Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65272
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

ERRATUM NOTICE

Summary

מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים (NETs) קשורות למחלות שונות, ואימונופלואורסנציה משמשת לעתים קרובות להדמיה שלהן. עם זאת, ישנם פרוטוקולי צביעה שונים, ובמקרים רבים, רק סוג אחד של רקמה נבדק. כאן, אנו קובעים פרוטוקול ישים באופן כללי להכתמת רשתות בעכבר וברקמות אנושיות.

Abstract

מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) משתחררות על ידי נויטרופילים כתגובה לזיהום חיידקי או נזק טראומטי לרקמות, אך גם ממלאות תפקיד במחלות אוטואימוניות ודלקות סטריליות. הם מבנים דמויי רשת המורכבים מחוטי דנ"א דו-גדיליים, היסטונים וחלבונים אנטי-מיקרוביאליים. לאחר שחרורם, NETs יכולים ללכוד ולהרוג פתוגנים חוץ-תאיים בדם וברקמות. יתר על כן, NETs משתתפים בוויסות הומיאוסטטי על ידי גירוי הידבקות טסיות וקרישה. עם זאת, הייצור המווסת של NETs נקשר גם עם מחלות שונות, כולל אלח דם או הפרעות אוטואימוניות, מה שהופך אותם למטרה מבטיחה להתערבות טיפולית. מלבד מיקרוסקופ אלקטרונים, הדמיה של NETs באמצעות הדמיה אימונופלואורסצנטית היא כיום אחת השיטות הידועות היחידות להדגמת אינטראקציות NET ברקמות. לכן, נעשה שימוש בשיטות צביעה שונות כדי להמחיש NETs. בספרות מתוארים פרוטוקולי צביעה שונים, וזיהינו ארבעה מרכיבים עיקריים המראים שונות גבוהה בין פרוטוקולים: (1) סוגי הנוגדנים שבהם נעשה שימוש, (2) שימוש בחומרים מפחיתי פלואורסצנטיות אוטופלואורסצנטית, (3) שיטות שליפת אנטיגן, ו-(4) חלחול. לכן, פרוטוקולי צביעה אימונופלואורסצנטית במבחנה הותאמו ושופרו באופן מערכתי בעבודה זו כדי להפוך אותם לישימים עבור מינים שונים (עכבר, אדם) ורקמות (עור, מעי, ריאות, כבד, לב, דיסק בעמוד השדרה). לאחר קיבוע ושיבוץ פרפין, חלקים בעובי 3 מיקרומטר הותקנו על מגלשות. דגימות אלה הוכתמו בנוגדנים ראשוניים עבור myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit) ו neutrophil elastase (NE) על פי פרוטוקול צביעה שונה. השקפים הוכתמו בנוגדנים משניים ונבדקו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב. התוצאות נותחו על פי דף הערכה, וההבדלים נרשמו באופן כמותי למחצה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול צביעת NET מותאם לרקמות שונות. השתמשנו בנוגדן ראשוני חדשני כדי להכתים עבור H3cit והפחתנו כתמים לא ספציפיים עם חומר להפחתת פלואורסצנטיות אוטופלואורסצנטית. יתר על כן, הוכחנו כי צביעת רשת דורשת טמפרטורה גבוהה קבועה וטיפול זהיר בדגימות.

Introduction

מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) הודגמו לראשונה על ידי ברינקמן ועמיתיו כמסלול של מוות תאי שונה מאפופטוזיס ונמק בשנת 20041. במסלול זה, נויטרופילים משחררים את הכרומטין המעובה שלהם לתוך החלל החוץ-תאי כדי ליצור מבנים גדולים דמויי רשת המכוסים בחלבונים אנטי-מיקרוביאליים שהיו מאוחסנים בעבר בגרגירים או בציטוזול. חלבונים אנטי-מיקרוביאליים אלה כוללים אלסטאז נויטרופילים (NE), מיאלופרוקסידז (MPO) והיסטון ציטרוליניציה H3 (H3cit), המשמשים בדרך כלל לזיהוי עקיף של NETs2 באימונופלואורסנציה. שיטה זו לא רק מזהה את הנוכחות הכמותית של חלבונים אלה; ואכן, יש לו את היתרון של זיהוי ספציפי מבנים דמויי NET. ב-NETs, החלבונים שהוזכרו מתמקמים יחד עם דנ"א חוץ-תאי, אשר יכול להיות מזוהה על ידי חפיפה של אותות הפלואורסצנטיות של כל חלבון מוכתם והדנ"א החוץ תאי. בניגוד לאותות החופפים הנובעים מדנ"א חוץ-תאי וקולוקליזציה של חלבונים ב-NETs, נויטרופילים שלמים אינם מראים לוקליזציה משותפת. כאן, רכיבי NET מאוחסנים בדרך כלל בנפרד בגרגירים, גרעינים, וציטוזול3.

מאז גילוים הראשון, הוכח כי NETs ממלאים תפקיד מרכזי במחלות רבות, במיוחד אלה הכרוכות בדלקת. NETs מראים תפקודים אנטי-מיקרוביאליים במהלך זיהום באמצעות לכידה והרג של פתוגנים חוץ-תאיים בדם וברקמות 4,5. עם זאת, NETs נקשרו גם למחלות אוטואימוניות ולתגובות היפר-דלקתיות, כמו זאבת אדמנתית מערכתית, דלקת מפרקים שגרונית ואסתמה אלרגית 6,7,8. NETs מקדמים חסימת כלי דם ודלקת בטרשת עורקים, הידבקות טסיות, ומשערים כי הם ממלאים תפקיד בסרטן גרורתי 9,10,11. עם זאת, מאמינים שיש להם תכונות אנטי דלקתיות על-ידי הפחתת רמות הציטוקינים מעודדי דלקת12. בעוד NETs צוברים עניין רב יותר בתחום רחב יותר של מחקר, שיטת זיהוי NET חזקה היא בסיסית למחקר עתידי.

אף על פי שהדמיה של NETs ברקמות שונות באמצעות הדמיה אימונופלואורסצנטית היא מורכבת ודורשת התאמה אישית, מלבד מיקרוסקופ אלקטרונים, היא כיום אחת השיטות הידועות ביותר להמחשת האינטראקציות בין NETs ותאים, והיא משמשת בעיקר ברקמות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE)13,14. עם זאת, השוואת הדמיה נטו קשה, שכן מעבדות שונות משתמשות בפרוטוקולים מותאמים אישית משלהן. פרוטוקולים אלה נבדלים זה מזה בשימוש שלהם בנוגדנים, בשליפת אנטיגן או בשיטת החדירה, ולעתים קרובות הם מותאמים לסוג מסוים של רקמה 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.

לאחר שברינקמן ועמיתיו פרסמו את המחקר המתודי הראשון באמצעות הדמיה אימונופלואורסצנטית של NETs ברקמת FFPE, רצינו למטב פרוטוקול זה עבור מגוון רחב יותר של רקמות ומינים15. בנוסף, כדי לבסס פרוטוקול אימונופלואורסצנטי ישים באופן רחב, בדקנו פרוטוקולים שונים ששונו ממחקרים שהשתמשו בשיטות אימונופלואורסצנטיות ברקמת FFPE כדי לזהות NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. יתר על כן, ניסינו נוגדן H3cit חדש עבור צביעה חוץ-תאית ספציפיתיותר 28. אנו משערים כי על ידי התאמה שיטתית של פרוטוקולי הצביעה הנוכחיים למינים ולרקמות שונים, ניתן לשפר את ההדמיה במבחנה, וכתוצאה מכך לייצג טוב יותר את האינטראקציה בין נויטרופילים ו- NETs הן מקומית והן מערכתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה כלל רקמות עכבר שמקורן בניסויים שאושרו על ידי המנהל הממלכתי של המבורג לחקר בעלי חיים, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, המבורג, גרמניה (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). הרקמות ששימשו היו ריאות עכברים ומעי גס ממודל ספיגה ועור שרוף. השתמשנו בעכברים זכרים ונקבות בני 8 שבועות. הדירקטיבה האירופית 2010/63/EU בנושא הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות בוצעה עבור כל הניסויים. הדגימות האנושיות האנונימיות כללו רקמות מדלקת מעיים בילוד, עור שרוף, אטרזיה של המרה, ספונדילודיסטיטיס ושריר הלב. על פי ועדת האתיקה של המחקר הרפואי של המבורג, הדגימות לא היו זקוקות להסכמה מדעת, אך המחקר אושר על ידי הוועדה (WF-026/21).

1. קיבוע לדוגמה

  1. השתמש בפרוטוקול הבא הנגזר מאבו עבד וברינקמן לקיבוע דגימה, התייבשות, הטבעה של פרפין, חתך והרכבה 3,15.
    1. הכינו תמיסת פורמלדהיד 4% על ידי המסת 40 גרם של פרפורמלדהיד (PFA) ב-800 מ"ל של מלח חוצץ טריס, pH 7.4 (TBS).
    2. ערבבו את התערובת בטמפרטורה של 60°C מתחת למכסה אדים עד שה-PFA יתמוסס. הביאו את התמיסה לטמפרטורת החדר (RT), וכווננו את עוצמת הקול עם TBS ל-1,000 מ"ל.
    3. כוונן את ה- pH ל- 7.4. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך 2-3 שבועות או בטמפרטורה של -20°C למשך עד שנה.
  2. לקיבוע דגימה, מקם רקמה טרייה במאגר TBS וגזור לחתיכות קטנות מ- 20 מ"מ x 30 מ"מ x 3 מ"מ. לטבול את חלקי הרקמה בתמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך 12-24 שעות.
    הערה: הפרוטוקול המקורי השתמש בתמיסת PFA של 2% וזמן קיבוע של 8-20 שעות. בשיטה זו, חלק מקטעי הרקמה לא היו מקובעים לחלוטין לאחר 20 שעות, ולכן ריכוז PFA הוגדל ל 4% PFA.
  3. העבר את הדגימות לקלטות עיבוד רקמות מסומנות. השתמשו בסמנים או עפרונות עמידים בפני ממס לתיוג.
  4. התחל את התייבשות הדגימה על ידי טבילה ואז קלטות באתנול 70% למשך שעה אחת. לאחר מכן, יש לטבול ב-80% אתנול, 90% אתנול, 96% אתנול ופעמיים ב-100% אתנול, כאשר כל שלב נמשך שעה אחת.
  5. יש לטבול פעמיים ב-100% קסילן (דימתילבנזן) ולאחר מכן פעמיים בפרפין ב-60°C למשך שעה אחת בכל פעם.
  6. השתמשו בתבניות הטבעה להרכבה, ותנו לפרפין להתמצק לפני הסרת התבנית.
  7. השתמש מיקרוטום לחיתוך קטעי רקמה בעובי 3 מיקרומטר.
  8. השתמש בפינצטה כדי להניח את החלקים החתוכים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, ותן להם לצוף על פני השטח כדי למתוח את חתכי הרקמות.
  9. הניחו את החלקים על מגלשות זכוכית דביקים (טבלה של חומרים), ותנו להם להתייבש למשך הלילה בתא חום של 40 מעלות צלזיוס.

2. התייבשות מדגם

  1. להסרת פרפיניזציה, ערמו את המגלשות במדף שקופיות, וטבלו פעמיים במשך 5 דקות כל אחת בלימונן בינוני (טבלת חומרים) עם תחליף קסילן ופעם אחת למשך 5 דקות בתערובת לימונן/אתנול ביחס 1:1.
    אזהרה: לימונן דליק ב-50°C ועלול לגרום לתגובות אלרגיות. יש להשתמש מתחת למכסה מנוע עם הגנה על העיניים וכפפות. יש להרחיק מאש גלויה.
  2. התייבשו מחדש את הדגימות בסדרת אתנול יורדת על ידי טבילת מדף השקופיות פעמיים ב-100% אתנול ופעם אחת ב-96% אתנול, 90% אתנול, 80% אתנול ו-70% אתנול למשך 5 דקות כל אחת.
  3. יש לטבול את מדף המגלשה למשך 5 דקות במים נטולי יונים, כדי לנקות את שאריות האתנול.

3. חסימת אוטופלואורסנציה ושליפת אנטיגן

  1. הכן תמיסת אחזור מטרות ציטראט pH 6 (TRS) (טבלת חומרים) בהתאם לגליון הנתונים. TRS זה מרוכז 10 פעמים. לכן, לדלל 1:10 עם מים DI. מחממים מראש בצנצנת פלסטיק ל-96°C.
    הערה: TRS שובר את גשרי המתילן שנוצרו במהלך קיבוע הדגימה כדי לחשוף את אפיטופי האנטיגן. זה מאפשר לנוגדנים הראשוניים לקשור את אנטיגן המטרה שלהם. יש לאחסן TRS מרוכז בטמפרטורה של 2-8°C למשך 8 חודשים. הכינו תמיד TRS טרי.
  2. הוציאו את המגלשות ממדף המגלשות והניחו אותן בתא רטוב. פיפטה טיפה אחת או שתיים של חומר מקטין אוטופלואורסצנטי (טבלה של חומרים) על כל דגימה. דוגרים במשך 5 דקות.
    הערה: החומר המפחית אוטופלואורסצנטיות חוסם את האוטופלואורסצנטיות הטבועה ברקמה הנגרמת על ידי פלואורופורים וקיבועים אנדוגניים. אחסן את הסוכן המפחית פלואורסצנטיות אוטומטית ב- RT למשך עד שנה אחת.
    הערה: יש לעבוד רק עם חלקים קטנים של רקמות כדי למנוע התייבשות של הדגימות או חריגה מזמן הדגירה.
  3. ערמו את המגלשות בחזרה למדף השקופיות, ושטפו במשך דקה אחת באתנול 60% בתנועה כלפי מעלה ומטה עד שכל המגיב מפחית הפלואורסצנטיות שלא נעשה בו שימוש נשטף.
  4. טבלו את מדף המגלשה למשך 5 דקות במי DI.
  5. לשליפת אנטיגן, העבירו את המגלשות לצנצנת צביעה עם TRS שחומם מראש. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורה של 96 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    הערה: ניתן להחליף את אמבט המים בטמפרטורה של 96 מעלות צלזיוס במיקרוגל או בסיר אדים אם ה-TRS מחומם מראש ל-96 מעלות צלזיוס ומובטח 10 דקות של זמן דגירה ב-96 מעלות צלזיוס.
  6. הוציאו את צנצנת הכתמים החוצה, ותנו לה להתקרר באיטיות למשך כ-60-90 דקות.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן למשך עד 4 שעות, ולהשאיר את השקופיות ב- TRS.
  7. הסר את TRS, אך שמור את המגלשות בצנצנת. יש לשטוף פעמיים במי מלח חוצצים עם 0.05% טווין (TBST, pH 7.4) במשך 3 דקות כל אחד כדי לשטוף את שאריות TRS שנותרו.
  8. לחדירה, הכינו 0.2% טריטון במי מלח חוצצי פוספט (PBS), pH 7.4, ומלאו אותו בצנצנת הצביעה כדי לחדור את הדגימות למשך 10 דקות.
    הערה: חדירות משפרת את הקישור של הנוגדנים הראשוניים עם חלבוני המטרה התוך-תאיים בדגימות הקבועות.
  9. שטפו את המגלשות שוב פעמיים ב-TBST במשך 3 דקות בכל פעם.
  10. הכינו את התא הרטוב, והניחו מגלשות. נגבו את עודפי המים משקופיות בעזרת רקמות נייר. הקף כל דגימה בעט מחסום הידרופובי כדי למנוע מתמיסת הנוגדנים לברוח.
    הערה: אין לתת לדגימות להתייבש. עדיף לעבוד עם קטעים קטנים.

4. חסימת קשירת נוגדנים לא ספציפיים

  1. קחו תמיסת חסימה מוכנה לשימוש עם נסיוב חמורים (Table of Materials), ופיפטה טיפה אחת על כל דגימה. דגירה במשך 30 דקות ב- RT.
    הערה: שלב חסימה זה ממזער את הקישור של הנוגדן המשני לאתרי קשירה לא ספציפיים בדגימה. לאחר חסימת אפיטופים לא ספציפיים אלה והחלת הנוגדן הראשוני, הנוגדן המשני ייקשר לנוגדן הראשוני ולא יתקשר עם פני השטח של הרקמה. מגיב חוסם מוכן לשימוש זה מאוחסן ב 2-8 ° C במשך 6 חודשים.
  2. הסר פתרון חסימת עודפים מהשקופיות על-ידי הקשה על קצה המגלשות על משטח קשיח. אין לשטוף אותם.

5. נוגדן ראשוני

  1. דילול נוגדנים ראשוניים במאגר דילול נוגדנים (טבלת חומרים). השתמש בערך 100 μL של הפתרון הסופי עבור כל דגימה. עבור נוגדן NE ו- H3cit (R8) ואיזוקונטרול, יש לדלל לריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל. עבור MPO ואיזוקונטרול תואם, השתמש ב- 10 מיקרוגרם/מ"ל. הכינו צינורית אחת לכל נוגדן ראשוני וצינורית אחת לכל נוגדן איזוקונטרול.
    הערה: ניתן לשלב H3cit (R8)/MPO או NE/MPO והאיזוקונטרולים שלהם לצביעת NETs. עבור השילוב של H3cit (R8)/MPO, יש לדלל לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל עבור H3cit (R8) ו-10 מיקרוגרם/מ"ל עבור MPO לנפח סופי של 100 μL לדגימה. עבור NE/MPO, יש לדלל לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל עבור NE ו-10 מיקרוגרם/מ"ל עבור MPO לנפח סופי של 100 מיקרוליטר לדגימה. עבור isocontrol, להשתמש באותו ריכוז כמו עבור כל נוגדן המתאים. השתמש תמיד בקצה פיפטה חדש עבור כל נוגדן בשימוש. נוגדנים ראשוניים ניתן לאחסן ב 4 ° C במשך 1-2 שבועות וב -20 ° C או -80 ° C עד 1 שנה.
  2. עם שתי דגימות בשקופית אחת, השתמש באחת עבור נוגדני איזוקונטרול ואחת עבור דילול נוגדני MPO/H3cit או MPO/NE. יש להשתמש בכ-100 מיקרוליטר לכל דגימה, ולפזר את תמיסת הנוגדנים באופן שווה.
    הערה: אין לאפשר לדגימות להתייבש. היזהר להימנע מערבוב של איזוקונטרול ונוגדנים ראשוניים.
  3. יש לאחסן בתא רטוב למשך הלילה ב-4°C.
  4. למחרת, הקש על תמיסת הנוגדנים הראשונית העודפת מהשקפים, וערם את השקופיות בקובט. יש לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות בכל פעם עם TBST כדי לשטוף את תמיסת הנוגדנים העיקרית שנותרה.

6. נוגדן משני

  1. הכן את פתרון הנוגדנים המשני. השתמש בשני נוגדנים משניים פלואורסצנטיים שונים: חמור-אנטי-עז עבור MPO וחמור-אנטי-ארנב עבור צביעת H3cit. לדלל כל אחד מהם לריכוז של 7.5 מיקרוגרם/מ"ל באמצעות חיץ דילול נוגדנים (טבלה של חומרים).
    הערה: עבור צביעה כפולה, השתמש בשני נוגדנים פלואורסצנטיים עם אזורי עירור שונים וחפיפה ספקטרלית מינימלית. יש לשלב את שני הנוגדנים המשניים, ולדלל לריכוז סופי של 7.5 מיקרוגרם/מ"ל עבור כל נוגדן לקבלת נפח סופי של 100 מיקרוליטר לדגימה. להגן על הנוגדנים מפני אור. הנוגדנים המשניים יכולים להיות מאוחסנים ב 2-8 ° C במשך 6-8 שבועות או ב -80 ° C עד 1 שנה.
  2. שמור את המגלשות בתא הרטוב, והוסף 100 μL של תמיסת הנוגדנים המשנית לכל דגימה. תן להם לדגור במשך 30 דקות ב RT מוגן מפני אור.
  3. הקש על תמיסת הנוגדנים המשנית העודפת וערם את השקופיות במדף השקופיות. יש לטבול שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת בצנצנת מכתימה מלאה ב-PBS כדי לשטוף את כל הנוגדנים הלא קשורים שנותרו.
  4. הכינו תמיסת DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindol) (טבלת חומרים), ודללו לריכוז של 1 מיקרוגרם/מ"ל עם מי DI. השקיעו את מדף המגלשות בצנצנת צביעה עם תמיסת DAPI, ודגרו במשך 5 דקות ב-RT בחושך.
    הערה: DAPI משמש ככתם פלואורסצנטי עבור DNA דו-גדילי. ניתן להשתמש בפתרון DAPI מוכן מספר פעמים. אחסן את פתרון DAPI המוכן ב- RT. ניתן לאחסן את תרכיז DAPI בטמפרטורה של -20°C למשך עד שנה.
  5. השקיעו את מדף המגלשות למשך 5 דקות בצנצנת מכתימה עם PBS כדי לשטוף את עודפי תמיסת DAPI.

7. הרכבה ואחסון הדגימות, ניתוח מיקרוסקופי

  1. הר את הדגימות עם כיסויים ואמצעי הרכבה (טבלה של חומרים).
    הערה: יש להשתמש רק בכמויות קטנות של אמצעי הרכבה ולנגב את עודפי המדיום ברקמות רטובות. לבשו כפפות, והימנעו מנגוב בטעות של כל מדיום מהכיסויים או המגלשות. הימנעו מהיווצרות בועות, והשתמשו במקלוני צמר גפן כדי ללחוץ בעדינות על הכיסויים כדי להסיר בועות מהמגלשות.
  2. להדמיה, השתמש במיקרוסקופ שדה רחב או במיקרוסקופ קונפוקלי.
    הערה: צלם תחילה תמונה של האיזוקונטרול. קצר את זמן החשיפה של מסנני הפלואורסצנטיות (למעט המסנן הכחול עבור DAPI) עד שכמעט ולא ניתן יהיה לזהות אות. לאחר מכן, השתמש בהגדרה זו כדי לבחון את הדגימות המתאימות. חפש אזורים שבהם ניתן לזהות אות פלואורסצנטי בכל דגימה בודדת באמצעות ערוץ הפלואורסצנטי. לאחר צילום תמונה של האזור, התוכנית יוצרת תמונה מורכבת של כל הערוצים ומציגה את אותות הפלואורסצנטיות השונים כחפיפה של צבעים שונים. לאחר מכן ניתן להמשיך לנתח את התמונה לצורך לוקליזציה משותפת עם תוכנות הדמיה כגון ImageJ.
  3. אחסן את המגלשות בטמפרטורה של 4°C למשך עד 6 חודשים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לפני שהתחלנו באופטימיזציה של הפרוטוקולים שלנו, זיהינו שלבים מרכזיים לצביעה מוצלחת על ידי חיפוש PubMed עבור מחקרים שהשתמשו ברקמת FFPE עבור צביעה חיסונית של NETs והשווינו את הפרוטוקולים שלהם. הבדלי הפרוטוקול המבטיחים ביותר זוהו כשלבי המפתח למיטוב הפרוטוקול, בעוד שצעדים שרובם תאמו זה את זה לא שונו (טבלה 1).

טבלה 1: מחקר PubMed עבור FFPE immunostaining של NETs. טבלה זו מציגה את המשתנים בפרוטוקול החיסוניזציה במחקרים שנבדקו. הפרוטוקולים שבהם נעשה שימוש חולקו לצעדים המהותיים שלהם ולאחר מכן הושוו זה לזה. הצעדים עם ההבדלים המבטיחים ביותר נלקחו לאחר מכן כשלבי המפתח לאופטימיזציה והותאמו לפרוטוקול שלנו. צעדים שלרוב התאימו זה לזה לא השתנו, כמו זמן הדגירה של הנוגדן הראשוני (לילה, 4 מעלות צלזיוס). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

בהתבסס על הממצאים שלנו, הגענו למסקנה שהנוגדנים שנבחרו כדי לתקוף את האפיטופים היו הצעד הקריטי הראשון. לפחות 10 פרוטוקולים שונים השתמשו בנוגדן triH3cit (ראה טבלה 1; עמודת נוגדנים ראשונית). אף על פי כן, Thålin et al. מצאו כי השיבוט H3cit (R8) הציג פחות תגובתיות צולבת מחוץ למטרה להיסטונים שאינם ציטרולינציה והראו שונות זניחה בין מגרשים. לכן, החלטנו להשוות את תוצאות הצביעה triH3cit ו- H3cit (R8) זו עם זו28.

ארבעה מחקרים השתמשו בנוגדן MPO אנושי/עכברי. יתר על כן, שני פרוטוקולים אחרים החילו MPO (2D4) עבור רקמת עכבר ו- MPO (2C7) עבור רקמה אנושית (ראה טבלה 1; עמודת נוגדנים ראשונית). לכן, השווינו בנפרד MPO (2C7) עם נוגדן MPO אנושי/עכברי עבור רקמות אנושיות ו- MPO (2D4) עם נוגדן MPO אנושי/עכברי עבור רקמות עכבר. NE זוהה באמצעות לפחות חמישה נוגדנים שונים, אך רק שלושה מהם הראו תוצאות צביעה טובות בתמונות שסופקו. עם זאת, נוגדן אחד כבר לא היה זמין בשוק, ולכן השווינו את נוגדן NE ממארח ארנב עם נוגדן ממארח עכבר עבור סדרת הבדיקות שלנו ברקמות אנושיות. עבור דגימות עכברים, נראה כי לא הייתה חלופה זמינה ואמינה לנוגדן NE שהועלה בפונדקאי ארנב בתחילת מחקר זה. מכיוון שנוגדנים NE אחד ושני נוגדני H3cit נגזרים מאותו פונדקאי ארנב, לא ניתן לשלב אותם לצביעה כפולה עם פרוטוקול זה. הנוגדן המשני הוא ספציפי לאזור הקבוע של הנוגדן הראשוני, אשר נקבע על ידי המארח שבו הוא גדל. אם משתמשים בשני נוגדנים ראשוניים שמקורם באותו מארח, הנוגדן המשני יכול להיקשר לשני הנוגדנים הראשוניים, והכתמים לא יהיו ספציפיים. עם זאת, צביעה כפולה עדיפה על צביעה בודדת מכיוון שניתן לזהות יותר רכיבי NET ולבצע לוקליזציה משותפת. לכן, תוצאת הצביעה תהיה ספציפית יותר. כתוצאה מכך, הכתמנו פעמיים עבור H3cit ו- MPO כדי להשיג פרוטוקול זיהוי חזק יותר.

למרות הדמיון בנוגדנים בהם נעשה שימוש, הדילול של הנוגדנים השתנה כמעט בכל הפרוטוקולים; לדוגמה, עבור triH3cit, טווח הריכוז היה בין 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ל 20 מיקרוגרם / מ"ל17,18. עבור כל נוגדן שנעשה בו שימוש, ניסינו דילולים שונים והשגנו תוצאות צביעה משביעות רצון בכל הטווח שדווח בספרות.

יתר על כן, ניתן למצוא קווי דמיון רבים בזמן הדגירה של הנוגדן הראשוני (לילה ב 4 מעלות צלזיוס) ובשימוש ודילול של הנוגדן המשני (ראה טבלה 1; עמודת נוגדנים ראשונית דגירה). לכן, לא שינינו שלבים אלה בסדרת הבדיקות שלנו וביצענו אותם בהתאם לפרוטוקול המתואר לעיל.

השלב הקריטי הבא שנקבע מהספרות היה שליפת האנטיגן. שלב זה חיוני מכיוון שבשל קיבוע פורמלין, האפיטופים של הנוגדנים מוסווים באמצעות גשרי מתילן, אשר ניתן להפוך על ידי חימום קטע הרקמה בחיץ מתאים29. ציטראט TRS ב-pH 6 וחיץ EDTA TRS ב-pH 9 שימשו באותה תדירות בספרות ונתנו תוצאות דומות (ראו טבלה 1; עמודת מאגר TRS). לכן, החלטנו על pH 6 ציטראט TRS עבור סדרת הבדיקה שלנו. לצורך שליפת אנטיגן, בדקנו שתי שיטות חימום שונות: מיקרוגל (תחילה דקה אחת ב-360 ואט ולאחר מכן 9 דקות ב-90 ואט) ואמבט מים (60 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות, 96 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות).

השלב האחרון שהראה שונות מסוימת בספרות היה החדירות עם Triton X-100. שלב זה דרש אופטימיזציה מכיוון שעם טיפול בחומרי ניקוי, קרום התא הופך חדיר לנוגדנים, וניתן להגיע לאפיטופים תוך תאיים30. הפרוטוקולים הקודמים השתמשו בריכוזים שונים של טריטון X-100 שנעו בין 1% ל-0.1% (ראו טבלה 1; עמודת חלחול). לכן, ניסינו שני ריכוזי טריטון X-100 (0.2% ו-0.5%) וסדרה אחת ללא חדירות טריטון.

לאחר זיהוי שלבי מפתח אלה, שינינו אותם וניסינו לייעל את הפרוטוקול. לאחר מכן נבדקו התמונות על פי דף הערכה, וההבדלים תועדו כמותית למחצה והושוו (ראו טבלה 2).

טבלה 2: טבלת תוצאות למיטוב שלבי הפרוטוקול. טבלה זו מציגה את התוצאות עבור השלבים המותאמים: סוכן מפחית אוטופלואורסצנטיות, אחזור אנטיגן וחדירות. לפני תחילת סדרת בדיקות זו, בדקנו את שילוב הנוגדנים והריכוז הטובים ביותר. השקפים הוערכו ב-10 אזורים שונים, ולאחר מכן אזור מייצג אחד קיבל ניקוד מ-(-) עבור תוצאה שלילית ל-(++) עבור תוצאה חיובית המכילה NET. התוצאות החיוביות חלקית כללו צביעת רקע מפוזרת גבוהה יותר של תאים שאינם נויטרופילים. קיצורים: n/u = לא בשימוש; - = תוצאה שלילית; + / -צביעה חיובית חלקית; + = צביעה ספציפית מתונה; + = צביעה טובה של רשתות ונויטרופילים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

נוגדנים ראשוניים
לפני התאמת הפרוטוקול, ניסינו למצוא את שילוב הנוגדנים הטוב ביותר. כאן, triH3cit הראה יותר צביעת היסטון תוך תאית מאשר H3cit (R8). לצורך זיהוי NETs, החלטנו להשתמש בנוגדן H3cit (R8) לאופטימיזציה של הפרוטוקול שלנו. נוגדן זה נקשר רק ל-H3cit החוץ-תאי ולא הראה שום צביעה של H3cit תוך-תאי בריכוז הזה (ראו איור 1A,B).

עבור צביעת MPO השווינו נוגדן MPO אנושי/עכברי עם MPO (2C7) עבור רקמה אנושית (ראו איור 1C,D) ונוגדן MPO (2D4) עבור רקמת עכבר (ראו איור 1E,F). נוגדני MPO (2D4) ונוגדני MPO (2C7) לא הצליחו להשיג צביעה עקבית עבור סוגי רקמות מרובים, בעוד שהנוגדנים MPO אדם/עכבר הביאו להכתמה אמינה וטובה עבור MPO. לכן, בחרנו MPO אדם/עכבר עבור פרוטוקול הצביעה שלנו.

עבור NE, ניסינו נוגדן NE מפונדקאי עכבר על רקמה אנושית, אשר הראה צביעת NE רק באחת מתוך חמש דגימות בהשוואה לצביעה אמינה של נוגדן NE מפונדקאי ארנב. בנוסף, נוגדן NE מפונדקאי ארנב ישים לרקמת אדם ועכבר. (ראו איור 1G,H).

Figure 1
איור 1: השוואת נוגדנים ראשונית ברקמות שונות. (A) רקמת אנטרוקוליטיס בילוד אנושי (NEC) מוכתמת ב-H3cit (R8) (אדום). כאן, רק אות חוץ תאי יכול להיות מזוהה. (B) אותה רקמה מוכתמת ב-triH3cit (R2,8,17) (אדום). נוגדן זה יוצר אות רחב יותר עם צביעה תוך תאית אינטנסיבית של היסטונים ציטרולינציה (חיצים צהובים). (ג,ה) רקמת NEC אנושית (C) ורקמת וולוולוס עכבר (E) עם צביעה טובה עבור H3cit (R8) (אדום) ועכבר / MPO אנושי (ירוק). לוקליזציה משותפת של האותות H3cit , MPO ו- DAPI (כחול) מציינת היווצרות NET (חצים לבנים). (ד,ו) לשם השוואה, (D) באמצעות MPO (2C7) עבור רקמת NEC אנושית ו-(F)MPO (2D4) (ירוק) עבור רקמת וולוולוס של עכבר, לא ניתן היה לקבל אות MPO. (ז) דגימת עור אנושית שרופה עם כתמים חזקים מאוד עבור נוגדן NE מפונדקאי ארנב (מגנטה) בהשוואה לתוצאת צביעה שלילית (H) עבור נוגדן NE ממארח עכבר. עבור בקרת איזוטיפ, ראה איור משלים איזוקונטרול 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דה-פרפיניזציה
כאן, הקסילן הוחלף בלימונן, אשר הראה שווה ערך לדפראפינזציה טובה יותר של דגימות הרקמה בהשוואה לקסילן, עם פחות אוטופלואורסצנטיות ברקע (ראו איור 2A,B).

סוכן מקטין אוטופלואורסצנטיות
ניתן למרוח את החומר המוכן לשימוש להפחתת פלואורסצנטיות המבוסס על סודן שחור למשך 2-20 דקות. הנה, יישמנו את זה במשך 0 דקות, 5 דקות, ו 10 דקות. כאשר לא נעשה שימוש בחסימה, חלק מדגימות העכבר הראו יותר צביעה לא ספציפית, וניתן היה להגיע לצביעה חיובית חלקית (ראו איור 2C). זמן החסימה של 5 דקות הראה תוצאות טובות בכל סוגי הרקמות, למעט H3cit ו-MPO ברקמת עכבר, ריאות ועור (ראה טבלה 2). לאחר 10 דקות של זמן חסימה בחלק מהדגימות, הצביעה החלה להיות פחות בהירה, כך שמסגרת הזמן של 5 דקות היא הבחירה הטובה ביותר לחסימת אוטופלואורסצנטיות (ראו איור 2D,E).

Figure 2
איור 2: שיטות דה-פראפיניזציה ושימוש בחומר מקטין אוטופלואורסצנטיות. (A) רקמת ספונדידיסקיטיס אנושית שעברה דה-פרפין בלימונן ומוכתמת עבור H3cit (אדום) ו-MPO (ירוק). היווצרות תקועה של האותות וקו-לוקליזציה חלקית מצביעים על נוכחות של NETs (חץ לבן). (ב) אותה דגימת רקמה deparaffinized עם xylene, וכתוצאה מכך תוצאות צביעה דומות, המציין כי xylene בשימוש נרחב ניתן להחליף עם מדיום חלופי. (ג-ה) רקמת ריאה של עכבר לאחר אלח דם מושרה מראה דפוסי צביעת NE שונים (מגנטה) כאשר זמני דגירה שונים עבור סוכן הפחתת autofluorescence משמשים. ללא שימוש במפחית פלואורסצנטיות עצמית, תמונה C עדיין מציגה צביעת רקע קלה של אריתרוציטים (חץ אדום). לעומת זאת, תמונה D מראה כי לאחר 5 דקות דגירה עם סוכן מקטין autofluorescence, נפלט אות ברור. לאחר 10 דקות, איכות הצביעה בתמונה E יורדת, והאות הופך לפחות בהיר. עבור בקרת איזוטיפ, ראה איור משלים איזוקונטרול 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

שיטות שליפת אנטיגן
עבור צביעת NE, חיממנו את הדגימות במאגר pH 6 ציטראט למשך 10 דקות במיקרוגל (תחילה למשך דקה אחת ב- 360 W ולאחר מכן למשך 9 דקות ב- 90 W), למשך 10 דקות באמבט מים ב- 96 ° C, או למשך 90 דקות באמבט מים ב- 60 ° C. כאן, הטמפרטורות הגבוהות יותר במיקרוגל ובאמבט המים הראו שליפת אנטיגן בינונית עד טובה באופן עקבי (ראו איור 3A). לא נמצא הבדל משמעותי בין המיקרוגל לבין אמבט המים בטמפרטורה של 96 מעלות צלזיוס (ראה טבלה 2). יתר על כן, הוכח כי באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס, היו רק כתמים חיוביים חלקית או ללא כתמים (ראה איור 3B). רק האילאום האנושי ושריר הלב האנושי הראו תוצאות ספציפיות טובות. מכיוון שלא ניתן היה להשיג צביעה נאותה עבור NE עם אמבט המים של 60 מעלות צלזיוס, סדרת בדיקות אמבט המים של 60 מעלות צלזיוס עבור H3cit ו- MPO הושלכה.

עבור צביעה כפולה עם MPO ו- H3cit, חיממנו את הדגימות במאגר pH 6 ציטראט במיקרוגל למשך 10 דקות (תחילה למשך דקה אחת ב- 360 W ולאחר מכן למשך 9 דקות ב- 90 W) או באמבט מים ב- 96 ° C למשך 10 דקות. כאן, שתי השיטות הראו תוצאות ספציפיות טובות, עם תוצאות מעט יותר חיוביות עבור אמבט מים של 96 מעלות צלזיוס (ראה איור 3C). רק רקמת הריאה והעור של העכבר יכלו להשיג דירוג כולל בינוני (ראו טבלה 2).

עם זאת, חריגה מזמן הדגירה של 40 דקות ב-96°C גרמה לצביעת נוגדנים פחות אינטנסיבית, בעוד שניתן היה לראות הרבה יותר צביעת רקע (ראו איור 3D).

Figure 3
איור 3: שיטות אחזור אנטיגן. (A) רקמת וולוולוס של עכבר המוכתמת עבור NE (מגנטה) באמצעות זמן דגירה של 10 דקות ב-96°C לאחזור חום מראה אות חזק משמעותית מאשר (B) בעת דגירה של הדגימה במשך 90 דקות באמבט מים של 60°C. (C) יתר על כן, הדגירה של 10 דקות בשליפת אנטיגן של 96 מעלות צלזיוס גורמת גם לאות חזק עבור H3cit (אדום) ו- MPO (ירוק) עם צביעת נטו משולבת (חצים לבנים). ד: עם זאת, הרתחת הדגימות במשך יותר מ -40 דקות גורמת לצביעת H3cit חוץ-תאית פחות ספציפית וללא צביעת MPO. עבור בקרת איזוטיפ, ראה איור משלים איזוקונטרול 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

חדירות
ניסינו לחדור את הדגימות עם Triton X-100 בשני דילולים (0.2% ו-0.5%) במשך 10 דקות והשווינו זאת ל-10 דקות במים נטולי יונים. כאן, 10 דקות עם טריטון 0.2% השיגו תוצאות טובות בכל סוגי הרקמות, למרות שההבדלים היו קטנים בהשוואה לתנאי טריטון 0.5% ומים נטולי יונים.

איור משלים איזוקונטרול 1: בקרות איזוטיפ עבור איור 1. כל התמונות מראות צביעת DAPI (כחול) טובה אך ללא אות לנוגדן הפלואורסצנטי. זה מאשר שהקישור של נוגדנים ראשוניים באיור 1 הוא ספציפי לאנטיגן המטרה ולא תוצאה של קשירה לא ספציפית או אינטראקציות חלבוניות. (A) רקמת אנטרוקוליטיס בילוד אנושי (NEC) מוכתמת בנוגדן איזוקונטרול עבור H3cit (R8) (אדום). (B) רקמת NEC מוכתמת בנוגדן איזוקונטרול עבור H3cit (R2,8,17) (אדום). (C) רקמת NEC (E) ורקמת וולוולוס עכבר מוכתמות בנוגדנים איזוקונטרולטיביים עבור H3cit (R8) (אדום) ו-MPO עכברי/אנושי (ירוק). (D) רקמת NEC מוכתמת בנוגדנים איזוקונטרולריים עבור H3cit (R8) (אדום) ו-MPO (2C7) (ירוק). (F) רקמת וולוולוס של עכבר מוכתמת בנוגדנים איזוקונטרולריים עבור H3cit (R8) (אדום) ו-MPO 2D4 (ירוק). ז: דגימת עור אנושית שרופה מוכתמת בנוגדן איזוקונטרול לנוגדן NE מפונדקאי ארנב (מגנטה). (H) אותה רקמה המוכתמת בנוגדן איזוקונטרול לנוגדן NE מפונדקאי עכבר (מגנטה). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים איזוקונטרול 2: בקרות איזוטיפ עבור איור 2. כל התמונות מראות צביעת DAPI (כחול) טובה אך ללא אות לנוגדן הפלואורסצנטי. זה מאשר את הקישור הספציפי של הנוגדנים הראשוניים באיור 2. תמונות C-E עדיין מראות מעט כתמי רקע במגנטה בשל זמני החשיפה הארוכים. אולם ניתן להבחין בין אות NE באיור 2 לבין צביעת הרקע. (א) רקמת ספונדילודיסטיטיס אנושית שפורה בלימונן ומוכתמת בנוגדנים איזוקונטרולטיים עבור H3cit (R8) (אדום) ועכבר/MPO אנושי (ירוק). (ב) אותה דגימת רקמה deparaffinized עם xylene ומוכתמת עם נוגדנים isocontrol עבור H3cit (אדום) ו MPO (ירוק). (ג) רקמת ריאה של עכבר מוכתמת בנוגדן איזוקונטרול עבור NE (מגנטה), ללא שימוש בחומר מקטין אוטופלואורסצנטי. (ד) אותה רקמה מוכתמת בנוגדן איזוקונטרול ל-NE (מגנטה) ו-5 דקות דגירה עם חומר מקטין אוטופלואורסצנטי. (E) אותה רקמה מוכתמת בנוגדן איזוקונטרול עבור NE (מגנטה) ו-10 דקות דגירה עם חומר מקטין אוטופלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים איזוקונטרול 3: בקרות איזוטיפ לאיור 3. כל התמונות מראות צביעה טובה של DAPI (כחול), אך ללא אות ספציפי לנוגדן הפלואורסצנטי. זה מאשר את הקישור הספציפי של הנוגדנים הראשוניים באיור 3. (A) רקמת וולוולוס עכברית מוכתמת בנוגדן איזוקונטרול עבור NE (מגנטה) תוך שימוש בזמן דגירה של 10 דקות ב-96°C לשליפת חום. (B) אותה רקמה מוכתמת בנוגדן איזוקונטרול עבור NE (מגנטה) ושליפת חום למשך 90 דקות באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס. (C) אותה רקמה מוכתמת בנוגדן איזוקונטרול עבור H3cit (אדום) ו-MPO (ירוק) ועם תנאי אחזור חום זהים ל-A. הנקודה הירוקה מראה מכתים של נוגדנים משניים מצטברים. (D) אותה רקמה מוכתמת בנוגדן איזוקונטרול עבור H3cit (אדום) ו-MPO (ירוק) ומשתמשת בזמן דגירה של 40 דקות ב-96°C לאחזור חום. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים איזוקונטרול 4: בקרות איזוטיפ עבור איור 4. כל האיזוקונטרולים הבאים הם מאותה שקופית כמו הניסוי "נכשל" המתאים. הניסיונות הכושלים לא נעשו בכוונה, כך שחלק מהאיזובקרות נראות שמישות, בעוד שהדגימה לא הייתה. (A) רקמת NEC מוכתמת בנוגדן איזוקונטרול עבור H3cit (אדום) ו-MPO (ירוק). דגימה זו עובדה מהר יותר מבלי להתייבש. לכן, לא ניתן לראות כתמי רקע מוגזמים. המבנים הירוקים והאדומים הם אגרגטים משניים של נוגדנים. (ב) רקמת Spondylodiscitis מוכתמת בנוגדן איזוקונטרול עבור NE (מגנטה). כאן, deparaffinization היה מוצלח, ולכן לא ניתן לראות שרידי פרפין. (ג) רקמת NEC מוכתמת בנוגדן איזוקונטרול עבור H3cit (אדום) ו- MPO (ירוק). למרות שנעשה שימוש באותם נוגדנים משניים שאוחסנו בצורה לא נכונה, לא ניתן היה לצפות להכתמה עבור תמונת איזוקונטרול זו. לכן, לא ניתן להשתמש בתמונה זו כדי להעריך את האיגוד הספציפי של התמונה המתאימה. (ד) עור אנושי שרוף מוכתם בנוגדן איזוקונטרול עבור H3cit (אדום) ו-MPO (ירוק). כאן, ההרכבה נעשתה בזהירות רבה יותר, ולא ניתן לראות אור מתפזר דרך בועות אוויר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעבודה זו שאפנו להתאים ולייעל את הפרוטוקולים הקיימים להדמיית NET לסוגי רקמות נוספים, החל מתהליך הצביעה בפועל. הצעד הקריטי הראשון לשיטה זו הוא בחירת הנוגדנים המתאימים ביותר. עבור NE, ניסינו נוגדן NE מפונדקאי עכבר על רקמה אנושית, אשר לא הראה כתמים אמינים בהשוואה ל- NE ממארח ארנב. יתר על כן, Thålin et al. הציעו H3cit (R8) כנוגדן ספציפי יותר לצביעה חוץ-תאית. השווינו נוגדן זה עם triH3cit בשימוש נרחב (R2, R8, R17). המחקר שלנו הראה כי נוגדן H3cit (R8) מוכתם רק עבור אות חוץ-תאי בריכוזים המשומשים, מה שמאפשר זיהוי קל יותר של NETs בשקופיות. ממצא זה תומך בטענות של Thålin et al. כי שיבוט H3cit (R8) יכול לספק אות NET טוב עם ירידה בתגובתיות צולבת מחוץ למטרה להיסטונים שאינם ציטרולינציה28. השווינו גם נוגדני MPO לרקמת אדם ועכבר לצביעת MPO. התוצאות שלנו מראות כי נוגדן MPO עכבר / אדם הראה צביעה אמינה יותר וניתן להשתמש בו זמנית על דגימות אדם ועכבר, מה שמפשט את השימוש בו במעבדה. לכן, אנו ממליצים להשתמש בשילוב נוגדנים זה, H3cit (R8) ו- MPO עכבר / אדם, למחקר עתידי ויישמנו אותו בפרוטוקול שלנו.

עם זאת, קיימת מגבלה עבור ניסיונות צביעה מרובים עם בחירת נוגדנים זו. פרוטוקול זה שונה לשימוש בנוגדנים ראשוניים ממארחים שונים. אחרת, נוגדן משני אחד יכול להיקשר לשני הנוגדנים הראשוניים. נוגדן H3cit מגיע מאותו מארח כמו נוגדן NE, כך שלא יכולנו להכתים NE ו- H3cit יחד. למרות שלא בוצעה צביעה משולשת (NE, H3cit, MPO) במחקר זה, פרוטוקול זה יכול לשמש בסיס לניסויים בצביעה משולשת בעתיד. אפשרות אחת להכתמה משולשת או צביעה כפולה של NE ו-H3cit יכולה להיות החלפת אחד מהנוגדנים הללו בנוגדן אמין ממארח אחר. במקרה זה, שותף משולב אפשרי יכול להיות נוגדן NE (סנטה קרוז; sc-55549) מכבשים בשימוש Knackstedt et al.24. אפשרות נוספת של דולר ואחרים פורסמה בשנת 2021, שם הם השתמשו בשיטת צביעה כפולה רצופה ושילבו NE ו- H3cit ממארח ארנב26. יישום מבטיח נוסף של שיטת צביעה מרובת כתמים הוא להבחנה בין היווצרות רשת תוך וסקולרית וחוץ-וסקולרית. במקום צביעה משולשת עבור סמני NET, ניתן לשלב צביעת NET כפולה עם צביעת כלי דם נוספת. יתר על כן, מספר גדל והולך של מחקרים בחנו את ההתפלגות התוך-וסקולרית והחוץ-וסקולרית של NETs כדי לרכוש ידע נוסף על הפתומנגנונים של מחלות ספציפיות, כגון מחלת אלצהיימר. Smyth et al.31 תיארו פרוטוקול מבטיח ומעמיק דומה לשלנו כדי להבדיל בין שתי הלוקליזציות האפשריות. הם שינו את פרוטוקול צביעת הרשת הקיים שלהם על ידי הוספת לקטין ביוטינילציה כדי לתייג תאי אנדותל, והשתמשו בסטרפטאבידין מצומד פלואורופור לצביעת לקטין. על ידי בחינת לוקליזציה משותפת של סמני לקטין ו- NET באותה תמונה, הם הצליחו לזהות NETs תוך וסקולריים31. בהקשר זה, נדרשים מחקרים נוספים כדי להרחיב את היישום של הפרוטוקול שלנו.

לאחר מציאת שילוב הנוגדנים המתאים ביותר, השלב הקריטי הבא הוא החדרת סוכן מקטין אוטופלואורסצנטיות. גורמים אקסוגניים כגון קיבוע דגימה באמצעות קיבוע פורמלדהיד וגורמים אנדוגניים כגון אריתרוציטים יכולים לגרום לאוטופלואורסצנטיות גבוהה, מה שמקשה על קביעת קו-לוקליזציה32. בעיה זו מתרחשת בעיקר בספקטרום הפלואורסצנטי הכחול (אזור עירור: 430-480 ננומטר) והפלואורסצנטי הירוק (אזור עירור: 500-550 ננומטר) ויכולה לגרום לתוצאות צביעה לא חד משמעיות כאשר משתמשים בנוגדן פלואורסצנטי עם אותו אזור עירור3. הספרות מדווחת כי סודן בלק הוא סוכן יעיל להפחתת אוטופלואורסנציה של רקמות טבועות33. סודן שחור מאפשר לקבל תוצאות צביעה ברורות יותר באמצעות תעלות פלואורסצנטיות כחולות או ירוקות. אזור עירור זה יהיה נחוץ לניסיונות צביעה מרובים עתידיים מכיוון שיש צורך בתעלות הכחולות והירוקות בעת שימוש בצבע פלואורסצנטי רביעי. המחקר שלנו מראה כי זמן הדגירה האופטימלי תלוי בסוג הרקמה והנוגדן המשמשים בתהליך הצביעה. עם זאת, בעבודה זו, 5 דקות של חומר מפחית אוטופלואורסצנטיות בדרך כלל נתנו תוצאות טובות על כל סוגי הרקמה והיה היתרון של צביעת הדגימה בשחור, ובכך להקל על הראייה בשקופיות. זה מנע חלקים חסרים של הרקמות בתהליך הצביעה, במיוחד עם דגימות קטנות.

גורם חיוני נוסף להצלחת פרוטוקול זה הוא טמפרטורה גבוהה קבועה לשלב שליפת האנטיגן. המחקר שלנו הראה כי 10 מתוך 15 המחקרים הקודמים השתמשו בטמפרטורות מעל 96 מעלות צלזיוס לאחזור אנטיגן 13,15,16,17,19,21,22,25,26,27. זה היה עקבי עם התוצאות שלנו, שם הדגירה על הדגימות באמבט מים או מיקרוגל של 96 מעלות צלזיוס נתנה תוצאות טובות ללא הבדלים משמעותיים. עם זאת, אנו ממליצים להשתמש באמבט מים לפיזור חום אחיד. בעת השימוש במיקרוגל, מצאנו שיפוע טמפרטורה בחיץ של עד 5 מעלות צלזיוס בין החלק העליון והתחתון של צנצנת הצביעה. בנוסף, אמבט המים קל יותר לשימוש ויש לו סיכון נמוך יותר של חיץ רותח. לצורך חדירה, מצאנו כי לטריטון X-100 הייתה השפעה פחותה על הצביעה. לכן, דילוג על שלב זה בפרוטוקול אפשרי מבלי להשפיע לרעה על התוצאה. באופן כללי, דגימות אנושיות נתנו תוצאות טובות יותר מאשר דגימות עכבר. סיבה לכך יכולה להיות שלבני אדם יש אחוז גבוה יותר של נויטרופילים מאשר לעכברים34,35. בנוסף, דגימות ריאה של עכברים לא הראו דלקת מקרוסקופית נראית לעין ופחות נויטרופילים, בעוד שדגימות מעי עכבר היו מודלקות באופן מקרוסקופי והראו תוצאות טובות של צביעה. לכן, הציונים הנמוכים במחקר שלנו יכלו לנבוע מהדלקת הנמוכה ולא בגלל שהפרוטוקול לא עבד בצורה אופטימלית.

לצורך פתרון בעיות, טעויות קלות בפרוטוקול או אי טיפול קפדני בדגימות עשויות להיות בעלות השפעה עצומה על תוצאות הצביעה. אחת הבעיות העיקריות שזיהינו הייתה התייבשות דגימה. כאן, מצאנו כי טיפול ביותר מ 10-15 שקופיות בבת אחת היה קריטי מכיוון שכל שלב גוזל זמן ויכול לגרום להתייבשות הדגימות. דגימות מיובשות אינן שמישות עוד עקב צביעת רקע גבוהה וללא אות פלואורסצנטי ספציפי שניתן לזהות (ראו איור 4A). בנוסף, הדגימות צריכות להיות deparaffinized לחלוטין לפני תחילת פרוטוקול הצביעה. שאריות פרפין יצרו אות רקע חזק, וניתן היה לראות את קווי החיתוך בפרפין המוכתם (ראו איור 4B). יתר על כן, לאחר יותר מ-20 מחזורי הקפאה-הפשרה, לא ניתן היה לזהות אות לנוגדן המשני ל-MPO (ראו איור 4C). צעד חשוב נוסף עם השפעה רבה על איכות התמונה הוא הטיפול בשלב ההרכבה הסופי. בעבודה זו, בועות אוויר מתחת למכסה גרמו לפיזור האות הפלואורסצנטי, ולכן לתמונה מטושטשת (ראו איור 4D).

Figure 4
איור 4: עצות לפתרון בעיות . (A) לוח זה מציג את התוצאה של דגימה מיובשת. כתמי הרקע האדומים המוצקים מעכבים כל הערכה של המדגם. (ב) כאן, החץ האדום מראה שרידי פרפין, המאופיינים במראה גלי, לאחר דה-פרפיניזציה לא מספקת. שרידים אלה יוצרים אות רקע גבוה ותמונות באיכות נמוכה יותר. (ג) אחסון נוגדנים לקוי או יותר מ-20 מחזורי הפשרה בהקפאה גורמים לצבירה של הנוגדן המשני (חיצים ירוקים) וללא קשירה ל-MPO. (ד) הרכבה שאינה נעשית בזהירות עלולה לגרום לבועות אוויר, ולכן לפיזור האור הפלואורסצנטי (חץ כחול). הדבר עלול להשפיע באופן משמעותי על איכות התמונה, במיוחד כאשר הפיזור מטשטש את המטרה. עבור בקרת האיזוטיפ, ראה איור משלים איזוקונטרול 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

למרות ש-NETs צוברים פופולריות רבה יותר במחקר מדעי, עדיין אין מספיק מחקרים המתמקדים בשיטות לזיהוי NET 3,13,17,26. למיטב ידיעתנו, אנו מציגים את המחקר הראשון המשווה פרוטוקולים ממחקרים שונים להדמיית NETs ברקמת FFPE. הפרוטוקולים המותאמים אישית שפורסמו בעבר היו שונים בשיטות שליפת הנוגדנים או האנטיגן שלהם ולעתים קרובות תוכננו עבור סוג רקמה אחד בלבד, מה שהקשה על השוואת תוצאות ההדמיה של NET. לכן, במחקר זה זיהינו שלבים קריטיים וביססנו פרוטוקול המתאים לרקמות עכבר ואדם שונות. השגנו זאת על ידי שימוש בנוגדן ראשוני חדש לצביעת H3cit והפחתת צביעת הרקע עם חומר להפחתת פלואורסצנטיות אוטופלואורסצנטית. יתר על כן, הראינו כי טמפרטורה גבוהה קבועה היא קריטית, וטיפול זהיר בדגימות הוא חיוני לצביעת נטו מוצלחת. לכן, מחקר זה מספק את השלבים החיוניים לפיתוח פרוטוקול ישים באופן כללי לצביעת NETs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נוסד על ידי חברת המחקר הגרמנית (BO5534). אנו מודים לאנטוניה קיוויט, מוריץ לנץ, יוהנה האגנס, ד"ר אניקה הואר וד"ר אינגו קוניגס על שסיפקו לנו דגימות. בנוסף, המחברים מודים לצוות של מתקן הדמיה מיקרוסקופיה UKE (מתקן הליבה, בית הספר לרפואה של UKE) על התמיכה במיקרוסקופ האימונופלואורסצנטי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
         Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg abcam Ab 68672  1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg abcam Ab 5103 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg abcam Ab 25989 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg abcam Ab 90810 1:50
Axiovision Microscopy Software  Zeiss 4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml GeneTex  GTX30972
Coverslips Marienfeld 0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) Dako S2369
DAPI 25 mg Roth 6335.1 1:25000
DCS antibody dilution 500 mL DCS diagnostics DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3 JacksonImmunoResearch 705-165-147 1:200
Donkey anti rabbit AF647 JacksonImmunoResearch 711-605-152 1:200
Donkey anti rabbit Cy3 JacksonImmunoResearch 711-165-152 1:200
Fluoromount-G Mounting Medium Invitrogen 00-4958-02
Glass slide rack Roth H552.1
Human/Mouse MPO Antibody R&D Systems AF 3667  1:20
Hydrophobic Pen KISKER MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg abcam Ab 37415 1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml Maxvision MB-L
Microscopy camera Zeiss AxioCamHR3
Microwave Bosch HMT84M421
Mouse IgG1 negative control Dako X0931 Aglient 1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control R&D Systems AB-108-C  1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x) Sigma-Aldrich P-3813
PMP staining jar Roth 2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg abcam Ab 219406 1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg abcam Ab 172730 1:300
ROTI Histol Roth  6640
SuperFrost Plus slides R. Langenbrinck 03-0060
TBS Tris buffered saline (x10) Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Water bath Memmert 830476
Water bath rice cooker reishunger RCP-30
Wet chamber Weckert Labortechnik 600016
Zeiss Widefield microscope Zeiss Axiovert 200M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
  3. Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).
  4. Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
  5. Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
  6. Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
  7. Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
  8. Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
  9. Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
  10. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
  11. Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
  12. Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
  13. Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).
  14. de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
  15. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  16. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  17. Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
  18. Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
  19. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  20. Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
  21. Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).
  22. Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
  23. Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).
  24. Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
  25. Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
  26. Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).
  27. Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
  28. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  29. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
  30. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  31. Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).
  32. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
  33. Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).
  34. Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).
  35. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).

Tags

דימות אימונופלואורסצנטי מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים NETs זיהום חיידקי נזק טראומטי לרקמות מחלות אוטואימוניות דלקות סטריליות חוטי DNA דו-גדיליים היסטונים חלבונים אנטי-מיקרוביאליים פתוגנים ויסות הומיאוסטטי הידבקות טסיות קרישה אלח דם הפרעות אוטואימוניות התערבות טיפולית מיקרוסקופ אלקטרונים שיטות צביעה נוגדנים חומרים מחזרי אוטופלואורסצנציה שיטות אחזור אנטיגן חדירות

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 09/29/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:

Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schoenfeld, L., Appl, B.,… More

Schoenfeld, L., Appl, B., Pagerols-Raluy, L., Heuer, A., Reinshagen, K., Boettcher, M. Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (198), e65272, doi:10.3791/65272 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter