Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التصوير المناعي لمصائد العدلات خارج الخلية في الأنسجة البشرية والفأر

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65272
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

ERRATUM NOTICE

Summary

ترتبط مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) بأمراض مختلفة ، وغالبا ما يستخدم التألق المناعي لتصورها. ومع ذلك ، هناك العديد من بروتوكولات التلوين ، وفي كثير من الحالات ، يتم فحص نوع واحد فقط من الأنسجة. هنا ، نضع بروتوكولا قابلا للتطبيق بشكل عام لتلطيخ الشبكات في الفئران والأنسجة البشرية.

Abstract

يتم إطلاق مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) بواسطة العدلات كاستجابة للعدوى البكتيرية أو تلف الأنسجة الرضحية ولكنها تلعب أيضا دورا في أمراض المناعة الذاتية والالتهابات المعقمة. إنها هياكل تشبه الويب تتكون من خيوط الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل ، والهستونات ، والبروتينات المضادة للميكروبات. بمجرد إطلاقها ، يمكن للشبكات أن تحبس وتقتل مسببات الأمراض خارج الخلية في الدم والأنسجة. علاوة على ذلك ، تشارك الشبكات في تنظيم الاستتباب عن طريق تحفيز التصاق الصفائح الدموية وتجلطها. ومع ذلك ، فقد ارتبط الإنتاج غير المنظم للشبكات أيضا بأمراض مختلفة ، بما في ذلك الإنتان أو اضطرابات المناعة الذاتية ، مما يجعلها هدفا واعدا للتدخل العلاجي. بصرف النظر عن المجهر الإلكتروني ، يعد تصور الشبكات باستخدام التصوير المناعي حاليا أحد الطرق الوحيدة المعروفة لإظهار تفاعلات NET في الأنسجة. لذلك ، تم استخدام طرق تلطيخ مختلفة لتصور NETs. في الأدبيات ، تم وصف بروتوكولات تلطيخ مختلفة ، وحددنا أربعة مكونات رئيسية تظهر تباينا كبيرا بين البروتوكولات: (1) أنواع الأجسام المضادة المستخدمة ، (2) استخدام عوامل تقليل التألق الذاتي ، (3) طرق استرجاع المستضد ، و (4) النفاذية. لذلك ، تم تكييف بروتوكولات التلوين المناعي في المختبر وتحسينها بشكل منهجي في هذا العمل لجعلها قابلة للتطبيق على الأنواع المختلفة (الفأر ، الإنسان) والأنسجة (الجلد والأمعاء والرئة والكبد والقلب والقرص الفقري). بعد التثبيت وتضمين البارافين ، تم تركيب أقسام بسمك 3 ميكرومتر على شرائح. تم تلطيخ هذه العينات بالأجسام المضادة الأولية ل myeloperoxidase (MPO) ، وهيستون سيترولين H3 (H3cit) ، وإيلاستاز العدلات (NE) وفقا لبروتوكول تلطيخ معدل. تم تلطيخ الشرائح بأجسام مضادة ثانوية وفحصها باستخدام مجهر مضان واسع المجال. تم تحليل النتائج وفقا لورقة تقييم ، وتم تسجيل الاختلافات شبه الكمية.

هنا ، نقدم بروتوكول تلطيخ صافي محسن مناسب للأنسجة المختلفة. استخدمنا جسما مضادا أوليا جديدا لتلطيخ H3cit وقللنا من تلطيخ غير محدد بعامل تقليل التألق الذاتي. علاوة على ذلك ، أثبتنا أن التلوين الصافي يتطلب درجة حرارة عالية ثابتة ومعالجة دقيقة للعينات.

Introduction

تم تصور مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) لأول مرة بواسطة Brinkmann et al. كمسار للموت الخلوي يختلف عن موت الخلايا المبرمج والنخر في عام 20041. في هذا المسار ، تطلق العدلات الكروماتين غير المكثف في الفضاء خارج الخلية لتشكيل هياكل كبيرة تشبه الويب مغطاة بالبروتينات المضادة للميكروبات التي كانت مخزنة سابقا في الحبيبات أو العصارة الخلوية. تشمل هذه البروتينات المضادة للميكروبات إيلاستاز العدلات (NE) ، والميلوبيروكسيديز (MPO) ، وهيستون سيترولين H3 (H3cit) ، والتي تستخدم عادة للكشف المناعي غير المباشر عن NETs2. هذه الطريقة لا تحدد فقط الوجود الكمي لهذه البروتينات. في الواقع ، لديها ميزة الكشف على وجه التحديد عن الهياكل الشبيهة بالشبكة. في الشبكات ، تتركز البروتينات المذكورة مع الحمض النووي خارج الخلية ، والذي يمكن اكتشافه من خلال تداخل الإشارات الفلورية لكل بروتين ملطخ والحمض النووي خارج الخلية. على عكس الإشارات المتداخلة بسبب الحمض النووي خارج الخلية والتوطين المشترك للبروتين في الشبكات ، لا تظهر العدلات السليمة أي توطين مشترك. هنا ، عادة ما يتم تخزين مكونات NET بشكل منفصل في الحبيبات والنوى والسيتوسول3.

منذ اكتشافها لأول مرة ، ثبت أن الشبكات تلعب دورا مركزيا في العديد من الأمراض ، لا سيما تلك التي تنطوي على التهاب. تظهر الشبكات وظائف مضادة للميكروبات أثناء العدوى من خلال محاصرة وقتل مسببات الأمراض خارج الخلية في الدم والأنسجة 4,5. ومع ذلك ، فقد تم ربط الشبكات أيضا بأمراض المناعة الذاتية والاستجابات المفرطة الالتهاب ، مثل الذئبة الحمامية الجهازية والتهاب المفاصل الروماتيزمي والربو التحسسي6،7،8. تعزز الشبكات انسداد الأوعية والالتهابات في تصلب الشرايين ، والتصاق الصفائح الدموية ، ومن المتوقع أن تلعب دورا في السرطانالنقيلي 9،10،11. ومع ذلك ، يعتقد أن لها خصائص مضادة للالتهابات عن طريق تقليل مستويات السيتوكين المسببة للالتهابات12. بينما تكتسب الشبكات اهتماما أكبر بمجال أوسع من البحث ، فإن طريقة الكشف عن NET القوية أمر أساسي للبحث في المستقبل.

على الرغم من أن تصور الشبكات في الأنسجة المختلفة باستخدام التصوير المناعي معقد ويتطلب التخصيص ، بصرف النظر عن المجهر الإلكتروني ، إلا أنه يعد حاليا أحد أشهر الطرق لتصور التفاعلات بين الشبكات والخلايا ويستخدم في الغالب في الأنسجة المدمجة بالبارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE)13,14. ومع ذلك ، فإن مقارنة التصوير NET أمر صعب ، حيث تستخدم المختبرات المختلفة بروتوكولاتها المخصصة. تختلف هذه البروتوكولات في استخدامها للأجسام المضادة أو استرجاع المستضد أو طريقة النفاذية وغالبا ما يتم تحسينها لنوع معين من الأنسجة3،13،15،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26، 27.

بعد أن نشر Brinkmann et al. أول دراسة منهجية باستخدام التصور المناعي الفلوري للشبكات في أنسجة FFPE ، أردنا تحسين هذا البروتوكول لمجموعة متنوعة من الأنسجة والأنواع15. بالإضافة إلى ذلك ، لإنشاء بروتوكول تألق مناعي قابل للتطبيق على نطاق واسع ، اختبرنا بروتوكولات معدلة مختلفة من الدراسات التي استخدمت طرق التألق المناعي في أنسجة FFPE للكشف عن الشبكات3،13،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25 ، 26,27. علاوة على ذلك ، جربنا جسما مضادا جديدا ل H3cit لتلطيخ أكثر تحديداخارج الخلية 28. نحن نفترض أنه من خلال تكييف بروتوكولات التلوين الحالية بشكل منهجي مع الأنواع والأنسجة المختلفة ، يمكن تحسين التصوير في المختبر ، مما يؤدي إلى تمثيل أفضل للتفاعل بين العدلات والشبكات محليا ومنهجيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

شملت هذه الدراسة أنسجة الفئران المشتقة من التجارب المعتمدة من قبل إدارة ولاية هامبورغ للبحوث الحيوانية ، Behörde für Justiz und Verbraucherschutz ، هامبورغ ، ألمانيا (73/17 ، 100/17 ، 94/16 ، 109/2018 ، 63/16). كانت الأنسجة المستخدمة هي رئة الفأر والقولون من نموذج الصرف الصحي والجلد المحترق. استخدمنا الفئران الذكور والإناث البالغة من العمر 8 أسابيع. تم اتباع التوجيه الأوروبي 2010/63 / EU بشأن حماية الحيوانات المستخدمة للأغراض العلمية لجميع التجارب. تضمنت العينات البشرية مجهولة المصدر أنسجة من التهاب الأمعاء والقولون الوليدي ، والجلد المحروق ، ورتق القناة الصفراوية ، والتهاب الفقار ، وعضلة القلب. وفقا للجنة أخلاقيات البحوث الطبية في هامبورغ ، لم تكن العينات بحاجة إلى موافقة مستنيرة ، ولكن تمت الموافقة على الدراسة من قبل اللجنة (WF-026/21).

1. تثبيت العينة

  1. استخدم البروتوكول التالي المشتق من أبو عابد وبرينكمان لتثبيت العينات ، والجفاف ، وتضمين البارافين ، والتقسيم ، والتركيب3،15.
    1. تحضير محلول الفورمالديهايد 4٪ عن طريق إذابة 40 جم من بارافورمالدهايد (PFA) في 800 مل من محلول ملحي مخزن Tris ، درجة الحموضة 7.4 (TBS).
    2. يقلب المزيج على حرارة 60 درجة مئوية تحت غطاء دخان حتى يذوب PFA. أحضر المحلول إلى درجة حرارة الغرفة (RT) ، واضبط مستوى الصوت باستخدام TBS إلى 1000 مل.
    3. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. يخزن في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أسابيع أو في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
  2. لتثبيت العينة، ضع الأنسجة الطازجة في محلول TBS، وقم بتشليلها إلى قطع أصغر من 20 مم × 30 مم × 3 مم. اغمر أقسام الأنسجة في محلول بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 12-24 ساعة.
    ملاحظة: استخدم البروتوكول الأصلي محلول PFA بنسبة 2٪ ووقت تثبيت من 8-20 ساعة. مع هذه الطريقة ، لم يتم تثبيت بعض أقسام الأنسجة بالكامل بعد 20 ساعة ، لذلك تم زيادة تركيز PFA إلى 4٪ PFA.
  3. نقل العينات إلى أشرطة معالجة الأنسجة الملصقة. استخدم أقلام تحديد أو أقلام رصاص مقاومة للمذيبات لوضع العلامات.
  4. ابدأ تجفيف العينة عن طريق غمر الكاسيت في 70٪ إيثانول لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، انغمس في 80٪ إيثانول ، و 90٪ إيثانول ، و 96٪ إيثانول ، ومرتين في 100٪ إيثانول ، مع كل خطوة تدوم 1 ساعة.
  5. اغمر مرتين في 100٪ زيلين (ثنائي ميثيل بنزين) ثم مرتين في 60 درجة مئوية من البارافين لمدة 1 ساعة في كل مرة.
  6. استخدم قوالب التضمين للتركيب ، واترك البارافين يتجمد قبل إزالة القالب.
  7. استخدم ميكروتوم لقطع أقسام الأنسجة السميكة 3 ميكرومتر.
  8. استخدم الملقط لوضع الأجزاء المقطوعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، واتركها تطفو على السطح لتمديد جروح الأنسجة.
  9. ضع الأقسام على شرائح زجاجية لاصقة (جدول المواد) ، واتركها تجف طوال الليل في غرفة حرارة 40 درجة مئوية.

2. عينة الإماهة

  1. لإزالة البارافين ، قم بتكديس الشرائح في رف منزلق ، واغمرها مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما في الليمونين المتوسط البديل للزيلين (جدول المواد) ومرة واحدة لمدة 5 دقائق في خليط 1: 1 ليمونين / إيثانول.
    تنبيه: الليمونين قابل للاشتعال عند 50 درجة مئوية ويمكن أن يسبب الحساسية. استخدميه تحت غطاء الدخان مع حماية العين والقفازات. الابتعاد عن إطلاق النار.
  2. أعد ترطيب العينات في سلسلة إيثانول تنازلية عن طريق غمر الرف المنزلق مرتين في إيثانول 100٪ ومرة واحدة في 96٪ إيثانول و 90٪ إيثانول و 80٪ إيثانول و 70٪ إيثانول لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  3. اغمر الرف المنزلق لمدة 5 دقائق في ماء منزوع الأيونات (ماء DI) لتنظيف أي إيثانول متبقي.

3. حجب التألق الذاتي واسترجاع المستضد

  1. قم بإعداد محلول استرجاع الهدف pH 6 citrate (TRS) (جدول المواد) وفقا لورقة البيانات. يتركز هذا TRS 10 مرات. لذلك ، تمييع 1:10 بالماء DI. سخني في برطمان بلاستيكي إلى 96 درجة مئوية.
    ملاحظة: يكسر TRS جسور الميثيلين التي تشكلت أثناء تثبيت العينة لكشف حوامل المستضد. وهذا يسمح للأجسام المضادة الأولية بربط مولد الضد المستهدف. يخزن TRS المركز في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة 8 أشهر. قم دائما بإعداد TRS الطازجة.
  2. أخرج الشرائح من رف الشرائح ، وضعها في غرفة مبللة. ماصة قطرة إلى قطرتين من عامل تقليل التألق الذاتي (جدول المواد) على كل عينة. احتضان لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يمنع عامل الحد من التألق الذاتي التألق الذاتي للأنسجة المتأصلة الناجم عن الفلوروفورات الداخلية والمثبتات. قم بتخزين عامل تقليل التألق الذاتي في RT لمدة تصل إلى 1 سنة.
    ملاحظة: العمل فقط مع أقسام صغيرة من الأنسجة لتجنب جفاف العينات أو تجاوز وقت الحضانة.
  3. قم بتكديس الشرائح مرة أخرى في رف الشرائح ، واشطفها لمدة 1 دقيقة في 60٪ من الإيثانول باستخدام حركة تصاعدية وهبوطية حتى يتم غسل كل كاشف تقليل التألق الذاتي غير المستخدم.
  4. اغمر الرف المنزلق لمدة 5 دقائق في ماء DI.
  5. لاسترجاع المستضد ، انقل الشرائح إلى جرة تلطيخ باستخدام TRS المسخن مسبقا. احتضان لمدة 10 دقائق على 96 درجة مئوية في حمام مائي.
    ملاحظة: يمكن استبدال حمام الماء 96 درجة مئوية بميكروويف أو طباخ بخار إذا تم تسخين TRS مسبقا إلى 96 درجة مئوية وتم ضمان 10 دقائق من وقت الحضانة عند 96 درجة مئوية.
  6. أخرج برطمان التلوين واتركه يبرد ببطء إلى RT لمدة 60-90 دقيقة تقريبا.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا لمدة تصل إلى 4 ساعات ، مع ترك الشرائح في TRS.
  7. قم بإزالة TRS ، ولكن احتفظ بالشرائح في الجرة. اشطفيه مرتين بمحلول ملحي مخزن من Tris مع 0.05٪ توين (TBST ، درجة الحموضة 7.4) لمدة 3 دقائق لكل منهما لغسل أي بقايا TRS متبقية.
  8. للنفاذية ، قم بإعداد 0.2٪ Triton في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4 ، واملأه في جرة التلوين لنفاذ العينات لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: يعزز النفاذية ارتباط الأجسام المضادة الأولية بالبروتينات المستهدفة داخل الخلايا في العينات الثابتة.
  9. شطف الشرائح مرة أخرى مرتين في TBST لمدة 3 دقائق في كل مرة.
  10. تحضير الغرفة الرطبة ، ووضع الشرائح. امسح الماء الزائد من الشرائح بمناديل ورقية. ضع دائرة حول كل عينة باستخدام قلم حاجز كاره للماء لمنع محلول الجسم المضاد من الجريان.
    ملاحظة: لا تدع العينات تجف. من الأفضل العمل مع أقسام صغيرة.

4. منع ربط الأجسام المضادة غير المحددة

  1. خذ محلول مانع جاهز للاستخدام مع مصل الحمير (جدول المواد) ، وماصة قطرة واحدة على كل عينة. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
    ملاحظة: تقلل خطوة الحظر هذه من ارتباط الجسم المضاد الثانوي بمواقع ربط غير محددة على العينة. بعد منع هذه الحواتم غير المتخصصة وتطبيق الجسم المضاد الأولي ، سيرتبط الجسم المضاد الثانوي بالجسم المضاد الأولي ولن يتفاعل مع سطح النسيج. يتم تخزين كاشف الحجب الجاهز للاستخدام في 2-8 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
  2. قم بإزالة محلول الحظر الزائد من الشرائح عن طريق النقر على حافة الشرائح على سطح صلب. لا تشطفها.

5. الأجسام المضادة الأولية

  1. تمييع الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة (جدول المواد). استخدم ما يقرب من 100 ميكرولتر من المحلول النهائي لكل عينة. بالنسبة للجسم المضاد NE و H3cit (R8) والتحكم في الأيزوكونترول ، قم بتخفيفه إلى تركيز 5 ميكروغرام / مل. بالنسبة ل MPO والتحكم في الأيزوكونترول المقابل ، استخدم 10 ميكروغرام / مل. قم بإعداد أنبوب واحد لكل جسم مضاد أولي وأنبوب واحد لكل جسم مضاد متساوي التحكم.
    ملاحظة: يمكن دمج H3cit (R8) / MPO أو NE / MPO وعناصر التحكم الخاصة بهم لتلطيخ NETs. بالنسبة لمزيج H3cit (R8) / MPO ، خفف إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل ل H3cit (R8) و 10 ميكروغرام / مل ل MPO إلى حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر لكل عينة. بالنسبة إلى NE / MPO ، خفف إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل ل NE و 10 ميكروغرام / مل ل MPO إلى حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر لكل عينة. بالنسبة إلى isocontrol ، استخدم نفس التركيز لكل جسم مضاد مقابل. استخدم دائما طرف ماصة جديدا لكل جسم مضاد مستخدم. يمكن تخزين الأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أسابيع وعند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد.
  2. مع عينتين على شريحة واحدة ، استخدم واحدة للأجسام المضادة isocontrol والأخرى لتخفيف الأجسام المضادة MPO / H3cit أو MPO / NE. استخدم ما يقرب من 100 ميكرولتر لكل عينة ، وانشر محلول الأجسام المضادة بالتساوي.
    ملاحظة: لا تدع العينات تجف. كن حذرا لتجنب الخلط بين الأجسام المضادة المتساوية والأجسام المضادة الأولية.
  3. يحفظ في حجرة مبللة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  4. في اليوم التالي ، اضغط على محلول الأجسام المضادة الأولية الزائدة من الشرائح ، وقم بتكديس الشرائح في كوفيت. شطف ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة مع TBST لغسل محلول الأجسام المضادة الأولية المتبقية.

6. الأجسام المضادة الثانوية

  1. تحضير محلول الأجسام المضادة الثانوية. استخدم اثنين من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المختلفة: حمار مضاد للماعز ل MPO ومضاد للأرانب للحمار لتلطيخ H3cit. قم بتخفيف كل واحد إلى تركيز 7.5 ميكروغرام / مل باستخدام محلول تخفيف الأجسام المضادة (جدول المواد).
    ملاحظة: للتلطيخ المزدوج ، استخدم جسمين مضادين فلوريين بمناطق إثارة مختلفة والحد الأدنى من التداخل الطيفي. الجمع بين كل من الأجسام المضادة الثانوية ، وتخفيفها إلى تركيز نهائي قدره 7.5 ميكروغرام / مل لكل جسم مضاد لحجم نهائي قدره 100 ميكرولتر لكل عينة. حماية الأجسام المضادة من الضوء. يمكن تخزين الأجسام المضادة الثانوية في 2-8 درجة مئوية لمدة 6-8 أسابيع أو في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
  2. احتفظ بالشرائح في الحجرة الرطبة ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الثانوي إلى كل عينة. دعهم يحتضنون لمدة 30 دقيقة في RT ومحميين من الضوء.
  3. اضغط على محلول الأجسام المضادة الثانوية الزائدة ، وقم بتكديس الشرائح في رف الشرائح. اغمر ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها في جرة ملطخة مملوءة ب PBS لغسل أي أجسام مضادة غير مقيدة متبقية.
  4. تحضير محلول DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindol) (جدول المواد) ، وتخفيفه إلى تركيز 1 ميكروغرام / مل مع ماء DI. اغمر الرف المنزلق في جرة تلطيخ بمحلول DAPI ، واحتضنه لمدة 5 دقائق في RT في الظلام.
    ملاحظة: يستخدم DAPI كصبغة فلورية للحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل. يمكن استخدام حل DAPI المحضر عدة مرات. قم بتخزين حل DAPI المعد في RT. يمكن تخزين مركز DAPI في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
  5. اغمر الرف المنزلق لمدة 5 دقائق في وعاء تلطيخ باستخدام برنامج تلفزيوني لغسل محلول DAPI الزائد.

7. تركيب وتخزين العينات والتحليل المجهري

  1. قم بتركيب العينات باستخدام أغطية ووسط تركيب (جدول المواد).
    ملاحظة: استخدم كميات صغيرة فقط من وسيط التركيب ، وامسح الوسط الزائد بمناديل مبللة. ارتد القفازات ، وتجنب مسح أي وسيط عن طريق الخطأ من أغطية الغطاء أو الشرائح. تجنب تكوين الفقاعات ، واستخدم مسحات القطن للضغط برفق على أغطية الغطاء لإزالة أي فقاعات من الشرائح.
  2. للتصوير ، استخدم مجهرا واسع المجال أو مجهرا متحد البؤر.
    ملاحظة: التقط صورة لعنصر التحكم المتماثل أولا. قم بتقليل وقت التعرض لمرشحات التألق (باستثناء المرشح الأزرق ل DAPI) حتى لا يمكن اكتشاف أي إشارة تقريبا. ثم استخدم هذا الإعداد لفحص العينات المقابلة. ابحث عن المناطق التي يمكن فيها اكتشاف إشارة الفلورسنت في كل عينة فردية باستخدام قناة التألق. بعد التقاط صورة للمنطقة ، يقوم البرنامج بإنشاء صورة مركبة لجميع القنوات ويظهر إشارات مضان مختلفة كتداخل بألوان مختلفة. يمكن بعد ذلك تحليل الصورة بشكل أكبر للتوطين المشترك مع برامج التصوير مثل ImageJ.
  3. قم بتخزين الشرائح في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قبل البدء في تحسين البروتوكول الخاص بنا ، حددنا الخطوات الرئيسية للتلوين الناجح من خلال البحث في PubMed عن الدراسات التي استخدمت أنسجة FFPE للتلطيخ المناعي للشبكات وقارنا بروتوكولاتها. تم تحديد الاختلافات الواعدة في البروتوكول كخطوات رئيسية لتحسين البروتوكول ، في حين لم يتم تغيير الخطوات التي تتوافق في الغالب مع بعضها البعض (الجدول 1).

الجدول 1: بحث PubMed للتلطيخ المناعي FFPE للشبكات. يوضح هذا الجدول المتغيرات في بروتوكول التلوين المناعي في الدراسات التي تم فحصها. تم تقسيم البروتوكولات المستخدمة إلى خطواتها الأساسية ثم تمت مقارنتها ببعضها البعض. ثم تم اتخاذ الخطوات ذات الاختلافات الواعدة كخطوات رئيسية للتحسين وتكييفها مع بروتوكولنا. لم يتم تغيير الخطوات التي تتوافق في الغالب مع بعضها البعض ، مثل وقت الحضانة للجسم المضاد الأساسي (بين عشية وضحاها ، 4 درجات مئوية). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

بناء على النتائج التي توصلنا إليها ، استنتجنا أن الأجسام المضادة المختارة لاستهداف الحواتم كانت الخطوة الأولى الحاسمة. استخدم ما لا يقل عن 10 بروتوكولات مختلفة الجسم المضاد triH3cit (انظر الجدول 1; عمود الأجسام المضادة الأساسي). ومع ذلك ، وجد Thålin et al. أن استنساخ H3cit (R8) أظهر تفاعلا متقاطعا أقل خارج الهدف للهستونات غير السيترولين وأظهر تباينا ضئيلا بين القطع. وبالتالي ، قررنا مقارنة نتائج تلطيخ triH3cit و H3cit (R8) مع بعضهاالبعض 28.

استخدمت أربع دراسات الجسم المضاد MPO البشري / الفأر. وعلاوة على ذلك، طبق بروتوكولان آخران MPO (2D4) على أنسجة الفئران و MPO (2C7) على الأنسجة البشرية (انظر الجدول 1؛ عمود الأجسام المضادة الأساسي). لذلك ، قارنا بشكل منفصل MPO (2C7) مع الجسم المضاد MPO البشري / الفأر للأنسجة البشرية و MPO (2D4) مع الجسم المضاد MPO البشري / الفأر لأنسجة الفئران. تم الكشف عن NE باستخدام خمسة أجسام مضادة مختلفة على الأقل ، لكن ثلاثة منها فقط أظهرت نتائج تلطيخ جيدة في الصور المقدمة. ومع ذلك ، لم يعد أحد الأجسام المضادة متاحا في السوق ، لذلك قارنا الجسم المضاد NE من مضيف أرنب بآخر من مضيف فأر لسلسلة اختباراتنا في الأنسجة البشرية. بالنسبة لعينات الفئران ، يبدو أنه لا يوجد بديل متاح وموثوق به للجسم المضاد NE الذي نشأ في مضيف الأرانب في بداية هذه الدراسة. نظرا لأن أحد الأجسام المضادة NE وكلا الأجسام المضادة H3cit مشتقة من نفس مضيف الأرانب ، فلا يمكن دمجها من أجل تلطيخ مزدوج مع هذا البروتوكول. الجسم المضاد الثانوي خاص بالمنطقة الثابتة للجسم المضاد الأولي ، والتي يحددها المضيف الذي نشأ فيه. إذا تم استخدام جسمين مضادين أوليين مشتقين من نفس المضيف ، فقد يرتبط الجسم المضاد الثانوي بكلا الجسمين المضادين الأوليين ، وسيكون التلوين غير محدد. ومع ذلك ، يفضل التلوين المزدوج على التلوين الفردي لأنه يمكن اكتشاف المزيد من مكونات NET وتوطينها بشكل مشترك. لذلك ، ستكون نتيجة التلوين أكثر تحديدا. وبالتالي ، قمنا بتلطيخ H3cit و MPO مرتين للحصول على بروتوكول كشف أكثر قوة.

على الرغم من أوجه التشابه في الأجسام المضادة المستخدمة ، اختلفت التخفيفات للأجسام المضادة في جميع البروتوكولات تقريبا. على سبيل المثال ، بالنسبة ل triH3cit ، كان نطاق التركيز من 0.5 ميكروغرام / مل إلى 20 ميكروغرام / مل17,18. لكل جسم مضاد مستخدم ، جربنا تخفيفات مختلفة وحصلنا على نتائج تلطيخ مرضية في النطاق الكامل المبلغ عنه في الأدبيات.

وعلاوة على ذلك، يمكن العثور على العديد من أوجه التشابه في وقت حضانة الجسم المضاد الأولي (بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية) واستخدام وتخفيف الجسم المضاد الثانوي (انظر الجدول 1؛ حضانة عمود الأجسام المضادة الأولية). لذلك ، لم نغير هذه الخطوات في سلسلة الاختبار الخاصة بنا وقمنا بتنفيذها وفقا للبروتوكول الموضح أعلاه.

كانت الخطوة الحاسمة التالية التي تم تحديدها من الأدبيات هي استرجاع المستضد. هذه الخطوة ضرورية لأنه ، بسبب تثبيت الفورمالين ، يتم إخفاء حوامل الأجسام المضادة من خلال جسور الميثيلين ، والتي يمكن عكسها عن طريق تسخين قسم الأنسجة في مخزن مؤقت مناسب29. تم استخدام سترات TRS عند الرقم الهيدروجيني 6 والمخزن المؤقت EDTA TRS عند الرقم الهيدروجيني 9 بالتساوي في الأدبيات وأعطت نتائج مماثلة (انظر الجدول 1; عمود المخزن المؤقت TRS). وبالتالي ، قررنا على درجة الحموضة 6 سترات TRS لسلسلة الاختبار الخاصة بنا. لاسترجاع المستضد ، اختبرنا طريقتين مختلفتين للتسخين: ميكروويف (أول 1 دقيقة عند 360 واط ثم تليها 9 دقائق عند 90 واط) وحمام مائي (60 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة ، 96 درجة مئوية لمدة 10 دقائق).

كانت الخطوة الأخيرة التي أظهرت بعض التباين في الأدبيات هي الاختراق باستخدام Triton X-100. تتطلب هذه الخطوة التحسين لأنه مع معالجة المنظفات ، يصبح غشاء الخلية قابلا للاختراق للأجسام المضادة ، ويمكن الوصول إلى الحواتم داخل الخلايا30. استخدمت البروتوكولات السابقة تركيزات مختلفة من Triton X-100 تتراوح من 1٪ إلى 0.1٪ (انظر الجدول 1 ؛ عمود النفاذية). لذلك ، جربنا تركيزين من Triton X-100 (0.2٪ و 0.5٪) وسلسلة واحدة بدون نفاذية Triton.

بعد تحديد هذه الخطوات الرئيسية ، قمنا بتعديلها وحاولنا تحسين البروتوكول. ثم تم فحص الصور وفقا لورقة تقييم ، وتم تسجيل الاختلافات بشكل شبه كمي ومقارنتها (انظر الجدول 2).

الجدول 2: جدول النتائج لتحسين خطوات البروتوكول. يوضح هذا الجدول نتائج الخطوات المعدلة: عامل تقليل التألق الذاتي ، واسترجاع المستضد ، والنفاذية. قبل البدء في سلسلة الاختبارات هذه ، اختبرنا أفضل مزيج من الأجسام المضادة والتركيز. تم تقييم الشرائح في 10 مناطق مختلفة ، ثم تم تسجيل منطقة تمثيلية واحدة من (-) للحصول على نتيجة سلبية إلى (++) للحصول على نتيجة إيجابية تحتوي على NET. تضمنت النتائج الإيجابية جزئيا تلطيخا خلفيا منتشرا أعلى للخلايا غير العدلة. الاختصارات: n / u = غير مستخدمة ؛ - = نتيجة سلبية ؛ +/- تلطيخ إيجابي جزئيا ؛ + = تلطيخ محدد معتدل ؛ + = تلطيخ جيد للشبكات والعدلات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الأجسام المضادة الأولية
قبل تكييف البروتوكول ، حاولنا العثور على أفضل مزيج من الأجسام المضادة. هنا ، أظهر triH3cit تلطيخ هيستون داخل الخلايا أكثر من H3cit (R8). للكشف عن الشبكات ، قررنا استخدام الجسم المضاد H3cit (R8) لتحسين البروتوكول الخاص بنا. يرتبط هذا الجسم المضاد فقط ب H3cit خارج الخلية ولم يظهر أي تلطيخ ل H3cit داخل الخلايا عند هذا التركيز (انظر الشكل 1A ، B).

بالنسبة لتلطيخ MPO ، قارنا الجسم المضاد MPO البشري / الفأر مع MPO (2C7) للأنسجة البشرية (انظر الشكل 1C ، D) و MPO (2D4) لأنسجة الفئران (انظر الشكل 1E ، F). لم تتمكن الأجسام المضادة MPO (2D4) و MPO (2C7) من تحقيق تلطيخ ثابت لأنواع الأنسجة المتعددة ، بينما أدى MPO البشري / الفأر إلى تلطيخ موثوق وجيد ل MPO. وبالتالي ، اخترنا MPO البشري / الفأر لبروتوكول التلوين الخاص بنا.

بالنسبة إلى NE ، جربنا جسما مضادا NE من مضيف فأر على الأنسجة البشرية ، والذي أظهر تلطيخ NE فقط في عينة واحدة من أصل خمس عينات مقارنة بالتلوين الموثوق به للجسم المضاد NE من مضيف أرنب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الجسم المضاد NE من مضيف الأرانب قابل للتطبيق على الأنسجة البشرية والفأر. (انظر الشكل 1G ، H).

Figure 1
الشكل 1: مقارنة الأجسام المضادة الأولية في الأنسجة المختلفة. (أ) أنسجة التهاب الأمعاء والقولون الوليدي البشري (NEC) الملطخة ب H3cit (R8) (أحمر). هنا ، يمكن اكتشاف إشارة خارج الخلية فقط. (ب) نفس النسيج الملون ب triH3cit (R2،8،17) (أحمر). يخلق هذا الجسم المضاد إشارة أوسع مع تلطيخ مكثف داخل الخلايا من الهستونات الحمضية (الأسهم الصفراء). (ج، ه) أنسجة NEC البشرية (C) وأنسجة انفتال الفأر (E) مع تلطيخ جيد ل H3cit (R8) (أحمر) والماوس / MPO البشري (أخضر). يشير التوطين المشترك للإشارة H3cit و MPO و DAPI (الأزرق) إلى تكوين NET (الأسهم البيضاء). (د، و) بالمقارنة ، (D) باستخدام MPO (2C7) لأنسجة NEC البشرية و (F) MPO (2D4) (أخضر) لأنسجة انفتال الفأر ، لا يمكن الحصول على إشارة MPO. (ز) عينة جلد بشري محترقة مع تلطيخ قوي جدا للجسم المضاد NE من مضيف أرنب (أرجواني) مقارنة بنتيجة التلوين السلبية (H) للجسم المضاد NE من مضيف الفأر. للاطلاع على عنصر التحكم في النمط المتماثل، انظر التحكم في الشكل التكميلي Isocontrol 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إزالة البارافين
هنا ، تم استبدال الزيلين بالليمونين ، والذي أظهر ما يعادل إزالة البارافين بشكل أفضل لعينات الأنسجة مقارنة بالزيلين ، مع تألق ذاتي أقل في الخلفية (انظر الشكل 2 أ ، ب).

عامل الحد من التألق الذاتي
يمكن تطبيق عامل تقليل التألق الذاتي الجاهز للاستخدام على أساس سودان بلاك لمدة 2-20 دقيقة. هنا ، قمنا بتطبيقه لمدة 0 دقيقة و 5 دقائق و 10 دقائق. عندما لم يتم استخدام أي حظر ، أظهرت بعض عينات الفئران المزيد من التلوين غير المحدد ، ويمكن الوصول إلى تلطيخ إيجابي جزئي (انظر الشكل 2C). أظهر وقت الحجب البالغ 5 دقائق نتائج جيدة في جميع أنواع الأنسجة باستثناء H3cit و MPO في رئة الفأر وأنسجة الجلد (انظر الجدول 2). في 10 دقائق من وقت الحجب في بعض العينات ، بدأ التلوين يكون أقل سطوعا ، وبالتالي فإن الإطار الزمني البالغ 5 دقائق هو الخيار الأفضل لمنع التألق الذاتي (انظر الشكل 2D ، E).

Figure 2
الشكل 2: طرق إزالة البارافين واستخدام عامل مختزل للتألق الذاتي. (أ) أنسجة التهاب الفقار العضلي البشري منزوعة البارافين بالليمونين وملطخة ب H3cit (أحمر) و MPO (أخضر). يشير التكوين الذي تقطعت به السبل للإشارات والتوطين المشترك الجزئي إلى وجود شبكات (سهم أبيض). (ب) نفس عينة الأنسجة منزوعة البارافين مع الزيلين ، مما يؤدي إلى نتائج تلطيخ مماثلة ، مما يشير إلى أنه يمكن استبدال الزيلين المستخدم على نطاق واسع بوسط بديل. (جيم - ه) تظهر أنسجة رئة الفأر بعد الإنتان المستحث أنماط تلطيخ NE مختلفة (أرجواني) عند استخدام أوقات حضانة مختلفة لعامل تقليل التألق الذاتي. مع عدم استخدام مخفض التألق الذاتي ، لا تزال الصورة C تظهر تلطيخا طفيفا في الخلفية لكريات الدم الحمراء (سهم أحمر). في المقابل ، توضح الصورة D أنه بعد 5 دقائق من الحضانة بعامل تقليل التألق الذاتي ، تنبعث إشارة واضحة. بعد 10 دقائق ، تنخفض جودة التلوين في الصورة E ، وتصبح الإشارة أقل سطوعا. للاطلاع على عنصر التحكم في النمط المتماثل، انظر التحكم في الشكل التكميلي Isocontrol 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

طرق استرجاع المستضد
بالنسبة للتلطيخ NE ، قمنا بتسخين العينات في محلول سترات الأس الهيدروجيني 6 لمدة 10 دقائق في الميكروويف (أولا لمدة 1 دقيقة عند 360 واط ثم لمدة 9 دقائق عند 90 واط) ، لمدة 10 دقائق في حمام مائي عند 96 درجة مئوية ، أو لمدة 90 دقيقة في حمام مائي عند 60 درجة مئوية. هنا ، أظهرت درجات الحرارة المرتفعة في الميكروويف والحمام المائي استرجاع مستضد معتدل إلى جيد باستمرار (انظر الشكل 3 أ). لم يتم العثور على فرق كبير بين الميكروويف وحمام الماء 96 درجة مئوية (انظر الجدول 2). علاوة على ذلك ، تبين أنه في حمام مائي بدرجة حرارة 60 درجة مئوية ، كان هناك تلطيخ إيجابي جزئيا فقط أو معدوم (انظر الشكل 3 ب). فقط الدقاق البشري وعضلة القلب البشرية أظهرت نتائج محددة جيدة. نظرا لعدم إمكانية تحقيق تلطيخ مناسب ل NE مع حمام مائي 60 درجة مئوية ، تم التخلص من سلسلة اختبار الحمام المائي 60 درجة مئوية ل H3cit و MPO.

للتلطيخ المزدوج باستخدام MPO و H3cit ، قمنا بتسخين العينات في محلول سترات الأس الهيدروجيني 6 في الميكروويف لمدة 10 دقائق (أولا لمدة 1 دقيقة عند 360 واط ثم لمدة 9 دقائق عند 90 واط) أو في حمام مائي عند 96 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. هنا ، أظهرت كلتا الطريقتين نتائج محددة جيدة ، مع نتائج أكثر إيجابية قليلا للحمام المائي 96 درجة مئوية (انظر الشكل 3C). فقط رئة الفأر وأنسجة الجلد يمكن أن تحقق ترتيبا عاما معتدلا (انظر الجدول 2).

ومع ذلك ، فإن تجاوز وقت الحضانة البالغ 40 دقيقة عند 96 درجة مئوية أدى إلى تلطيخ أقل كثافة للأجسام المضادة ، في حين يمكن ملاحظة المزيد من تلطيخ الخلفية (انظر الشكل 3 د).

Figure 3
الشكل 3: طرق استرجاع مولد الضد. (أ) يظهر النسيج الانفتال الحجي للفأر المصبوغ ل NE (أرجواني) باستخدام وقت حضانة مدته 10 دقائق عند 96 درجة مئوية لاسترجاع الحرارة إشارة أقوى بكثير من (B) عند احتضان العينة لمدة 90 دقيقة في حمام مائي 60 درجة مئوية. (C) علاوة على ذلك ، فإن الحضانة لمدة 10 دقائق في استرجاع مستضد 96 درجة مئوية تؤدي أيضا إلى إشارة قوية ل H3cit (أحمر) و MPO (أخضر) مع تلطيخ صافي مشترك (أسهم بيضاء). د: ومع ذلك ، فإن غلي العينات لأكثر من 40 دقيقة يؤدي إلى تلطيخ H3cit خارج الخلية أقل تحديدا وعدم تلطيخ MPO. للاطلاع على عنصر التحكم في النمط المتماثل، انظر الشكل التكميلي Isocontrol 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النفاذية
حاولنا تخلل العينات باستخدام Triton X-100 في تخفيفين (0.2٪ و 0.5٪) لمدة 10 دقائق وقارنا هذا ب 10 دقائق في الماء منزوع الأيونات. هنا ، حققت 10 دقائق مع Triton 0.2٪ نتائج جيدة عبر جميع أنواع الأنسجة ، على الرغم من أن الاختلافات كانت صغيرة مقارنة بظروف 0.5٪ Triton والمياه منزوعة الأيونات (انظر الجدول 2).

الشكل التكميلي Isocontrol 1: ضوابط النمط المتماثل للشكل 1. تظهر جميع الصور تلطيخا جيدا ل DAPI (الأزرق) ولكن لا توجد إشارة للجسم المضاد الفلوري. وهذا يؤكد أن ارتباط الأجسام المضادة الأولية في الشكل 1 خاص بمولد الضد المستهدف وليس نتيجة لارتباطات غير محددة أو تفاعلات بروتينية. (أ) نسيج التهاب الأمعاء والقولون الوليدي البشري (NEC) ملطخ بالجسم المضاد isocontrol ل H3cit (R8) (أحمر). (B) نسيج NEC ملطخ بالجسم المضاد isocontrol ل H3cit (R2،8،17) (أحمر). (C) أنسجة NEC (E) وأنسجة انفتال الفأر الملطخة بالأجسام المضادة isocontrol ل H3cit (R8) (أحمر) و MPO للفأر / الإنسان (أخضر). (د) أنسجة NEC ملطخة بالأجسام المضادة isocontrol ل H3cit (R8) (أحمر) و MPO (2C7) (أخضر). (F) نسيج انفتال فأر ملطخ بالأجسام المضادة isocontrol ل H3cit (R8) (أحمر) و MPO 2D4 (أخضر). جي: عينة جلد بشري محترقة ملطخة بالجسم المضاد isocontrol للجسم المضاد NE من مضيف أرنب (أرجواني). (H) نفس النسيج الملون بالجسم المضاد isocontrol للجسم المضاد NE من مضيف فأر (أرجواني). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي Isocontrol 2: ضوابط النمط المتماثل للشكل 2. تظهر جميع الصور تلطيخا جيدا ل DAPI (الأزرق) ولكن لا توجد إشارة للجسم المضاد الفلوري. وهذا يؤكد الارتباط المحدد للأجسام المضادة الأولية في الشكل 2. لا تزال الصور C-E تظهر بعض تلطيخ الخلفية باللون الأرجواني بسبب أوقات التعرض الطويلة. ومع ذلك ، يمكن تمييز إشارة NE في الشكل 2 عن تلطيخ الخلفية. (أ) أنسجة التهاب الفقار البشري منزوع البارافين بالليمونين وملطخ بالأجسام المضادة isocontrol ل H3cit (R8) (أحمر) والفأر / MPO البشري (أخضر). (ب) نفس عينة الأنسجة منزوعة البارافين مع الزيلين وملطخة بالأجسام المضادة isocontrol ل H3cit (أحمر) و MPO (أخضر). (ج) أنسجة رئة الفأر ملطخة بالجسم المضاد isocontrol ل NE (أرجواني) ، مع عدم استخدام عامل تقليل التألق الذاتي. (د) نفس الأنسجة ملطخة بالجسم المضاد isocontrol ل NE (أرجواني) و 5 دقائق من الحضانة بعامل تقليل التألق الذاتي. (ه) نفس النسيج ملطخ بالجسم المضاد متساوي التحكم ل NE (أرجواني) و 10 دقائق من الحضانة بعامل مختزل للتألق الذاتي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي Isocontrol 3: ضوابط النمط المتماثل للشكل 3. تظهر جميع الصور تلطيخا جيدا ل DAPI (الأزرق) ولكن لا توجد إشارة محددة للجسم المضاد الفلوري. وهذا يؤكد الارتباط المحدد للأجسام المضادة الأولية في الشكل 3. (أ) نسيج انفتال فأر ملطخ بالجسم المضاد isocontrol ل NE (أرجواني) باستخدام وقت حضانة مدته 10 دقائق عند 96 درجة مئوية لاسترجاع الحرارة. (ب) نفس النسيج الملطخ بالجسم المضاد isocontrol ل NE (أرجواني) واسترجاع الحرارة لمدة 90 دقيقة في حمام مائي بدرجة حرارة 60 درجة مئوية. (ج) نفس النسيج الملطخ بالجسم المضاد متساوي التحكم ل H3cit (أحمر) و MPO (أخضر) وله ظروف استرجاع حرارة مماثلة كما في A. تظهر النقطة الخضراء قطعة أثرية ملطخة للأجسام المضادة الثانوية المجمعة. (د) نفس النسيج ملطخ بالجسم المضاد isocontrol ل H3cit (أحمر) و MPO (أخضر) واستخدام وقت حضانة مدته 40 دقيقة عند 96 درجة مئوية لاسترجاع الحرارة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي Isocontrol 4: ضوابط النمط المتماثل للشكل 4. جميع عناصر التحكم المتساوية التالية هي من نفس الشريحة مثل التجربة "الفاشلة" المقابلة. لم يتم إجراء المحاولات الفاشلة عن قصد ، لذلك يبدو أن بعض النظائر قابلة للاستخدام ، في حين أن العينة لم تكن كذلك. (أ) أنسجة NEC ملطخة بالجسم المضاد isocontrol ل H3cit (أحمر) و MPO (أخضر). تمت معالجة هذه العينة بشكل أسرع دون أن تجف. لذلك ، لا يوجد تلطيخ مفرط في الخلفية مرئي. الهياكل الخضراء والحمراء هي مجاميع الأجسام المضادة الثانوية. (ب) نسيج التهاب الفقار ملطخ بالجسم المضاد isocontrol ل NE (أرجواني). هنا ، كانت إزالة البارافين ناجحة ، لذلك لا يمكن رؤية بقايا البارافين. (ج) أنسجة NEC ملطخة بالجسم المضاد isocontrol ل H3cit (أحمر) و MPO (أخضر). على الرغم من استخدام نفس الأجسام المضادة الثانوية المخزنة بشكل غير صحيح ، لا يتوقع حدوث تلطيخ لهذه الصورة المتساوية التحكم. لذلك ، لا يمكن استخدام هذه الصورة لتقييم الربط المحدد للصورة المقابلة. (د) جلد الإنسان المحروق ملطخ بالجسم المضاد isocontrol ل H3cit (أحمر) و MPO (أخضر). هنا ، تم التثبيت بعناية أكبر ، ولا يمكن رؤية تشتت الضوء عبر فقاعات الهواء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا العمل ، كنا نهدف إلى تكييف وتحسين البروتوكولات الحالية لتصوير الشبكات لمزيد من أنواع الأنسجة ، بدءا من عملية التلوين الفعلية. الخطوة الأولى الحاسمة لهذه الطريقة هي اختيار الأجسام المضادة الأكثر ملاءمة. بالنسبة إلى NE ، جربنا جسما مضادا NE من مضيف فأر على الأنسجة البشرية ، والذي لم يظهر أي تلطيخ موثوق به مقارنة ب NE من مضيف أرنب. علاوة على ذلك ، اقترح Thålin et al. H3cit (R8) كجسم مضاد أكثر تحديدا للتلطيخ خارج الخلية. قارنا هذا الجسم المضاد مع triH3cit المستخدم على نطاق واسع (R2 ، R8 ، R17). أظهرت دراستنا أن الجسم المضاد H3cit (R8) ملطخ فقط بإشارة خارج الخلية بتركيزات مستخدمة ، مما يتيح التعرف بسهولة على الشبكات على الشرائح. تدعم هذه النتيجة ادعاءات Thålin et al. بأن استنساخ H3cit (R8) يمكن أن يوفر إشارة NET جيدة مع انخفاض التفاعل المتقاطع خارج الهدف إلى الهستونات غير السيترولين28. قارنا أيضا الأجسام المضادة MPO للأنسجة البشرية والفأر لتلطيخ MPO. تظهر نتائجنا أن الجسم المضاد MPO للفأر / الإنسان أظهر تلطيخا أكثر موثوقية ويمكن استخدامه في وقت واحد على عينات الإنسان والفأر ، مما يبسط استخدامه في المختبر. وبالتالي ، نوصي باستخدام تركيبة الأجسام المضادة هذه ، H3cit (R8) والماوس / MPO البشري ، للبحث المستقبلي وتنفيذها في بروتوكولنا.

ومع ذلك ، هناك قيود على محاولات تلطيخ متعددة مع هذا الاختيار للأجسام المضادة. تم تعديل هذا البروتوكول لاستخدام الأجسام المضادة الأولية من مضيفين مختلفين. خلاف ذلك ، يمكن أن يرتبط جسم مضاد ثانوي واحد بكلا الجسمين المضادين الأساسيين. يأتي الجسم المضاد H3cit من نفس المضيف مثل الجسم المضاد NE ، لذلك لم نتمكن من تلطيخ NE و H3cit معا. على الرغم من عدم إجراء تلطيخ ثلاثي (NE ، H3cit ، MPO) في هذه الدراسة ، يمكن أن يكون هذا البروتوكول بمثابة أساس لتجارب التلوين الثلاثي في المستقبل. يمكن أن يكون أحد الخيارات الممكنة للتلطيخ الثلاثي أو التلوين المزدوج NE و H3cit هو تبادل أحد هذه الأجسام المضادة بجسم مضاد موثوق به من مضيف مختلف. في هذه الحالة ، يمكن أن يكون الشريك المركب المحتمل هو الجسم المضاد NE (Santa Cruz ؛ sc-55549) من الأغنام التي يستخدمها Knackstedt et al.24. خيار آخر بواسطة Duler et al. تم نشره في عام 2021 ، حيث استخدموا طريقة تلطيخ مزدوج متتالية ودمجوا NE و H3cit من مضيف أرنب26. تطبيق واعد إضافي لطريقة تلطيخ متعددة هو التمييز بين تكوين صافي داخل وخارج الأوعية الدموية. بدلا من التلوين الثلاثي لعلامات NET ، يمكن دمج تلطيخ NET المزدوج مع تلطيخ الأوعية الدموية الإضافي. علاوة على ذلك ، قام عدد متزايد من الدراسات بفحص التوزيع داخل وخارج الأوعية الدموية للشبكات لاكتساب المزيد من المعرفة حول الآليات المرضية لأمراض معينة ، مثل مرض الزهايمر. وصف Smyth et al.31 بروتوكولا واعدا ومتعمقا مشابها لبروتوكولنا للتمييز بين التوطينين المحتملين. قاموا بتعديل بروتوكول تلطيخ NET الحالي الخاص بهم عن طريق إضافة محاضر بيوتينيل لتسمية الخلايا البطانية واستخدموا ستربتافيدين مترافق بالفلوروفور لتلطيخ الليكتين المناعي. من خلال فحص التوطين المشترك لعلامات الليكتين و NET في نفس الصورة ، تمكنوا من تحديد الشبكات داخل الأوعيةالدموية 31. في هذا السياق ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتوسيع تطبيق بروتوكولنا.

بعد العثور على أنسب تركيبة من الأجسام المضادة ، فإن الخطوة الحاسمة التالية هي إدخال عامل تقليل التألق الذاتي. يمكن أن تؤدي العوامل الخارجية مثل تثبيت العينة باستخدام مثبتات الفورمالديهايد والعوامل الداخلية مثل كريات الدم الحمراء إلى ارتفاع التألق الذاتي ، مما يجعل تحديد التوطين المشترك أمرا صعبا32. تحدث هذه المشكلة بشكل رئيسي في أطياف التألق الأزرق (منطقة الإثارة: 430-480 نانومتر) والأطياف الفلورية الخضراء (منطقة الإثارة: 500-550 نانومتر) ويمكن أن تؤدي إلى نتائج تلطيخ غير حاسمة عند استخدام جسم مضاد مضان بنفس منطقة الإثارة3. تشير الأدبيات إلى أن السودان الأسود عامل فعال لتقليل التألق الذاتي للأنسجةالمتأصلة 33. السودان الأسود يجعل من الممكن الحصول على نتائج تلطيخ أكثر وضوحا باستخدام قنوات مضان زرقاء أو خضراء. ستكون منطقة الإثارة هذه ضرورية لمحاولات التلوين المتعددة المستقبلية لأن القنوات الزرقاء والخضراء مطلوبة عند استخدام صبغة فلورية رابعة. تظهر دراستنا أن وقت الحضانة الأمثل يعتمد على نوع الأنسجة والأجسام المضادة المستخدمة في عملية التلطيخ. ومع ذلك ، في هذا العمل ، أعطت 5 دقائق من عامل تقليل التألق الذاتي بشكل عام نتائج جيدة على جميع أنواع الأنسجة وكان لها فائدة تلطيخ العينة باللون الأسود ، مما يسهل رؤيتها على الشرائح. هذا منع الأجزاء المفقودة من الأنسجة في عملية التلوين ، خاصة مع العينات الصغيرة.

عامل أساسي آخر لنجاح هذا البروتوكول هو ارتفاع درجة الحرارة الثابتة لخطوة استرجاع المستضد. أظهر بحثنا أن 10 من 15 دراسة سابقة استخدمت درجات حرارة أعلى من 96 درجة مئوية لاسترجاع المستضد13،15،16،17،19،21،22،25،26،27. كان هذا متسقا مع نتائجنا ، حيث أعطى احتضان العينات في حمام مائي أو ميكروويف بدرجة حرارة 96 درجة مئوية نتائج جيدة دون وجود اختلافات كبيرة. ومع ذلك ، نوصي باستخدام حمام مائي لتوزيع الحرارة بشكل متساو. عند استخدام الميكروويف ، وجدنا تدرجا في درجة الحرارة في المخزن المؤقت يصل إلى 5 درجات مئوية بين الجزء العلوي والسفلي من جرة التلطيخ. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحمام المائي أسهل في الاستخدام وله خطر أقل من غليان المخزن المؤقت. من أجل النفاذية ، وجدنا أن Triton X-100 كان له تأثير أقل على التلطيخ. لذا ، فإن تخطي هذه الخطوة في البروتوكول ممكن دون التأثير سلبا على النتيجة. بشكل عام ، أعطت العينات البشرية نتائج أفضل من عينات الفئران. قد يكون السبب في ذلك هو أن البشر لديهم نسبة أعلى من العدلات من الفئران34,35. بالإضافة إلى ذلك ، لم تظهر عينات رئة الفئران أي التهاب عياني مرئي وعدد أقل من العدلات ، في حين أن عينات أمعاء الفئران كانت ملتهبة مجهريا وأظهرت نتائج تلطيخ جيدة. وبالتالي ، يمكن أن تكون الدرجات المنخفضة في دراستنا ناتجة عن انخفاض الالتهاب وليس بسبب عدم عمل البروتوكول على النحو الأمثل.

لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، قد يكون للأخطاء الطفيفة في البروتوكول أو عدم التعامل مع العينات بعناية تأثيرات كبيرة على نتائج التلطيخ. كانت إحدى المشكلات الرئيسية التي حددناها هي عينة الجفاف. هنا ، وجدنا أن التعامل مع أكثر من 10-15 شريحة في وقت واحد كان أمرا بالغ الأهمية لأن كل خطوة تستغرق وقتا طويلا ويمكن أن تؤدي إلى جفاف العينات. لم تعد العينات المجففة قابلة للاستخدام بسبب تلطيخ الخلفية العالي وعدم وجود إشارة مضان محددة يمكن اكتشافها (انظر الشكل 4 أ). بالإضافة إلى ذلك ، يجب إزالة العينات تماما قبل البدء في بروتوكول التلطيخ. أدت بقايا البارافين إلى إشارة خلفية قوية ، ويمكن رؤية خطوط القطع في البارافين الملون (انظر الشكل 4 ب). علاوة على ذلك ، بعد أكثر من 20 دورة تجميد وذوبان ، لم يتم اكتشاف أي إشارة للجسم المضاد الثانوي ل MPO (انظر الشكل 4C). خطوة أخرى مهمة لها تأثير كبير على جودة الصورة هي التعامل مع خطوة التثبيت النهائية. في هذا العمل ، أدت فقاعات الهواء تحت الغطاء إلى تشتت إشارة الفلورسنت ، وبالتالي صورة ضبابية (انظر الشكل 4D).

Figure 4
الشكل 4: نصائح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها . (أ) توضح هذه اللوحة نتيجة عينة جافة. يعيق تلطيخ الخلفية الحمراء الصلبة أي تقييم للعينة. (ب) هنا ، يظهر السهم الأحمر بقايا البارافين ، التي تتميز بالمظهر المموج ، بعد إزالة البارافين غير الكافية. ينتج عن هذه البقايا إشارة خلفية عالية وصور أقل جودة. (ج) يؤدي التخزين غير الكافي للأجسام المضادة أو أكثر من 20 دورة ذوبان التجميد إلى تجميع الجسم المضاد الثانوي (الأسهم الخضراء) وعدم الارتباط ب MPO. (د) يمكن أن يؤدي التركيب الذي لا يتم بعناية إلى فقاعات هواء ، وبالتالي تشتت ضوء الفلورسنت (السهم الأزرق). يمكن أن يؤثر هذا بشكل كبير على جودة الصورة ، خاصة عندما يؤدي التشتت إلى طمس الهدف. للاطلاع على عنصر التحكم في النمط المتماثل، انظر الشكل التكميلي Isocontrol 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

على الرغم من أن الشبكات تكتسب شعبية أكبر في البحث العلمي ، إلا أنه لا توجد حتى الآن دراسات كافية تركز على طرق اكتشاف NET3،13،17،26. على حد علمنا ، نقدم أول دراسة تقارن البروتوكولات من دراسات مختلفة للتصوير المناعي للشبكات في أنسجة FFPE. اختلفت البروتوكولات المخصصة المنشورة سابقا في طرق استرجاع الأجسام المضادة أو المستضد وغالبا ما كانت مصممة لنوع واحد فقط من الأنسجة ، مما يجعل مقارنة نتائج التصوير NET أكثر صعوبة. لذلك ، في هذه الدراسة ، حددنا الخطوات الحاسمة وأنشأنا بروتوكولا مناسبا لمختلف أنسجة الفئران والبشر. لقد حققنا ذلك باستخدام جسم مضاد أولي جديد لتلطيخ H3cit وتقليل تلطيخ الخلفية بعامل تقليل التألق الذاتي. علاوة على ذلك ، أظهرنا أن درجة الحرارة المرتفعة الثابتة أمر بالغ الأهمية ، وأن التعامل الدقيق مع العينات أمر أساسي لنجاح تلطيخ الشبكة. لذلك ، توفر هذه الدراسة الخطوات الأساسية لتطوير بروتوكول قابل للتطبيق بشكل عام لتلطيخ NETs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تأسست هذه الأبحاث من قبل جمعية الأبحاث الألمانية (BO5534). نشكر أنطونيا كيويت وموريتز لينز ويوهانا هاجنز والدكتورة أنيكا هوير والأستاذة العامة الدكتورة إنغو كونيغس على تزويدنا بالعينات. بالإضافة إلى ذلك ، يشكر المؤلفون فريق مرفق التصوير المجهري UKE (المرفق الأساسي ، كلية الطب UKE) على الدعم في الفحص المجهري المناعي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
         Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg abcam Ab 68672  1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg abcam Ab 5103 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg abcam Ab 25989 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg abcam Ab 90810 1:50
Axiovision Microscopy Software  Zeiss 4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml GeneTex  GTX30972
Coverslips Marienfeld 0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) Dako S2369
DAPI 25 mg Roth 6335.1 1:25000
DCS antibody dilution 500 mL DCS diagnostics DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3 JacksonImmunoResearch 705-165-147 1:200
Donkey anti rabbit AF647 JacksonImmunoResearch 711-605-152 1:200
Donkey anti rabbit Cy3 JacksonImmunoResearch 711-165-152 1:200
Fluoromount-G Mounting Medium Invitrogen 00-4958-02
Glass slide rack Roth H552.1
Human/Mouse MPO Antibody R&D Systems AF 3667  1:20
Hydrophobic Pen KISKER MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg abcam Ab 37415 1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml Maxvision MB-L
Microscopy camera Zeiss AxioCamHR3
Microwave Bosch HMT84M421
Mouse IgG1 negative control Dako X0931 Aglient 1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control R&D Systems AB-108-C  1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x) Sigma-Aldrich P-3813
PMP staining jar Roth 2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg abcam Ab 219406 1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg abcam Ab 172730 1:300
ROTI Histol Roth  6640
SuperFrost Plus slides R. Langenbrinck 03-0060
TBS Tris buffered saline (x10) Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Water bath Memmert 830476
Water bath rice cooker reishunger RCP-30
Wet chamber Weckert Labortechnik 600016
Zeiss Widefield microscope Zeiss Axiovert 200M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
  3. Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).
  4. Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
  5. Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
  6. Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
  7. Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
  8. Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
  9. Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
  10. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
  11. Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
  12. Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
  13. Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).
  14. de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
  15. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  16. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  17. Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
  18. Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
  19. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  20. Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
  21. Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).
  22. Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
  23. Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).
  24. Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
  25. Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
  26. Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).
  27. Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
  28. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  29. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
  30. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  31. Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).
  32. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
  33. Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).
  34. Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).
  35. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).

Tags

التصوير المناعي ، مصائد العدلات خارج الخلية ، الشبكات ، العدوى البكتيرية ، تلف الأنسجة الرضحية ، أمراض المناعة الذاتية ، الالتهاب المعقم ، خيوط الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل ، الهستونات ، البروتينات المضادة للميكروبات ، مسببات الأمراض ، تنظيم الاستتباب ، التصاق الصفائح الدموية ، التخثر ، الإنتان ، اضطرابات المناعة الذاتية ، التدخل العلاجي ، المجهر الإلكتروني ، طرق التلوين ، الأجسام المضادة ، عوامل تقليل التألق الذاتي ، طرق استرجاع المستضد ، النفاذية

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 09/29/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:

Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

التصوير المناعي لمصائد العدلات خارج الخلية في الأنسجة البشرية والفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schoenfeld, L., Appl, B.,… More

Schoenfeld, L., Appl, B., Pagerols-Raluy, L., Heuer, A., Reinshagen, K., Boettcher, M. Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (198), e65272, doi:10.3791/65272 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter