מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים (NETs) קשורות למחלות שונות, ואימונופלואורסנציה משמשת לעתים קרובות להדמיה שלהן. עם זאת, ישנם פרוטוקולי צביעה שונים, ובמקרים רבים, רק סוג אחד של רקמה נבדק. כאן, אנו קובעים פרוטוקול ישים באופן כללי להכתמת רשתות בעכבר וברקמות אנושיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר
במאמר זה
הודעת תיקון
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
סיכום
תקציר
מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) משתחררות על ידי נויטרופילים כתגובה לזיהום חיידקי או נזק טראומטי לרקמות, אך גם ממלאות תפקיד במחלות אוטואימוניות ודלקות סטריליות. הם מבנים דמויי רשת המורכבים מחוטי דנ"א דו-גדיליים, היסטונים וחלבונים אנטי-מיקרוביאליים. לאחר שחרורם, NETs יכולים ללכוד ולהרוג פתוגנים חוץ-תאיים בדם וברקמות. יתר על כן, NETs משתתפים בוויסות הומיאוסטטי על ידי גירוי הידבקות טסיות וקרישה. עם זאת, הייצור המווסת של NETs נקשר גם עם מחלות שונות, כולל אלח דם או הפרעות אוטואימוניות, מה שהופך אותם למטרה מבטיחה להתערבות טיפולית. מלבד מיקרוסקופ אלקטרונים, הדמיה של NETs באמצעות הדמיה אימונופלואורסצנטית היא כיום אחת השיטות הידועות היחידות להדגמת אינטראקציות NET ברקמות. לכן, נעשה שימוש בשיטות צביעה שונות כדי להמחיש NETs. בספרות מתוארים פרוטוקולי צביעה שונים, וזיהינו ארבעה מרכיבים עיקריים המראים שונות גבוהה בין פרוטוקולים: (1) סוגי הנוגדנים שבהם נעשה שימוש, (2) שימוש בחומרים מפחיתי פלואורסצנטיות אוטופלואורסצנטית, (3) שיטות שליפת אנטיגן, ו-(4) חלחול. לכן, פרוטוקולי צביעה אימונופלואורסצנטית במבחנה הותאמו ושופרו באופן מערכתי בעבודה זו כדי להפוך אותם לישימים עבור מינים שונים (עכבר, אדם) ורקמות (עור, מעי, ריאות, כבד, לב, דיסק בעמוד השדרה). לאחר קיבוע ושיבוץ פרפין, חלקים בעובי 3 מיקרומטר הותקנו על מגלשות. דגימות אלה הוכתמו בנוגדנים ראשוניים עבור myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit) ו neutrophil elastase (NE) על פי פרוטוקול צביעה שונה. השקפים הוכתמו בנוגדנים משניים ונבדקו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב. התוצאות נותחו על פי דף הערכה, וההבדלים נרשמו באופן כמותי למחצה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול צביעת NET מותאם לרקמות שונות. השתמשנו בנוגדן ראשוני חדשני כדי להכתים עבור H3cit והפחתנו כתמים לא ספציפיים עם חומר להפחתת פלואורסצנטיות אוטופלואורסצנטית. יתר על כן, הוכחנו כי צביעת רשת דורשת טמפרטורה גבוהה קבועה וטיפול זהיר בדגימות.
מבוא
מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) הודגמו לראשונה על ידי ברינקמן ועמיתיו כמסלול של מוות תאי שונה מאפופטוזיס ונמק בשנת 20041. במסלול זה, נויטרופילים משחררים את הכרומטין המעובה שלהם לתוך החלל החוץ-תאי כדי ליצור מבנים גדולים דמויי רשת המכוסים בחלבונים אנטי-מיקרוביאליים שהיו מאוחסנים בעבר בגרגירים או בציטוזול. חלבונים אנטי-מיקרוביאליים אלה כוללים אלסטאז נויטרופילים (NE), מיאלופרוקסידז (MPO) והיסטון ציטרוליניציה H3 (H3cit), המשמשים בדרך כלל לזיהוי עקיף של NETs2 באימונופלואורסנציה. שיטה זו לא רק מזהה את הנוכחות הכמותית של חלבונים אלה; ואכן, יש לו את היתרון של זיהוי ספציפי מבנים דמויי NET. ב-NETs, החלבונים שהוזכרו מתמקמים יחד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה כלל רקמות עכבר שמקורן בניסויים שאושרו על ידי המנהל הממלכתי של המבורג לחקר בעלי חיים, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, המבורג, גרמניה (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). הרקמות ששימשו היו ריאות עכברים ומעי גס ממודל ספיגה ועור שרוף. השתמשנו בעכברים זכרים ונקבות בני 8 שבועות. הדירקטיבה האירופית 2010/63/EU בנושא הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות בוצעה עבור כל הניסויים. הדגימות האנושיות האנונימיות כללו רקמות מדלקת מעיים בילוד, עור שרוף, אטרזיה של המרה, ספונדילודיסטיטיס ושריר הלב. על פי ועדת האתיקה של המחקר הרפואי של המבורג, הדגימות לא היו זקוקות להסכמה מדעת, אך המחקר אושר על ידי הוועדה (WF-026/21).
1. קיבוע לדוג....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לפני שהתחלנו באופטימיזציה של הפרוטוקולים שלנו, זיהינו שלבים מרכזיים לצביעה מוצלחת על ידי חיפוש PubMed עבור מחקרים שהשתמשו ברקמת FFPE עבור צביעה חיסונית של NETs והשווינו את הפרוטוקולים שלהם. הבדלי הפרוטוקול המבטיחים ביותר זוהו כשלבי המפתח למיטוב הפרוטוקול, בעוד שצעדים שרובם תאמו זה את זה לא שונו (טבלה 1).
טבלה 1: מחקר PubMed עבור FFPE immunostaining של NETs. טבלה זו מציגה את המשתנים בפרוטוקול החיסוניזציה במחקרים שנבדקו. הפרוטוקולים שבהם נעשה שימוש חולקו לצעדים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בעבודה זו שאפנו להתאים ולייעל את הפרוטוקולים הקיימים להדמיית NET לסוגי רקמות נוספים, החל מתהליך הצביעה בפועל. הצעד הקריטי הראשון לשיטה זו הוא בחירת הנוגדנים המתאימים ביותר. עבור NE, ניסינו נוגדן NE מפונדקאי עכבר על רקמה אנושית, אשר לא הראה כתמים אמינים בהשוואה ל- NE ממארח ארנב. יתר על כן, Thålin et al. הציעו H3cit (R8) כנוגדן ספציפי יותר לצביעה חוץ-תאית. השווינו נוגדן זה עם triH3cit בשימוש נרחב (R2, R8, R17). המחקר שלנו הראה כי נוגדן H3cit (R8) מוכתם רק עבור אות חוץ-תאי בריכוזים המשומשים, מה שמאפשר זיהוי קל יותר של NETs .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר זה נוסד על ידי חברת המחקר הגרמנית (BO5534). אנו מודים לאנטוניה קיוויט, מוריץ לנץ, יוהנה האגנס, ד"ר אניקה הואר וד"ר אינגו קוניגס על שסיפקו לנו דגימות. בנוסף, המחברים מודים לצוות של מתקן הדמיה מיקרוסקופיה UKE (מתקן הליבה, בית הספר לרפואה של UKE) על התמיכה במיקרוסקופ האימונופלואורסצנטי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>דילול | |||
| נוגדן אנטי נויטרופילים אלסטאז 100µ g | abcam | Ab 68672 | 1:100 |
| נוגדן אנטי-היסטון H3 (ציטרולין R2 + R8 + R17) 100&מיקרו; g | abcam | Ab 5103 | 1:50 |
| נוגדן נגד מיאלופרוקסידאז [2C7] אנטי אנושי 100 ומיקרו; g | abcam | Ab 25989 | 1:50 |
| נוגדן נגד מיאלופרוקסידאז [2D4] נגד עכבר 50 ומיקרו; g | abcam | Ab 90810 | 1:50 |
| תוכנת מיקרוסקופיה Axiovision | צייס | 4.8.2. | |
| תמיסת חסימה עם סרום חמור (מוכן לשימוש) 50 מ"ל | GeneTex | ||
| Coverslips | Marienfeld | 0101202 | |
| Dako תמיסת אחזור מטרה ציטראט pH6 (x10) | Dako | S2369 | |
| DAPI 25 מ"ג | רוט | 6335.1 | 1:25000 |
| דילול נוגדנים DCS 500 מ"ל | DCS אבחון DCS | AL120R500 | |
| עז נמלה חמור Cy3 | JacksonImmunoResearch | 705-165-147 | 1:200 |
| חמור אנטי ארנב AF647 | JacksonImmunoResearch | 711-605-152 | 1:200 |
| חמור אנטי ארנב Cy3 | JacksonImmunoResearch | 711-165-152 | 1:200 |
| Fluoromount-G הרכבה בינונית | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| מתלה שקופיות זכוכית | Roth | H552.1 | |
| אדם/עכבר MPO נוגדן | R& D Systems | AF 3667 | 1:20 |
| עט הידרופובי | KISKER | MKP-1 | |
| ארנב איזוקונטרול IgG פוליקלונלי 5 מ"ג | abcam | Ab 37415 | 1:2000 ו-1:250 |
| MaxBlock Autofluorescence Reagent Reagent Kit (RUO) 100 מ"ל | Maxvision | MB-L | |
| מיקרוסקופיה מצלמה | Zeiss | AxioCamHR3 | |
| מיקרוגל | Bosch | HMT84M421 | |
| עכבר IgG1 שליטה שלילית | Dako | X0931 Aglient | 1:50 ו-1:5 |
| Normal Goat IgG Control | R& D מערכות | AB-108-C | 1:100 |
| PBS פוספט חוצץ מלח (10x) | Sigma-Aldrich | P-3813 | |
| PMP צנצנת צביעה | Roth | 2292.2 | |
| רקומביננטי אנטי-היסטון H3 (ציטרולין R8) נוגדן 100µ g | abcam | Ab 219406 | 1:100 |
| ארנב רקומביננטי IgG, חד שבטי [EPR25A] - בקרת איזוטיפ 200µ g | abcam | Ab 172730 | 1:300 |
| ROTI Histol | Roth | 6640 | |
| SuperFrost Plus slides | R. Langenbrinck | 03-0060 | |
| TBS Tris תמיסת מלח חוצצת (x10) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| אמבט מים | Memmert | 830476 | |
| סיר | אורז לאמבט מיםreishunger | RCP-30 | |
| תא רטוב | Weckert Labortechnik | 600016 | |
| מיקרוסקופ Zeiss Widefield | Zeiss | Axiovert 200M |
מקורות
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תיקון
Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 9/29/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:
Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
