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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65272
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

ERRATUM NOTICE

Summary

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, und Immunfluoreszenz wird häufig für ihre Visualisierung verwendet. Es gibt jedoch verschiedene Färbeprotokolle, und in vielen Fällen wird nur eine Art von Gewebe untersucht. Hier etablieren wir ein allgemein anwendbares Protokoll für die Färbung von NETs in Maus und menschlichem Gewebe.

Abstract

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden von Neutrophilen als Reaktion auf bakterielle Infektionen oder traumatische Gewebeschäden freigesetzt, spielen aber auch eine Rolle bei Autoimmunerkrankungen und sterilen Entzündungen. Es handelt sich um netzartige Strukturen, die aus doppelsträngigen DNA-Filamenten, Histone und antimikrobiellen Proteinen bestehen. Einmal freigesetzt, können NETs extrazelluläre Krankheitserreger in Blut und Gewebe einfangen und abtöten. Darüber hinaus sind NETs an der homöostatischen Regulation beteiligt, indem sie die Adhäsion und Koagulation von Blutplättchen stimulieren. Die dysregulierte Produktion von NETs wurde jedoch auch mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter Sepsis oder Autoimmunerkrankungen, was sie zu einem vielversprechenden Ziel für therapeutische Interventionen macht. Neben der Elektronenmikroskopie ist die Visualisierung von NETs mittels Immunfluoreszenz-Bildgebung derzeit eine der wenigen bekannten Methoden, um NET-Wechselwirkungen im Gewebe nachzuweisen. Daher wurden verschiedene Färbemethoden zur Visualisierung von NETs eingesetzt. In der Literatur werden verschiedene Färbeprotokolle beschrieben, und wir haben vier Schlüsselkomponenten identifiziert, die eine hohe Variabilität zwischen den Protokollen aufweisen: (1) die Art der verwendeten Antikörper, (2) die Verwendung von Autofluoreszenz-reduzierenden Mitteln, (3) Antigen-Retrieval-Methoden und (4) Permeabilisierung. Daher wurden in dieser Arbeit in vitro Immunfluoreszenz-Färbeprotokolle systemisch angepasst und verbessert, um sie für verschiedene Spezies (Maus, Mensch) und Gewebe (Haut, Darm, Lunge, Leber, Herz, Bandscheibe) anwendbar zu machen. Nach der Fixierung und Paraffineinbettung wurden 3 μm dicke Schnitte auf Objektträger montiert. Diese Proben wurden mit primären Antikörpern gegen Myeloperoxidase (MPO), citrulliniertes Histon H3 (H3cit) und neutrophile Elastase (NE) nach einem modifizierten Färbeprotokoll gefärbt. Die Objektträger wurden mit Sekundärantikörpern gefärbt und mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Ergebnisse wurden anhand eines Bewertungsbogens analysiert und Unterschiede semi-quantitativ erfasst.

Hier stellen wir ein optimiertes NET-Färbeprotokoll vor, das für verschiedene Gewebe geeignet ist. Wir verwendeten einen neuartigen Primärantikörper zur Färbung von H3cit und reduzierten die unspezifische Färbung mit einem Autofluoreszenz-reduzierenden Mittel. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die NET-Färbung eine konstant hohe Temperatur und einen sorgfältigen Umgang mit den Proben erfordert.

Introduction

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) wurden erstmals 2004 von Brinkmann et al. als ein Weg des Zelltods visualisiert, der sich von Apoptose und Nekrose unterscheidet1. Auf diesem Weg geben Neutrophile ihr dekondensiertes Chromatin in den extrazellulären Raum ab, um große netzartige Strukturen zu bilden, die mit antimikrobiellen Proteinen bedeckt sind, die zuvor in den Granula oder dem Zytosol gespeichert waren. Zu diesen antimikrobiellen Proteinen gehören neutrophile Elastase (NE), Myeloperoxidase (MPO) und citrulliniertes Histon H3 (H3cit), die üblicherweise für den indirekten Immunfluoreszenznachweis von NETsverwendet werden 2. Diese Methode identifiziert nicht nur das quantitative Vorhandensein dieser Proteine; in der Tat hat es den Vorteil, NET-ähnliche Strukturen spezifisch zu detektieren. In den NETs kolokalisieren die genannten Proteine mit extrazellulärer DNA, was durch eine Überlappung der Fluoreszenzsignale jedes gefärbten Proteins und der extrazellulären DNA nachgewiesen werden kann. Im Gegensatz zu den überlappenden Signalen, die auf die Kolokalisation von extrazellulärer DNA und Proteinen in NETs zurückzuführen sind, zeigen intakte Neutrophile keine Kolokalisation. Hier werden die NET-Komponenten in der Regel getrennt in den Granula, Zellkernen und Zytosol3 gelagert.

Seit ihrer ersten Entdeckung hat sich gezeigt, dass NETs bei zahlreichen Krankheiten, insbesondere bei Entzündungen, eine zentrale Rolle spielen. NETs zeigen antimikrobielle Funktionen während der Infektion, indem sie extrazelluläre Krankheitserreger in Blut und Gewebe einfangen und abtöten 4,5. NETs wurden jedoch auch mit Autoimmunerkrankungen und hyperinflammatorischen Reaktionen wie systemischem Lupus erythematodes, rheumatischer Arthritis und allergischem Asthma in Verbindung gebracht 6,7,8. NETs fördern Vaso-Verschluss und Entzündung bei Atherosklerose, Thrombozytenadhäsion und es wird spekuliert, dass sie eine Rolle bei metastasierendem Krebs spielen 9,10,11. Dennoch wird angenommen, dass sie entzündungshemmende Eigenschaften haben, indem sie den proinflammatorischen Zytokinspiegel senken12. Während NETs in einem breiteren Forschungsfeld immer mehr an Interesse gewinnen, ist eine robuste NET-Detektionsmethode für die zukünftige Forschung von grundlegender Bedeutung.

Auch wenn die Visualisierung von NETs in verschiedenen Geweben mittels Immunfluoreszenz-Bildgebung komplex ist und angepasst werden muss, ist sie neben der Elektronenmikroskopie derzeit eine der renommiertesten Methoden zur Visualisierung der Wechselwirkungen zwischen NETs und Zellen und wird überwiegend in formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben (FFPE) eingesetzt13,14. Der Vergleich der NET-Bildgebung ist jedoch schwierig, da verschiedene Labore ihre eigenen maßgeschneiderten Protokolle verwenden. Diese Protokolle unterscheiden sich in der Verwendung von Antikörpern, der Antigengewinnung oder der Permeabilisierungsmethode und sind oft für einen bestimmten Gewebetyp optimiert 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.

Nachdem Brinkmann et al. die erste methodische Studie mit immunfluoreszierender Visualisierung von NETs in FFPE-Gewebe veröffentlicht hatten, wollten wir dieses Protokoll für eine größere Vielfalt von Geweben und Spezies optimieren15. Um ein breit anwendbares Immunfluoreszenzprotokoll zu etablieren, testeten wir verschiedene modifizierte Protokolle aus Studien, die Immunfluoreszenzmethoden in FFPE-Gewebe zum Nachweis von NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 verwendeten. 26,27. Darüber hinaus haben wir einen neuen H3cit-Antikörper für eine spezifischere extrazelluläre Färbung ausprobiert28. Wir stellen die Hypothese auf, dass durch die systematische Anpassung aktueller Färbeprotokolle an verschiedene Spezies und Gewebe die In-vitro-Bildgebung verbessert werden kann, was zu einer besseren Darstellung der Interaktion zwischen Neutrophilen und NETs sowohl lokal als auch systemisch führt.

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Protocol

Diese Studie umfasste Mausgewebe aus Experimenten, die von der Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, genehmigt wurden (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Bei den verwendeten Geweben handelte es sich um Maus, Lunge und Dickdarm aus einem septischen Modell und verbrannte Haut. Wir haben 8 Wochen alte männliche und weibliche Mäuse verwendet. Bei allen Versuchen wurde die europäische Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere befolgt. Die anonymisierten menschlichen Proben umfassten Gewebe von neonataler Enterokolitis, verbrannter Haut, Gallengangsatresie, Spondylodiszitis und Myokard. Nach Angaben der Ethikkommission für medizinische Forschung Hamburg bedurften die Proben keiner Einverständniserklärung, die Studie wurde jedoch von der Kommission genehmigt (WF-026/21).

1. Proben-Fixierung

  1. Verwenden Sie das folgende Protokoll, das von Abu Abed und Brinkmann abgeleitet wurde, für die Probenfixierung, Dehydratisierung, Paraffineinbettung, Schnitte und Einbettung 3,15.
    1. Bereiten Sie eine 4%ige Formaldehydlösung vor, indem Sie 40 g Paraformaldehyd (PFA) in 800 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 (TBS) auflösen.
    2. Die Mischung bei 60 °C unter einem Abzug rühren, bis sich das PFA aufgelöst hat. Bringen Sie die Lösung auf Raumtemperatur (RT) und stellen Sie das Volumen mit TBS auf 1.000 ml ein.
    3. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. 2-3 Wochen bei 4 °C oder bis zu 1 Jahr bei −20 °C lagern.
  2. Zur Fixierung der Probe wird frisches Gewebe in TBS-Puffer gelegt und in Stücke zerlegt, die kleiner als 20 mm x 30 mm x 3 mm sind. Tauchen Sie die Gewebeschnitte für 12-24 h in 4%ige Paraformaldehydlösung.
    HINWEIS: Das ursprüngliche Protokoll verwendete eine 2%ige PFA-Lösung und eine Fixierungszeit von 8-20 Stunden. Mit dieser Methode waren einige Gewebeschnitte nach 20 h nicht vollständig fixiert, so dass die PFA-Konzentration auf 4% PFA erhöht wurde.
  3. Überführen Sie die Proben in beschriftete Tissue-Processing-Kassetten. Verwenden Sie lösungsmittelbeständige Marker oder Bleistifte für die Beschriftung.
  4. Beginnen Sie mit der Dehydrierung der Probe, indem Sie die Kassetten 1 h lang in 70%iges Ethanol tauchen. Dann in 80 % Ethanol, 90 % Ethanol, 96 % Ethanol und zweimal in 100 % Ethanol eintauchen, wobei jeder Schritt 1 Stunde dauert.
  5. Zweimal in 100%iges Xylol (Dimethylbenzol) und dann zweimal für jeweils 1 h in 60 °C Paraffin eintauchen.
  6. Verwenden Sie Einbettformen für die Montage und lassen Sie das Paraffin erstarren, bevor Sie die Form entfernen.
  7. Verwenden Sie ein Mikrotom zum Schneiden von 3 μm dicken Gewebeschnitten.
  8. Legen Sie die geschnittenen Abschnitte mit einer Pinzette in ein 37 °C warmes Wasserbad und lassen Sie sie auf der Oberfläche schwimmen, um die Gewebeschnitte zu dehnen.
  9. Legen Sie die Abschnitte auf selbstklebende Objektträger (Materialtabelle) und lassen Sie sie über Nacht in einer 40 °C heißen Wärmekammer trocknen.

2. Rehydrierung der Probe

  1. Zur Entparaffinierung werden die Objektträger in einem Objektträgergestell gestapelt und zweimal für jeweils 5 Minuten in das Xylol-Ersatzmedium Limonen (Materialtabelle) und einmal für 5 Minuten in ein 1:1-Limonen/Ethanol-Gemisch getaucht.
    ACHTUNG: Limonen ist bei 50 °C brennbar und kann allergische Reaktionen hervorrufen. Unter einem Abzug mit Augenschutz und Handschuhen verwenden. Von offenem Feuer fernhalten.
  2. Rehydrieren Sie die Proben in einer absteigenden Ethanolreihe, indem Sie das Objektträgergestell zweimal in 100 % Ethanol und einmal in 96 % Ethanol, 90 % Ethanol, 80 % Ethanol und 70 % Ethanol für jeweils 5 Minuten eintauchen.
  3. Tauchen Sie das Objektträgergestell für 5 Minuten in deionisiertes Wasser (DI-Wasser), um das restliche Ethanol zu entfernen.

3. Autofluoreszenz-Blockierung und Antigen-Rückgewinnung

  1. pH 6 Citrat Target Retrieval Solution (TRS) (Table of Materials) gemäß dem Datenblatt vorbereiten. Dieses TRS ist 10-fach konzentriert. Daher 1:10 mit DI-Wasser verdünnen. In einem Färbeglas aus Kunststoff auf 96 °C vorheizen.
    HINWEIS: TRS bricht die Methylenbrücken, die während der Probenfixierung gebildet werden, um die Antigenepitope freizulegen. Dadurch können die Primärantikörper an ihr Zielantigen binden. Konzentriertes TRS 8 Monate lang bei 2-8 °C lagern. Bereiten Sie immer frisches TRS zu.
  2. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Objektträgergestell und legen Sie sie in eine feuchte Kammer. Pipettieren Sie ein bis zwei Tropfen Autofluoreszenzreduktionsmittel (Materialtabelle) auf jede Probe. 5 Minuten inkubieren.
    HINWEIS: Das Autofluoreszenzreduktionsmittel blockiert die inhärente Autofluoreszenz des Gewebes, die durch endogene Fluorophore und Fixiermittel verursacht wird. Lagern Sie das Autofluoreszenz-Reduktionsmittel bis zu 1 Jahr bei RT.
    HINWEIS: Arbeiten Sie nur mit kleinen Gewebeabschnitten, um ein Austrocknen der Proben oder eine Überschreitung der Inkubationszeit zu vermeiden.
  3. Stapeln Sie die Objektträger wieder in das Objektträgergestell und spülen Sie sie 1 Minute lang in 60%igem Ethanol mit einer Aufwärts- und Abwärtsbewegung, bis das gesamte unbenutzte Autofluoreszenz-reduzierende Reagenz abgewaschen ist.
  4. Tauchen Sie das Objektträgergestell für 5 Minuten in DI-Wasser.
  5. Für die Antigengewinnung werden die Objektträger mit dem vorgewärmten TRS in ein Färbegefäß gegeben. 10 min bei 96 °C im Wasserbad inkubieren.
    HINWEIS: Das 96 °C warme Wasserbad kann durch eine Mikrowelle oder einen Dampfgarer ersetzt werden, wenn der TRS auf 96 °C vorgeheizt ist und eine Inkubationszeit von 10 Minuten bei 96 °C gewährleistet ist.
  6. Nehmen Sie das Färbeglas heraus und lassen Sie es ca. 60-90 Minuten lang langsam auf RT abkühlen.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier für bis zu 4 Stunden pausiert werden, wobei die Folien im TRS verbleiben.
  7. Entferne die TRS, aber bewahre die Objektträger im Glas auf. Zweimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween (TBST, pH 7,4) jeweils 3 Minuten lang spülen, um alle übrig gebliebenen TRS-Rückstände abzuwaschen.
  8. Für die Permeabilisierung wird 0,2 % Triton in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4 hergestellt und in das Färbegefäß gefüllt, um die Proben 10 Minuten lang zu permeabilisieren.
    HINWEIS: Die Permeabilisierung verbessert die Bindung der primären Antikörper an die intrazellulären Zielproteine in den fixierten Proben.
  9. Spülen Sie die Objektträger erneut zweimal in TBST für jeweils 3 min.
  10. Bereiten Sie die Nasskammer vor und legen Sie die Objektträger aus. Wischen Sie überschüssiges Wasser mit Papiertaschentüchern von den Objektträgern ab. Umkreisen Sie jede Probe mit einem hydrophoben Barrierestift, um zu verhindern, dass die Antikörperlösung abläuft.
    HINWEIS: Lassen Sie die Proben nicht austrocknen. Am besten ist es, mit kleinen Abschnitten zu arbeiten.

4. Blockierung der unspezifischen Antikörperbindung

  1. Nehmen Sie gebrauchsfertige Blockierungslösung mit Eselsserum (Materialtabelle) und pipettieren Sie einen Tropfen auf jede Probe. 30 Minuten bei RT inkubieren.
    HINWEIS: Dieser Blockierungsschritt minimiert die Bindung des sekundären Antikörpers an unspezifische Bindungsstellen auf der Probe. Nach der Blockierung dieser unspezifischen Epitope und dem Auftragen des Primärantikörpers bindet der Sekundärantikörper an den Primärantikörper und interagiert nicht mit der Oberfläche des Gewebes. Dieses gebrauchsfertige Blockierungsreagenz wird 6 Monate lang bei 2-8 °C gelagert.
  2. Entfernen Sie überschüssige Blockierungslösung von Objektträgern, indem Sie die Kante der Objektträger gegen eine harte Oberfläche klopfen. Spülen Sie sie nicht aus.

5. Primärer Antikörper

  1. Primärantikörper im Antikörperverdünnungspuffer verdünnen (Materialtabelle). Verwenden Sie für jede Probe ca. 100 μl der endgültigen Lösung. Für den NE- und H3cit-Antikörper (R8) und die Isokontrolle auf eine Konzentration von 5 μg/ml verdünnen. Für MPO und die entsprechende Isokontrolle verwenden Sie 10 μg/ml. Bereiten Sie ein Röhrchen für jeden Primärantikörper und eines für jeden Isocontrol-Antikörper vor.
    HINWEIS: H3cit (R8)/MPO oder NE/MPO und ihre Isokontrollen können für die NET-Färbung kombiniert werden. Für die Kombination von H3cit (R8)/MPO wird auf eine Endkonzentration von 5 μg/ml für H3cit (R8) und 10 μg/ml für MPO auf ein Endvolumen von 100 μl pro Probe verdünnt. Bei NE/MPO auf eine Endkonzentration von 5 μg/ml für NE und 10 μg/ml für MPO auf ein Endvolumen von 100 μl pro Probe verdünnen. Verwenden Sie für die Isokontrolle die gleiche Konzentration wie für jeden entsprechenden Antikörper. Verwenden Sie für jeden verwendeten Antikörper immer eine neue Pipettenspitze. Primärantikörper können bei 4 °C für 1-2 Wochen und bei −20 °C oder −80 °C für bis zu 1 Jahr gelagert werden.
  2. Verwenden Sie mit zwei Proben auf einem Objektträger eine für die Isocontrol-Antikörper und eine für die MPO/H3cit- oder MPO/NE-Antikörperverdünnung. Verwenden Sie ca. 100 μl für jede Probe und verteilen Sie die Antikörperlösung gleichmäßig.
    HINWEIS: Lassen Sie die Proben nicht austrocknen. Achten Sie darauf, dass Sie die Isokontroll- und Primärantikörper nicht verwechseln.
  3. Über Nacht in einer Feuchtkammer bei 4 °C lagern.
  4. Klopfen Sie am nächsten Tag die überschüssige Primärantikörperlösung von den Objektträgern ab und stapeln Sie die Objektträger in einer Küvette. Dreimal für jeweils 5 Minuten mit TBST spülen, um die verbleibende Primärantikörperlösung abzuwaschen.

6. Sekundärer Antikörper

  1. Bereiten Sie die Sekundärantikörperlösung vor. Verwenden Sie zwei verschiedene fluoreszierende Sekundärantikörper: Esel-Anti-Ziege für MPO und Esel-Anti-Kaninchen für die H3cit-Färbung. Verdünnen Sie sie jeweils auf eine Konzentration von 7,5 μg/ml mit Antikörper-Verdünnungspuffer (Materialtabelle).
    HINWEIS: Verwenden Sie für die Doppelfärbung zwei fluoreszierende Antikörper mit unterschiedlichen Anregungsbereichen und minimaler spektraler Überlappung. Kombinieren Sie beide Sekundärantikörper und verdünnen Sie sie auf eine Endkonzentration von 7,5 μg/ml für jeden Antikörper, um ein Endvolumen von 100 μl pro Probe zu erhalten. Schützen Sie die Antikörper vor Licht. Die Sekundärantikörper können bei 2-8 °C für 6-8 Wochen oder bei -80 °C für bis zu 1 Jahr gelagert werden.
  2. Bewahren Sie die Objektträger in der Nasskammer auf und geben Sie 100 μl der Sekundärantikörperlösung auf jede Probe. Lassen Sie sie 30 Minuten bei RT und lichtgeschützt inkubieren.
  3. Klopfen Sie die überschüssige Sekundärantikörperlösung ab und stapeln Sie die Objektträger im Objektträgergestell. Dreimal für jeweils 5 Minuten in ein mit PBS gefülltes Färbegefäß eintauchen, um alle verbleibenden ungebundenen Antikörper abzuwaschen.
  4. Bereiten Sie die DAPI-Lösung (4',6-Diamidino-2-phenylindol) (Materialtabelle) vor und verdünnen Sie sie mit DI-Wasser auf eine Konzentration von 1 μg/ml. Tauchen Sie das Objektträgergestell in ein Färbegefäß mit DAPI-Lösung und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
    HINWEIS: DAPI wird als Fluoreszenzfärbung für doppelsträngige DNA verwendet. Die vorbereitete DAPI-Lösung kann mehrfach verwendet werden. Bewahren Sie die vorbereitete DAPI-Lösung bei RT auf. Das DAPI-Konzentrat kann bei −20 °C bis zu 1 Jahr gelagert werden.
  5. Tauchen Sie das Objektträgergestell für 5 Minuten in ein Färbegefäß mit PBS, um die überschüssige DAPI-Lösung abzuwaschen.

7. Montieren und Lagern der Proben, mikroskopische Analyse

  1. Montieren Sie die Proben mit Deckgläsern und Eindeckmedium (Materialtabelle).
    HINWEIS: Verwenden Sie nur kleine Mengen des Eindeckmediums und wischen Sie das überschüssige Medium mit feuchten Taschentüchern ab. Tragen Sie Handschuhe und vermeiden Sie es, versehentlich Medien von den Deckgläsern oder Objektträgern abzuwischen. Vermeiden Sie Blasenbildung und drücken Sie mit Wattestäbchen vorsichtig auf die Deckgläser, um Blasen von den Objektträgern zu entfernen.
  2. Verwenden Sie für die Bildgebung ein Weitfeldmikroskop oder ein konfokales Mikroskop.
    HINWEIS: Machen Sie zuerst ein Bild von der Isokontrolle. Verringern Sie die Belichtungszeit für die Fluoreszenzfilter (mit Ausnahme des Blaufilters für DAPI), bis fast kein Signal mehr detektiert werden kann. Verwenden Sie dann diese Einstellung, um die entsprechenden Beispiele zu untersuchen. Suchen Sie nach Bereichen, in denen mit Hilfe des Fluoreszenzkanals ein Fluoreszenzsignal in jeder einzelnen Probe detektiert werden kann. Nach der Aufnahme eines Bildes des Bereichs erzeugt das Programm ein zusammengesetztes Bild aller Kanäle und zeigt die verschiedenen Fluoreszenzsignale als Überlappung verschiedener Farben an. Das Bild kann dann für die Co-Lokalisierung mit Bildgebungssoftware wie ImageJ weiter analysiert werden.
  3. Lagern Sie die Objektträger bis zu 6 Monate bei 4 °C.

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Representative Results

Bevor wir mit unserer Protokolloptimierung begannen, identifizierten wir die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Färbung, indem wir in PubMed nach Studien suchten, die FFPE-Gewebe für die Immunfärbung von NETs verwendeten, und ihre Protokolle verglichen. Die erfolgversprechendsten Protokollunterschiede wurden als Schlüsselschritte für die Protokolloptimierung identifiziert, während Schritte, die größtenteils miteinander korrespondierten, nicht verändert wurden (Tabelle 1).

Tabelle 1: PubMed-Forschung zur FFPE-Immunfärbung von NETs. Diese Tabelle zeigt die Variablen im Immunfärbeprotokoll in den untersuchten Studien. Die verwendeten Protokolle wurden in ihre wesentlichen Schritte zerlegt und anschließend miteinander verglichen. Die Schritte mit den vielversprechendsten Unterschieden wurden dann als Schlüsselschritte zur Optimierung genommen und für unser Protokoll angepasst. Schritte, die größtenteils miteinander übereinstimmten, wurden nicht verändert, wie z.B. die Inkubationszeit für den Primärantikörper (über Nacht, 4 °C). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Basierend auf unseren Ergebnissen kamen wir zu dem Schluss, dass die Antikörper, die ausgewählt wurden, um auf die Epitope abzuzielen, der erste kritische Schritt war. Mindestens 10 verschiedene Protokolle verwendeten den triH3cit-Antikörper (siehe Tabelle 1; Primäre Antikörpersäule). Nichtsdestotrotz fanden Thålin et al. heraus, dass der H3cit (R8)-Klon eine geringere Off-Target-Kreuzreaktivität gegenüber nicht-citrullinierten Histonen und eine vernachlässigbare Variabilität zwischen den Chargen zeigte. Daher haben wir uns entschlossen, die Ergebnisse der triH3cit- und H3cit (R8)-Färbung miteinander zu vergleichen28.

In vier Studien wurde der MPO-Antikörper von Mensch und Maus verwendet. Darüber hinaus wurde in zwei weiteren Protokollen MPO (2D4) für Mausgewebe und MPO (2C7) für menschliches Gewebe angewendet (siehe Tabelle 1; Primäre Antikörpersäule). Daher haben wir MPO (2C7) separat mit humanen/Maus-MPO-Antikörpern für menschliches Gewebe und MPO (2D4) mit humanen/Maus-MPO-Antikörpern für Mausgewebe verglichen. NE wurde mit mindestens fünf verschiedenen Antikörpern nachgewiesen, aber nur drei von ihnen zeigten in den bereitgestellten Bildern gute Färbeergebnisse. Da ein Antikörper jedoch nicht mehr auf dem Markt verfügbar war, verglichen wir für unsere Testreihe in menschlichem Gewebe den NE-Antikörper eines Kaninchenwirts mit einem von einem Mauswirt. Für Mausproben schien es zu Beginn dieser Studie keine verfügbare und zuverlässige Alternative zu dem NE-Antikörper zu geben, der im Kaninchenwirt gezüchtet wurde. Da ein NE- und beide H3cit-Antikörper vom selben Kaninchenwirt stammen, können sie mit diesem Protokoll nicht für eine Doppelfärbung kombiniert werden. Der sekundäre Antikörper ist spezifisch für die konstante Region des primären Antikörpers, die durch den Wirt bestimmt wird, in dem er aufgezogen wurde. Wenn zwei Primärantikörper desselben Wirts verwendet werden, könnte der Sekundärantikörper an beide Primärantikörper binden, und die Färbung wäre unspezifisch. Die Doppelfärbung wird jedoch der Einzelfärbung vorgezogen, da mehr NET-Komponenten nachgewiesen und kolokalisiert werden können. Daher wird das Färbeergebnis spezifischer sein. Folglich haben wir H3cit und MPO doppelt gefärbt, um ein robusteres Detektionsprotokoll zu erhalten.

Trotz der Ähnlichkeiten der verwendeten Antikörper variierten die Verdünnungen der Antikörper in fast allen Protokollen; Für triH3cit lag der Konzentrationsbereich beispielsweise zwischen 0,5 μg/ml und 20 μg/ml17,18. Für jeden verwendeten Antikörper haben wir verschiedene Verdünnungen ausprobiert und zufriedenstellende Färbeergebnisse in dem gesamten in der Literatur berichteten Bereich erzielt.

Darüber hinaus konnten viele Ähnlichkeiten in der Inkubationszeit für den Primärantikörper (über Nacht bei 4 °C) und der Verwendung und Verdünnung des Sekundärantikörpers gefunden werden (siehe Tabelle 1; Inkubations-Primärantikörper-Kolonne). Daher haben wir diese Schritte in unseren Testreihen nicht verändert und nach dem oben beschriebenen Protokoll durchgeführt.

Der nächste kritische Schritt, der aus der Literatur ermittelt wurde, war das Antigen-Retrieval. Dieser Schritt ist unerlässlich, da aufgrund der Formalinfixierung die Epitope für die Antikörper durch Methylenbrücken maskiert werden, was durch Erhitzen des Gewebeschnitts in einem geeigneten Puffer29 rückgängig gemacht werden kann. Citrat TRS bei pH 6 und EDTA TRS-Puffer bei pH 9 wurden in der Literatur gleich häufig verwendet und lieferten ähnliche Ergebnisse (siehe Tabelle 1; TRS-Pufferspalte). Daher haben wir uns für unsere Testreihe für das pH 6 Citrat TRS entschieden. Für die Antigengewinnung haben wir zwei verschiedene Heizmethoden getestet: eine Mikrowelle (zuerst 1 min bei 360 W und dann 9 min bei 90 W) und ein Wasserbad (60 °C für 90 min, 96 °C für 10 min).

Der letzte Schritt, der in der Literatur eine gewisse Variabilität zeigte, war die Permeabilisierung mit Triton X-100. Dieser Schritt erforderte eine Optimierung, da bei einer Detergenzienbehandlung die Zellmembran für Antikörper durchlässig wird und intrazelluläre Epitope erreicht werden können30. Die bisherigen Protokolle verwendeten unterschiedliche Triton X-100-Konzentrationen im Bereich von 1 % bis 0,1 % (siehe Tabelle 1; Permeabilisierungssäule). Daher haben wir zwei Triton X-100-Konzentrationen (0,2 % und 0,5 %) und eine Serie ohne Triton-Permeabilisierung ausprobiert.

Nachdem wir diese Schlüsselschritte identifiziert hatten, änderten wir sie und versuchten, das Protokoll zu optimieren. Anschließend wurden die Bilder anhand eines Auswertungsbogens untersucht und die Unterschiede semi-quantitativ erfasst und verglichen (siehe Tabelle 2).

Tabelle 2: Ergebnistabelle zur Optimierung der Protokollschritte. Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse für die angepassten Schritte: Autofluoreszenzreduktionsmittel, Antigengewinnung und Permeabilisierung. Bevor wir mit dieser Testreihe begonnen haben, haben wir die beste Antikörperkombination und -konzentration getestet. Die Objektträger wurden in 10 verschiedenen Bereichen ausgewertet, und dann wurde ein repräsentativer Bereich von (-) für ein negatives Ergebnis bis (++) für ein positives NET-enthaltendes Ergebnis bewertet. Zu den teilweise positiven Ergebnissen gehörte eine höhere diffuse Hintergrundfärbung von nicht-neutrophilen Zellen. Abkürzungen: n/u = nicht verwendet; - = negatives Ergebnis; +/-teilweise positive Färbung; + = mäßige spezifische Färbung; + = gute Färbung von NETs und Neutrophilen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Primäre Antikörper
Bevor wir das Protokoll angepasst haben, haben wir versucht, die beste Antikörperkombination zu finden. Hier zeigte das triH3cit eine stärkere intrazelluläre Histonfärbung als das H3cit (R8). Für den Nachweis von NETs haben wir uns entschieden, den Antikörper H3cit (R8) für unsere Protokolloptimierung zu verwenden. Dieser Antikörper bindet nur an das extrazelluläre H3cit und zeigte keine Färbung des intrazellulären H3cit in dieser Konzentration (siehe Abbildung 1A,B).

Für die MPO-Färbung verglichen wir den MPO-Antikörper von Mensch und Maus mit dem MPO (2C7) für menschliches Gewebe (siehe Abbildung 1C,D) und dem MPO (2D4) für Mausgewebe (siehe Abbildung 1E,F). Die Antikörper MPO (2D4) und MPO (2C7) konnten keine konsistente Färbung für mehrere Gewebetypen erreichen, während die MPO von Mensch und Maus zu einer zuverlässigen, guten Färbung von MPO führte. Daher haben wir Mensch/Maus MPO für unser Färbeprotokoll ausgewählt.

Für NE haben wir einen NE-Antikörper von einem Mauswirt auf menschlichem Gewebe getestet, der nur in einer von fünf Proben eine NE-Färbung zeigte, verglichen mit der zuverlässigen Färbung des NE-Antikörpers von einem Kaninchenwirt. Darüber hinaus ist der NE-Antikörper aus einem Kaninchenwirt auf menschliches und Mausgewebe anwendbar. (siehe Abbildung 1G,H).

Figure 1
Abbildung 1: Vergleich von Primärantikörpern in verschiedenen Geweben. (A) Gewebe der humanen neonatalen Enterokolitis (NEC), gefärbt mit H3cit (R8) (rot). Hier kann nur ein extrazelluläres Signal detektiert werden. (B) Dasselbe Gewebe, gefärbt mit triH3cit (R2,8,17) (rot). Dieser Antikörper erzeugt ein breiteres Signal mit intensiver intrazellulärer Färbung von citrullinierten Histonen (gelbe Pfeile). (C,E) Humanes NEC-Gewebe (C) und Maus-Volvulus-Gewebe (E) mit guter Färbung für H3cit (R8) (rot) und Maus/humanes MPO (grün). Die Kolokalisierung der H3cit-, MPO- und DAPI-Signale (blau) zeigt die NET-Bildung an (weiße Pfeile). (D,F) Im Vergleich dazu konnte (D) unter Verwendung des MPO (2C7) für humanes NEC-Gewebe und (F)MPO (2D4) (grün) für das Volvulus-Gewebe der Maus kein MPO-Signal erhalten werden. (G) Verbrannte menschliche Hautprobe mit sehr starker Färbung für den NE-Antikörper von einem Kaninchenwirt (Magenta) im Vergleich zum (H)-negativen Färbeergebnis für den NE-Antikörper von einem Mauswirt. Für die Isotypkontrolle siehe Ergänzende Abbildung Isocontrol 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Entparaffinierung
Hier wurde das Xylol durch Limonen ersetzt, was im Vergleich zu Xylol eine bessere Entparaffinierung der Gewebeproben mit weniger Autofluoreszenz im Hintergrund zeigte (siehe Abbildung 2A,B).

Autofluoreszenz-Reduktionsmittel
Das gebrauchsfertige Autofluoreszenz-Reduktionsmittel auf Basis von Sudan Black kann 2-20 Minuten angewendet werden. Hier haben wir es für 0 min, 5 min und 10 min angewendet. Wenn keine Blockierung verwendet wurde, zeigten einige Mausproben eine unspezifischere Färbung, und es konnte eine teilweise positive Färbung erreicht werden (siehe Abbildung 2C). Die Blockierungszeit von 5 Minuten zeigte gute Ergebnisse bei allen Gewebetypen mit Ausnahme von H3cit und MPO im Lungen- und Hautgewebe der Maus (siehe Tabelle 2). Bei einer Blockierungszeit von 10 Minuten in einigen Proben begann die Färbung weniger hell zu sein, so dass der Zeitrahmen von 5 Minuten die beste Wahl für die Blockierung der Autofluoreszenz ist (siehe Abbildung 2D, E).

Figure 2
Abbildung 2: Entparaffinisierungsmethoden und Verwendung eines Autofluoreszenzreduktionsmittels. (A) Humanes Spondylodiszitis-Gewebe, das mit Limonen deparaffiniert und auf H3cit (rot) und MPO (grün) gefärbt wurde. Die gestrandete Bildung der Signale und die teilweise Kolokalisierung deuten auf das Vorhandensein von NETs hin (weißer Pfeil). (B) Dieselbe Gewebeprobe wurde mit Xylol deparaffiniert, was zu ähnlichen Färbeergebnissen führte, was darauf hindeutet, dass das weit verbreitete Xylol durch ein Ersatzmedium ersetzt werden kann. (C-E) Lungengewebe der Maus nach induzierter Sepsis mit unterschiedlichen NE-Färbemustern (Magenta), wenn unterschiedliche Inkubationszeiten für das Autofluoreszenz-Reduktionsmittel verwendet werden. Ohne Verwendung eines Autofluoreszenzreduzierers zeigt Bild C immer noch eine leichte Hintergrundfärbung der Erythrozyten (roter Pfeil). Im Gegensatz dazu zeigt Bild D, dass nach 5 min Inkubation mit einem Autofluoreszenz-Reduktionsmittel ein klares Signal ausgegeben wird. Nach 10 Minuten nimmt die Färbequalität in Bild E ab und das Signal wird weniger hell. Für die Isotypkontrolle siehe Ergänzende Abbildung Isocontrol 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Methoden zur Antigengewinnung
Für die NE-Färbung erhitzten wir die Proben in pH-6-Citratpuffer für 10 min in der Mikrowelle (zuerst für 1 min bei 360 W und dann für 9 min bei 90 W), für 10 min in einem Wasserbad bei 96 °C oder für 90 min in einem Wasserbad bei 60 °C. Hier zeigten die höheren Temperaturen im Mikrowellen- und Wasserbad durchweg eine moderate bis gute Antigengewinnung (siehe Abbildung 3A). Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der Mikrowelle und dem 96 °C warmen Wasserbad festgestellt (siehe Tabelle 2). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass in einem 60 °C warmen Wasserbad nur teilweise positive bis keine Färbungen auftraten (siehe Abbildung 3B). Nur das humane Ileum und das humane Myokard zeigten gute spezifische Ergebnisse. Da mit dem 60 °C-Wasserbad keine adäquate Färbung für NE erreicht werden konnte, wurde die 60 °C-Wasserbad-Versuchsreihe für H3cit und MPO verworfen.

Für die Doppelfärbung mit MPO und H3cit erhitzten wir die Proben in pH 6 Citratpuffer in der Mikrowelle für 10 min (zuerst für 1 min bei 360 W und dann für 9 min bei 90 W) oder in einem Wasserbad bei 96 °C für 10 min. Hier zeigten beide Methoden gute spezifische Ergebnisse, wobei die Ergebnisse für das 96 °C-Wasserbad etwas günstiger waren (siehe Abbildung 3C). Nur Lungen- und Hautgewebe der Maus konnten ein moderates Gesamtranking erreichen (siehe Tabelle 2).

Eine Überschreitung der Inkubationszeit von 40 min bei 96 °C führte jedoch zu einer weniger intensiven Antikörperfärbung, während eine wesentlich stärkere Hintergrundfärbung beobachtet werden konnte (siehe Abbildung 3D).

Figure 3
Abbildung 3: Methoden zur Antigengewinnung. (A) Volvulus-Gewebe der Maus, das mit einer 10-minütigen Inkubationszeit bei 96 °C für die Wärmegewinnung auf NE (magenta) gefärbt wurde, zeigt ein signifikant stärkeres Signal als (B) bei 90-minütiger Inkubation der Probe in einem 60 °C-Wasserbad. (C) Darüber hinaus führt die 10-minütige Inkubation bei 96 °C Antigen-Retrieval auch zu einem starken Signal für H3cit (rot) und MPO (grün) mit kombinierter NET-Färbung (weiße Pfeile). D: Das Kochen der Proben für mehr als 40 Minuten führt jedoch zu einer weniger spezifischen extrazellulären H3cit-Färbung und keiner MPO-Färbung. Für die Isotypkontrolle siehe Ergänzende Abbildung Isocontrol 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Permeabilisierung
Wir versuchten, die Proben mit Triton X-100 in zwei Verdünnungen (0,2 % und 0,5 %) für 10 Minuten zu permeabilisieren und verglichen dies mit 10 Minuten in deionisiertem Wasser. Hier erzielten 10 min mit Triton 0,2 % gute Ergebnisse über alle Gewebetypen hinweg, auch wenn die Unterschiede im Vergleich zu den 0,5 % Triton- und deionisierten Wasserbedingungen gering waren (siehe Tabelle 2).

Ergänzende Abbildung Isocontrol 1: Isotyp-Steuerelemente für Abbildung 1. Alle Bilder zeigen eine gute DAPI-Färbung (blau), aber kein Signal für den fluoreszierenden Antikörper. Dies bestätigt, dass die Bindung von Primärantikörpern in Abbildung 1 spezifisch für das Zielantigen ist und nicht das Ergebnis unspezifischer Bindung oder Proteininteraktionen ist. (A) Humanes neonatales Enterokolitis (NEC)-Gewebe, gefärbt mit dem isocontrol-Antikörper gegen H3cit (R8) (rot). (B) NEC-Gewebe, gefärbt mit dem isocontrol-Antikörper gegen H3cit (R2,8,17) (rot). (C) NEC-Gewebe (E) und Maus-Volvulus-Gewebe, gefärbt mit den isokontrollierten Antikörpern gegen H3cit (R8) (rot) und Maus-/Human-MPO (grün). (D) NEC-Gewebe, gefärbt mit den isokontrollierten Antikörpern gegen H3cit (R8) (rot) und MPO (2C7) (grün). (F) Volvulus-Gewebe der Maus, gefärbt mit den Isocontrol-Antikörpern gegen H3cit (R8) (rot) und MPO 2D4 (grün). G: Verbrannte menschliche Hautprobe, gefärbt mit dem Isocontrol-Antikörper für den NE-Antikörper eines Kaninchenwirts (Magenta). (H) Dasselbe Gewebe, das mit dem Isocontrol-Antikörper für den NE-Antikörper eines Mauswirts (Magenta) gefärbt wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung Isocontrol 2: Isotyp-Steuerelemente für Abbildung 2. Alle Bilder zeigen eine gute DAPI-Färbung (blau), aber kein Signal für den fluoreszierenden Antikörper. Dies bestätigt die spezifische Bindung der Primärantikörper in Abbildung 2. Die Bilder C-E zeigen aufgrund der langen Belichtungszeiten noch einige Hintergrundfärbungen in Magenta. Das NE-Signal in Abbildung 2 ist jedoch von der Hintergrundfärbung zu unterscheiden. (A) Humanes Spondylodiszitis-Gewebe, das mit Limonen deparaffiniert und mit den isokontrollierten Antikörpern für H3cit (R8) (rot) und Maus/humanes MPO (grün) gefärbt wurde. (B) Dieselbe Gewebeprobe wurde mit Xylol deparaffiniert und mit den isocontrol-Antikörpern für H3cit (rot) und MPO (grün) gefärbt. (C) Lungengewebe der Maus, gefärbt mit dem Isocontrol-Antikörper für NE (Magenta), ohne Verwendung eines Autofluoreszenzreduktionsmittels. (D) Dasselbe Gewebe wurde mit dem isocontrol-Antikörper für NE (Magenta) gefärbt und 5 Minuten Inkubation mit einem Autofluoreszenz-Reduktionsmittel durchgeführt. (E) Dasselbe Gewebe gefärbt mit dem isocontrol-Antikörper für NE (Magenta) und 10-minütiger Inkubation mit einem Autofluoreszenzreduktionsmittel. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung Isocontrol 3: Isotyp-Steuerelemente für Abbildung 3. Alle Bilder zeigen eine gute DAPI-Färbung (blau), aber kein spezifisches Signal für den fluoreszierenden Antikörper. Dies bestätigt die spezifische Bindung der Primärantikörper in Abbildung 3. (A) Volvulus-Gewebe der Maus, gefärbt mit dem isocontrol-Antikörper für NE (Magenta) unter Verwendung einer 10-minütigen Inkubationszeit bei 96 °C zur Wärmegewinnung. (B) Dasselbe Gewebe wird mit dem isocontrol-Antikörper für NE (Magenta) gefärbt und 90 min lang in einem 60 °C warmen Wasserbad entzogen. (C) Gleiches Gewebe, gefärbt mit dem isocontrol-Antikörper gegen H3cit (rot) und MPO (grün) und mit identischen Wärmerückgewinnungsbedingungen wie in A. Der grüne Punkt zeigt ein Färbeartefakt von aggregierten Sekundärantikörpern. (D) Dasselbe Gewebe, gefärbt mit dem isocontrol-Antikörper für H3cit (rot) und MPO (grün) und unter Verwendung einer 40-minütigen Inkubationszeit bei 96 °C zur Wärmegewinnung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung Isocontrol 4: Isotyp-Steuerelemente für Abbildung 4. Alle folgenden Isokontrollen stammen vom gleichen Objektträger wie das entsprechende "fehlgeschlagene" Experiment. Die fehlgeschlagenen Versuche wurden nicht absichtlich unternommen, so dass einige Isokontrollen verwendbar erscheinen, während die Probe es nicht war. (A) NEC-Gewebe, gefärbt mit dem isocontrol-Antikörper für H3cit (rot) und MPO (grün). Diese Probe wurde schneller verarbeitet, ohne auszutrocknen. Daher ist keine übermäßige Hintergrundfärbung sichtbar. Bei den grünen und roten Strukturen handelt es sich um sekundäre Antikörperaggregate. (B) Spondylodiszitis-Gewebe, gefärbt mit dem Isocontrol-Antikörper für NE (magenta). Hier war die Entparaffinierung erfolgreich, so dass keine Paraffinreste zu sehen sind. (C) NEC-Gewebe, gefärbt mit dem isocontrol-Antikörper gegen H3cit (rot) und MPO (grün). Obwohl die gleichen unsachgemäß gelagerten Sekundärantikörper verwendet wurden, wäre für dieses Isocontrol-Bild keine Färbung zu erwarten. Daher kann dieses Bild nicht verwendet werden, um die spezifische Bindung des entsprechenden Bilds auszuwerten. (D) Verbrannte menschliche Haut, gefärbt mit dem Isocontrol-Antikörper gegen H3cit (rot) und MPO (grün). Hier wurde die Montage sorgfältiger durchgeführt, und es ist keine Lichtstreuung durch Luftblasen zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

In dieser Arbeit zielten wir darauf ab, die bestehenden Protokolle für die Bildgebung von NETs an weitere Gewebetypen anzupassen und zu optimieren, beginnend mit dem eigentlichen Färbeprozess. Der erste kritische Schritt für diese Methode ist die Auswahl der am besten geeigneten Antikörper. Für NE haben wir einen NE-Antikörper von einem Mauswirt auf menschlichem Gewebe getestet, der im Vergleich zu NE von einem Kaninchenwirt keine zuverlässige Färbung zeigte. Darüber hinaus schlugen Thålin et al. H3cit (R8) als spezifischeren Antikörper für die extrazelluläre Färbung vor. Wir verglichen diesen Antikörper mit dem weit verbreiteten triH3cit (R2, R8, R17). Unsere Studie zeigte, dass der H3cit (R8) Antikörper nur für ein extrazelluläres Signal in den verwendeten Konzentrationen gefärbt wurde, was eine einfachere Erkennung von NETs auf den Objektträgern ermöglichte. Dieser Befund unterstützt die Behauptungen von Thålin et al., dass der H3cit (R8)-Klon ein gutes NET-Signal mit verminderter Off-Target-Kreuzreaktivität zu nicht-citrullinierten Histonen liefern kann28. Wir verglichen auch MPO-Antikörper für menschliches und Mausgewebe für die MPO-Färbung. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Maus/Human-MPO-Antikörper eine zuverlässigere Färbung zeigte und gleichzeitig auf Human- und Mausproben angewendet werden kann, was die Verwendung im Labor vereinfacht. Daher empfehlen wir, diese Antikörperkombination, H3cit (R8) und Maus/Mensch-MPO, für zukünftige Forschungen zu verwenden und sie in unser Protokoll zu integrieren.

Allerdings gibt es bei dieser Antikörperselektion eine Einschränkung für mehrfache Färbeversuche. Dieses Protokoll wurde modifiziert, um Primärantikörper von verschiedenen Wirten zu verwenden. Andernfalls könnte ein Sekundärantikörper an beide Primärantikörper binden. Der H3cit-Antikörper stammt vom selben Wirt wie der NE-Antikörper, so dass wir NE und H3cit nicht zusammen färben konnten. Auch wenn in dieser Studie keine Dreifachfärbung (NE, H3cit, MPO) durchgeführt wurde, könnte dieses Protokoll in Zukunft als Grundlage für Dreifachfärbungsexperimente dienen. Eine mögliche Option für die Dreifachfärbung oder die NE- und H3cit-Doppelfärbung könnte der Austausch eines dieser Antikörper gegen einen zuverlässigen Antikörper eines anderen Wirts sein. In diesem Fall könnte ein möglicher Kombinationspartner der NE-Antikörper (Santa Cruz; sc-55549) von Schafen sein, der von Knackstedt et al. verwendet wird.24. Eine weitere Option von Duler et al. wurde 2021 veröffentlicht, wo sie eine konsekutive Doppelfärbemethode verwendeten und NE und H3cit aus einem Kaninchenwirt kombinierten26. Eine weitere vielversprechende Anwendung einer Mehrfachfärbemethode ist die Unterscheidung zwischen intra- und extravaskulärer NET-Bildung. Anstelle der Dreifachfärbung für NET-Marker könnte die doppelte NET-Färbung mit einer zusätzlichen Gefäßfärbung kombiniert werden. Darüber hinaus haben immer mehr Studien die intra- und extravaskuläre Verteilung von NETs untersucht, um mehr Wissen über die Pathomechanismen bestimmter Krankheiten, wie z.B. der Alzheimer-Krankheit, zu gewinnen. Smyth et al.31 beschrieben ein vielversprechendes und tiefgreifendes Protokoll, das dem unseren ähnelt, um zwischen den beiden möglichen Lokalisationen zu unterscheiden. Sie modifizierten ihr bestehendes NET-Färbeprotokoll, indem sie ein biotinyliertes Lektin zur Markierung von Endothelzellen hinzufügten und ein Fluorophor-konjugiertes Streptavidin für die Immunfluoreszenzfärbung von Lektin verwendeten. Durch die Untersuchung der Kolokalisation von Lektin- und NET-Markern im selben Bild konnten sie intravaskuläre NETs identifizieren31. In diesem Zusammenhang sind weitere Studien erforderlich, um die Anwendung unseres Protokolls zu erweitern.

Nachdem die am besten geeignete Antikörperkombination gefunden wurde, ist der nächste entscheidende Schritt die Einführung eines Autofluoreszenz-reduzierenden Mittels. Exogene Faktoren wie die Probenfixierung mit Formaldehydfixiermitteln und endogene Faktoren wie Erythrozyten können zu einer hohen Autofluoreszenz führen, was die Bestimmung der Kolokalisation erschwert32. Dieses Problem tritt hauptsächlich in den blauen (Anregungsbereich: 430-480 nm) und grünen Fluoreszenzspektren (Anregungsbereich: 500-550 nm) auf und kann zu nicht eindeutigen Färbeergebnissen führen, wenn ein Fluoreszenzantikörper mit dem gleichen Anregungsbereich verwendet wird3. In der Literatur wird berichtet, dass Sudanschwarz ein wirksames Mittel zur Reduzierung der inhärenten Gewebeautofluoreszenz ist33. Sudan Black ermöglicht es, mit den blauen oder grünen Fluoreszenzkanälen klarere Färbeergebnisse zu erzielen. Dieser Anregungsbereich wird für zukünftige Mehrfachfärbeversuche notwendig sein, da der blaue und der grüne Kanal bei Verwendung eines vierten Fluoreszenzfarbstoffs benötigt werden. Unsere Studie zeigt, dass die optimale Inkubationszeit von der Art des Gewebes und des Antikörpers abhängt, die im Färbeprozess verwendet werden. Nichtsdestotrotz lieferten in dieser Arbeit 5 Minuten Autofluoreszenzreduktionsmittel im Allgemeinen gute Ergebnisse bei allen Gewebetypen und hatten den Vorteil, dass die Probe schwarz gefärbt wurde, wodurch sie auf den Objektträgern besser zu sehen war. Dadurch wurde verhindert, dass Teile des Gewebes im Färbeprozess fehlen, insbesondere bei kleinen Proben.

Ein weiterer wesentlicher Faktor für den Erfolg dieses Protokolls ist eine konstant hohe Temperatur für den Schritt der Antigengewinnung. Unsere Forschung zeigte, dass 10 der 15 vorherigen Studien Temperaturen über 96 °C für die Antigengewinnung 13,15,16,17,19,21,22,25,26,27 verwendeten. Dies stimmte mit unseren Ergebnissen überein, bei denen die Inkubation der Proben in einem 96 °C warmen Wasserbad oder einer Mikrowelle gute Ergebnisse ohne signifikante Unterschiede lieferte. Dennoch empfehlen wir für eine gleichmäßige Wärmeverteilung die Verwendung eines Wasserbades. Bei der Verwendung der Mikrowelle fanden wir einen Temperaturgradienten im Puffer von bis zu 5 °C zwischen der Ober- und Unterseite des Färbegefäßes. Darüber hinaus ist das Wasserbad einfacher zu bedienen und birgt ein geringeres Risiko, dass der Puffer überkocht. Für die Permeabilisierung stellten wir fest, dass der Triton X-100 einen geringeren Einfluss auf die Färbung hatte. Es ist also möglich, diesen Schritt im Protokoll zu überspringen, ohne das Ergebnis negativ zu beeinflussen. Im Allgemeinen lieferten menschliche Proben bessere Ergebnisse als Mäuseproben. Ein Grund dafür könnte sein, dass Menschen einen höheren Anteil an neutrophilen Granulozyten haben als Mäuse34,35. Darüber hinaus zeigten die Lungenproben der Maus keine sichtbare makroskopische Entzündung und weniger Neutrophile, während die Darmproben der Maus makroskopisch entzündet waren und gute Färbeergebnisse zeigten. Die niedrigeren Werte in unserer Studie könnten also auf die geringe Entzündung zurückzuführen sein und nicht darauf, dass das Protokoll nicht optimal funktioniert.

Bei der Fehlerbehebung können kleinere Fehler im Protokoll oder ein nicht sorgfältiger Umgang mit den Proben große Auswirkungen auf die Färbeergebnisse haben. Ein Hauptproblem, das wir identifiziert haben, war die Dehydrierung der Proben. Hier stellten wir fest, dass die gleichzeitige Handhabung von mehr als 10-15 Objektträgern von entscheidender Bedeutung war, da jeder Schritt zeitaufwändig ist und zu einer Austrocknung der Proben führen kann. Dehydrierte Proben sind aufgrund der hohen Hintergrundfärbung und des fehlenden nachweisbaren spezifischen Fluoreszenzsignals nicht mehr verwendbar (siehe Abbildung 4A). Darüber hinaus sollten die Proben vollständig entparaffiniert werden, bevor mit dem Färbeprotokoll begonnen wird. Paraffinrückstände führten zu einem starken Hintergrundsignal, und die Schnittlinien waren im gefärbten Paraffin zu sehen (siehe Abbildung 4B). Darüber hinaus konnte nach mehr als 20 Gefrier-Auftau-Zyklen kein Signal für den sekundären Antikörper gegen MPO nachgewiesen werden (siehe Abbildung 4C). Ein weiterer wichtiger Schritt, der einen großen Einfluss auf die Bildqualität hat, ist die Abwicklung des abschließenden Montageschritts. In dieser Arbeit führten Luftblasen unter dem Deckglas zur Streuung des Fluoreszenzsignals und damit zu einem unscharfen Bild (siehe Abbildung 4D).

Figure 4
Abbildung 4: Tipps zur Fehlerbehebung . (A) Dieses Feld zeigt die Folgen einer ausgetrockneten Probe. Die durchgehend rote Hintergrundfärbung erschwert die Auswertung der Probe. (B) Hier zeigt der rote Pfeil Paraffinreste, die sich durch das gewellte Aussehen auszeichnen, nach einer unzureichenden Entparaffinierung. Diese Überbleibsel führen zu einem hohen Hintergrundsignal und einer schlechteren Bildqualität. (C) Eine unzureichende Antikörperlagerung oder mehr als 20 Gefrier-Auftau-Zyklen führen zur Aggregation des Sekundärantikörpers (grüne Pfeile) und zu keiner Bindung an MPO. (D) Eine nicht sorgfältige Montage kann zu Luftblasen und damit zu Streuung des Fluoreszenzlichts führen (blauer Pfeil). Dies kann die Bildqualität erheblich beeinträchtigen, insbesondere wenn die Streuung das Ziel unscharf macht. Für die Isotypkontrolle siehe Ergänzende Abbildung Isocontrol 4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Auch wenn NETs in der wissenschaftlichen Forschung immer beliebter werden, gibt es immer noch nicht genügend Studien, die sich auf die Methoden zur NET-Detektion konzentrieren 3,13,17,26. Unseres Wissens präsentieren wir die erste Studie, in der Protokolle aus verschiedenen Studien zur Immunfluoreszenz-Bildgebung von NETs in FFPE-Gewebe verglichen werden. Die zuvor veröffentlichten maßgeschneiderten Protokolle unterschieden sich in ihren Antikörper- oder Antigen-Gewinnungsmethoden und waren oft nur für einen Gewebetyp konzipiert, was den Vergleich der NET-Bildgebungsergebnisse erschwerte. Daher haben wir in dieser Studie kritische Schritte identifiziert und ein Protokoll erstellt, das für verschiedene Maus- und menschliche Gewebe geeignet ist. Dies erreichten wir, indem wir einen neuen Primärantikörper für die H3cit-Färbung verwendeten und die Hintergrundfärbung mit einem Autofluoreszenz-Reduktionsmittel reduzierten. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass eine konstant hohe Temperatur entscheidend ist und ein sorgfältiger Umgang mit den Proben für eine erfolgreiche NET-Färbung von grundlegender Bedeutung ist. Daher liefert diese Studie die wesentlichen Schritte zur Entwicklung eines allgemein anwendbaren Protokolls für die Färbung von NETs.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (BO5534) ins Leben gerufen. Wir danken Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dr. Annika Heuer und PD Dr. Ingo Königs für die Bereitstellung von Mustern. Darüber hinaus danken die Autoren dem Team der UKE Microscopy Imaging Facility (Core Facility, UKE Medical School) für die Unterstützung bei der Immunfluoreszenzmikroskopie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
         Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg abcam Ab 68672  1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg abcam Ab 5103 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg abcam Ab 25989 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg abcam Ab 90810 1:50
Axiovision Microscopy Software  Zeiss 4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml GeneTex  GTX30972
Coverslips Marienfeld 0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) Dako S2369
DAPI 25 mg Roth 6335.1 1:25000
DCS antibody dilution 500 mL DCS diagnostics DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3 JacksonImmunoResearch 705-165-147 1:200
Donkey anti rabbit AF647 JacksonImmunoResearch 711-605-152 1:200
Donkey anti rabbit Cy3 JacksonImmunoResearch 711-165-152 1:200
Fluoromount-G Mounting Medium Invitrogen 00-4958-02
Glass slide rack Roth H552.1
Human/Mouse MPO Antibody R&D Systems AF 3667  1:20
Hydrophobic Pen KISKER MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg abcam Ab 37415 1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml Maxvision MB-L
Microscopy camera Zeiss AxioCamHR3
Microwave Bosch HMT84M421
Mouse IgG1 negative control Dako X0931 Aglient 1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control R&D Systems AB-108-C  1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x) Sigma-Aldrich P-3813
PMP staining jar Roth 2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg abcam Ab 219406 1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg abcam Ab 172730 1:300
ROTI Histol Roth  6640
SuperFrost Plus slides R. Langenbrinck 03-0060
TBS Tris buffered saline (x10) Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Water bath Memmert 830476
Water bath rice cooker reishunger RCP-30
Wet chamber Weckert Labortechnik 600016
Zeiss Widefield microscope Zeiss Axiovert 200M

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Immunfluoreszenz-Bildgebung Neutrophile extrazelluläre Fallen NETs bakterielle Infektion traumatische Gewebeschäden Autoimmunerkrankungen sterile Entzündungen doppelsträngige DNA-Filamente Histone antimikrobielle Proteine Krankheitserreger homöostatische Regulation Thrombozytenadhäsion Gerinnung Sepsis Autoimmunerkrankungen therapeutische Intervention Elektronenmikroskopie Färbemethoden Antikörper Autofluoreszenzreduzierende Mittel Antigen-Retrieval-Methoden Permeabilisierung

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 09/29/2023. Citeable Link.

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Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben
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Schoenfeld, L., Appl, B.,… More

Schoenfeld, L., Appl, B., Pagerols-Raluy, L., Heuer, A., Reinshagen, K., Boettcher, M. Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (198), e65272, doi:10.3791/65272 (2023).

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