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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65272
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

ERRATUM NOTICE

Summary

好中球細胞外トラップ(NET)はさまざまな疾患と関連しており、その可視化には免疫蛍光法がよく用いられます。しかし、染色プロトコルは様々であり、多くの場合、1種類の組織しか検査されません。ここでは、マウスおよびヒト組織におけるNETsの染色に一般的に適用可能なプロトコルを確立します。

Abstract

好中球細胞外トラップ(NET)は、細菌感染または外傷性組織損傷に対する応答として好中球によって放出されますが、自己免疫疾患および不妊性炎症にも関与します。これらは、二本鎖DNAフィラメント、ヒストン、および抗菌タンパク質で構成される網状の構造です。いったん放出されると、NETは血液や組織中の細胞外病原体を捕捉して死滅させることができます。さらに、NETは血小板の接着と凝固を刺激することにより、恒常性調節に関与します。しかし、NETの産生不全は、敗血症や自己免疫疾患などのさまざまな疾患とも関連しており、治療的介入の有望な標的となっています。電子顕微鏡法とは別に、免疫蛍光イメージングを用いたNETの可視化は、現在、組織におけるNET相互作用を実証する唯一の既知の方法の1つです。そのため、NETを可視化するための様々な染色法が利用されています。文献には、さまざまな染色プロトコルが記載されており、プロトコル間で大きなばらつきを示す4つの主要コンポーネントを特定しました:(1)使用する抗体の種類、(2)自家蛍光低減剤の使用、(3)抗原賦活化法、および(4)透過化。したがって、in vitro 免疫蛍光染色プロトコルは、異なる種(マウス、ヒト)および組織(皮膚、腸、肺、肝臓、心臓、脊椎椎間板)に適用できるように、この作業で体系的に適応および改善されました。固定とパラフィン包埋の後、厚さ3μmの切片をスライドに取り付けました。これらのサンプルは、修正された染色プロトコルに従って、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、シトルリン化ヒストンH3(H3cit)、および好中球エラスターゼ(NE)の一次抗体で染色しました。スライドを二次抗体で染色し、広視野蛍光顕微鏡で調べました。その結果を評価シートに従って分析し、その差を半定量的に記録した。

ここでは、さまざまな組織に適した最適化されたNET染色プロトコルを紹介します。新規一次抗体を用いてH3citを染色し、自家蛍光低減剤で非特異的染色を低減しました。さらに、NET染色には、一定の高温とサンプルの慎重な取り扱いが必要であることを実証しました。

Introduction

好中球細胞外トラップ(NET)は、2004年にBrinkmannらによって、アポトーシスや壊死とは異なる細胞死の経路として初めて可視化されました1。この経路では、好中球は脱凝縮したクロマチンを細胞外空間に放出し、以前は顆粒または細胞質に保存されていた抗菌タンパク質で覆われた大きなウェブ状の構造を形成します。これらの抗菌タンパク質には、好中球エラスターゼ(NE)、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、およびシトルリン化ヒストンH3(H3cit)が含まれ、これらはNETの間接免疫蛍光検出に一般的に使用されます2。この方法は、これらのタンパク質の定量的存在を特定するだけではありません。実際、NET に似た構造を具体的に検出できるという利点があります。NETでは、上記のタンパク質は細胞外DNAと共局在しており、染色された各タンパク質と細胞外DNAの蛍光シグナルの重なりによって検出できます。NETでは細胞外DNAとタンパク質の共局在によるシグナルの重複とは対照的に、無傷の好中球は共局在を示しません。ここで、NET成分は、通常、顆粒、核、および細胞質3に別々に貯蔵される。

最初の発見以来、NETは多くの疾患、特に炎症を伴う疾患において中心的な役割を果たしていることが示されています。NETは、血液や組織中の細胞外病原体を捕捉して死滅させることで、感染時に抗菌機能を示します4,5。しかし、NETは、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、アレルギー性喘息などの自己免疫疾患や高炎症反応にも関連しています6,7,8。NETは、アテローム性動脈硬化症、血小板癒着における血管閉塞と炎症を促進し、転移性癌に関与していると推測されています9,10,11。それにもかかわらず、それらは炎症性サイトカインレベルを低下させることにより抗炎症作用を有すると考えられている12。NETはより広い研究分野で関心を集めていますが、堅牢なNET検出方法は将来の研究の基本です。

免疫蛍光イメージングを用いた異なる組織におけるNETの可視化は複雑でカスタマイズが必要ですが、電子顕微鏡法は別として、現在、NETと細胞間の相互作用を可視化するための最も有名な方法の1つであり、主にホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPE)で使用されています13,14。.しかし、異なるラボが独自にカスタマイズしたプロトコルを使用しているため、NETイメージングの比較は困難です。これらのプロトコルは、抗体、抗原賦活化、または透過処理法の使用が異なり、多くの場合、特定のタイプの組織に最適化されています3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 、27。

BrinkmannらがFFPE組織におけるNETの免疫蛍光可視化を用いた最初の方法論的研究を発表した後、我々はこのプロトコルをより多様な組織および種に最適化したいと考えた15。さらに、広く適用可能な免疫蛍光プロトコルを確立するために、FFPE組織で免疫蛍光法を使用してNETを検出した研究とは異なる修正プロトコルをテストしました3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25、26,27。さらに、より特異的な細胞外染色のために新しいH3cit抗体を試した28。現在の染色プロトコルをさまざまな種や組織に体系的に適応させることにより、in vitroイメージングが改善され、好中球とNETの間の相互作用を局所的および全身的により適切に表現できるという仮説を立てています。

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Protocol

この研究には、ドイツ、ハンブルクのハンブルク州動物研究局(Behörde für Justiz und Verbraucherschutz)によって承認された実験に由来するマウス組織が含まれていました(73/17、100/17、94/16、109/2018、63/16)。使用した組織は、敗血症モデルからのマウスの肺と結腸、および火傷した皮膚でした。8週齢の雄と雌のマウスを使用しました。科学目的で使用される動物の保護に関する欧州指令2010/63 / EUは、すべての実験で従いました。匿名化されたヒトサンプルには、新生児腸炎、火傷した皮膚、胆道閉鎖症、脊椎椎間板炎、および心筋の組織が含まれていました。ハンブルクの医学研究倫理委員会によると、サンプルはインフォームドコンセントを必要としませんでしたが、研究は委員会によって承認されました(WF-026 / 21)。

1. サンプル固定

  1. サンプルの固定、脱水、パラフィン包埋、切片化、およびマウントには、Abu AbedおよびBrinkmannに由来する次のプロトコルを使用します3,15。
    1. 40 gのパラホルムアルデヒド(PFA)を800 mLのトリス緩衝生理食塩水(pH 7.4(TBS))に溶解して、4%ホルムアルデヒド溶液を調製します。
    2. PFAが溶解するまで、ドラフト下で60°Cで混合物を撹拌します。溶液を室温(RT)に戻し、TBSで容量を1,000 mLに調整します。
    3. pHを7.4に調整します。4°Cで2〜3週間、または-20°Cで最大1年間保管してください。
  2. サンプルを固定するには、新鮮な組織をTBSバッファーに入れ、20 mm x 30 mm x 3 mm未満の断片に解剖します。組織切片を4%パラホルムアルデヒド溶液に12〜24時間浸します。
    注:元のプロトコルでは、2% PFA溶液を使用し、固定時間は8〜20時間でした。この方法では、20時間後に一部の組織切片が完全に固定されなかったため、PFA濃度を4%PFAに増加させました。
  3. サンプルを標識された組織処理カセットに移します。ラベルには耐溶剤性のマーカーまたは鉛筆を使用してください。
  4. 次にカセットを70%エタノールに1時間浸漬して、サンプルの脱水を開始します。次に、80%エタノール、90%エタノール、96%エタノール、および100%エタノールに2回浸し、各ステップを1時間持続させます。
  5. 100%キシレン(ジメチルベンゼン)に2回浸漬し、次に60°Cパラフィンに2回1時間浸漬します。
  6. 取り付けには埋め込み型を使用し、型を取り外す前にパラフィンを固めてください。
  7. 厚さ3μmの組織切片の切断にはミクロトームを使用します。
  8. ピンセットを使用して切断切片を37°Cの水浴に置き、表面に浮かせて組織の切断部を伸ばします。
  9. 切片を粘着スライドガラス(材料表)に置き、40°Cの加熱チャンバーで一晩乾燥させます。

2. サンプルの水分補給

  1. 脱パラフィンの場合は、スライドをスライドラックに積み重ね、キシレン置換培地リモネン(材料表)にそれぞれ5分間、1:1のリモネン/エタノール混合物に5分間浸します。
    注意: リモネンは50°Cで可燃性であり、アレルギー反応を引き起こす可能性があります。ドラフトの下で、目の保護具と手袋を着用して使用してください。直火に近づかないでください。
  2. スライドラックを100%エタノールに2回、96%エタノール、90%エタノール、80%エタノール、70%エタノールに1回ずつ5分間浸して、サンプルをエタノール系列に再水和します。
  3. スライドラックを脱イオン水(脱イオン水)に5分間浸し、残っているエタノールを洗い流します。

3. 自家蛍光遮断と抗原賦活化

  1. データシートに従って、pH 6のクエン酸ターゲット賦活化溶液(TRS)(材料表)を調製します。このTRSを10倍に濃縮します。したがって、脱イオン水で1:10に希釈します。プラスチック製の染色ジャーで96°Cに予熱します。
    注:TRSは、サンプル固定中に形成されたメチレン架橋を切断し、抗原エピトープを露出させます。これにより、一次抗体が標的抗原に結合することができます。濃縮TRSを2〜8°Cで8ヶ月間保管します。常に新しいTRSを準備してください。
  2. スライドラックからスライドを取り出し、ウェットチャンバーに入れます。各サンプルに自家蛍光低減剤(材料表)を1〜2滴ピペットで移します。5分間インキュベートします。
    注:自家蛍光低減剤は、内因性蛍光色素および固定剤によって引き起こされる固有の組織自家蛍光をブロックします。自家蛍光低減剤は室温で最長1年間保管してください。
    注:サンプルの乾燥やインキュベーション時間の超過を避けるために、組織の小さな部分のみで作業してください。
  3. スライドをスライドラックに戻し、60%エタノールで上下に1分間、未使用の自家蛍光低減試薬をすべて洗い流します。
  4. スライドラックを脱イオン水に5分間浸します。
  5. 抗原賦活化のために、スライドを予熱したTRSで染色ジャーに移します。ウォーターバス中で96°Cで10分間インキュベートします。
    注:TRSを96°Cに予熱し、96°Cで10分間のインキュベーション時間を確保できれば、96°Cのウォーターバスを電子レンジまたはスチームクッカーで代用できます。
  6. 染色ジャーを取り出し、ゆっくりと冷まして約60〜90分間RTします。
    注:プロトコルはここで最大4時間一時停止し、スライドをTRSに残すことができます。
  7. TRSを取り外しますが、スライドは瓶に入れたままにします。0.05% Tween(TBST、pH 7.4)のトリス緩衝生理食塩水でそれぞれ3分間2回すすぎ、残ったTRS残留物を洗い流します。
  8. 透過処理には、0.2% Triton をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)で調製し、染色ジャーに充填してサンプルを 10 分間透過処理します。
    注:透過処理により、固定サンプル中の細胞内標的タンパク質と一次抗体の結合が促進されます。
  9. スライドをTBSTで2回、毎回3分間すすぎます。
  10. ウェットチャンバーを準備し、スライドを置きます。スライドの余分な水分をペーパーティッシュで拭き取ります。すべてのサンプルを疎水性バリアペンで囲み、抗体溶液が流出しないようにします。
    注:サンプルを乾燥させないでください。小さなセクションで作業するのが最善です。

4. 非特異的抗体結合の阻害

  1. すぐに使用できるブロッキング溶液とロバ血清(材料表)を採取し、各サンプルに1滴ピペットで移します。室温で30分間インキュベートします。
    注:このブロッキングステップにより、サンプル上の非特異的結合部位への二次抗体の結合が最小限に抑えられます。これらの非特異的エピトープをブロックし、一次抗体を塗布した後、二次抗体は一次抗体に結合し、組織の表面と相互作用しません。このすぐに使用できるブロッキング試薬は、2〜8°Cで6か月間保存されます。
  2. スライドの端を硬い表面に軽くたたいて、スライドから余分なブロッキング溶液を取り除きます。洗い流さないでください。

5. 一次抗体

  1. 一次抗体を抗体希釈バッファーで希釈します(材料表)。各サンプルに約 100 μL の最終溶液を使用します。NEおよびH3cit(R8)抗体およびアイソコントロールの場合は、5 μg/mLの濃度に希釈します。MPO および対応するアイソコントロールには、10 μg/mL を使用します。一次抗体ごとに1本のチューブを調製し、アイソコントロール抗体ごとに1本のチューブを用意します。
    注:H3cit(R8)/MPOまたはNE/MPOおよびそれらのアイソコントロールを組み合わせてNET染色を行うことができます。H3cit(R8)/MPOの組み合わせの場合、H3cit(R8)は5 μg/mL、MPOは10 μg/mLの最終濃度に希釈し、サンプルあたりの最終容量は100 μLになります。NE/MPO の場合、NE の場合は 5 μg/mL、MPO の場合は 10 μg/mL の最終濃度に希釈し、サンプルあたりの最終容量は 100 μL になります。アイソコントロールには、対応する各抗体と同じ濃度を使用してください。使用する抗体ごとに、必ず新しいピペットチップを使用してください。一次抗体は、4°Cで1〜2週間、-20°Cまたは-80°Cで最大1年間保存できます。
  2. 1枚のスライドに2つのサンプルを載せ、1つはアイソコントロール抗体に、もう1つはMPO/H3citまたはMPO/NE抗体の希釈に使用します。各サンプルに約100μLを使用し、抗体溶液を均一に広げます。
    注:サンプルを乾燥させないでください。アイソコントロール抗体と一次抗体を混同しないように注意してください。
  3. 湿式チャンバーで4°Cで一晩保存します。
  4. 翌日、スライドから余分な一次抗体溶液を取り除き、スライドをキュベットに積み重ねます。TBSTで毎回5分間3回すすぎ、残りの一次抗体溶液を洗い流します。

6. 二次抗体

  1. 二次抗体溶液を調製します。MPOにはdonkey-anti-goat、H3cit染色にはdonkey-anti-rabbitの2種類の蛍光二次抗体を使用します。それぞれを抗体希釈バッファーで7.5 μg/mLの濃度に希釈します(材料表)。
    注:二重染色には、励起領域が異なり、スペクトルの重複が最小限に抑えられた2つの蛍光抗体を使用してください。両方の二次抗体を混合し、各抗体の最終濃度が7.5 μg/mLになるまで希釈し、サンプルあたりの最終容量が100 μLになるようにします。抗体を光から保護します。二次抗体は、2〜8°Cで6〜8週間、または-80°Cで最大1年間保存できます。
  2. スライドをウェットチャンバーに保管し、各サンプルに100 μLの二次抗体溶液を加えます。室温で30分間インキュベートし、光から保護します。
  3. 余分な二次抗体溶液を軽くたたき取り、スライドをスライドラックに積み重ねます。PBSで満たされた染色ジャーにそれぞれ5分間ずつ3回浸漬し、残っている未結合の抗体を洗い流します。
  4. DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルリンドール)溶液(材料表)を調製し、脱イオン水で1μg/mLの濃度に希釈します。スライドラックをDAPI溶液の入った染色ジャーに浸し、室温で暗所で5分間インキュベートします。
    注:DAPIは、二本鎖DNAの蛍光染色剤として使用されます。調製したDAPI溶液は、複数回使用することができます。準備したDAPI溶液をRTに保存します。DAPI濃縮液は、-20°Cで最長1年間保存できます。
  5. スライドラックをPBSの入った染色ジャーに5分間浸し、余分なDAPI溶液を洗い流します。

7.サンプルの取り付けと保管、顕微鏡分析

  1. カバーガラスと封入剤(材料表)でサンプルをマウントします。
    注意: 少量の封入剤のみを使用し、余分な培地はウェットティッシュで拭き取ってください。手袋を着用し、カバーガラスやスライドから誤って媒体を拭き取らないようにしてください。気泡の形成を避け、綿棒を使用してカバーガラスをそっと押して、スライドから気泡を取り除きます。
  2. イメージングには、広視野顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用します。
    注意: 最初にアイソコントロールのイメージを撮ります。蛍光フィルター(DAPIの青色フィルターを除く)の露光時間を、シグナルがほとんど検出されなくなるまで下げます。次に、この設定を使用して、対応するサンプルを調べます。蛍光チャンネルを使用して、個々のサンプルで蛍光シグナルを検出できる領域を探します。領域の画像を撮影した後、プログラムはすべてのチャンネルの複合画像を生成し、異なる蛍光シグナルを異なる色の重なりとして表示します。その後、ImageJなどのイメージングソフトウェアとの共局在化のために、画像をさらに分析することができます。
  3. スライドは4°Cで最大6ヶ月間保存できます。

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Representative Results

プロトコールの最適化を開始する前に、NETの免疫染色にFFPE組織を使用した研究をPubMedで検索し、それらのプロトコルを比較することで、染色を成功させるための重要なステップを特定しました。最も有望なプロトコルの違いは、プロトコル最適化の主要なステップとして特定されましたが、互いにほぼ対応するステップは変更されませんでした(表1)。

表1:NETのFFPE免疫染色に関するPubMedの研究。 この表は、調査した研究における免疫染色プロトコルの変数を示しています。使用したプロトコルは、重要なステップに分けられ、互いに比較されました。次に、最も有望な違いのあるステップを最適化の重要なステップとして採用し、プロトコルに適合させました。一次抗体のインキュベーション時間(一晩、4°C)など、ほぼ一致するステップは変更されませんでした。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

この結果から、エピトープを標的とする抗体が最初の重要なステップであると結論付けました。少なくとも10種類のプロトコルでtriH3cit抗体が使用されました( 表1; 一次抗体カラム)。それにもかかわらず、Thålinらは、H3cit(R8)クローンが非シトルリン化ヒストンに対するオフターゲット交差反応性が低く、ロット間変動が無視できる程度であることを発見しました。そこで、triH3citとH3cit(R8)の染色結果を互いに比較することにしました28。

4件の研究では、ヒト/マウスMPO抗体が用いられた。さらに、他の2つのプロトコルでは、マウス組織にMPO(2D4)を適用し、ヒト組織にMPO(2C7)を適用しました( 表1を参照。 一次抗体カラム)。そこで、MPO(2C7)とヒト組織に対するヒト/マウスMPO抗体、およびMPO(2D4)とマウス組織に対するヒト/マウスMPO抗体を別々に比較した。NEは少なくとも5つの異なる抗体を用いて検出されましたが、提供された画像で良好な染色結果を示したのはそのうちの3つだけでした。しかし、1つの抗体が市場に出回らなくなったため、ヒト組織での一連の試験のために、ウサギ宿主のNE抗体とマウス宿主のNE抗体を比較しました。マウスサンプルについては、この研究の開始時にウサギ宿主で産生されたNE抗体に代わる利用可能な信頼できる代替物はないようでした。1つのNE抗体と両方のH3cit抗体が同じウサギ宿主に由来するため、このプロトコルでは二重染色のために組み合わせることはできません。二次抗体は一次抗体の定常領域に特異的であり、これは産生された宿主によって決定されます。同じ宿主由来の2つの一次抗体を使用すると、二次抗体が両方の一次抗体に結合し、染色が非特異的になります。ただし、二重染色は、より多くのNET成分を検出して共局在化できるため、単一染色よりも好まれます。したがって、染色結果はより特異的になります。その結果、H3cit と MPO を二重染色し、より堅牢な検出プロトコルを取得しました。

使用した抗体は類似しているにもかかわらず、抗体の希釈倍率はほぼすべてのプロトコルで異なっていました。例えば、triH3citの場合、濃度範囲は0.5 μg/mLから20 μg/mLであった17,18。使用した抗体ごとに、異なる希釈率を試し、文献で報告されている全範囲で満足のいく染色結果が得られました。

さらに、一次抗体のインキュベーション時間(4°Cで一晩)と二次抗体の使用および希釈に多くの類似点が見られました( 表1を参照)。 インキュベーション一次抗体カラム)。したがって、テストシリーズではこれらの手順を変更せず、上記のプロトコルに従って実行しました。

文献から決定された次の重要なステップは、抗原賦活化でした。このステップは、ホルマリン固定により、抗体のエピトープがメチレン架橋を介してマスクされ、メチレン架橋は、適切な緩衝液29で組織切片を加熱することによって逆転することができるので、不可欠である。pH 6 のクエン酸 TRS と pH 9 の EDTA TRS 緩衝液は、文献で同等の頻度で使用され、同様の結果が得られました( 表 1 を参照)。 TRS バッファー列)。そこで、試験シリーズにpH 6のクエン酸TRSを採用することにしました。抗原賦活化については、電子レンジ(360Wで1分間、90Wで9分間)とウォーターバス(60°Cで90分間、96°Cで10分間)の2種類の加熱方法を試しました。

文献にばらつきが見られた最後のステップは、Triton X-100による透過処理でした。界面活性剤処理により、細胞膜が抗体を透過するようになり、細胞内エピトープが30に達する可能性があるため、このステップには最適化が必要でした。以前のプロトコルでは、1%から0.1%の範囲のさまざまなTriton X-100濃度が使用されていました( 表1を参照。 透過処理カラム)。そのため、Triton X-100 濃度を 2 種類(0.2% と 0.5%)、Triton 透過処理を行わない 1 つのシリーズを試しました。

これらの重要なステップを特定した後、それらを修正し、プロトコルの最適化を試みました。次に、評価シートに従って画像を調べ、その差を半定量的に記録して比較しました( 表2参照)。

表 2:プロトコル手順を最適化するための結果の表。 この表は、適応されたステップ(自家蛍光低減剤、抗原賦活化、透過処理)の結果を示しています。この一連の試験を開始する前に、最適な抗体の組み合わせと濃度をテストしました。スライドは 10 の異なる領域で評価され、1 つの代表的な領域は、陰性の結果の (-) から肯定的な NET を含む結果の (++) までスコアリングされました。部分的に肯定的な結果には、非好中球細胞のより高いびまん性バックグラウンド染色が含まれていました。省略形: n/u = 使用なし。- =負の結果;+/-部分的に陽性染色;+ =中程度の特異的染色;+ = NETおよび好中球の良好な染色。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

一次抗体
プロトコルを適応させる前に、最適な抗体の組み合わせを見つけようとしました。ここで、triH3citはH3cit(R8)よりも多くの細胞内ヒストン染色を示しました。NETの検出には、プロトコルの最適化のためにH3cit(R8)抗体を使用することにしました。この抗体は細胞外H3citにのみ結合し、この濃度では細胞内H3citの染色は見られませんでした( 図1A、Bを参照)。

MPO 染色では、ヒト/マウスの MPO 抗体を、ヒト組織(図 1C、D を参照)および マウス組織用の MPO(2D4)(図 1E、F を参照)と比較しました。MPO(2D4)およびMPO(2C7)抗体は、複数の組織タイプに対して一貫した染色を達成できませんでしたが、ヒト/マウスMPOでは、MPOの信頼性が高く良好な染色が得られました。したがって、染色プロトコルにヒト/マウスMPOを選択しました。

NEについては、ヒト組織でマウス宿主由来のNE抗体を試したところ、ウサギ宿主由来のNE抗体の確実な染色と比較して、NE染色は5サンプル中1検体でしか見られませんでした。さらに、ウサギ宿主由来のNE抗体は、ヒトおよびマウスの組織に適用できます。( 図1G、Hを参照)。

Figure 1
図1:異なる組織における一次抗体の比較。 (A)H3cit(R8)で染色されたヒト新生児腸炎(NEC)組織(赤)。ここでは、細胞外シグナルのみを検出できます。(B)triH3cit(R2,8,17)で染色した同じ組織(赤)。この抗体は、シトルリン化ヒストン(黄色の矢印)の強力な細胞内染色により、より広範なシグナルを生成します。(C、E) ヒトNEC組織(C)およびマウス軸捻転組織(E)で、H3cit(R8)(赤)およびマウス/ヒトMPO(緑)の染色が良好です。H3cit、MPO、およびDAPI(青)信号の共局在は、NET形成(白い矢印)を示しています。(D、F)これに対し、(D)ヒトNEC組織にMPO(2C7)、マウス軸捻転組織に(F)MPO(2D4)(緑)を用いたが、MPOシグナルは得られなかった。(G) ウサギ宿主由来のNE抗体(マゼンタ)の染色が非常に強い火傷を負ったヒト皮膚サンプルと、マウス宿主由来のNE抗体の(H)陰性染色結果の比較。アイソタイプコントロールについては、補足図アイソコントロール1を参照してください。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

脱パラフィン
ここでは、キシレンをリモネンに置き換えたところ、キシレンと比較して組織サンプルの脱パラフィン化が良好で、バックグラウンドでの自家蛍光も少なくなることが示されました( 図2A、Bを参照)。

自家蛍光低減剤
スーダンブラックをベースにしたすぐに使用できる自家蛍光低減剤は、2〜20分間塗布できます。ここでは、0分、5分、10分で適用しました。ブロッキングを使用しない場合、一部のマウスサンプルでは非特異的染色が多く、部分陽性染色に達することができました( 図2Cを参照)。5分間のブロッキング時間は、マウスの肺および皮膚組織におけるH3citおよびMPOを除くすべての組織タイプで良好な結果を示しました( 表2を参照)。一部のサンプルでは、ブロッキング時間が 10 分になると染色が明るくなり始めたため、自家蛍光をブロッキングするには 5 分が最適です( 図 2D、E を参照)。

Figure 2
図2:自家蛍光低減剤の脱パラフィン法と使用法。 (A)リモネンで脱パラフィン処理し、H3cit(赤)とMPO(緑)で染色したヒト脊椎椎間板炎組織。シグナルの撚り線形成と部分的な共局在は、NETの存在を示しています(白い矢印)。(イ) 同じ組織サンプルをキシレンで脱パラフィンしたところ、同様の染色結果が得られ、広く使用されているキシレンを置換培地で置換できることを示しています。(C-E) 自己蛍光低減剤の異なるインキュベーション時間を使用した場合、異なるNE染色パターン(マゼンタ)を示す敗血症誘発後のマウス肺組織。自家蛍光還元剤を使用しない場合、画像Cは赤血球のわずかなバックグラウンド染色を示しています(赤い矢印)。対照的に、画像Dは、自家蛍光低減剤との5分間のインキュベーション後、明確なシグナルが放出されることを示しています。10分後、画像Eの染色品質が低下し、シグナルの明るさが低下します。アイソタイプコントロールについては、補足図アイソコントロール2を参照してください。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

抗原賦活化法
NE染色では、サンプルをpH 6クエン酸緩衝液中で電子レンジで10分間(最初に360 Wで1分間、次に90 Wで9分間)、96°Cのウォーターバスで10分間、または60°Cのウォーターバスで90分間加熱しました。 ここで、マイクロ波とウォーターバスの高温は、一貫して中程度から良好な抗原賦活化を示しました( 図3Aを参照)。マイクロ波と96°Cのウォーターバスの間に有意差は認められませんでした( 表2を参照)。さらに、60°Cのウォーターバスでは、染色が部分的に陽性またはまったくないことが示されました( 図3Bを参照)。ヒト回腸とヒト心筋のみが良好な特異的結果を示した。60°Cの水浴ではNEの適切な染色が得られなかったため、H3citおよびMPOの60°C水浴試験シリーズは破棄しました。

MPOとH3citによる二重染色では、サンプルをpH 6クエン酸緩衝液中で電子レンジで10分間(最初に360Wで1分間、次に90Wで9分間)または96°Cのウォーターバスで10分間加熱しました。ここでは、どちらの方法も良好な特異的結果を示し、96°Cの水浴ではわずかに良好な結果が得られました( 図3Cを参照)。マウスの肺と皮膚組織のみが中程度の総合順位を達成できました( 表2を参照)。

ただし、96°Cで40分のインキュベーション時間を超えると、抗体染色の強度は低下し、バックグラウンド染色が大幅に多く観察されました( 図3Dを参照)。

Figure 3
図3:抗原賦活法。 (A)96°Cで10分間のインキュベーション時間を用いてNE(マゼンタ)を染色したマウス軸捻転組織は、サンプルを60°Cのウォーターバス中で90分間インキュベートした場合、(B)よりも有意に強いシグナルを示します。(C)さらに、96°Cの抗原賦活化で10分間インキュベートすると、NET染色を組み合わせたH3cit(赤)とMPO(緑)の強いシグナルも得られます(白矢印)。Dさん:ただし、サンプルを40分以上煮沸すると、細胞外H3cit染色は特異的ではなく、MPO染色は行われません。アイソタイプコントロールについては、補足図アイソコントロール3を参照してください。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

透過処理
Triton X-100 を 2 倍希釈(0.2% と 0.5%)で 10 分間透過処理し、これを脱イオン水で 10 分間と比較しました。ここでは、0.5% Triton および脱イオン水条件と比較して差はわずかでしたが、Triton 0.2% で 10 分間投与すると、すべての組織タイプで良好な結果が得られました( 表 2 を参照)。

補足図アイソコントロール1:図1のアイソタイプコントロール。すべての画像でDAPI(青色)染色は良好ですが、蛍光抗体のシグナルは見られません。これにより、図1の一次抗体の結合は標的抗原に特異的であり、非特異的結合やタンパク質相互作用の結果ではないことが確認されました。(A)H3cit(R8)のアイソコントロール抗体で染色されたヒト新生児腸炎(NEC)組織(赤)。(B)H3cit(R2,8,17)のアイソコントロール抗体で染色したNEC組織(赤)。(C)H3cit(R8)のアイソコントロール抗体で染色したNEC組織(E)およびマウス軸捻転組織(赤)およびマウス/ヒトMPO(緑)。(D)H3cit(R8)(赤)およびMPO(2C7)(緑)のアイソコントロール抗体で染色したNEC組織。(F)H3cit(R8)(赤)およびMPO 2D4(緑)のアイソコントロール抗体で染色したマウス軸捻転組織。 G:ウサギ宿主由来のNE抗体のアイソコントロール抗体(マゼンタ)で染色した火傷したヒト皮膚サンプル。(H)マウス宿主由来のNE抗体のアイソコントロール抗体(マゼンタ)で染色した同じ組織。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図アイソコントロール2:図2のアイソタイプコントロール。すべての画像でDAPI(青色)染色は良好ですが、蛍光抗体のシグナルは見られません。これにより、図2の一次抗体の特異的結合が確認されました。画像C-Eは、露光時間が長いため、マゼンタの背景染色が残っています。ただし、図 2 の NE シグナルはバックグラウンド染色と区別できます。(ア) ヒト脊椎椎間板炎組織をリモネンで脱パラフィンし、H3cit(R8)(赤)およびマウス/ヒトMPO(緑)のアイソコントロール抗体で染色しました。(イ) 同じ組織サンプルをキシレンで脱パラフィンし、H3cit(赤)およびMPO(緑)のアイソコントロール抗体で染色しました。(ハ) マウスの肺組織をNE(マゼンタ)のアイソコントロール抗体で染色し、自家蛍光低減剤は使用していません。(エ) 同じ組織をNE(マゼンタ)のアイソコントロール抗体で染色し、自家蛍光低減剤で5分間インキュベーションしました。(E)同じ組織をNE(マゼンタ)のアイソコントロール抗体で染色し、自家蛍光低減剤で10分間インキュベーションします。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図アイソコントロール3:図3のアイソタイプコントロール。すべての画像で良好なDAPI(青色)染色が示されていますが、蛍光抗体の特異的シグナルは見られません。これにより、図 3 の一次抗体の特異的結合が確認されました。(A)マウス軸捻転組織をNE(マゼンタ)のアイソコントロール抗体で染色し、96°Cで10分間のインキュベーション時間で熱賦活化しました。(B)同じ組織をNE(マゼンタ)のアイソコントロール抗体で染色し、60°Cのウォーターバスで90分間熱賦活化しました。(C)H3cit(赤)およびMPO(緑)のアイソコントロール抗体で染色した同じ組織を、Aと同じ熱回収条件で染色しました。緑色の点は、凝集した二次抗体の染色アーチファクトを示しています。(D)同じ組織をH3cit(赤)およびMPO(緑)のアイソコントロール抗体で染色し、96°Cで40分間のインキュベーション時間を使用して熱賦活化します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図アイソコントロール4:図4のアイソタイプコントロール。以下のアイソコントロールはすべて、対応する「失敗した」実験と同じスライドからのものです。失敗した試みは意図的に行われたものではないため、一部のアイソコントロールは使用可能に見えますが、サンプルは使用可能ではありませんでした。 (A)H3cit(赤)およびMPO(緑)のアイソコントロール抗体で染色したNEC組織。このサンプルは、乾燥することなくより速く処理されました。したがって、過度の背景汚れは見られません。緑と赤の構造は二次抗体凝集体です。(イ) NE(マゼンタ)のアイソコントロール抗体で染色された脊椎椎間板炎組織。ここでは脱パラフィン化に成功したため、パラフィンの残渣は見られません。(ハ) H3cit(赤)およびMPO(緑)のアイソコントロール抗体で染色したNEC組織。不適切に保存された二次抗体を使用した場合でも、このアイソコントロール画像では染色は期待できません。したがって、このイメージを使用して、対応するイメージの特定のバインディングを評価することはできません。(エ) H3cit(赤)およびMPO(緑)のアイソコントロール抗体で染色した火傷を負ったヒト皮膚。ここでは、より慎重に取り付けが行われており、気泡による光の散乱は見られません。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

この研究では、NETをイメージングするための既存のプロトコルを、実際の染色プロセスから始めて、より多くの組織タイプに適応させ、最適化することを目指しました。この方法の最初の重要なステップは、最適な抗体の選択です。NEについては、ヒト組織上のマウス宿主由来のNE抗体を試しましたが、ウサギ宿主由来のNEと比較して信頼性の高い染色は示されませんでした。さらに、Thålinらは、細胞外染色のより特異的な抗体としてH3cit(R8)を提案しました。この抗体を広く使用されているtriH3cit(R2、R8、R17)と比較しました。私たちの研究は、H3cit(R8)抗体が使用濃度の細胞外シグナルについてのみ染色され、スライド上のNETの認識を容易にすることを示しました。この発見は、H3cit(R8)クローンが非シトルリン化ヒストンに対するオフターゲット交差反応性を減少させ、良好なNETシグナルを提供できるというThålinらの主張を支持する28。また、MPO染色では、ヒト組織とマウス組織に対するMPO抗体を比較しました。その結果、マウス/ヒト MPO 抗体はより信頼性の高い染色を示し、ヒトとマウスのサンプルに同時に使用できるため、実験室での使用が簡素化されることが示されました。したがって、この抗体の組み合わせ、H3cit(R8)とマウス/ヒトMPOを将来の研究に使用し、プロトコルに実装することをお勧めします。

ただし、この抗体選択による複数回の染色試行には制限があります。このプロトコルは、異なる宿主由来の一次抗体を使用するように修正されました。そうしないと、1つの二次抗体が両方の一次抗体に結合する可能性があります。H3cit抗体はNE抗体と同じ宿主由来であるため、NE抗体とH3citを一緒に染色することはできませんでした。この研究では三重染色(NE、H3cit、MPO)は行われませんでしたが、このプロトコルは将来の三重染色実験の基礎として役立つ可能性があります。三重染色またはNEとH3citの二重染色の1つの選択肢として考えられるのは、これらの抗体の1つを別の宿主由来の信頼できる抗体と交換することです。この場合、可能な併用パートナーは、Knackstedtらが使用したヒツジ由来のNE抗体(Santa Cruz;sc-55549)である可能性があります24。Dulerらによる別の選択肢は2021年に発表され、連続二重染色法を使用し、ウサギ宿主からのNEとH3citを組み合わせた26。多重染色法のさらなる有望な用途は、血管内および血管外のNET形成の識別です。NETマーカーの三重染色の代わりに、二重NET染色と追加の血管染色を組み合わせることができます。さらに、アルツハイマー病などの特定の疾患の病態メカニズムに関するより多くの知識を得るために、NETの血管内および血管外分布を調べた研究が増えています。Smyth et al.31 は、2 つの可能な局在化を区別するために、私たちのプロトコルに似た有望で詳細なプロトコルを説明しました。彼らは、内皮細胞を標識するためにビオチン化レクチンを添加することで既存のNET染色プロトコルを変更し、レクチンの免疫蛍光染色に蛍光色素結合ストレプトアビジンを使用しました。同じ画像内のレクチンマーカーとNETマーカーの共局在を調べることで、血管内NETを同定することができました31。これに関連して、私たちのプロトコルの適用を拡大するためにさらなる研究が必要です。

最適な抗体の組み合わせを見つけたら、次の重要なステップは自家蛍光低減剤の導入です。ホルムアルデヒド固定剤を用いたサンプル固定などの外因性因子や赤血球などの内因性因子は、高い自家蛍光をもたらす可能性があり、共局在の判断を困難にする32。この問題は、主に青色(励起領域:430-480 nm)と緑色(励起領域:500-550 nm)の蛍光スペクトルで発生し、同じ励起領域の蛍光抗体を用いた場合、決定的な染色結果が得られない可能性があります3。文献では、スーダンブラックは固有の組織自家蛍光を低減するための効果的な薬剤であると報告されています33。Sudan Blackは、青色または緑色の蛍光チャンネルを使用して、より鮮明な染色結果を得ることができます。この励起領域は、4番目の蛍光色素を使用する場合に青と緑のチャンネルが必要になるため、将来の複数回の染色の試みに必要になります。私たちの研究は、最適なインキュベーション時間が染色プロセスで使用される組織と抗体の種類に依存することを示しています。それにもかかわらず、この研究では、5分間の自家蛍光低減剤は、すべての組織タイプで一般的に良好な結果をもたらし、サンプルを黒く染色するため、スライドで見やすくなるという利点がありました。これにより、特に少量のサンプルで、染色プロセスにおける組織の欠落を防ぐことができました。

このプロトコルの成功のためのもう一つの重要な要素は、抗原賦活化ステップのための一定の高温です。私たちの研究では、以前の15の研究のうち10が抗原賦活化に96°Cを超える温度を使用していたことが示されました13、15、16、17、19、21、22、25、26、27。これは、サンプルを96°Cのウォーターバスまたはマイクロ波でインキュベートしても有意差がなく良好な結果が得られたという結果と一致していました。それでも、均一な熱分布のためにウォーターバスを使用することをお勧めします。マイクロ波を使用したところ、染色ジャーの上部と下部の間に最大5°Cの緩衝液の温度勾配があることがわかりました。さらに、ウォーターバスは使いやすく、バッファーが沸騰するリスクが低くなります。透過処理については、Triton X-100の方が染色への影響が少ないことがわかりました。したがって、プロトコルのこのステップをスキップしても、結果に悪影響を与えることはありません。一般に、ヒトのサンプルはマウスのサンプルよりも優れた結果を示しました。この理由は、ヒトがマウスよりも好中球の割合が高いためである可能性があります34,35。さらに、マウスの肺サンプルでは、目に見える肉眼的炎症は見られず、好中球も少なかったのに対し、マウスの腸サンプルは肉眼的に炎症を起こしており、良好な染色結果を示しました。したがって、私たちの研究のスコアが低いのは、プロトコルが最適に機能していないためではなく、炎症が少ないことに起因している可能性があります。

トラブルシューティングでは、プロトコールの軽微なエラーやサンプルの取り扱いの誤りが、染色結果に大きな影響を与える可能性があります。私たちが特定した大きな問題の1つは、サンプルの脱水でした。ここでは、10〜15枚以上のスライドを一度に処理することが、すべてのステップに時間がかかり、サンプルの脱水につながる可能性があるため、重要であることがわかりました。脱水されたサンプルは、バックグラウンド染色が高く、検出可能な特異的蛍光シグナルがないため、もはや使用できません(図4Aを参照)。さらに、染色プロトコルを開始する前に、サンプルを完全に脱パラフィン化する必要があります。パラフィン残渣は強いバックグラウンドシグナルをもたらし、染色されたパラフィンに切断線が見られました(図4Bを参照)。さらに、20 回以上の凍結融解サイクルの後、MPO に対する二次抗体のシグナルは検出されませんでした(図 4C を参照)。画質に大きな影響を与えるもう一つの重要なステップは、最後の実装ステップの処理です。この研究では、カバーガラスの下の気泡により蛍光シグナルが散乱し、画像がぼやけました(図4Dを参照)。

Figure 4
図4:トラブルシューティングのヒント。 (A)このパネルは、乾燥したサンプルの結果を示します。背景が赤く染色されていると、サンプルの評価が妨げられます。(イ) ここで、赤矢印は、脱パラフィン化が不十分な後の波形の外観を特徴とするパラフィン残存物を示している。これらの残骸は、高いバックグラウンド信号と低品質の画像をもたらします。(ハ) 抗体の保管が不十分であったり、凍結融解サイクルが20回を超えたりすると、二次抗体が凝集し(緑色の矢印)、MPOに結合しなくなります。(エ) 丁寧に取り付けないと、気泡が発生し、蛍光灯が散乱することがあります(青矢印)。これは、特に散乱によってターゲットがぼやける場合に、画質に大きな影響を与える可能性があります。アイソタイプコントロールについては、補足図アイソコントロール4を参照してください。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

NETは科学研究で人気が高まっていますが、NET検出の方法に焦点を当てた研究はまだ十分ではありません3,13,17,26。私たちの知る限り、FFPE組織におけるNETの免疫蛍光イメージングに関するさまざまな研究のプロトコルを比較した最初の研究を紹介します。以前に発表されたカスタマイズされたプロトコルは、抗体または抗原賦活化の方法が異なり、多くの場合、1つの組織タイプのみに対して設計されていたため、NETイメージング結果の比較がより困難でした。そこで、本研究では、重要なステップを特定し、マウスやヒトの異なる組織に適したプロトコールを確立しました。これは、H3cit染色に新しい一次抗体を使用し、自家蛍光還元剤でバックグラウンド染色を減らすことで達成しました。さらに、一定の高温が重要であり、NET染色を成功させるためにはサンプルの慎重な取り扱いが不可欠であることを示しました。したがって、この研究は、NETを染色するための一般的に適用可能なプロトコルを開発するための重要なステップを提供します。

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Disclosures

著者は何も開示していません。

Acknowledgments

この研究は、ドイツ研究協会(BO5534)によって設立されました。サンプルを提供してくださったAntonia Kiwitt氏、Moritz Lenz氏、Johanna Hagens氏、Annika Heuer博士、PDのIngo Königs博士に感謝します。さらに、著者らは、免疫蛍光顕微鏡法のサポートについて、UKE Microscopy Imaging Facility(中核施設、UKE Medical School)のチームに感謝しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
         Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg abcam Ab 68672  1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg abcam Ab 5103 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg abcam Ab 25989 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg abcam Ab 90810 1:50
Axiovision Microscopy Software  Zeiss 4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml GeneTex  GTX30972
Coverslips Marienfeld 0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) Dako S2369
DAPI 25 mg Roth 6335.1 1:25000
DCS antibody dilution 500 mL DCS diagnostics DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3 JacksonImmunoResearch 705-165-147 1:200
Donkey anti rabbit AF647 JacksonImmunoResearch 711-605-152 1:200
Donkey anti rabbit Cy3 JacksonImmunoResearch 711-165-152 1:200
Fluoromount-G Mounting Medium Invitrogen 00-4958-02
Glass slide rack Roth H552.1
Human/Mouse MPO Antibody R&D Systems AF 3667  1:20
Hydrophobic Pen KISKER MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg abcam Ab 37415 1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml Maxvision MB-L
Microscopy camera Zeiss AxioCamHR3
Microwave Bosch HMT84M421
Mouse IgG1 negative control Dako X0931 Aglient 1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control R&D Systems AB-108-C  1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x) Sigma-Aldrich P-3813
PMP staining jar Roth 2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg abcam Ab 219406 1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg abcam Ab 172730 1:300
ROTI Histol Roth  6640
SuperFrost Plus slides R. Langenbrinck 03-0060
TBS Tris buffered saline (x10) Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Water bath Memmert 830476
Water bath rice cooker reishunger RCP-30
Wet chamber Weckert Labortechnik 600016
Zeiss Widefield microscope Zeiss Axiovert 200M

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References

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Tags

免疫蛍光イメージング、好中球細胞外トラップ、NET、細菌感染、外傷性組織損傷、自己免疫疾患、無菌炎症、二本鎖DNAフィラメント、ヒストン、抗菌タンパク質、病原体、恒常性制御、血小板接着、凝固、敗血症、自己免疫疾患、治療的介入、電子顕微鏡、染色法、抗体、自家蛍光低減剤、抗原賦活化法、透過処理

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 09/29/2023. Citeable Link.

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Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング
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Schoenfeld, L., Appl, B., Pagerols-Raluy, L., Heuer, A., Reinshagen, K., Boettcher, M. Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (198), e65272, doi:10.3791/65272 (2023).

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