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Immunology and Infection

Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65272
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

ERRATUM NOTICE

Summary

Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) estão associadas a várias doenças, e a imunofluorescência é frequentemente usada para sua visualização. No entanto, existem vários protocolos de coloração e, em muitos casos, apenas um tipo de tecido é examinado. Aqui, estabelecemos um protocolo geralmente aplicável para coloração de NETs em tecido humano e de camundongo.

Abstract

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são liberadas pelos neutrófilos como resposta à infecção bacteriana ou dano traumático do tecido, mas também desempenham um papel em doenças autoimunes e inflamação estéril. São estruturas semelhantes a teias compostas por filamentos de DNA de fita dupla, histonas e proteínas antimicrobianas. Uma vez liberados, os NETs podem capturar e matar patógenos extracelulares no sangue e no tecido. Além disso, os TNEs participam da regulação homeostática, estimulando a adesão plaquetária e a coagulação. No entanto, a produção desregulada de TNEs também tem sido associada a várias doenças, incluindo sepse ou doenças autoimunes, o que as torna um alvo promissor para intervenção terapêutica. Além da microscopia eletrônica, a visualização de NETs usando imagens de imunofluorescência é atualmente um dos únicos métodos conhecidos para demonstrar interações de NET no tecido. Portanto, vários métodos de coloração para visualização de NETs têm sido utilizados. Na literatura, diferentes protocolos de coloração são descritos, e identificamos quatro componentes-chave mostrando alta variabilidade entre os protocolos: (1) os tipos de anticorpos utilizados, (2) o uso de agentes redutores de autofluorescência, (3) métodos de recuperação de antígenos e (4) permeabilização. Portanto, os protocolos de coloração por imunofluorescência in vitro foram adaptados e aprimorados sistemicamente neste trabalho para torná-los aplicáveis a diferentes espécies (camundongo, humano) e tecidos (pele, intestino, pulmão, fígado, coração, disco vertebral). Após fixação e inclusão em parafina, cortes de 3 μm de espessura foram montados sobre as lâminas. Essas amostras foram coradas com anticorpos primários para mieloperoxidase (MPO), histona citrulinada H3 (H3cit) e elastase neutrofílica (NE) de acordo com um protocolo de coloração modificado. As lâminas foram coradas com anticorpos secundários e examinadas em microscópio de fluorescência de campo largo. Os resultados foram analisados de acordo com uma ficha de avaliação, e as diferenças foram registradas semiquantitativamente.

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado de coloração NET adequado para diferentes tecidos. Usamos um novo anticorpo primário para corar para H3cit e reduzimos a coloração inespecífica com um agente redutor de autofluorescência. Além disso, demonstramos que a coloração NET requer uma alta temperatura constante e manuseio cuidadoso das amostras.

Introduction

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) foram visualizadas pela primeira vez por Brinkmann e col. como uma via de morte celular diferente da apoptose e necrose em 20041. Nessa via, os neutrófilos liberam sua cromatina descondensada no espaço extracelular para formar grandes estruturas semelhantes a teias cobertas por proteínas antimicrobianas que antes eram armazenadas nos grânulos ou citosol. Essas proteínas antimicrobianas incluem elastase neutrofílica (NE), mieloperoxidase (MPO) e histona citrulinada H3 (H3cit), que são comumente usadas para detecção por imunofluorescência indireta de NETs2. Esse método não apenas identifica a presença quantitativa dessas proteínas; na verdade, ele tem a vantagem de detectar especificamente estruturas semelhantes à NET. Nas NETs, as proteínas mencionadas co-localizam-se com o DNA extracelular, que pode ser detectado por uma sobreposição dos sinais de fluorescência de cada proteína corada e do DNA extracelular. Em contraste com os sinais de sobreposição devido ao DNA extracelular e à co-localização de proteínas em NETs, os neutrófilos intactos não mostram co-localização. Aqui, os componentes NET são geralmente armazenados separadamente nos grânulos, núcleos e citosol3.

Desde sua primeira descoberta, tem sido demonstrado que as NETs desempenham um papel central em inúmeras doenças, particularmente aquelas que envolvem inflamação. Os TNEs apresentam funções antimicrobianas durante a infecção através do aprisionamento e morte de patógenos extracelulares no sangue e nos tecidos 4,5. No entanto, os TNEs também têm sido associados a doenças autoimunes e respostas hiperinflamatórias, como lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumática e asma alérgica 6,7,8. Os TNEs promovem vaso-oclusão e inflamação na aterosclerose, adesão plaquetária e especula-se que desempenhem um papel no câncer metastático 9,10,11. No entanto, acredita-se que tenham propriedades anti-inflamatórias, reduzindo os níveis de citocinas pró-inflamatórias12. Embora as NETs estejam ganhando mais interesse em um campo mais amplo de pesquisa, um método robusto de detecção de NET é fundamental para pesquisas futuras.

Embora a visualização de NETs em diferentes tecidos por imunofluorescência seja complexa e necessite de personalização, além da microscopia eletrônica, é atualmente um dos métodos mais renomados para visualizar as interações entre NETs e células, sendo predominantemente utilizada em tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina (FFPE)13,14. No entanto, a comparação de imagens NET é difícil, pois diferentes laboratórios usam seus próprios protocolos personalizados. Esses protocolos diferem no uso de anticorpos, recuperação de antígenos ou método de permeabilização e são frequentemente otimizados para um tipo específico de tecido 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27º.

Após Brinkmann e col. publicarem o primeiro estudo metódico utilizando a visualização imunofluorescente de NETs em tecido FFPE, quisemos otimizar esse protocolo para uma maior variedade de tecidos e espécies15. Além disso, para estabelecer um protocolo de imunofluorescência amplamente aplicável, testamos diferentes protocolos modificados de estudos que utilizaram métodos de imunofluorescência em tecido FFPE para detectar NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Além disso, tentamos um novo anticorpo contra H3cit para coloração extracelular mais específica28. Nós hipotetizamos que, adaptando sistematicamente os protocolos de coloração atuais para diferentes espécies e tecidos, a imagem in vitro pode ser melhorada, resultando em uma melhor representação da interação entre neutrófilos e NETs tanto local quanto sistemicamente.

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Protocol

Este estudo incluiu tecidos de camundongos derivados de experimentos aprovados pela Administração Estadual de Pesquisa Animal de Hamburgo, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburgo, Alemanha (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Os tecidos utilizados foram pulmão e cólon de camundongo de modelo séptico e pele queimada. Foram utilizados camundongos machos e fêmeas com 8 semanas de idade. A Diretiva Europeia 2010/63/UE relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos foi seguida em todas as experiências. As amostras humanas anonimizadas incluíram tecidos de enterocolite neonatal, pele queimada, atresia biliar, espondilodiscite e miocárdio. De acordo com o Comitê de Ética em Pesquisa Médica de Hamburgo, as amostras não necessitaram de consentimento informado, mas o estudo foi aprovado pelo comitê (WF-026/21).

1. Fixação da amostra

  1. Utilizar o seguinte protocolo derivado de Abu Abed e Brinkmann para fixação da amostra, desidratação, incorporação em parafina, seccionamento e montagem 3,15.
    1. Preparar solução de formaldeído a 4% dissolvendo 40 g de paraformaldeído (PFA) em 800 ml de solução salina tamponada com Tris, pH 7,4 (TBS).
    2. Agitar a mistura a 60 °C sob um exaustor até dissolver o PFA. Levar a solução à temperatura ambiente (TR) e ajustar o volume com TBS para 1.000 mL.
    3. Ajuste o pH para 7,4. Conservar a 4 °C durante 2-3 semanas ou a -20 °C até 1 ano.
  2. Para fixação da amostra, colocar o tecido fresco em tampão TBS e dissecar em pedaços menores que 20 mm x 30 mm x 3 mm. Imergir os cortes de tecido em solução de paraformaldeído a 4% por 12-24 horas.
    NOTA: O protocolo original utilizava uma solução de PFA a 2% e um tempo de fixação de 8-20 h. Com esse método, alguns cortes teciduais não foram completamente fixados após 20 h, de modo que a concentração de PFA foi aumentada para 4% de PFA.
  3. Transfira as amostras para de processamento de tecidos marcados. Use marcadores resistentes a solventes ou lápis para rotulagem.
  4. Iniciar a desidratação da amostra imergindo em seguida os em etanol 70% por 1 h. Em seguida, mergulhe em etanol 80%, etanol 90%, etanol 96% e duas vezes em etanol 100%, com cada etapa durando 1 h.
  5. Imergir duas vezes em xileno a 100% (dimetilbenzeno) e, em seguida, duas vezes em parafina a 60 °C durante 1 h de cada vez.
  6. Use moldes de embutimento para montagem e deixe a parafina solidificar antes de remover o molde.
  7. Use um micrótomo para cortar cortes de tecido de 3 μm de espessura.
  8. Use uma pinça para colocar as seções cortadas em banho-maria a 37 °C e deixe-as flutuar na superfície para esticar os cortes de tecido.
  9. Coloque as seções em lâminas de vidro adesivo (Tabela de Materiais) e deixe-as secar durante a noite em uma câmara de calor de 40 °C.

2. Reidratação da amostra

  1. Para a desparafinização, empilhar as lâminas em um rack de corrediças e submergir duas vezes por 5 min cada no limoneno médio de reposição de xileno (Tabela de Materiais) e uma vez por 5 min em uma mistura de limoneno/etanol 1:1.
    CUIDADO: O limoneno é inflamável a 50 °C e pode causar reações alérgicas. Use sob um exaustor com proteção para os olhos e luvas. Manter longe de fogo aberto.
  2. Reidratar as amostras em uma série descendente de etanol submergindo a prateleira duas vezes em etanol 100% e uma vez em etanol 96%, etanol 90%, etanol 80% e etanol 70% por 5 min cada.
  3. Submergir o rack deslizante por 5 min em água deionizada (água DI) para limpar qualquer etanol restante.

3. Bloqueio de autofluorescência e recuperação de antígenos

  1. Preparar solução de recuperação alvo de citrato (TRS) pH 6 (Tabela de Materiais) de acordo com a ficha técnica. Este TRS é concentrado 10 vezes. Portanto, diluir 1:10 com água DI. Pré-aqueça em um frasco de coloração plástico a 96 °C.
    NOTA: O TRS quebra as pontes de metileno formadas durante a fixação da amostra para expor os epítopos do antígeno. Isso permite que os anticorpos primários se liguem ao antígeno alvo. Conservar TRS concentrado a 2-8 °C durante 8 meses. Prepare sempre TRS fresco.
  2. Retire as corrediças do rack de slides e coloque-as em uma câmara molhada. Pipetar uma a duas gotas de agente redutor de autofluorescência (Tabela de Materiais) em cada amostra. Incubar por 5 min.
    NOTA: O agente redutor de autofluorescência bloqueia a autofluorescência tecidual inerente causada por fluoróforos endógenos e fixadores. Armazene o agente redutor de autofluorescência em RT por até 1 ano.
    NOTA: Trabalhe apenas com pequenas seções de tecidos para evitar o ressecamento das amostras ou exceder o tempo de incubação.
  3. Empilhe as lâminas de volta no rack deslizante e enxágue por 1 min em etanol a 60% usando um movimento ascendente e descendente até que todo o reagente redutor de autofluorescência não utilizado tenha sido lavado.
  4. Submerja o rack deslizante por 5 min em água DI.
  5. Para recuperação de antígeno, transfira as lâminas para um frasco de coloração com o TRS pré-aquecido. Incubar durante 10 min a 96 °C em banho-maria.
    NOTA: O banho-maria de 96 °C pode ser substituído por um micro-ondas ou fogão a vapor se o TRS for pré-aquecido a 96 °C e 10 min de tempo de incubação a 96 °C for assegurado.
  6. Retire o frasco de coloração e deixe esfriar lentamente por aproximadamente 60-90 min.
    OBS: O protocolo pode ser pausado aqui por até 4 h, deixando os slides no TRS.
  7. Retire o TRS, mas mantenha as lâminas no frasco. Enxaguar duas vezes com solução salina tamponada com Tris com Tween 0,05% (TBST, pH 7,4) por 3 min cada para lavar os resíduos de TRS que sobraram.
  8. Para permeabilização, preparar Triton 0,2% em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4, e preenchê-lo no frasco de coloração para permeabilizar as amostras por 10 min.
    NOTA: A permeabilização aumenta a ligação dos anticorpos primários com as proteínas-alvo intracelulares nas amostras fixas.
  9. Enxágue as lâminas novamente duas vezes em TBST por 3 min de cada vez.
  10. Prepare a câmara molhada e deite escorregadores. Limpe o excesso de água das lâminas com lenços de papel. Circule cada amostra com uma caneta de barreira hidrofóbica para evitar que a solução de anticorpos se esgote.
    OBS: Não deixe as amostras secarem. É melhor trabalhar com seções pequenas.

4. Bloqueio da ligação de anticorpos inespecíficos

  1. Tome solução de bloqueio pronta para uso com soro de burro (Tabela de Materiais) e pipete uma gota em cada amostra. Incubar por 30 min no TR.
    Observação : esta etapa de bloqueio minimiza a ligação do anticorpo secundário a locais de ligação inespecíficos na amostra. Após o bloqueio desses epítopos inespecíficos e a aplicação do anticorpo primário, o anticorpo secundário se ligará ao anticorpo primário e não interagirá com a superfície do tecido. Este reagente de bloqueio pronto a utilizar é armazenado a 2-8 °C durante 6 meses.
  2. Remova o excesso de solução de bloqueio das lâminas tocando a borda das lâminas contra uma superfície dura. Não enxágue.

5. Anticorpo primário

  1. Diluir anticorpos primários em tampão de diluição de anticorpos (Tabela de Materiais). Utilizar aproximadamente 100 μL da solução final para cada amostra. Para o anticorpo NE e H3cit (R8) e isocontrole, diluir a uma concentração de 5 μg/mL. Para MPO e isocontrole correspondente, utilizar 10 μg/mL. Prepare um tubo para cada anticorpo primário e um para cada anticorpo isocontrole.
    NOTA: H3cit (R8)/MPO ou NE/MPO e seus isocontroles podem ser combinados para coloração de NETs. Para a combinação de H3cit (R8)/MPO, diluir até uma concentração final de 5 μg/mL para H3cit (R8) e 10 μg/mL para MPO até um volume final de 100 μL por amostra. Para NE/MPO, diluir até uma concentração final de 5 μg/mL para NE e 10 μg/mL para MPO até um volume final de 100 μL por amostra. Para o isocontrole, use a mesma concentração que para cada anticorpo correspondente. Use sempre uma nova ponta de pipeta para cada anticorpo utilizado. Os anticorpos primários podem ser armazenados a 4 °C por 1-2 semanas e a -20 °C ou -80 °C por até 1 ano.
  2. Com duas amostras em uma lâmina, utilizar uma para os anticorpos de isocontrole e outra para a diluição de anticorpos MPO/H3cit ou MPO/NE. Use aproximadamente 100 μL para cada amostra e espalhe a solução de anticorpos uniformemente.
    OBS: Não deixe as amostras secarem. Tenha cuidado para evitar misturar o isocontrole e os anticorpos primários.
  3. Conservar numa câmara húmida durante a noite a 4 °C.
  4. No dia seguinte, retire o excesso de solução de anticorpos primários das lâminas e empilhe as lâminas em uma cubeta. Enxaguar três vezes por 5 min cada vez com TBST para lavar a solução de anticorpos primários restante.

6. Anticorpo secundário

  1. Preparar a solução de anticorpos secundários. Use dois anticorpos secundários fluorescentes diferentes: burro-anti-cabra para MPO e burro-anti-coelho para coloração de H3cit. Diluir cada um deles na concentração de 7,5 μg/mL com tampão de diluição de anticorpos (Tabela de Materiais).
    NOTA: Para dupla coloração, use dois anticorpos fluorescentes com áreas de excitação diferentes e sobreposição espectral mínima. Combinar ambos os anticorpos secundários e diluir até uma concentração final de 7,5 μg/mL para cada anticorpo para um volume final de 100 μL por amostra. Proteger os anticorpos da luz. Os anticorpos secundários podem ser armazenados a 2-8 °C por 6-8 semanas ou a -80 °C por até 1 ano.
  2. Mantenha as lâminas na câmara húmida e adicione 100 μL da solução de anticorpos secundários em cada amostra. Deixe incubar por 30 min no RT e protegido da luz.
  3. Toque na solução de anticorpos secundários em excesso e empilhe as lâminas no rack de slides. Submergir três vezes por 5 min cada em um frasco de coloração cheio de PBS para lavar os anticorpos não ligados restantes.
  4. Preparar a solução de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) (Tabela de Materiais) e diluir até uma concentração de 1 μg/mL com água DI. Submergir o rack de slides em um frasco de coloração com solução DAPI e incubar por 5 min em RT no escuro.
    NOTA: DAPI é usado como uma coloração fluorescente para DNA de fita dupla. A solução DAPI preparada pode ser usada várias vezes. Armazene a solução DAPI preparada no RT. O concentrado DAPI pode ser armazenado a -20 °C por até 1 ano.
  5. Submergir o rack deslizante por 5 min em um frasco de coloração com PBS para lavar o excesso de solução DAPI.

7. Montagem e armazenamento das amostras, análise microscópica

  1. Monte as amostras com lamínulas e meio de montagem (Tabela de Materiais).
    NOTA: Use apenas pequenas quantidades de meio de montagem e limpe o meio em excesso com tecidos molhados. Use luvas e evite limpar acidentalmente qualquer meio das tampas ou corrediças. Evite a formação de bolhas e use cotonetes para pressionar suavemente as lamínulas para remover quaisquer bolhas das lâminas.
  2. Para aquisição de imagens, use um microscópio de campo largo ou um microscópio confocal.
    NOTA: Tire uma imagem do isocontrol primeiro. Diminua o tempo de exposição para os filtros de fluorescência (exceto o filtro azul para DAPI) até que quase nenhum sinal possa ser detectado. Em seguida, use essa configuração para examinar as amostras correspondentes. Procure áreas onde um sinal fluorescente pode ser detectado em cada amostra individual usando o canal de fluorescência. Depois de tirar uma imagem da área, o programa gera uma imagem composta de todos os canais e mostra os diferentes sinais de fluorescência como uma sobreposição de cores diferentes. A imagem pode então ser analisada para co-localização com software de imagem como o ImageJ.
  3. Conservar as lâminas a 4 °C até 6 meses.

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Representative Results

Antes de iniciar nossa otimização de protocolo, identificamos os principais passos para o sucesso da coloração, pesquisando no PubMed estudos que utilizaram tecido FFPE para a imunomarcação de NETs e comparamos seus protocolos. As diferenças de protocolo mais promissoras foram identificadas como os passos chave para a otimização do protocolo, enquanto os passos que correspondiam em sua maioria não foram alterados (Tabela 1).

Tabela 1: Pesquisa PubMed para imunomarcação FFPE de NETs. Esta tabela mostra as variáveis do protocolo de imunomarcação nos estudos examinados. Os protocolos utilizados foram divididos em suas etapas essenciais e, em seguida, comparados entre si. Os passos com as diferenças mais promissoras foram então tomados como os passos chave para a otimização e adaptados para o nosso protocolo. Os passos que correspondiam principalmente entre si não foram alterados, como o tempo de incubação do anticorpo primário (durante a noite, 4 °C). Clique aqui para baixar esta tabela.

Com base em nossos achados, concluímos que os anticorpos escolhidos para atingir os epítopos foi o primeiro passo crítico. Pelo menos 10 protocolos diferentes utilizaram o anticorpo triH3cit (ver Tabela 1; Coluna de anticorpos primários). No entanto, Thålin et al., verificaram que o clone H3cit (R8) apresentou menor reatividade cruzada fora do alvo para histonas não citrulinadas e apresentou variabilidade insignificante entre lotes. Assim, optou-se por comparar os resultados das colorações triH3cit e H3cit (R8) entre si28.

Quatro estudos utilizaram o anticorpo MPO humano/camundongo. Além disso, dois outros protocolos aplicaram MPO (2D4) para tecido de camundongo e MPO (2C7) para tecido humano (ver Tabela 1; Coluna de anticorpos primários). Portanto, comparamos separadamente MPO (2C7) com anticorpo MPO humano/camundongo para tecidos humanos e MPO (2D4) com anticorpo MPO humano/camundongo para tecidos de camundongos. O NE foi detectado usando pelo menos cinco anticorpos diferentes, mas apenas três deles mostraram bons resultados de coloração nas imagens fornecidas. No entanto, um anticorpo não estava mais disponível no mercado, então comparamos o anticorpo NE de um hospedeiro de coelho com um de um hospedeiro de camundongo para nossa série de testes em tecidos humanos. Para amostras de camundongos, parecia não haver alternativa disponível e confiável para o anticorpo NE criado em hospedeiro coelho no início deste estudo. Como um NE e ambos os anticorpos H3cit são derivados do mesmo hospedeiro coelho, eles não podem ser combinados para dupla coloração com este protocolo. O anticorpo secundário é específico para a região constante do anticorpo primário, que é determinada pelo hospedeiro em que foi criado. Se dois anticorpos primários derivados do mesmo hospedeiro forem usados, o anticorpo secundário poderia se ligar a ambos os anticorpos primários, e a coloração seria inespecífica. No entanto, a coloração dupla é preferida em relação à coloração única porque mais componentes NET podem ser detectados e colocalizados. Portanto, o resultado da coloração será mais específico. Consequentemente, nós duplamente coloridos para H3cit e MPO para obter um protocolo de detecção mais robusto.

Apesar das semelhanças nos anticorpos utilizados, as diluições para os anticorpos variaram em quase todos os protocolos; por exemplo, para o triH3cit, a faixa de concentração foi de 0,5 μg/mL a 20 μg/mL17,18. Para cada anticorpo utilizado, foram tentadas diferentes diluições e obtivemos colorações satisfatórias em toda a faixa relatada na literatura.

Além disso, muitas semelhanças podem ser encontradas no tempo de incubação do anticorpo primário (durante a noite a 4 °C) e no uso e diluição do anticorpo secundário (ver Tabela 1; Coluna de anticorpos primários de incubação). Portanto, não alteramos essas etapas em nossa série de testes e as realizamos de acordo com o protocolo descrito acima.

O próximo passo crítico determinado a partir da literatura foi a recuperação antigênica. Essa etapa é essencial, pois, devido à fixação da formalina, os epítopos dos anticorpos são mascarados através de pontes de metileno, que podem ser revertidas com o aquecimento do corte tecidual em tampão adequado29. O TRS citrato em pH 6 e o tampão TRS EDTA em pH 9 foram usados com igual frequência na literatura e apresentaram resultados semelhantes (ver Tabela 1; Coluna de buffer TRS). Assim, optou-se pelo TRS citrato pH 6 para nossa série de testes. Para a recuperação do antígeno, testamos dois métodos diferentes de aquecimento: um micro-ondas (primeiro 1 min a 360 W e depois com 9 min a 90 W) e um banho-maria (60 °C por 90 min, 96 °C por 10 min).

A última etapa que mostrou alguma variabilidade na literatura foi a permeabilização com Triton X-100. Essa etapa necessitou de otimização, pois com o tratamento com detergente, a membrana celular torna-se permeável a anticorpos, e epítopos intracelulares podem ser alcançados30. Os protocolos anteriores utilizaram diferentes concentrações de Triton X-100 variando de 1% a 0,1% (ver Tabela 1; Coluna de permeabilização). Portanto, foram testadas duas concentrações de Triton X-100 (0,2% e 0,5%) e uma série sem permeabilização de Triton.

Após a identificação desses passos-chave, nós os modificamos e tentamos otimizar o protocolo. Em seguida, as imagens foram examinadas de acordo com uma ficha de avaliação, e as diferenças foram registradas semiquantitativamente e comparadas (ver Tabela 2).

Tabela 2: Tabela de resultados para otimização das etapas do protocolo. Esta tabela mostra os resultados para as etapas adaptadas: agente redutor de autofluorescência, recuperação de antígenos e permeabilização. Antes de iniciar esta série de testes, testamos a melhor combinação e concentração de anticorpos. As lâminas foram avaliadas em 10 áreas diferentes e, em seguida, uma área representativa foi pontuada de (-) para um resultado negativo a (++) para um resultado positivo contendo NET. Os resultados parcialmente positivos incluíram uma maior coloração de fundo difusa de células não neutrófilas. Abreviaturas: n/u = não utilizadas; - = resultado negativo; coloração +/-parcialmente positiva; + = coloração específica moderada; + = boa coloração de NETs e neutrófilos. Clique aqui para baixar esta tabela.

Anticorpos primários
Antes de adaptar o protocolo, procurou-se encontrar a melhor combinação de anticorpos. Aqui, o triH3cit mostrou mais coloração de histonas intracelulares do que o H3cit (R8). Para a detecção de NETs, decidimos usar o anticorpo H3cit (R8) para nossa otimização do protocolo. Este anticorpo ligou-se apenas ao H3cit extracelular e não mostrou coloração de H3cit intracelular nesta concentração (ver Figura 1A,B).

Para a coloração MPO, comparamos o anticorpo MPO humano/camundongo com o MPO (2C7) para tecido humano (ver Figura 1C,D) e o MPO (2D4) para tecido de camundongo (ver Figura 1E,F). Os anticorpos MPO (2D4) e MPO (2C7) não conseguiram obter coloração consistente para vários tipos de tecido, enquanto o MPO humano/camundongo resultou em boa coloração confiável para MPO. Assim, selecionamos MPO humano/camundongo para nosso protocolo de coloração.

Para NE, tentamos um anticorpo NE de um hospedeiro de camundongo em tecido humano, que mostrou coloração NE apenas em uma de cinco amostras em comparação com a coloração confiável do anticorpo NE de um hospedeiro coelho. Além disso, o anticorpo NE de um hospedeiro de coelho é aplicável ao tecido humano e de camundongo. (ver Figura 1G,H).

Figure 1
Figura 1: Comparação de anticorpos primários em diferentes tecidos. (A) Enterocolite neonatal humana (ECN) corada com H3cit (R8) (vermelho). Aqui, apenas um sinal extracelular pode ser detectado. (B) Mesmo tecido corado com triH3cit (R2,8,17) (vermelho). Esse anticorpo cria um sinal mais amplo com intensa coloração intracelular de histonas citrulinadas (setas amarelas). (C,E) Tecido NEC humano (C) e tecido volvo de camundongo (E) com boa coloração para H3cit (R8) (vermelho) e MPO camundongo/humano (verde). A colocalização dos sinais H3cit, MPO e DAPI (azul) indica a formação de NET (setas brancas). (D,F) Em comparação, (D) usando a MPO (2C7) para tecido NEC humano e (F)MPO (2D4) (verde) para tecido volvo de camundongo, nenhum sinal de MPO pôde ser obtido. (G) Amostra de pele humana queimada com coloração muito forte para o anticorpo NE de um hospedeiro de coelho (magenta) em comparação com o resultado de coloração (H) negativa para o anticorpo NE de um hospedeiro de camundongo. Para o controle de isótipos, consulte Figura Suplementar Isocontrol 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Desparafinização
Aqui, o xileno foi substituído por limoneno, o que se mostrou equivalente a uma melhor desparafinização das amostras de tecido em comparação com o xileno, com menor autofluorescência no fundo (ver Figura 2A,B).

Agente redutor de autofluorescência
O agente redutor de autofluorescência pronto para uso à base de Sudan Black pode ser aplicado por 2-20 minutos. Aqui, aplicamos por 0 min, 5 min e 10 min. Quando nenhum bloqueio foi usado, algumas amostras de camundongos mostraram coloração mais inespecífica, e a coloração positiva parcial pôde ser obtida (ver Figura 2C). O tempo de bloqueio de 5 min mostrou bons resultados em todos os tipos de tecido, exceto H3cit e MPO em pulmão e pele de camundongos (ver Tabela 2). Com 10 min de tempo de bloqueio em algumas amostras, a coloração começou a ser menos brilhante, de modo que o período de tempo de 5 min é a melhor escolha para bloquear a autofluorescência (ver Figura 2D,E).

Figure 2
Figura 2: Métodos de desparafinização e uso de agente redutor de autofluorescência. (A) Tecido de espondilodiscite humana desparafinizado com limoneno e corado para H3cit (vermelho) e MPO (verde). A formação encalhada dos sinais e a co-localização parcial indicam a presença de NETs (seta branca). (B) A mesma amostra de tecido desparafinizada com xileno, resultando em resultados de coloração semelhantes, indicando que o xileno amplamente utilizado pode ser substituído por um meio de substituição. (C-E) Tecido pulmonar de camundongo após sepse induzida mostrando diferentes padrões de coloração NE (magenta) quando diferentes tempos de incubação para o agente redutor de autofluorescência são usados. Sem o uso de redutor de autofluorescência, a imagem C ainda mostra discreta coloração de fundo dos eritrócitos (seta vermelha). Em contraste, a imagem D mostra que, após 5 min de incubação com um agente redutor de autofluorescência, um sinal claro é emitido. Após 10 min, a qualidade de coloração na imagem E diminui e o sinal se torna menos brilhante. Para o controle de isótipo, consulte Figura Suplementar Isocontrol 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Métodos de recuperação de antígenos
Para a coloração NE, as amostras foram aquecidas em tampão citrato pH 6 por 10 min no micro-ondas (primeiro por 1 min a 360 W e depois por 9 min a 90 W), por 10 min em banho-maria a 96 °C ou por 90 min em banho-maria a 60 °C. Aqui, as temperaturas mais altas no micro-ondas e no banho-maria mostraram consistentemente moderada a boa recuperação antigênica (ver Figura 3A). Não houve diferença significativa entre o banho de micro-ondas e o banho-maria a 96 °C (Tabela 2). Além disso, demonstrou-se que, em banho-maria a 60 °C, houve apenas coloração parcialmente positiva ou nenhuma (ver Figura 3B). Apenas o íleo e o miocárdio humanos apresentaram bons resultados específicos. Como não foi possível obter coloração adequada para NE com banho-maria a 60 °C, a série de testes em banho-maria de 60 °C para H3cit e MPO foi descartada.

Para dupla coloração com MPO e H3cit, as amostras foram aquecidas em tampão citrato pH 6 no micro-ondas por 10 min (primeiro por 1 min a 360 W e depois por 9 min a 90 W) ou em banho-maria a 96 °C por 10 min. Aqui, ambos os métodos apresentaram bons resultados específicos, com resultados ligeiramente mais favoráveis para o banho-maria de 96 °C (ver Figura 3C). Apenas o pulmão e o tecido cutâneo de camundongos conseguiram alcançar uma classificação geral moderada (ver Tabela 2).

No entanto, exceder o tempo de incubação de 40 min a 96 °C resultou em coloração de anticorpos menos intensa, enquanto substancialmente mais coloração de fundo pôde ser observada (ver Figura 3D).

Figure 3
Figura 3: Métodos de recuperação antigênica. (A) O tecido volvulus de camundongo corado para NE (magenta) usando um tempo de incubação de 10 min a 96 °C para recuperação de calor mostra um sinal significativamente mais forte do que (B) ao incubar a amostra por 90 min em banho-maria a 60 °C. (C) Além disso, a incubação de 10 min na recuperação do antígeno a 96 °C também resulta em um forte sinal para H3cit (vermelho) e MPO (verde) com coloração NET combinada (setas brancas). D: No entanto, ferver as amostras por mais de 40 min resulta em coloração extracelular menos específica de H3cit e nenhuma coloração de MPO. Para o controle de isotipos, consulte Figura Suplementar Isocontrol 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Permeabilização
Tentamos permeabilizar as amostras com Triton X-100 em duas diluições (0,2% e 0,5%) por 10 min e comparamos com 10 min em água deionizada. Aqui, 10 min com Triton 0,2% alcançaram bons resultados em todos os tipos de tecido, embora as diferenças fossem pequenas em comparação com as condições de Triton 0,5% e água deionizada (ver Tabela 2).

Figura Suplementar Isocontrol 1: Controles isotípicos para a Figura 1. Todas as imagens mostram boa coloração DAPI (azul), mas nenhum sinal para o anticorpo fluorescente. Isso confirma que a ligação dos anticorpos primários na Figura 1 é específica ao antígeno alvo e não é resultado de ligações inespecíficas ou interações proteicas. (A) Enterocolite neonatal humana (ECN) corada com o anticorpo isocontrole para H3cit (R8) (vermelho). (B) NEC tecidual corado com o anticorpo isocontrole para H3cit (R2,8,17) (vermelho). (C) tecido NEC (E) e tecido volvo de camundongo corados com os anticorpos isocontrole para H3cit (R8) (vermelho) e MPO camundongo/humano (verde). (D) Tecido NEC corado com os anticorpos isocontrole para H3cit (R8) (vermelho) e MPO (2C7) (verde). (F) Tecido volvo de camundongo corado com anticorpos isocontrole para H3cit (R8) (vermelho) e MPO 2D4 (verde). G: Amostra de pele humana queimada corada com o anticorpo isocontrole para o anticorpo NE de um hospedeiro coelho (magenta). (H) Mesmo tecido corado com o anticorpo isocontrole para o anticorpo NE de um hospedeiro de camundongo (magenta). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar Isocontrol 2: Controles de isotipo para a Figura 2. Todas as imagens mostram boa coloração DAPI (azul), mas nenhum sinal para o anticorpo fluorescente. Isso confirma a ligação específica dos anticorpos primários na Figura 2. As imagens C-E ainda mostram alguma coloração de fundo em magenta devido aos longos tempos de exposição. No entanto, o sinal NE na Figura 2 é distinguível da coloração de fundo. (A) Tecido de espondilodiscite humana desparafinizado com limoneno e corado com os anticorpos isocontrole para H3cit (R8) (vermelho) e MPO camundongo/humano (verde). (B) Mesma amostra de tecido desparafinizada com xileno e corada com os anticorpos isocontrole para H3cit (vermelho) e MPO (verde). (C) Tecido pulmonar de camundongo corado com o anticorpo isocontrole para NE (magenta), sem uso de agente redutor de autofluorescência. (D) Mesmo tecido corado com o anticorpo isocontrole para NE (magenta) e 5 min de incubação com um agente redutor de autofluorescência. (E) Mesmo tecido corado com o anticorpo isocontrole para NE (magenta) e 10 min de incubação com agente redutor de autofluorescência. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar Isocontrol 3: Controles isotípicos para a Figura 3. Todas as imagens mostram boa coloração DAPI (azul), mas nenhum sinal específico para o anticorpo fluorescente. Isso confirma a ligação específica dos anticorpos primários na Figura 3. (A) Tecido volvo de camundongo corado com o anticorpo isocontrole para NE (magenta) usando um tempo de incubação de 10 min a 96 °C para recuperação de calor. (B) Mesmo tecido corado com o anticorpo isocontrole para NE (magenta) e recuperação térmica por 90 min em banho-maria a 60 °C. (C) Mesmo tecido corado com o anticorpo isocontrole para H3cit (vermelho) e MPO (verde) e com condições de recuperação térmica idênticas às de A. O ponto verde mostra um artefato de coloração de anticorpos secundários agregados. (D) Mesmo tecido corado com o anticorpo isocontrole para H3cit (vermelho) e MPO (verde) e utilizando um tempo de incubação de 40 min a 96 °C para recuperação do calor. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar Isocontrol 4: Controles isotípicos para a Figura 4. Todos os isocontroles a seguir são do mesmo slide que o experimento "falhou" correspondente. As tentativas fracassadas não foram feitas intencionalmente, de modo que alguns isocontroles parecem utilizáveis, enquanto a amostra não foi. (A) tecido NEC corado com o anticorpo isocontrole para H3cit (vermelho) e MPO (verde). Esta amostra foi processada mais rapidamente sem secar. Portanto, nenhuma coloração de fundo excessiva é visível. As estruturas verde e vermelha são agregados secundários de anticorpos. (B) Tecido de espondilodiscite corado com o anticorpo isocontrole para NE (magenta). Aqui, a desparafinização foi bem-sucedida, de modo que nenhum remanescente de parafina pode ser visto. (C) NEC tecidual corado com o anticorpo isocontrole para H3cit (vermelho) e MPO (verde). Embora os mesmos anticorpos secundários armazenados inadequadamente tenham sido usados, nenhuma coloração seria esperada para esta imagem de isocontrole. Portanto, essa imagem não pode ser usada para avaliar a ligação específica da imagem correspondente. (D) Pele humana queimada corada com o anticorpo isocontrole para H3cit (vermelho) e MPO (verde). Aqui, a montagem foi feita com mais cuidado, e nenhuma luz espalhada através de bolhas de ar pode ser vista. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Neste trabalho, nosso objetivo foi adaptar e otimizar os protocolos existentes de obtenção de imagens de TNEs para mais tipos de tecidos, começando pelo processo de coloração propriamente dito. O primeiro passo crítico para este método é a seleção dos anticorpos mais adequados. Para NE, tentamos um anticorpo NE de um hospedeiro de camundongo em tecido humano, que não mostrou coloração confiável em comparação com NE de um hospedeiro coelho. Além disso, Thålin et al., propuseram o H3cit (R8) como um anticorpo mais específico para coloração extracelular. Comparamos esse anticorpo com o triH3cit amplamente utilizado (R2, R8, R17). Nosso estudo mostrou que o anticorpo H3cit (R8) corou apenas para um sinal extracelular nas concentrações utilizadas, permitindo um reconhecimento mais fácil dos TNEs nas lâminas. Esse achado corrobora as afirmações de Thålin e col. de que o clone H3cit (R8) pode fornecer um bom sinal NET com diminuição da reatividade cruzada fora do alvo para histonas não citrulinadas28. Também comparamos anticorpos MPO para tecido humano e de camundongo para coloração MPO. Nossos resultados mostram que o anticorpo MPO camundongo/humano mostrou coloração mais confiável e pode ser usado simultaneamente em amostras humanas e de camundongos, simplificando seu uso em laboratório. Consequentemente, recomendamos o uso desta combinação de anticorpos, H3cit (R8) e MPO camundongo/humano, para pesquisas futuras e implementá-la em nosso protocolo.

No entanto, há uma limitação para múltiplas tentativas de coloração com essa seleção de anticorpos. Esse protocolo foi modificado para utilizar anticorpos primários de diferentes hospedeiros. Caso contrário, um anticorpo secundário poderia se ligar a ambos os anticorpos primários. O anticorpo H3cit vem do mesmo hospedeiro que o anticorpo NE, então não poderíamos corar NE e H3cit juntos. Embora nenhuma coloração tripla (NE, H3cit, MPO) tenha sido feita neste estudo, este protocolo poderá servir de base para experimentos de tripla coloração no futuro. Uma opção possível para tripla coloração ou dupla coloração NE e H3cit poderia ser a troca de um desses anticorpos por um anticorpo confiável de outro hospedeiro. Nesse caso, um possível parceiro de combinação poderia ser o anticorpo NE (Santa Cruz; sc-55549) de ovinos utilizado por Knackstedt et al.24. Outra opção de Duler e col. foi publicada em 2021, onde usaram um método consecutivo de dupla coloração e combinaram NE e H3cit de um hospedeiro coelho26. Uma aplicação adicional promissora de um método de coloração múltipla é para a discriminação entre a formação intra e extravascular de NET. Em vez de tripla coloração para marcadores NET, a dupla coloração NET poderia ser combinada com coloração vascular adicional. Além disso, um número crescente de estudos tem examinado a distribuição intra e extravascular dos TNEs para obter mais conhecimento sobre os patomecanismos de doenças específicas, como a doença de Alzheimer. Smyth et al.31 descreveram um protocolo promissor e aprofundado semelhante ao nosso para diferenciar as duas possíveis localizações. Eles modificaram seu protocolo de coloração NET existente adicionando uma lectina biotinilada para marcar células endoteliais e usaram uma estreptavidina conjugada a fluoróforo para a coloração de imunofluorescência de lectina. Examinando a co-localização dos marcadores lectina e NET na mesma imagem, eles foram capazes de identificar NETs intravasculares31. Nesse contexto, mais estudos são necessários para ampliar a aplicação do nosso protocolo.

Depois de encontrar a combinação de anticorpos mais adequada, o próximo passo crítico é a introdução de um agente redutor de autofluorescência. Fatores exógenos, como a fixação da amostra com fixadores de formaldeído, e fatores endógenos, como eritrócitos, podem resultar em alta autofluorescência, o que dificulta a determinação da colocalização32. Esse problema ocorre principalmente nos espectros de fluorescência azul (área de excitação: 430-480 nm) e verde (área de excitação: 500-550 nm) e pode resultar em resultados inconclusivos de coloração quando um anticorpo de fluorescência com a mesma área de excitação é usado3. A literatura relata que o Sudan Black é um agente eficaz na redução da autofluorescência tecidual inerente33. O Sudan Black permite obter resultados de coloração mais claros usando os canais de fluorescência azuis ou verdes. Esta área de excitação será necessária para futuras tentativas de coloração múltipla porque os canais azuis e verdes são necessários ao usar um quarto corante fluorescente. Nosso estudo mostra que o tempo ótimo de incubação depende do tipo de tecido e anticorpo utilizado no processo de coloração. No entanto, neste trabalho, 5 min de agente redutor de autofluorescência geralmente deu bons resultados em todos os tipos de tecido e teve o benefício de corar a amostra de preto, facilitando a visualização nas lâminas. Isso evitou que partes faltantes dos tecidos no processo de coloração, especialmente com amostras pequenas.

Outro fator essencial para o sucesso deste protocolo é a constante temperatura elevada para a etapa de recuperação do antígeno. Nossa pesquisa mostrou que 10 dos 15 estudos anteriores utilizaram temperaturas acima de 96 °C para recuperação antigênica 13,15,16,17,19,21,22,25,26,27. Isso foi consistente com nossos resultados, onde incubar as amostras em banho-maria ou micro-ondas a 96 °C deu bons resultados, sem diferenças significativas. No entanto, recomendamos o uso de banho-maria para distribuição uniforme do calor. Ao utilizar o micro-ondas, encontramos um gradiente de temperatura no tampão de até 5 °C entre a parte superior e inferior do frasco de coloração. Além disso, o banho-maria é mais fácil de usar e tem um risco menor de o tampão ferver. Para a permeabilização, verificamos que o Triton X-100 teve menor efeito na coloração. Assim, pular essa etapa do protocolo é possível sem afetar negativamente o resultado. Geralmente, as amostras humanas deram melhores resultados do que as amostras de camundongos. Uma razão para isso pode ser que os humanos têm uma porcentagem maior de neutrófilos do que os camundongos34,35. Além disso, amostras de pulmão de camundongo não mostraram inflamação macroscópica visível e menos neutrófilos, enquanto amostras de intestino de camundongo estavam macroscopicamente inflamadas e mostraram bons resultados de coloração. Assim, os escores mais baixos em nosso estudo poderiam ter sido decorrentes da baixa inflamação e não devido ao protocolo não funcionar da melhor forma.

Para solução de problemas, pequenos erros no protocolo ou o não manuseio cuidadoso das amostras podem ter enormes efeitos nos resultados da coloração. Um grande problema que identificamos foi a desidratação da amostra. Aqui, descobrimos que manusear mais de 10-15 lâminas ao mesmo tempo era fundamental, pois cada etapa é demorada e pode resultar na desidratação das amostras. As amostras desidratadas não são mais utilizáveis devido à alta coloração de fundo e à ausência de sinal de fluorescência específico detectável (ver Figura 4A). Além disso, as amostras devem ser completamente desparafinizadas antes de iniciar o protocolo de coloração. O resíduo de parafina resultou em um forte sinal de fundo, e as linhas de corte puderam ser vistas na parafina corada (ver Figura 4B). Além disso, após mais de 20 ciclos de congelamento-descongelamento, nenhum sinal para o anticorpo secundário à MPO pôde ser detectado (ver Figura 4C). Outro passo importante e com grande impacto na qualidade da imagem é o manuseio da etapa final de montagem. Neste trabalho, bolhas de ar sob o deslizamento resultaram no espalhamento do sinal fluorescente e, portanto, em uma imagem borrada (ver Figura 4D).

Figure 4
Figura 4: Dicas de solução de problemas . (A) Este painel mostra a consequência de uma amostra seca. A coloração de fundo vermelho sólido dificulta qualquer avaliação da amostra. (B) Aqui, a seta vermelha mostra remanescentes de parafina, caracterizados pela aparência ondulada, após uma desparafinização insuficiente. Esses remanescentes resultam em um alto sinal de fundo e imagens de baixa qualidade. (C) O armazenamento inadequado de anticorpos ou mais de 20 ciclos de congelamento-descongelamento resultam na agregação do anticorpo secundário (setas verdes) e não se ligam à MPO. (D) A montagem que não é feita com cuidado pode resultar em bolhas de ar e, portanto, espalhamento da luz fluorescente (seta azul). Isso pode afetar significativamente a qualidade da imagem, especialmente quando a dispersão desfoca o alvo. Para o controle de isotipos, consulte Figura Suplementar Isocontrol 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Embora as NETs estejam ganhando cada vez mais popularidade nas pesquisas científicas, ainda não há estudos suficientes enfocando os métodos para detecção deNET3,13,17,26. Até onde sabemos, apresentamos o primeiro estudo comparando protocolos de diferentes estudos para imagens de imunofluorescência de TNEs em tecido FFPE. Os protocolos personalizados publicados anteriormente diferiam em seus métodos de recuperação de anticorpos ou antígenos e muitas vezes eram projetados para apenas um tipo de tecido, tornando a comparação dos resultados de imagem NET mais difícil. Portanto, neste estudo, identificamos etapas críticas e estabelecemos um protocolo adequado para diferentes tecidos de camundongos e humanos. Conseguimos isso usando um novo anticorpo primário para coloração de H3cit e reduzindo a coloração de fundo com um agente redutor de autofluorescência. Além disso, mostramos que uma alta temperatura constante é crucial, e o manuseio cuidadoso das amostras é fundamental para o sucesso da coloração NET. Portanto, este estudo fornece os passos essenciais para o desenvolvimento de um protocolo geralmente aplicável para coloração de TNEs.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi fundada pela Sociedade Alemã de Pesquisa (BO5534). Agradecemos a Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dra. Annika Heuer e PD Dr. Ingo Königs por nos fornecerem amostras. Além disso, os autores agradecem à equipe do UKE Microscopy Imaging Facility (Core facility, UKE Medical School) pelo suporte com a microscopia de imunofluorescência.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
         Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg abcam Ab 68672  1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg abcam Ab 5103 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg abcam Ab 25989 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg abcam Ab 90810 1:50
Axiovision Microscopy Software  Zeiss 4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml GeneTex  GTX30972
Coverslips Marienfeld 0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) Dako S2369
DAPI 25 mg Roth 6335.1 1:25000
DCS antibody dilution 500 mL DCS diagnostics DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3 JacksonImmunoResearch 705-165-147 1:200
Donkey anti rabbit AF647 JacksonImmunoResearch 711-605-152 1:200
Donkey anti rabbit Cy3 JacksonImmunoResearch 711-165-152 1:200
Fluoromount-G Mounting Medium Invitrogen 00-4958-02
Glass slide rack Roth H552.1
Human/Mouse MPO Antibody R&D Systems AF 3667  1:20
Hydrophobic Pen KISKER MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg abcam Ab 37415 1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml Maxvision MB-L
Microscopy camera Zeiss AxioCamHR3
Microwave Bosch HMT84M421
Mouse IgG1 negative control Dako X0931 Aglient 1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control R&D Systems AB-108-C  1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x) Sigma-Aldrich P-3813
PMP staining jar Roth 2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg abcam Ab 219406 1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg abcam Ab 172730 1:300
ROTI Histol Roth  6640
SuperFrost Plus slides R. Langenbrinck 03-0060
TBS Tris buffered saline (x10) Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Water bath Memmert 830476
Water bath rice cooker reishunger RCP-30
Wet chamber Weckert Labortechnik 600016
Zeiss Widefield microscope Zeiss Axiovert 200M

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References

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Imagem por Imunofluorescência Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos NETs Infecção Bacteriana Dano Traumático ao Tecido Doenças Autoimunes Inflamação Estéril Filamentos de DNA de Fita Dupla Histonas Proteínas Antimicrobianas Patógenos Regulação Homeostática Adesão Plaquetária Coagulação Sepse Doenças Autoimunes Intervenção Terapêutica Microscopia Eletrônica Métodos de Coloração Anticorpos Agentes Redutores de Autofluorescência Métodos de Recuperação de Antígenos Permeabilização

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 09/29/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:

Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos
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Schoenfeld, L., Appl, B.,… More

Schoenfeld, L., Appl, B., Pagerols-Raluy, L., Heuer, A., Reinshagen, K., Boettcher, M. Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (198), e65272, doi:10.3791/65272 (2023).

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