную среду (0,3 мл/см2). Повторите процесс стирки три-четыре раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, работа с образцами должна выполняться асептически на чистом столе или в безопасном шкафу. - Вывихнуть все стыки образцов путем вытягивания тонким пинцетом в питательной среде под стереомикроскопом (при 10-20-кратном увеличении). На этом этапе удобен пинцет с тонким концом. Удалите большеберцовую кость и как можно больше сосудов, сухожилий и связок. Будьте осторожны, чтобы не сломать кости при вывихе.
- Подготовьте две пробирки по 15 мл на образец. Перенесите вывихнутые кости с мягкими тканями в первую пробирку объемом 15 мл с помощью пинцета. Добавьте в пробирку 4 мл питательной среды на образец, полученную из обеих задних лап.
- Для сбора остаточных клеток и фрагментов тканей переносят среду, в которой содержался образец, во вторую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте среду при 500 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу с 1 мл питательной среды и перенесите раствор из клеток и фрагментов тканей в первую пробирку объемом 15 мл, содержащую почти всю ткань (всего 5 мл среды пищеварения/задних лап).
- Вываривают образец в течение 60-120 мин при 37 °С с встряхиванием в гибридизационной печи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо определить оптимальное время для разложения образцов. Время зависит от степени отека лодыжек и коллагеназ. В большинстве случаев достаточно 60-120 минут. Через 60 мин инкубации отбирают часть переваренного образца пипетированием и наблюдают под микроскопом. Если пищеварение недостаточное, инкубацию следует продолжать, а пищеварение проверять каждые 30 мин. - Хорошо пропитывайте раствор. Процедите клеточный раствор через сетчатый фильтр (размер пор 40 мкм) в пробирку объемом 50 мл.
- Добавьте 10 мл питательной среды в пробирку объемом 50 мл через клеточный фильтр. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
- После удаления надосадочной жидкости ресуспендировать с 10 мл питательной среды. Повторите центрифугирование. После удаления надосадочной жидкости ресуспендировать с 2 мл питательной среды.
Рисунок 1: Процедура забора проб тканей мышиного артрита и расщепления коллагеназы . (A) (i) Задняя лапа мыши с воспалительным артритом. (ii) Удаление кожи на задней лапе. iii) Вывих плюснефаланговых суставов и удаление пальцев стопы. (iv) Разрезание сухожилий голеностопного сустава. (v) Удаление мышц голеней. (vi) Вывих коленного сустава. (Б) Левый; Иссеченные ножки в питательной среде. Правильно; вывих цевки и плюсны в питательной среде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
4. Выделение синовиальных фибробластов ( рис. 2А)
- Высейте все клеточные суспензии, полученные с обеих лодыжек, на чашку, покрытую коллагеном.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании лодыжек со слабым или умеренным отеком для получения клеток применяется чашка диаметром 40 мм. Размер чашки, покрытой коллагеновой оболочкой, может быть изменен на 60 мм в диаметре, если обе лодыжки сильно опухли. - Добавьте питательную среду (примерно 222 мкл/см2). Инкубируют в течение 1 ч при 37 °C во влажной атмосфере с 5% CO2.
- Соберите неадгезивные клетки с помощью пипетки (используйте на шаге 5.1). Вымойте чашку, покрытую коллагеном, питательной средой и соберите среду. Культивирование адгезивных клеток в свежей среде (рис. 2B,i). Большинство клеток, которые быстро прикрепляются к покрытой коллагеном чашке, имеют фибробластоидную (веретенообразную) морфологию.
- Прохождение субсливающихся клеток путем обработки 0,05% трипсином в сбалансированном растворе соли Хэнкса (HBSS). В этом методе контаминация других клеток ограничена, даже если она находится в начальном расширении. Если требуется более очищенные фибробластоподобные клетки, выполните повторное пассирование, чтобы обеспечить повышение чистоты; однако также наблюдается расширение цитоплазмы клеток при адгезии (рис. 2B, ii). Поскольку чрезмерные пассажи влияют на потерю наивных характеристик в клетках, используйте клетки с менее чем 5 пассажами.
5. Выделение синовиальных макрофагов ( рис. 2А)
- Высейте все неадгезивные клетки, начиная с шага 4.4, на чашки (диаметр 40 или 60 мм), которые не были покрыты коллагеном.
ПРИМЕЧАНИЕ: К неадгезивным клеткам относятся макрофаги, другие лимфоциты и остаточные фибробласты из ткани синовита. - Культивирование объемных клеток в течение 1 суток при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5%CO2.
- Для удаления неадгезивных лимфоцитов аспирируют культивируемую среду, а затем добавляют свежую питательную среду. Повторите этот процесс два или три раза (рисунок 2B, iii).
- Культивирование адгезивных объемных клеток в течение 1-2 недель в питательной среде, при этом среда меняется каждые 2 дня при сохранении слияния (рис. 2B, iv).
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество СМ медленно увеличивается в условиях совместного культивирования с НФ. Таким образом, период совместного культивирования должен быть скорректирован по мере необходимости. - Вымойте PBS или HBSS два раза. Обработать 0,05% трипсином в HBSS (примерно 55 мкл/см2) в течение 3 мин при 37 °C во влажной атмосфере с 5% CO2. Фибробласты легко отделяются от культуральной чашки при обработке трипсином, а макрофаги проявляют устойчивость к обработке трипсином. Используют это свойство для отбора синовиальных макрофагов.
- Осторожно добавьте питательную среду (примерно 222 мкл/см2) к 0,05% трипсина в HBSS. После этого шага не выливайте средство непосредственно на клетки.
- Чтобы удалить отделившиеся клетки, аспирируйте питательную среду, а затем осторожно добавляйте свежую питательную среду. Повторите этот процесс два-три раза. Оставшиеся клетки на чашке выдерживают в свежей питательной среде до использования (рис. 2B, v).
ПРИМЕЧАНИЕ: После лечения трипсином адгезивные клетки проявляют макрофагоподобные морфологические характеристики.
Рисунок 2: Отделение фракций, богатых макрофагами и фибробластами, от ткани воспалительного артрита. (А) Схема процедуры отделения клеток, богатых макрофагами и фибробластами, от ткани артрита. (B) Репрезентативные фазово-контрастные изображения этапов процедуры, (i) - (v) на рисунке 2A. Масштабная линейка представляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Самки мышей C57BL/6 в возрасте 7-8 недель перенесли артрит, индуцированный коллагеновыми антителами. Макрофагоподобные клетки и фибробластоподобные клетки были независимо выделены из ткани воспалительного артрита в соответствии с процедурой, описанной выше (рис. 2А, Б). Макрофагоподобные клетки использовали сразу после этапа 5.7. Фибробластоподобные клетки первоначально культивировались до субслияния после шага 4.4, а затем переходили в новую культуральную чашку с последующим использованием. Для оценки успешности выделения СМ и СФ были проведены следующие эксперименты.
Для оценки чистоты выделенных клеток методом ОТ-кПЦР анализировали экспрессию мРНК различных клеточных маркеров. В качестве панмакрофагальных маркеров использовали Cd68, Emr1, Itgam и Csf1r, а в качестве SF-маркеров — Cdh11, Col6a1, Csf1 и Vcam1. Rplp0 использовали в качестве референсного гена 6,8. Все гены-маркеры нормализовались экспрессией Rplp0. Оба маркера клеточного типа были проанализированы в макрофагоподобных клетках, а фибробластоподобные клетки были получены из ткани артрита. SF-маркеры экспрессировались в фибробластоподобных клетках, а панмакрофагальные маркеры экспрессировались в макрофагоподобных клетках, что позволяет предположить, что из ткани синовита были выделены фракции, богатые макрофагами, и фракции, богатые фибробластами соответственно (рис. 3A, B).
Для установления чистоты макрофагов методом проточной цитометрии анализировали поверхностные белковые маркеры макрофагов и других типов клеток. F4/80 и CD11b использовались для макрофагальных маркеров, Ly6G — для маркера нейтрофилов и CD3 — для маркера Т-клеток6. Стратегия стробирования использовалась, как показано ранеена рисунке 6. Более 90% клеток экспрессировали CD45, CD11b и F4/80, в то время как экспрессия Ly6G и CD3 была ниже 1% (рис. 4).
Рисунок 3: Экспрессия мРНК специфических маркеров клеточного типа. (A) экспрессия мРНК панмакрофагальных маркеров (Cd68, Emr1, Itgam, Csf1r) в синовиальных макрофагах (СМ) и синовиальных фибробластах (СФ) методом ОТ-кПЦР (n = 4). (B) Уровни экспрессии SF-маркеров (Cdh11, Col6a1, Csf1, Vcam1) в SM и SF (n = 4). Данные представлены в виде средних значений ± SD. ** обозначает p < 0,01 по непарному t-критерию. Данные были получены в результате четырех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Экспрессия белка на клеточной поверхности специфической клеточной поверхности. Репрезентативные гистограммы, полученные при проточном цитометрическом анализе маркеров поверхности лейкоцитов (CD45, CD11b, F4/80, Ly6g, CD3) синовиальных макрофагов (СМ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод, разработанный здесь, является улучшением предыдущих методов выделения как СФ из мышиного артрита, так и резидентных макрофагов из ряда органов 7,11. Модифицированный метод позволяет выделять как макрофаги, так и фибробласты из воспалительной синовиальной оболочки с высокой чистотой, он прост и воспроизводим. Поскольку метод не требует сложных инструментов, таких как клеточный сортировщик, провести его может любой желающий. Кроме того, данный метод позволяет избежать проблем, связанных с другими методами, такими как флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) и магнитно-активированная сортировка клеток (MACS), которые могут вызывать повреждение и стресс в клетках из-за обработки антителами и физических эффектов, связанных с сортировкой12,13. Полученные клетки могут быть использованы для исследования с относительно небольшим количеством ненужных внешних раздражителей. Ранее анализ in vitro тканевых резидентных макрофагов из синовиальной оболочки был затруднен, так как количество выделенных клеток невелико, даже в условиях артрита у мышей. Этот метод позволяет распространять СМ при совместном культивировании с СФ, так же как и предыдущий метод для макрофагов из печени, селезенки, легких и головного мозга11. Кроме того, результаты кПЦР свидетельствуют о том, что только один пассаж СФ обеспечивает достаточно высокий уровень чистоты (рис. 3В), хотя предыдущий метод выделения СФ требовал не менее трех пассажей7. Отсутствие проверки чистоты СФ методом проточного цитометрического анализа является ограничением данного исследования. Тем не менее, метод также дает преимущество в том, что SF можно использовать с меньшим количеством проходов.
Критически важным шагом для изоляции синовиальных клеток высокой чистоты является предотвращение загрязнения бактериями и/или клетками костного мозга. С продезинфицированными мышами следует обращаться стерильными инструментами. В частности, изолированные образцы голеностопного сустава должны содержать как можно меньше волос. Если в образцах присутствует много волос, следует выполнить усиленное мытье (шаг 3.1). Кроме того, кости, полученные при артрите, часто бывают хрупкими14; Вывих плюснефаланговых суставов требует большой осторожности, чтобы избежать перелома, а загрязнение клеток костного мозга переломом может нарушить качество синовиальных клеток. Если кость сломана, сломанная кость должна быть немедленно удалена.
Недавний анализ последовательности одноклеточной РНК показал, что всиновиальной оболочке 5,15 присутствует несколько субпопуляций SM и SF. В этом методе могут культивироваться объемные клетки, в том числе гетерогенные субпопуляции. Как правило, гетерогенность клеток теряется в условиях in vitro 16. Действительно, предыдущий анализ последовательности РНК показал, что клетки, полученные с помощью этого метода, обладают большим количеством характеристик, включая некоторые субпопуляции с точки зрения паттерна экспрессии генов, чем конкретная характеристикасубпопуляции. Это говорит о том, что клетки, полученные этим методом, могут иметь некоторые характеристики микроокружения синовиальной ткани. Таким образом, этот метод может быть полезен в качестве нового подхода к изучению клеточных популяций при воспалительном артрите.
Поскольку развитие отека после экспериментальной индукции артрита обычно контролируется в голеностопных суставах 8,10,15, здесь был предложен метод выделения синовиальных клеток только из тканей голеностопного сустава. Клетки, полученные с помощью разработанных здесь методов, могут быть использованы с другими суставами, такими как коленный сустав и/или другие модели артрита. Однако чистота, количество клеток и пролиферативная способность могут быть разными. Этот метод также может быть использован для выделения макрофагов из синовиальной оболочки человека; Тем не менее, верификация обязательна.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят сотрудников Отдела поддержки медицинских исследований Центра поддержки перспективных исследований (ADRES) и членов Отдела интегративной патофизиологии Центра протео-науки (PROS) Университета Эхимэ за их техническую помощь и полезную поддержку. Это исследование было частично поддержано грантами KAKENHI Японского общества содействия науке (JSPS) JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (для NS) и JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (для YI); гранты от Фонда медицинских исследований трудноизлечимых заболеваний Осаки, Фонда Накатоми, Гранта «Восходящие звезды» Японского общества исследований костей и минералов (JSBMR), Фонда «Сумитомо», Фонда медицинских исследований SENSHIN, Мемориального фонда Мочиды (для NS); а также грант Takeda Science Foundation на медицинские исследования, грант проекта UCB Japan (UCBJ) и грант JSBMR Frontier Scientist 2019 (YI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
References
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B.
- McInnes, I. B., Schett, G.
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages: friend or foe. RMD Open. 3 (2), (2017).
- Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers. Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).
- Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).
- Saeki, N., Imai, Y. Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188 (2020).
- Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts. Protocol Exchange. , (2009).
- Saeki, N., et al. Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner. The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).
- Midwood, K., et al. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).
- You, D. G., et al. Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis. Science Advances. 7 (23), 0083 (2021).
- Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs. BMC Immunology. 20 (1), 34 (2019).
- Andrä, I., et al. An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation. Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons. Frontiers in Medicine. 7, 601618 (2020).
- Croft, A. P., et al. Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis. Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).
- Wei, K., et al. Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology. Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).
