ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング
Summary
好中球細胞外トラップ(NET)はさまざまな疾患と関連しており、その可視化には免疫蛍光法がよく用いられます。しかし、染色プロトコルは様々であり、多くの場合、1種類の組織しか検査されません。ここでは、マウスおよびヒト組織におけるNETsの染色に一般的に適用可能なプロトコルを確立します。
Abstract
好中球細胞外トラップ(NET)は、細菌感染または外傷性組織損傷に対する応答として好中球によって放出されますが、自己免疫疾患および不妊性炎症にも関与します。これらは、二本鎖DNAフィラメント、ヒストン、および抗菌タンパク質で構成される網状の構造です。いったん放出されると、NETは血液や組織中の細胞外病原体を捕捉して死滅させることができます。さらに、NETは血小板の接着と凝固を刺激することにより、恒常性調節に関与します。しかし、NETの産生不全は、敗血症や自己免疫疾患などのさまざまな疾患とも関連しており、治療的介入の有望な標的となっています。電子顕微鏡法とは別に、免疫蛍光イメージングを用いたNETの可視化は、現在、組織におけるNET相互作用を実証する唯一の既知の方法の1つです。そのため、NETを可視化するための様々な染色法が利用されています。文献には、さまざまな染色プロトコルが記載されており、プロトコル間で大きなばらつきを示す4つの主要コンポーネントを特定しました:(1)使用する抗体の種類、(2)自家蛍光低減剤の使用、(3)抗原賦活化法、および(4)透過化。したがって、in vitro 免疫蛍光染色プロトコルは、異なる種(マウス、ヒト)および組織(皮膚、腸、肺、肝臓、心臓、脊椎椎間板)に適用できるように、この作業で体系的に適応および改善されました。固定とパラフィン包埋の後、厚さ3μmの切片をスライドに取り付けました。これらのサンプルは、修正された染色プロトコルに従って、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、シトルリン化ヒストンH3(H3cit)、および好中球エラスターゼ(NE)の一次抗体で染色しました。スライドを二次抗体で染色し、広視野蛍光顕微鏡で調べました。その結果を評価シートに従って分析し、その差を半定量的に記録した。
ここでは、さまざまな組織に適した最適化されたNET染色プロトコルを紹介します。新規一次抗体を用いてH3citを染色し、自家蛍光低減剤で非特異的染色を低減しました。さらに、NET染色には、一定の高温とサンプルの慎重な取り扱いが必要であることを実証しました。
Introduction
好中球細胞外トラップ(NET)は、2004年にBrinkmannらによって、アポトーシスや壊死とは異なる細胞死の経路として初めて可視化されました1。この経路では、好中球は脱凝縮したクロマチンを細胞外空間に放出し、以前は顆粒または細胞質に保存されていた抗菌タンパク質で覆われた大きなウェブ状の構造を形成します。これらの抗菌タンパク質には、好中球エラスターゼ(NE)、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、およびシトルリン化ヒストンH3(H3cit)が含まれ、これらはNETの間接免疫蛍光検出に一般的に使用されます2。この方法は、これらのタンパク質の定量的存在を特定するだけではありません。実際、NET に似た構造を具体的に検出できるという利点があります。NETでは、上記のタンパク質は細胞外DNAと共局在しており、染色された各タンパク質と細胞外DNAの蛍光シグナルの重なりによって検出できます。NETでは細胞外DNAとタンパク質の共局在によるシグナルの重複とは対照的に、無傷の好中球は共局在を示しません。ここで、NET成分は、通常、顆粒、核、および細胞質3に別々に貯蔵される。
最初の発見以来、NETは多くの疾患、特に炎症を伴う疾患において中心的な役割を果たしていることが示されています。NETは、血液や組織中の細胞外病原体を捕捉して死滅させることで、感染時に抗菌機能を示します4,5。しかし、NETは、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、アレルギー性喘息などの自己免疫疾患や高炎症反応にも関連しています6,7,8。NETは、アテローム性動脈硬化症、血小板癒着における血管閉塞と炎症を促進し、転移性癌に関与していると推測されています9,10,11。それにもかかわらず、それらは炎症性サイトカインレベルを低下させることにより抗炎症作用を有すると考えられている12。NETはより広い研究分野で関心を集めていますが、堅牢なNET検出方法は将来の研究の基本です。
免疫蛍光イメージングを用いた異なる組織におけるNETの可視化は複雑でカスタマイズが必要ですが、電子顕微鏡法は別として、現在、NETと細胞間の相互作用を可視化するための最も有名な方法の1つであり、主にホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPE)で使用されています13,14。.しかし、異なるラボが独自にカスタマイズしたプロトコルを使用しているため、NETイメージングの比較は困難です。これらのプロトコルは、抗体、抗原賦活化、または透過処理法の使用が異なり、多くの場合、特定のタイプの組織に最適化されています3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 、27。
BrinkmannらがFFPE組織におけるNETの免疫蛍光可視化を用いた最初の方法論的研究を発表した後、我々はこのプロトコルをより多様な組織および種に最適化したいと考えた15。さらに、広く適用可能な免疫蛍光プロトコルを確立するために、FFPE組織で免疫蛍光法を使用してNETを検出した研究とは異なる修正プロトコルをテストしました3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25、26,27。さらに、より特異的な細胞外染色のために新しいH3cit抗体を試した28。現在の染色プロトコルをさまざまな種や組織に体系的に適応させることにより、in vitroイメージングが改善され、好中球とNETの間の相互作用を局所的および全身的により適切に表現できるという仮説を立てています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究では、NETをイメージングするための既存のプロトコルを、実際の染色プロセスから始めて、より多くの組織タイプに適応させ、最適化することを目指しました。この方法の最初の重要なステップは、最適な抗体の選択です。NEについては、ヒト組織上のマウス宿主由来のNE抗体を試しましたが、ウサギ宿主由来のNEと比較して信頼性の高い染色は示されませんでした。さらに、Thålinら…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ドイツ研究協会(BO5534)によって設立されました。サンプルを提供してくださったAntonia Kiwitt氏、Moritz Lenz氏、Johanna Hagens氏、Annika Heuer博士、PDのIngo Königs博士に感謝します。さらに、著者らは、免疫蛍光顕微鏡法のサポートについて、UKE Microscopy Imaging Facility(中核施設、UKE Medical School)のチームに感謝しています。
Materials
| Dilution | |||
| Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg | abcam | Ab 68672 | 1:100 |
| Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody 100µg | abcam | Ab 5103 | 1:50 |
| Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg | abcam | Ab 25989 | 1:50 |
| Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg | abcam | Ab 90810 | 1:50 |
| Axiovision Microscopy Software | Zeiss | 4.8.2. | |
| Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml | GeneTex | GTX30972 | |
| Coverslips | Marienfeld | 0101202 | |
| Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) | Dako | S2369 | |
| DAPI 25 mg | Roth | 6335.1 | 1:25000 |
| DCS antibody dilution 500 mL | DCS diagnostics | DCS AL120R500 | |
| Donkey ant goat Cy3 | JacksonImmunoResearch | 705-165-147 | 1:200 |
| Donkey anti rabbit AF647 | JacksonImmunoResearch | 711-605-152 | 1:200 |
| Donkey anti rabbit Cy3 | JacksonImmunoResearch | 711-165-152 | 1:200 |
| Fluoromount-G Mounting Medium | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| Glass slide rack | Roth | H552.1 | |
| Human/Mouse MPO Antibody | R&D Systems | AF 3667 | 1:20 |
| Hydrophobic Pen | KISKER | MKP-1 | |
| Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg | abcam | Ab 37415 | 1:2000 and 1:250 |
| MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml | Maxvision | MB-L | |
| Microscopy camera | Zeiss | AxioCamHR3 | |
| Microwave | Bosch | HMT84M421 | |
| Mouse IgG1 negative control | Dako | X0931 Aglient | 1:50 and 1:5 |
| Normal Goat IgG Control | R&D Systems | AB-108-C | 1:100 |
| PBS Phosphate buffered saline (10x) | Sigma-Aldrich | P-3813 | |
| PMP staining jar | Roth | 2292.2 | |
| Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg | abcam | Ab 219406 | 1:100 |
| Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] – Isotype Control 200µg | abcam | Ab 172730 | 1:300 |
| ROTI Histol | Roth | 6640 | |
| SuperFrost Plus slides | R. Langenbrinck | 03-0060 | |
| TBS Tris buffered saline (x10) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Water bath | Memmert | 830476 | |
| Water bath rice cooker | reishunger | RCP-30 | |
| Wet chamber | Weckert Labortechnik | 600016 | |
| Zeiss Widefield microscope | Zeiss | Axiovert 200M |
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