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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

人和小鼠组织中性粒细胞胞外陷阱的免疫荧光成像

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65272
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

ERRATUM NOTICE

Summary

中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 与多种疾病有关，免疫荧光通常用于其可视化。然而，有各种染色方案，在许多情况下，只检查一种类型的组织。在这里，我们建立了一种普遍适用的方案，用于在小鼠和人体组织中染色NET。

Abstract

中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 由中性粒细胞释放，作为对细菌感染或创伤性组织损伤的反应，但也在自身免疫性疾病和无菌性炎症中发挥作用。它们是由双链 DNA 细丝、组蛋白和抗菌蛋白组成的网状结构。一旦释放，NETs可以捕获并杀死血液和组织中的细胞外病原体。此外，NET通过刺激血小板粘附和凝血来参与稳态调节。然而，神经内分泌失调的产生也与各种疾病有关，包括败血症或自身免疫性疾病，这使它们成为治疗干预的有希望的靶点。除电子显微镜外，使用免疫荧光成像可视化NET是目前唯一已知的证明组织中NET相互作用的方法之一。因此，已经使用了各种染色方法来可视化 NET。在文献中，描述了不同的染色方案，我们确定了方案之间显示出高度变异性的四个关键组成部分：（1）使用的抗体类型，（2）自发荧光还原剂的使用，（3）抗原修复方法，以及（4）透化。因此，在这项工作中系统地调整和改进 了体外 免疫荧光染色方案，使其适用于不同的物种（小鼠、人类）和组织（皮肤、肠道、肺、肝脏、心脏、椎间盘）。固定和石蜡包埋后，将 3 μm 厚的切片安装到载玻片上。根据改良的染色方案，用髓过氧化物酶 （MPO）、瓜氨酸组蛋白 H3 （H3cit） 和中性粒细胞弹性蛋白酶 （NE） 的一抗对这些样品进行染色。用二抗对载玻片进行染色，并使用宽场荧光显微镜进行检查。根据评估表对结果进行分析，并半定量记录差异。

在这里，我们提出了一种适用于不同组织的优化NET染色方案。我们使用一种新型一抗对 H3cit 进行染色，并使用自发荧光还原剂减少非特异性染色。此外，我们证明了NET染色需要恒定的高温和小心处理样品。

Introduction

Brinkmann 等人于 2004 年首次将中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 可视化为不同于细胞凋亡和坏死的细胞死亡途径1。在该途径中，中性粒细胞将其解凝的染色质释放到细胞外空间，形成覆盖着先前储存在颗粒或胞质溶胶中的抗菌蛋白的大型网状结构。这些抗菌蛋白包括中性粒细胞弹性蛋白酶 （NE）、髓过氧化物酶 （MPO） 和瓜氨酸组蛋白 H3 （H3cit），它们通常用于 NET 的间接免疫荧光检测2。该方法不仅可以鉴定这些蛋白质的定量存在;事实上，它具有专门检测类NET结构的优点。在NET中，上述蛋白质与细胞外DNA共定位，这可以通过每个染色蛋白质和细胞外DNA的荧光信号的重叠来检测。与NET中细胞外DNA和蛋白质共定位引起的重叠信号相反，完整的中性粒细胞没有共定位。在这里，NET 组分通常分别储存在颗粒、细胞核和胞质溶胶3 中。

自首次发现以来，已经表明NET在许多疾病中起着核心作用，特别是那些涉及炎症的疾病。NETs在感染期间通过捕获和杀死血液和组织中的细胞外病原体显示出抗菌功能4,5。然而，NET也与自身免疫性疾病和过度炎症反应有关，如系统性红斑狼疮、风湿性关节炎和过敏性哮喘6,7,8。NETs促进动脉粥样硬化中的血管闭塞和炎症，血小板粘附，并被推测在转移性癌症中发挥作用9,10,11。然而，它们被认为通过降低促炎细胞因子水平而具有抗炎特性12。虽然神经内分泌瘤在更广泛的研究领域越来越受到关注，但强大的神经内分泌瘤检测方法是未来研究的基础。

尽管使用免疫荧光成像对不同组织中的NET进行可视化很复杂并且需要定制，但除了电子显微镜之外，它是目前最著名的可视化NET与细胞之间相互作用的方法之一，主要用于福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）13,14.然而，比较NET成像是困难的，因为不同的实验室使用自己的定制方案。这些方案在抗体、抗原修复或透化方法的使用上有所不同，并且通常针对特定类型的组织进行优化 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ，27.

在 Brinkmann 等人发表了第一项使用免疫荧光可视化 FFPE 组织中 NET 的方法研究后，我们希望针对更广泛的组织和物种优化该协议15。此外，为了建立广泛适用的免疫荧光方案，我们测试了在FFPE组织中使用免疫荧光方法检测NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25，26,27.此外，我们尝试了一种新的 H3cit 抗体用于更特异性的细胞外染色28。我们假设，通过系统地使当前的染色方案适应不同的物种和组织，可以改善体外成像，从而更好地表示局部和全身中性粒细胞和NET之间的相互作用。

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Protocol

这项研究包括来自汉堡国家动物研究局批准的实验的小鼠组织，Behörde für Justiz und Verbraucherschutz，汉堡，德国（73/17,100/17,94/16,109/2018,63/16）。使用的组织是来自化粪池模型的小鼠肺和结肠以及烧伤的皮肤。我们使用了 8 周龄的雄性和雌性小鼠。所有实验均遵循关于保护用于科学目的的动物的欧洲指令 2010/63/EU。匿名的人类样本包括新生儿小肠结肠炎、烧伤皮肤、胆道闭锁、椎间盘炎和心肌的组织。根据汉堡医学研究伦理委员会的说法，这些样本不需要知情同意，但该研究得到了委员会的批准（WF-026/21）。

1. 样品固定

  1. 使用源自 Abu Abed 和 Brinkmann 的以下方案进行样品固定、脱水、石蜡包埋、切片和封片 3,15。
    1. 通过将 40 g 多聚甲醛 （PFA） 溶解在 800 mL Tris 缓冲盐水 （pH 7.4） （TBS） 中来制备 4% 甲醛溶液。
    2. 在通风橱下在60°C下搅拌混合物，直到PFA溶解。将溶液置于室温 （RT），并用 TBS 将体积调节至 1,000 mL。
    3. 将pH值调节至7.4。在4°C下储存2-3周或在-20°C下储存长达1年。
  2. 对于样品固定，将新鲜组织放入TBS缓冲液中，并解剖成小于20 mm x 30 mm x 3 mm的碎片。将组织切片浸入4%多聚甲醛溶液中12-24小时。
    注：原始方案使用2%PFA溶液，固定时间为8-20小时。使用这种方法，一些组织切片在20小时后没有完全固定，因此PFA浓度增加到4%PFA。
  3. 将样品转移到标记的组织处理盒中。使用耐溶剂记号笔或铅笔进行标记。
  4. 通过将盒浸入70%乙醇中1小时开始样品脱水。然后，浸入80%乙醇，90%乙醇，96%乙醇中，并在100%乙醇中浸泡两次，每步持续1小时。
  5. 在100%二甲苯（二甲苯）中浸泡两次，然后在60°C石蜡中浸泡两次，每次浸泡1小时。
  6. 使用嵌入模具进行安装，并在取出模具之前让石蜡固化。
  7. 使用切片机切割3μm厚的组织切片。
  8. 用镊子将切割部分铺设在37°C的水浴中，让它们漂浮在表面上以拉伸组织切割。
  9. 将切片放在粘性载玻片上（材料表），并在40°C加热室中干燥过夜。

2. 样品补水

  1. 对于脱蜡，将载玻片堆叠在载玻片架中，并在二甲苯替代介质柠檬烯（材料表）中浸没两次，每次浸没5分钟，在1：1柠檬烯/乙醇混合物中浸泡一次5分钟。
    注意：柠檬烯在50°C时易燃，会引起过敏反应。在通风橱下使用，戴上护目镜和手套。远离明火。
  2. 通过将载玻片架浸入100%乙醇中两次，一次浸入96%乙醇，90%乙醇，80%乙醇和70%乙醇中，每次浸泡5分钟，使样品在下降乙醇系列中再水化。
  3. 将载玻片架浸入去离子水（去离子水）中5分钟，以清除任何残留的乙醇。

3. 自发荧光阻断和抗原修复

  1. 根据数据表制备pH 6柠檬酸盐目标修复溶液（TRS）（材料表）。该TRS浓缩10倍。因此，用去离子水按 1：10 稀释。在塑料染色罐中预热至96°C。
    注：TRS破坏样品固定过程中形成的亚甲基桥，暴露抗原表位。这使得一抗能够结合其靶抗原。将浓缩的TRS在2-8°C下储存8个月。始终准备新鲜的 TRS。
  2. 将载玻片从载玻片架中取出，然后将它们放入湿室中。将一到两滴自发荧光还原剂（材料表）移液到每个样品上。孵育 5 分钟。
    注：自发荧光还原剂可阻断由内源性荧光团和固定剂引起的固有组织自发荧光。将自发荧光还原剂在室温下储存长达 1 年。
    注意：仅处理小块组织，以避免样品变干或超过孵育时间。
  3. 将载玻片堆叠回载玻片架中，并在60%乙醇中以向上和向下的动作冲洗1分钟，直到所有未使用的自发荧光还原试剂被洗掉。
  4. 将载玻片架浸入去离子水中5分钟。
  5. 为了抗原修复，将载玻片转移到带有预热 TRS 的染色罐中。在96°C的水浴中孵育10分钟。
    注意：如果将TRS预热至96°C并确保在96°C下孵育10分钟，则可以用微波炉或蒸汽锅代替96°C水浴。
  6. 取出染色罐，让它慢慢冷却至室温约60-90分钟。
    注意：该协议可以在此处暂停长达4小时，将载玻片留在TRS中。
  7. 取出 TRS，但将载玻片放在罐子里。用含有0.05%吐温（TBST，pH 7.4）的Tris缓冲盐水冲洗两次，每次3分钟，以洗去任何剩余的TRS残留物。
  8. 对于透化，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备0.2%Triton，pH 7.4，并将其填充到染色罐中以透化样品10分钟。
    注：透化可增强一抗与固定样品中细胞内靶蛋白的结合。
  9. 在TBST中再次冲洗载玻片两次，每次3分钟。
  10. 准备湿室，并放置载玻片。用纸巾擦去载玻片上多余的水。用疏水屏障笔圈出每个样品，以防止抗体溶液流失。
    注意： 不要让样品变干。最好使用小部分。

4. 阻断非特异性抗体结合

  1. 取含有驴血清的即用型封闭液（材料表），吸取一滴到每个样品上。在室温下孵育 30 分钟。
    注：此封闭步骤可最大限度地减少二抗与样品上非特异性结合位点的结合。在阻断这些非特异性表位并应用一抗后，二抗将与一抗结合，不与组织表面相互作用。这种即用型封闭试剂在2-8°C下储存6个月。
  2. 将载玻片的边缘轻敲坚硬的表面，去除载玻片上多余的堵塞溶液。不要冲洗它们。

5. 一抗

  1. 在抗体稀释缓冲液中稀释一抗（材料表）。每个样品使用大约 100 μL 的最终溶液。对于 NE 和 H3cit （R8） 抗体和同质对照，稀释至 5 μg/mL 的浓度。对于MPO和相应的isocontrol，使用10μg/ mL。为每种一抗准备一管，为每种同对照抗体准备一管。
    注意：H3cit （R8）/MPO 或 NE/MPO 及其等对照可以组合用于 NET 染色。对于 H3cit （R8）/MPO 的组合，将 H3cit （R8） 的终浓度稀释至 5 μg/mL，将 MPO 的终浓度稀释至 10 μg/mL，至每个样品的终体积为 100 μL。对于 NE/MPO，将 NE 的终浓度稀释至 5 μg/mL，MPO 的终浓度为 10 μg/mL，每个样品的终体积为 100 μL。对于isocontrol，使用与每种相应抗体相同的浓度。始终对使用的每种抗体使用新的移液器吸头。一抗可在 4 °C 下储存 1-2 周，在 -20 °C 或 -80 °C 下储存长达 1 年。
  2. 在一张载玻片上放置两个样品，一个用于 isocontrol 抗体，另一个用于 MPO/H3cit 或 MPO/NE 抗体稀释。每个样品使用约 100 μL，并将抗体溶液均匀分布。
    注意： 不要让样品变干。注意避免混淆同对照抗体和一抗。
  3. 在4°C的湿室中储存过夜。
  4. 第二天，从载玻片中取出多余的一抗溶液，然后将载玻片堆叠在比色皿中。用TBST冲洗3次，每次5分钟，以洗去剩余的一抗溶液。

6. 二抗

  1. 制备二抗溶液。使用两种不同的荧光二抗：驴-抗山羊用于 MPO 和驴-抗兔用于 H3cit 染色。用抗体稀释缓冲液将每种稀释液稀释至7.5μg/ mL的浓度（材料表）。
    注：对于双染色，使用两种具有不同激发区域和最小光谱重叠的荧光抗体。合并两种二抗，并将每种抗体的终浓度稀释至 7.5 μg/mL，使每个样品的最终体积为 100 μL。保护抗体避光。二抗可在 2-8 °C 下储存 6-8 周，或在 -80 °C 下储存长达 1 年。
  2. 将载玻片保持在湿室中，并在每个样品上加入 100 μL 二抗溶液。让它们在室温下孵育 30 分钟并避光。
  3. 轻拍多余的二抗溶液，然后将载玻片堆叠在载玻片架中。在装有 PBS 的染色罐中浸没 3 次，每次 5 分钟，以洗去任何剩余的未结合抗体。
  4. 制备DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液（材料表），并用去离子水稀释至1μg/ mL的浓度。将载玻片架浸入装有DAPI溶液的染色罐中，并在室温下在黑暗中孵育5分钟。
    注：DAPI用作双链DNA的荧光染料。制备的DAPI溶液可以多次使用。将制备好的DAPI溶液储存在室温下。DAPI浓缩液可在-20°C下储存长达1年。
  5. 将载玻片架浸入装有PBS的染色罐中5分钟，以洗去多余的DAPI溶液。

7. 安装和储存样品，显微镜分析

  1. 用盖玻片和安装介质（材料表）安装样品。
    注意： 仅使用少量封固剂，并用湿纸巾擦去多余的介质。戴上手套，避免意外擦掉盖玻片或载玻片上的任何介质。避免气泡形成，并用棉签轻轻按压盖玻片，以去除载玻片上的任何气泡。
  2. 对于成像，请使用宽视场显微镜或共聚焦显微镜。
    注意： 首先拍摄 isocontrol 的图像。降低荧光滤光片的曝光时间（DAPI的蓝色滤光片除外），直到几乎无法检测到信号。然后，使用此设置检查相应的样本。使用荧光通道寻找可以在每个样品中检测到荧光信号的区域。在拍摄该区域的图像后，程序会生成所有通道的复合图像，并将不同的荧光信号显示为不同颜色的重叠。然后可以进一步分析图像，以便与成像软件（如 ImageJ）进行共定位。
  3. 将载玻片在4°C下储存长达6个月。

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Representative Results

在开始优化方案之前，我们通过在 PubMed 上搜索使用 FFPE 组织对 NET 进行免疫染色的研究并比较其方案，确定了成功染色的关键步骤。最有希望的协议差异被确定为协议优化的关键步骤，而大部分相互对应的步骤没有改变（表1）。

表 1：用于 NET FFPE 免疫染色的 PubMed 研究。 该表显示了所检查研究中免疫染色方案中的变量。所使用的协议被划分为它们的基本步骤，然后相互比较。然后，将具有最有希望的差异的步骤作为优化的关键步骤，并针对我们的方案进行调整。基本对应的步骤没有改变，例如一抗的孵育时间（过夜，4°C）。 请按此下载此表格。

根据我们的研究结果，我们得出结论，选择靶向表位的抗体是第一个关键步骤。至少有 10 种不同的方案使用了 triH3cit 抗体（见 表 1; 一抗柱）。尽管如此，Thålin等人发现，H3cit（R8）克隆对非瓜氨酸化组蛋白的脱靶交叉反应性较小，批间变异性可忽略不计。因此，我们决定将 triH3cit 和 H3cit （R8） 染色结果相互比较28。

四项研究使用了人/小鼠MPO抗体。此外，另外两种方案将MPO（2D4）应用于小鼠组织，MPO（2C7）应用于人体组织（见 表1; 一抗柱）。因此，我们分别比较了用于人体组织的 MPO （2C7） 与人/小鼠 MPO 抗体以及用于小鼠组织的 MPO （2D4） 与人/小鼠 MPO 抗体。使用至少五种不同的抗体检测NE，但其中只有三种在提供的图像中显示出良好的染色结果。然而，市场上已不再有一种抗体，因此我们将来自兔宿主的 NE 抗体与来自小鼠宿主的 NE 抗体进行了比较，用于我们在人体组织中的一系列测试。对于小鼠样本，在这项研究开始时，似乎没有可用且可靠的替代品来替代兔宿主中产生的 NE 抗体。由于一种 NE 和两种 H3cit 抗体来源于同一兔宿主，因此它们不能联合使用该方案进行双重染色。二抗对一抗的恒定区域具有特异性，该恒定区域由其生长的宿主决定。如果使用来自同一宿主的两种一抗，则二抗可能与两种一抗结合，并且染色将是非特异性的。然而，双染色优于单染色，因为可以检测到更多的NET成分并共定位。因此，染色结果会更加具体。因此，我们对 H3cit 和 MPO 进行了双重染色，以获得更可靠的检测方案。

尽管所用抗体相似，但几乎所有方案中抗体的稀释度都不同;例如，对于triH3cit，浓度范围为0.5 μg/mL至20 μg/mL17,18。对于使用的每种抗体，我们尝试了不同的稀释度，并在文献报道的整个范围内获得了令人满意的染色结果。

此外，在一抗的孵育时间（在4°C下过夜）以及二抗的使用和稀释度方面可以发现许多相似之处（见 表1; 孵育一抗柱）。因此，我们没有在测试系列中更改这些步骤，而是根据上述协议执行它们。

根据文献确定的下一个关键步骤是抗原修复。这一步是必不可少的，因为由于福尔马林固定，抗体的表位通过亚甲基桥被掩盖，这可以通过在合适的缓冲液中加热组织切片来逆转29。pH 值为 6 的柠檬酸盐 TRS 和 pH 值为 9 的 EDTA TRS 缓冲液在文献中的使用频率相同，结果相似（见 表 1; TRS 缓冲柱）。因此，我们决定将 pH 值为 6 的柠檬酸盐 TRS 用于我们的测试系列。对于抗原修复，我们测试了两种不同的加热方法：微波（首先在 360 W 下 1 分钟，然后在 90 W 下 9 分钟）和水浴（60 °C 90 分钟，96 °C 10 分钟）。

在文献中显示出一些可变性的最后一步是Triton X-100的透化。这一步需要优化，因为通过洗涤剂处理，细胞膜变得可渗透抗体，细胞内表位可以达到30。以前的方案使用不同的Triton X-100浓度，范围从1%到0.1%（见 表1; 透化柱）。因此，我们尝试了两种Triton X-100浓度（0.2%和0.5%）和一个没有Triton透化的系列。

在确定了这些关键步骤后，我们修改了它们并尝试优化协议。然后根据评估表检查图像，半定量记录差异并进行比较（见 表2）。

表2：优化协议步骤的结果表。 下表显示了调整步骤的结果：自发荧光还原剂、抗原修复和透化。在开始此测试系列之前，我们测试了最佳抗体组合和浓度。在 10 个不同的区域对载玻片进行评估，然后对一个代表性区域进行评分，从 （-） 表示阴性结果到 （++） 表示阳性 NET 结果。部分阳性结果包括非中性粒细胞的较高弥漫背景染色。缩写：n/u = 未使用;- = 阴性结果;+/-部分阳性染色;+ = 中度特异性染色;+ = NET和中性粒细胞的良好染色。请按此下载此表格。

一抗
在调整方案之前，我们试图找到最佳的抗体组合。在这里，triH3cit 比 H3cit （R8） 显示出更多的细胞内组蛋白染色。为了检测NET，我们决定使用H3cit （R8）抗体进行实验方案优化。该抗体仅与细胞外 H3cit 结合，在此浓度下未显示细胞内 H3cit 染色（见 图 1A、B）。

对于MPO染色，我们将人/小鼠MPO抗体与用于人体组织的MPO（2C7）（见图1C，D）和用于小鼠组织的MPO（2D4）（见图1E，F）进行了比较。MPO （2D4） 和 MPO （2C7） 抗体无法对多种组织类型实现一致的染色，而人/小鼠 MPO 可对 MPO 进行可靠、良好的染色。因此，我们选择了人/小鼠MPO作为我们的染色方案。

对于NE，我们在人体组织上尝试了来自小鼠宿主的NE抗体，与来自兔宿主的NE抗体的可靠染色相比，该样本仅在五分之一的样品中显示出NE染色。此外，来自兔宿主的NE抗体适用于人和小鼠组织。（见图1G，H）。

Figure 1
图1：不同组织中的一抗比较。 （A） 用 H3cit （R8） 染色的人新生儿小肠结肠炎 （NEC） 组织（红色）。在这里，只能检测到细胞外信号。（B） 用 triH3cit （R2,8,17） 染色的相同组织（红色）。该抗体通过瓜氨酸化组蛋白（黄色箭头）的强烈细胞内染色产生更广泛的信号。（C，E） 人NEC组织（C）和小鼠扭转组织（E），H3cit（R8）（红色）和小鼠/人MPO（绿色）染色良好。H3cit、MPO 和 DAPI（蓝色）信号共定位表示 NET 形成（白色箭头）。（D，F）相比之下，（D）将MPO（2C7）用于人NEC组织，（F）MPO（2D4）（绿色）用于小鼠扭转组织，无法获得MPO信号。（七） 与来自小鼠宿主的 NE 抗体的 （H） 阴性染色结果相比，来自兔宿主（品红色）的 NE 抗体具有非常强染色的烧伤人皮肤样本。有关同型对照，请参阅补充图 Isocontrol 1。请点击这里查看此图的较大版本.

脱蜡
在这里，二甲苯被柠檬烯取代，与二甲苯相比，柠檬烯显示出更好的组织样品脱蜡效果，背景中的自发荧光较少（见图2A，B）。

自发荧光还原剂
基于苏丹黑的即用型自发荧光还原剂可涂抹 2-20 分钟。在这里，我们应用了 0 分钟、5 分钟和 10 分钟。当不使用封闭时，一些小鼠样品显示出更多的非特异性染色，并且可以达到部分阳性染色（见图2C）。5 min的封闭时间在小鼠肺和皮肤组织中除H3cit和MPO外的所有组织类型中都显示出良好的结果（见表2）。在某些样品中，在封闭时间为10 min时，染色开始变得不那么明亮，因此5 min的时间范围是阻断自发荧光的最佳选择（见图2D，E）。

Figure 2
图2：自发荧光还原剂的脱蜡方法和用法。 （A） 用柠檬烯脱蜡并染色 H3cit（红色）和 MPO（绿色）的人椎间盘炎组织。信号的绞合形成和部分共定位表明存在 NET（白色箭头）。（二） 用二甲苯脱蜡的相同组织样品，产生相似的染色结果，表明广泛使用的二甲苯可以用替代培养基代替。（中至英文） 当使用不同的自发荧光还原剂孵育时间时，诱导脓毒症后的小鼠肺组织显示出不同的NE染色模式（品红色）。在未使用自发荧光还原剂的情况下，图像C仍显示红细胞的轻微背景染色（红色箭头）。相反，图像D显示，在与自发荧光还原剂孵育5分钟后，发出清晰的信号。10分钟后，图像E中的染色质量下降，信号变得不那么明亮。有关同型对照，请参阅补充图 Isocontrol 2。请点击这里查看此图的较大版本.

抗原修复方法
对于NE染色，我们在pH 6柠檬酸盐缓冲液中将样品在微波炉中加热10分钟（首先在360W下加热1分钟，然后在90W下加热9分钟），在96°C的水浴中加热10分钟，或在60°C的水浴中加热90分钟。 在这里，微波和水浴中的较高温度显示出一致的中等到良好的抗原修复（见 图3A）。微波和96°C水浴之间没有发现显着差异（见 表2）。此外，结果表明，在60°C水浴中，只有部分阳性或没有染色（见 图3B）。只有人回肠和人心肌显示出良好的特异性结果。由于60 °C水浴无法实现对NE的充分染色，因此放弃了H3CIT和MPO的60 °C水浴测试系列。

对于用MPO和H3cit进行双染色，我们在pH 6柠檬酸盐缓冲液中在微波炉中加热10分钟（首先在360W下加热1分钟，然后在90W下加热9分钟）或在96°C的水浴中加热10分钟。在这里，两种方法都显示出良好的特异性结果，在96 °C水浴中结果略好（见 图3C）。只有小鼠肺和皮肤组织才能达到中等的总体排名（见 表2）。

然而，在96°C下超过40分钟的孵育时间导致抗体染色强度降低，同时可以观察到更多的背景染色（见 图3D）。

Figure 3
图3：抗原修复方法。 （A）在96°C下孵育10分钟用于热修复时，对NE（品红色）染色的小鼠扭转组织显示出比（B）在60°C水浴中孵育样品90分钟时明显更强的信号。（C）此外，在96°C抗原修复中孵育10分钟也导致H3cit（红色）和MPO（绿色）与联合NET染色（白色箭头）的强信号。丁：然而，将样品煮沸超过 40 分钟会导致细胞外 H3cit 染色的特异性降低，并且没有 MPO 染色。有关同型对照，请参阅补充图 Isocontrol 3。请点击这里查看此图的较大版本.

透化
我们尝试用Triton X-100在两种稀释液（0.2%和0.5%）中透化样品10分钟，并将其与在去离子水中10分钟进行比较。在这里，使用0.2%Triton 10 min在所有组织类型中都取得了良好的结果，尽管与0.5%Triton和去离子水条件相比差异很小（见 表2）。

补充图等值对照 1：图 1 的同型对照。所有图像均显示良好的DAPI（蓝色）染色，但没有荧光抗体信号。这证实了图1中一抗的结合是靶抗原特异性的，而不是非特异性结合或蛋白质相互作用的结果。（A） 用 H3cit （R8） 同对抗体染色的人新生儿小肠结肠炎 （NEC） 组织（红色）。（B） 用 H3cit （R2,8,17） 的同对照抗体染色的 NEC 组织（红色）。（C） NEC 组织 （E） 和用 H3cit （R8）（红色）和小鼠/人 MPO（绿色）的同对照抗体染色的小鼠扭转组织。（D） 用 H3cit （R8）（红色）和 MPO （2C7）（绿色）的同对照抗体染色的 NEC 组织。（F） 用 H3cit （R8）（红色）和 MPO 2D4（绿色）的同对照抗体染色的小鼠扭转组织。 克：用来自兔宿主（品红色）的 NE 抗体的同对抗体染色的烧伤人皮肤样本。（H） 用来自小鼠宿主的 NE 抗体的同对照抗体染色的相同组织（品红色）。请点击这里下载此文件。

补充图Isocontrol 2：图2的同型对照。所有图像均显示良好的DAPI（蓝色）染色，但没有荧光抗体信号。这证实了图2中一抗的特异性结合。由于曝光时间较长，图像C-E仍然显示出一些洋红色的背景染色。然而，图2中的NE信号与背景染色是有区别的。（一） 用柠檬烯脱蜡的人椎间盘炎组织，并用 H3cit （R8）（红色）和小鼠/人 MPO（绿色）的同对抗体染色。（二） 用二甲苯脱蜡并用 H3cit（红色）和 MPO（绿色）的同对照抗体染色的相同组织样品。（三） 用NE同对照抗体（品红色）染色的小鼠肺组织，不使用自发荧光还原剂。（四） 用NE的isocontrol抗体（品红色）染色相同的组织，并用自发荧光还原剂孵育5分钟。（E） 用 NE 的同对照抗体（品红色）染色的相同组织，并用自发荧光还原剂孵育 10 分钟。请点击这里下载此文件。

补充图Isocontrol 3：图3的同型对照。所有图像均显示良好的DAPI（蓝色）染色，但荧光抗体无特异性信号。这证实了图3中一抗的特异性结合。（A） 在 96 °C 下孵育 10 分钟，用 NE 同对抗体（品红色）染色的小鼠扭转组织进行热修复。（B）用NE的同对照抗体（品红色）染色相同的组织，并在60°C水浴中热修复90分钟。（C） 用 H3cit（红色）和 MPO（绿色）的同对照抗体染色的相同组织，并在与 A 中相同的热修复条件下染色。绿点表示聚集的二抗的染色伪影。（D） 用 H3cit（红色）和 MPO（绿色）的同对照抗体染色的相同组织，并在 96 °C 下孵育 40 分钟以进行热回收。请点击这里下载此文件。

补充图Isocontrol 4：图4的同型对照。以下所有等对照都来自与相应的“失败”实验相同的幻灯片。失败的尝试不是故意进行的，因此一些同质对照似乎可用，而样品则不可用。 （A） 用 H3cit（红色）和 MPO（绿色）的同对照抗体染色的 NEC 组织。该样品处理速度更快，不会变干。因此，看不到过多的背景染色。绿色和红色结构是二抗聚集体。（二） 用 NE 同对照抗体（品红色）染色的椎间盘炎组织。在这里，脱蜡是成功的，所以看不到石蜡残留物。（三） 用 H3cit（红色）和 MPO（绿色）的 isocontrol 抗体染色的 NEC 组织。即使使用了相同储存不当的二抗，该同质对照图像也不会进行染色。因此，此图像不能用于评估相应图像的特定绑定。（四） 用 H3cit（红色）和 MPO（绿色）的同对照抗体染色的烧伤人体皮肤。在这里，安装更加仔细，看不到通过气泡散射的光。请点击这里下载此文件。

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Discussion

在这项工作中，我们旨在从实际染色过程开始，调整和优化现有的NET成像方案，以适应更多的组织类型。该方法的第一个关键步骤是选择最合适的抗体。对于NE，我们在人体组织上尝试了来自小鼠宿主的NE抗体，与来自兔宿主的NE相比，该抗体没有显示出可靠的染色。此外，Thålin 等人提出 H3cit （R8） 作为细胞外染色的更具特异性的抗体。我们将该抗体与广泛使用的triH3cit（R2，R8，R17）进行了比较。我们的研究表明，H3cit （R8） 抗体仅针对所用浓度的细胞外信号进行染色，从而更容易识别载玻片上的 NET。这一发现支持了 Thålin 等人的说法，即 H3cit （R8） 克隆可以提供良好的 NET 信号，降低对非瓜氨酸化组蛋白的脱靶交叉反应性28。我们还比较了用于人组织和小鼠组织的MPO抗体进行MPO染色。我们的结果表明，小鼠/人 MPO 抗体显示出更可靠的染色，可以同时用于人和小鼠样本，简化了其在实验室中的使用。因此，我们建议将这种抗体组合 H3cit （R8） 和小鼠/人 MPO 用于未来的研究，并在我们的实验方案中实施。

然而，这种抗体选择的多次染色尝试存在局限性。该方案已修改为使用来自不同宿主的一抗。否则，一个二抗可以与两个一抗结合。H3cit 抗体与 NE 抗体来自同一宿主，因此我们无法将 NE 和 H3cit 一起染色。尽管本研究中没有进行三重染色（NE，H3cit，MPO），但该协议可以作为未来三重染色实验的基础。三重染色或 NE 和 H3cit 双染色的一种可能选择是将其中一种抗体与来自不同宿主的可靠抗体交换。在这种情况下，可能的组合伴侣可能是 Knackstedt 等人使用的来自绵羊的 NE 抗体 （Santa Cruz;sc-55549）[24]。Duler 等人于 2021 年发表了另一种选择，他们使用连续双染色方法，并将来自兔宿主26 的 NE 和 H3cit 相结合。多重染色方法的另一个有前途的应用是区分血管内和血管外神经内分泌瘤的形成。双NET染色可以与额外的血管染色相结合，而不是NET标志物的三重染色。此外，越来越多的研究检查了神经内分泌瘤的血管内和血管外分布，以更多地了解特定疾病（如阿尔茨海默病）的病理机制。Smyth 等人 31 描述了一种类似于我们的有前途且深入的协议，以区分两种可能的定位。他们通过添加生物素化凝集素来标记内皮细胞，并修改了现有的NET染色方案，并使用荧光团偶联的链霉亲和素对凝集素进行免疫荧光染色。通过检查凝集素和NET标志物在同一图像中的共定位，他们能够识别血管内NETs31。在这种情况下，需要进一步的研究来扩大我们协议的应用。

在找到最合适的抗体组合后，下一个关键步骤是引入自发荧光还原剂。外源性因素（例如使用甲醛固定剂固定样品）和内源性因素（例如红细胞）可导致高自发荧光，这使得确定共定位变得困难32.该问题主要发生在蓝色（激发区域：430-480 nm）和绿色荧光光谱（激发区域：500-550 nm）中，当使用相同激发区域的荧光抗体时，可能导致染色结果不确定3.文献报道苏丹黑是减少固有组织自发荧光的有效试剂33.Sudan Black可以使用蓝色或绿色荧光通道获得更清晰的染色结果。该激发区域对于未来的多次染色尝试是必要的，因为使用第四种荧光染料时需要蓝色和绿色通道。我们的研究表明，最佳孵育时间取决于染色过程中使用的组织和抗体的类型。然而，在这项工作中，5 min的自发荧光还原剂通常在所有组织类型上都具有良好的效果，并且具有将样品染成黑色的好处，从而使其更容易在载玻片上看到。这可以防止在染色过程中丢失部分组织，尤其是对于小样本。

该协议成功的另一个重要因素是抗原修复步骤的恒定高温。我们的研究表明，在之前的 15 项研究中，有 10 项使用高于 96 °C 的温度进行抗原修复13、15、16、17、19、21、22、25、26、27。这与我们的结果一致，在96°C水浴或微波炉中孵育样品得到了良好的结果，没有显着差异。尽管如此，我们还是建议使用水浴来均匀分布热量。使用微波炉时，我们发现染色罐顶部和底部之间的缓冲液温度梯度高达5°C。此外，水浴更易于使用，缓冲液沸腾的风险较低。对于透化，我们发现Triton X-100对染色的影响较小。因此，在协议中跳过这一步是可能的，而不会对结果产生不利影响。一般来说，人类样本比小鼠样本给出更好的结果。造成这种情况的一个原因可能是人类的中性粒细胞百分比高于小鼠34,35。此外，小鼠肺样本未显示可见的肉眼炎症和较少的中性粒细胞，而小鼠肠道样本肉眼可见发炎，染色结果良好。因此，我们研究中较低的分数可能是由于低炎症造成的，而不是由于方案没有发挥最佳作用。

对于故障排除，方案中的小错误或未仔细处理样品可能会对染色结果产生巨大影响。我们发现的一个主要问题是样品脱水。在这里，我们发现一次处理超过 10-15 张玻片至关重要，因为每个步骤都很耗时，并且可能导致样品脱水。由于高背景染色和没有可检测到的特异性荧光信号，脱水样品不再可用（见图4A）。此外，在开始染色方案之前，应将样品完全脱蜡。石蜡残留物产生强背景信号，在染色的石蜡中可以看到切割线（见图4B）。此外，经过 20 多次冻融循环后，未检测到 MPO 二抗的信号（见图 4C）。另一个对图像质量有很大影响的重要步骤是处理最后的安装步骤。在这项工作中，盖玻片下的气泡导致荧光信号散射，从而导致图像模糊（见图4D）。

Figure 4
图 4：故障排除提示。 （A） 此面板显示了样品干涸的结果。纯红色背景染色阻碍了对样品的任何评估。（二） 在这里，红色箭头表示脱蜡不充分后残留的石蜡，其特征是波纹状外观。这些残余物会导致高背景信号和低质量的图像。（三） 抗体储存不足或冻融循环超过 20 次会导致二抗聚集（绿色箭头）且无法与 MPO 结合。（四） 安装不小心会导致气泡，从而导致荧光灯散射（蓝色箭头）。这会显著影响图像质量，尤其是当散射使目标模糊时。有关同型对照，请参阅补充图 Isocontrol 4。请点击这里查看此图的较大版本.

尽管神经内分泌瘤在科学研究中越来越受欢迎，但仍然没有足够的研究关注神经内分泌瘤检测方法3,13,17,26。据我们所知，我们提出了第一项研究，比较了来自不同研究的方案，用于FFPE组织中NET的免疫荧光成像。先前发表的定制方案在抗体或抗原修复方法上有所不同，并且通常仅针对一种组织类型设计，这使得比较NET成像结果更加困难。因此，在这项研究中，我们确定了关键步骤并建立了适用于不同小鼠和人体组织的方案。我们通过使用一种新的一抗进行 H3cit 染色并用自发荧光还原剂减少背景染色来实现这一目标。此外，我们表明恒定的高温至关重要，仔细处理样品是成功进行NET染色的基础。因此，本研究为制定普遍适用的NET染色方案提供了基本步骤。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究由德国研究学会（BO5534）创立。我们感谢 Antonia Kiwitt、Moritz Lenz、Johanna Hagens、Annika Heuer 博士和 PD Ingo Königs 博士为我们提供样品。此外，作者还感谢UKE显微镜成像设施（UKE医学院核心设施）的团队对免疫荧光显微镜的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
         Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg abcam Ab 68672  1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg abcam Ab 5103 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg abcam Ab 25989 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg abcam Ab 90810 1:50
Axiovision Microscopy Software  Zeiss 4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml GeneTex  GTX30972
Coverslips Marienfeld 0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) Dako S2369
DAPI 25 mg Roth 6335.1 1:25000
DCS antibody dilution 500 mL DCS diagnostics DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3 JacksonImmunoResearch 705-165-147 1:200
Donkey anti rabbit AF647 JacksonImmunoResearch 711-605-152 1:200
Donkey anti rabbit Cy3 JacksonImmunoResearch 711-165-152 1:200
Fluoromount-G Mounting Medium Invitrogen 00-4958-02
Glass slide rack Roth H552.1
Human/Mouse MPO Antibody R&D Systems AF 3667  1:20
Hydrophobic Pen KISKER MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg abcam Ab 37415 1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml Maxvision MB-L
Microscopy camera Zeiss AxioCamHR3
Microwave Bosch HMT84M421
Mouse IgG1 negative control Dako X0931 Aglient 1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control R&D Systems AB-108-C  1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x) Sigma-Aldrich P-3813
PMP staining jar Roth 2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg abcam Ab 219406 1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg abcam Ab 172730 1:300
ROTI Histol Roth  6640
SuperFrost Plus slides R. Langenbrinck 03-0060
TBS Tris buffered saline (x10) Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Water bath Memmert 830476
Water bath rice cooker reishunger RCP-30
Wet chamber Weckert Labortechnik 600016
Zeiss Widefield microscope Zeiss Axiovert 200M

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References

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Tags

免疫荧光成像、中性粒细胞胞外陷阱、神经内分泌瘤、细菌感染、创伤性组织损伤、自身免疫性疾病、无菌炎症、双链 DNA 丝、组蛋白、抗菌蛋白、病原体、稳态调节、血小板粘附、凝血、败血症、自身免疫性疾病、治疗干预、电子显微镜检查、染色方法、抗体、自发荧光还原剂、抗原修复方法、透化

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 09/29/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:

Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

人和小鼠组织中性粒细胞胞外陷阱的免疫荧光成像
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Schoenfeld, L., Appl, B.,… More

Schoenfeld, L., Appl, B., Pagerols-Raluy, L., Heuer, A., Reinshagen, K., Boettcher, M. Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (198), e65272, doi:10.3791/65272 (2023).

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