Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Immunfluorescensavbildning av nøytrofile ekstracellulære feller i vev fra mennesker og mus

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65272
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

ERRATUM NOTICE

Summary

Neutrofile ekstracellulære feller (NET) er forbundet med ulike sykdommer, og immunfluorescens brukes ofte til visualisering. Imidlertid er det forskjellige fargeprotokoller, og i mange tilfeller undersøkes bare en type vev. Her etablerer vi en generelt anvendelig protokoll for farging av NET i mus og humant vev.

Abstract

Neutrofile ekstracellulære feller (NET) frigjøres av nøytrofiler som et svar på bakteriell infeksjon eller traumatisk vevskader, men spiller også en rolle i autoimmune sykdommer og steril betennelse. De er nettlignende strukturer sammensatt av dobbeltstrengede DNA-filamenter, histoner og antimikrobielle proteiner. Når de er utgitt, kan NET fange og drepe ekstracellulære patogener i blod og vev. Videre deltar NET i homeostatisk regulering ved å stimulere blodplateadhesjon og koagulasjon. Imidlertid har den dysregulerte produksjonen av NET også vært assosiert med ulike sykdommer, inkludert sepsis eller autoimmune lidelser, noe som gjør dem til et lovende mål for terapeutisk inngrep. Bortsett fra elektronmikroskopi, er visualisering av NET ved hjelp av immunfluorescensavbildning for tiden en av de eneste kjente metodene for å demonstrere NET-interaksjoner i vev. Derfor har ulike fargemetoder for å visualisere NET blitt benyttet. I litteraturen er forskjellige fargeprotokoller beskrevet, og vi identifiserte fire nøkkelkomponenter som viser høy variabilitet mellom protokoller: (1) hvilke typer antistoffer som brukes, (2) bruk av autofluorescensreduserende midler, (3) antigenuthentingsmetoder og (4) permeabilisering. Derfor ble in vitro immunfluorescensfargeprotokoller systematisk tilpasset og forbedret i dette arbeidet for å gjøre dem anvendelige for forskjellige arter (mus, menneske) og vev (hud, tarm, lunge, lever, hjerte, ryggskive). Etter fiksering og parafininnstøping ble 3 μm tykke seksjoner montert på lysbilder. Disse prøvene ble farget med primære antistoffer for myeloperoksidase (MPO), citrullinert histon H3 (H3cit) og nøytrofil elastase (NE) i henhold til en modifisert fargeprotokoll. Lysbildene ble farget med sekundære antistoffer og undersøkt med et bredfeltfluorescensmikroskop. Resultatene ble analysert i henhold til et evalueringsark, og forskjellene ble registrert semi-kvantitativt.

Her presenterer vi en optimalisert NET-fargeprotokoll som passer for forskjellige vev. Vi brukte et nytt primært antistoff for å flekke for H3cit og reduserte uspesifikk farging med et autofluorescensreduserende middel. Videre demonstrerte vi at NET-farging krever konstant høy temperatur og forsiktig håndtering av prøver.

Introduction

Nøytrofile ekstracellulære feller (NET) ble først visualisert av Brinkmann et al. som en vei for cellulær død forskjellig fra apoptose og nekrose i 20041. I denne banen frigjør nøytrofiler deres dekondenserte kromatin i det ekstracellulære rommet for å danne store nettlignende strukturer dekket av antimikrobielle proteiner som tidligere ble lagret i granulatene eller cytosolen. Disse antimikrobielle proteinene inkluderer nøytrofil elastase (NE), myeloperoksidase (MPO) og citrullinert histon H3 (H3cit), som ofte brukes til indirekte immunfluorescensdeteksjon av NET2. Denne metoden identifiserer ikke bare den kvantitative tilstedeværelsen av disse proteinene; faktisk har den fordelen av å spesifikt oppdage NET-lignende strukturer. I NET lokaliseres de nevnte proteiner sammen med ekstracellulært DNA, som kan detekteres ved en overlapping av fluorescenssignalene til hvert farget protein og det ekstracellulære DNA. I motsetning til de overlappende signalene på grunn av ekstracellulær DNA- og protein-samlokalisering i NET, viser intakte nøytrofiler ingen samlokalisering. Her lagres NET-komponentene vanligvis separat i granulatene, kjernene og cytosol3.

Siden deres første oppdagelse har det vist seg at NET spiller en sentral rolle i mange sykdommer, spesielt de som involverer betennelse. NET viser antimikrobielle funksjoner under infeksjon gjennom fangst og drap av ekstracellulære patogener i blod og vev 4,5. Imidlertid har NET også vært knyttet til autoimmune sykdommer og hyperinflammatoriske responser, som systemisk lupus erythematosus, revmatisk artritt og allergisk astma 6,7,8. NET fremmer vaso-okklusjon og betennelse i aterosklerose, blodplateadhesjon, og spekuleres i å spille en rolle i metastatisk kreft 9,10,11. Likevel antas de å ha antiinflammatoriske egenskaper ved å redusere proinflammatoriske cytokinnivåer12. Mens NET får mer interesse for et bredere forskningsfelt, er en robust NET-deteksjonsmetode grunnleggende for fremtidig forskning.

Selv om visualisering av NET i forskjellige vev ved hjelp av immunfluorescensavbildning er kompleks og krever tilpasning, bortsett fra elektronmikroskopi, er det for tiden en av de mest anerkjente metodene for å visualisere interaksjonene mellom NET og celler, og brukes hovedsakelig i formalinfast parafininnebygd vev (FFPE)13,14. Det er imidlertid vanskelig å sammenligne NET-bildebehandling, da forskjellige laboratorier bruker sine egne tilpassede protokoller. Disse protokollene varierer i bruk av antistoffer, antigengjenfinning eller permeabiliseringsmetode og er ofte optimalisert for en bestemt type vev 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.

Etter at Brinkmann et al. publiserte den første metodiske studien ved hjelp av immunfluorescerende visualisering av NET i FFPE-vev, ønsket vi å optimalisere denne protokollen for et bredere utvalg av vev og arter15. I tillegg, for å etablere en bredt anvendelig immunfluorescensprotokoll, testet vi forskjellige modifiserte protokoller fra studier som brukte immunfluorescensmetoder i FFPE-vev for å oppdage NET 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Videre prøvde vi et nytt H3cit-antistoff for mer spesifikk ekstracellulær farging28. Vi hypoteser at ved systematisk å tilpasse nåværende fargeprotokoller til forskjellige arter og vev, kan in vitro-avbildning forbedres, noe som resulterer i en bedre representasjon av samspillet mellom nøytrofiler og NET både lokalt og systemisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien inkluderte musevev avledet fra eksperimenter godkjent av Hamburg State Administration for Animal Research, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, Tyskland (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Vevet som ble brukt var mus, lunge og tykktarm fra en septikmodell og brent hud. Vi brukte 8 uker gamle hann- og hunnmus. Det europeiske direktivet 2010/63/EU om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål ble fulgt for alle forsøkene. De anonymiserte humane prøvene inkluderte vev fra neonatal enterocolitt, brent hud, biliær atresi, spondylodiskitt og myokard. Ifølge komiteen for medisinsk forskningsetikk i Hamburg trengte ikke prøvene informert samtykke, men studien ble godkjent av komiteen (WF-026/21).

1. Eksempel fiksering

  1. Bruk følgende protokoll avledet fra Abu Abed og Brinkmann for prøvefiksering, dehydrering, parafininnebygging, seksjonering og montering 3,15.
    1. Lag 4% formaldehydoppløsning ved å oppløse 40 g paraformaldehyd (PFA) i 800 ml Tris-bufret saltvann, pH 7,4 (TBS).
    2. Rør blandingen ved 60 °C under en avtrekkshette til PFA er oppløst. Ta løsningen til romtemperatur (RT), og juster volumet med TBS til 1,000 ml.
    3. Juster pH til 7,4. Oppbevares ved 4 °C i 2-3 uker eller ved -20 °C i opptil 1 år.
  2. For prøvefiksering, legg ferskt vev i TBS-buffer, og dissekere i stykker mindre enn 20 mm x 30 mm x 3 mm. Dyp vevsseksjonene i 4% paraformaldehydoppløsning i 12-24 timer.
    MERK: Den opprinnelige protokollen brukte en 2% PFA-løsning og en fikseringstid på 8-20 timer. Med denne metoden ble noen vevsseksjoner ikke fullstendig fiksert etter 20 timer, slik at PFA-konsentrasjonen ble økt til 4% PFA.
  3. Overfør prøvene til merkede vevsbehandlingskassetter. Bruk løsemiddelbestandige markører eller blyanter for merking.
  4. Start prøven dehydrering ved å senke deretter kassetter i 70% etanol i 1 time. Deretter fordyper du deg i 80% etanol, 90% etanol, 96% etanol og to ganger i 100% etanol, med hvert trinn som varer 1 time.
  5. Fordyp to ganger i 100 % xylen (dimetylbenzen) og deretter to ganger i 60 °C parafin i 1 time hver gang.
  6. Bruk støpeformer for montering, og la parafinen stivne før du fjerner formen.
  7. Bruk en mikrotome for å kutte 3 μm tykke vevsseksjoner.
  8. Bruk pinsetten til å legge de kuttede seksjonene i et vannbad på 37 °C, og la dem flyte på overflaten for å strekke vevskuttene.
  9. Plasser seksjonene på selvklebende glassglass (materialfortegnelse), og la dem tørke over natten i et varmekammer på 40 °C.

2. Prøve rehydrering

  1. For deparaffinering, stable lysbildene i et lysbildestativ, og senk to ganger i 5 minutter hver i xylenerstatningsmediet limonen (materialfortegnelse) og en gang i 5 minutter i en 1: 1 limonen / etanolblanding.
    FORSIKTIG: Limonene er brannfarlig ved 50 °C og kan forårsake allergiske reaksjoner. Bruk under avtrekkshette med øyevern og hansker. Holdes borte fra åpen ild.
  2. Rehydrer prøvene i en synkende etanolserie ved å senke glidestativet to ganger i 100% etanol og en gang i 96% etanol, 90% etanol, 80% etanol og 70% etanol i 5 minutter hver.
  3. Senk glidestativet i 5 minutter i avionisert vann (DI-vann) for å rense av gjenværende etanol.

3. Autofluorescensblokkering og antigenuthenting

  1. Forbered pH 6 citrate target retrieval solution (TRS) (Table of Materials) i henhold til databladet. Denne TRS er konsentrert 10 ganger. Fortynn derfor 1:10 med DI-vann. Forvarm i en plastkanne til 96 °C.
    MERK: TRS bryter metylenbroene dannet under prøvefiksering for å avsløre antigenepitopene. Dette gjør at de primære antistoffene kan binde sitt målantigen. Oppbevar konsentrert TRS ved 2-8 °C i 8 måneder. Forbered alltid fersk TRS.
  2. Ta lysbildene ut av glidestativet, og plasser dem i et vått kammer. Pipett en til to dråper autofluorescensreduserende middel (materialfortegnelse) på hver prøve. Inkuber i 5 min.
    MERK: Det autofluorescensreduserende middel blokkerer den iboende vevsautofluorescensen forårsaket av endogene fluoroforer og fikseringsmidler. Oppbevar autofluorescensreduserende middel ved RT i opptil 1 år.
    MERK: Arbeid bare med små deler av vev for å unngå uttørking av prøvene eller overskridelse av inkubasjonstiden.
  3. Stable lysbildene tilbake i glidestativet, og skyll i 1 min i 60% etanol med en oppadgående og nedadgående bevegelse til alt ubrukt autofluorescensreduserende reagens er vasket av.
  4. Senk glidestativet i 5 min i DI-vann.
  5. For antigenhenting, overfør lysbildene til en fargekrukke med forvarmet TRS. Inkuber i 10 minutter ved 96 °C i vannbad.
    MERK: Vannbadet på 96 °C kan erstattes med mikrobølgeovn eller dampkoker hvis TRS forvarmes til 96 °C og 10 minutters inkubasjonstid ved 96 °C er sikret.
  6. Ta ut fargeglasset, og la det avkjøles sakte til RT i ca 60-90 min.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her i opptil 4 timer, og etterlater lysbildene i TRS.
  7. Fjern TRS, men hold lysbildene i krukken. Skyll to ganger med Tris-bufret saltvann med 0,05% Tween (TBST, pH 7,4) i 3 minutter hver for å vaske av eventuelle rester av TRS-rester.
  8. For permeabilisering, lag 0,2% Triton i fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4, og fyll den i fargeglasset for å permeabilisere prøvene i 10 minutter.
    MERK: Permeabilisering øker bindingen av de primære antistoffene med de intracellulære målproteinene i de faste prøvene.
  9. Skyll skliene igjen to ganger i TBST i 3 min hver gang.
  10. Forbered det våte kammeret, og legg ned lysbilder. Tørk overflødig vann fra lysbilder med papirvev. Sett ring rundt hver prøve med en hydrofob barrierepenn for å hindre at antistoffoppløsningen renner av.
    MERK: Ikke la prøvene tørke ut. Det er best å jobbe med små seksjoner.

4. Blokkering av uspesifikk antistoffbinding

  1. Ta bruksklar blokkeringsløsning med eselserum (materialfortegnelse), og pipett en dråpe på hver prøve. Inkuber i 30 min ved RT.
    MERK: Dette blokkeringstrinnet minimerer bindingen av det sekundære antistoffet til ikke-spesifikke bindingssteder på prøven. Etter å ha blokkert disse uspesifikke epitopene og påført det primære antistoffet, vil det sekundære antistoffet binde seg til det primære antistoffet og ikke interagere med overflaten av vevet. Dette bruksklare blokkeringsreagenset oppbevares ved 2-8 °C i 6 måneder.
  2. Fjern overflødig blokkeringsløsning fra lysbilder ved å trykke kanten av lysbildene mot en hard overflate. Ikke skyll dem.

5. Primært antistoff

  1. Fortynn primære antistoffer i antistofffortynningsbuffer (materialfortegnelse). Bruk ca. 100 μL av den endelige løsningen for hver prøve. For NE og H3cit (R8) antistoff og isokontroll, fortynnet til en konsentrasjon på 5 μg / ml. For MPO og tilsvarende isokontroll, bruk 10 μg/ml. Klargjør ett rør for hvert primære antistoff og ett for hvert isocontrol antistoff.
    MERK: H3cit (R8) / MPO eller NE / MPO og deres isokontroller kan kombineres for NET farging. For kombinasjonen av H3cit (R8)/MPO, fortynn til en endelig konsentrasjon på 5 μg/ml for H3cit (R8) og 10 μg/ml for MPO til et endelig volum på 100 μL per prøve. For NE/MPO fortynnes den til en endelig konsentrasjon på 5 μg/ml for NE og 10 μg/ml for MPO til et endelig volum på 100 μL per prøve. For isocontrol, bruk samme konsentrasjon som for hvert tilsvarende antistoff. Bruk alltid en ny pipettespiss for hvert antistoff som brukes. Primære antistoffer kan oppbevares ved 4 °C i 1-2 uker og ved -20 °C eller -80 °C i opptil 1 år.
  2. Med to prøver på ett lysbilde, bruk en for isocontrol antistoffer og en for MPO / H3cit eller MPO / NE antistoff fortynning. Bruk ca. 100 μL for hver prøve, og fordel antistoffoppløsningen jevnt.
    MERK: Ikke la prøvene tørke ut. Vær forsiktig så du ikke blander opp isocontrol og primære antistoffer.
  3. Oppbevares i vått kammer over natten ved 4 °C.
  4. Neste dag, trykk av overflødig primær antistoff løsning fra lysbildene, og stable lysbildene i en kuvette. Skyll tre ganger i 5 minutter hver gang med TBST for å vaske av den gjenværende primære antistoffoppløsningen.

6. Sekundært antistoff

  1. Forbered den sekundære antistoffoppløsningen. Bruk to forskjellige fluorescerende sekundære antistoffer: esel-anti-geit for MPO og esel-anti-kanin for H3cit-farging. Fortynn hver enkelt til en konsentrasjon på 7,5 μg/ml med antistofffortynningsbuffer (materialfortegnelse).
    MERK: For dobbeltfarging, bruk to fluorescerende antistoffer med forskjellige eksitasjonsområder og minimal spektral overlapping. Kombiner begge sekundære antistoffer, og fortynn til en endelig konsentrasjon på 7,5 μg / ml for hvert antistoff for et endelig volum på 100 μL per prøve. Beskytt antistoffene mot lys. De sekundære antistoffene kan oppbevares ved 2-8 °C i 6-8 uker eller ved -80 °C i opptil 1 år.
  2. Hold lysbildene i det våte kammeret, og tilsett 100 μL av den sekundære antistoffløsningen på hver prøve. La dem ruge i 30 min ved RT og beskyttet mot lys.
  3. Trykk av overflødig sekundært antistoffløsning, og stable lysbildene i skyvestativet. Senk tre ganger i 5 minutter hver i en fargekrukke fylt med PBS for å vaske av eventuelle gjenværende ubundne antistoffer.
  4. Forbered DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindol) oppløsning (materialfortegnelse), og fortynn til en konsentrasjon på 1 μg / ml med DI-vann. Senk glidestativet i en fargekrukke med DAPI-løsning, og rug i 5 min ved RT i mørket.
    MERK: DAPI brukes som fluorescerende flekk for dobbeltstrenget DNA. Den forberedte DAPI-løsningen kan brukes flere ganger. Oppbevar den forberedte DAPI-løsningen hos RT. DAPI-konsentratet kan oppbevares ved −20 °C i opptil 1 år.
  5. Senk glidestativet i 5 minutter i en fargekrukke med PBS for å vaske av overflødig DAPI-løsning.

7. Montering og lagring av prøvene, mikroskopisk analyse

  1. Monter prøvene med deksler og monteringsmedium (materialfortegnelse).
    NOTAT: Bruk bare små mengder monteringsmedium, og tørk av overflødig medium med vått vev. Bruk hansker, og unngå å tørke av noe medium fra dekslene eller lysbildene ved et uhell. Unngå bobledannelse, og bruk bomullspinner til å trykke forsiktig på dekksedlene for å fjerne eventuelle bobler fra lysbildene.
  2. For avbildning, bruk et bredfeltmikroskop eller et konfokalmikroskop.
    MERK: Ta et bilde av isocontrol først. Senk eksponeringstiden for fluorescensfiltrene (unntatt det blå filteret for DAPI) til nesten ingen signaler kan oppdages. Bruk deretter denne innstillingen til å undersøke de tilsvarende eksemplene. Se etter områder der et fluorescerende signal kan detekteres i hver enkelt prøve ved hjelp av fluorescenskanalen. Etter å ha tatt et bilde av området, genererer programmet et sammensatt bilde av alle kanalene og viser de forskjellige fluorescenssignalene som en overlapping av forskjellige farger. Bildet kan deretter analyseres videre for samlokalisering med bildebehandlingsprogramvare som ImageJ.
  3. Oppbevar lysbildene ved 4 °C i opptil 6 måneder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før vi startet protokolloptimaliseringen, identifiserte vi viktige trinn for vellykket farging ved å søke i PubMed etter studier som brukte FFPE-vev til immunfarging av NET og sammenlignet protokollene deres. De mest lovende protokollforskjellene ble identifisert som de viktigste trinnene for protokolloptimaliseringen, mens trinn som stort sett korresponderte med hverandre, ikke ble endret (tabell 1).

Tabell 1: PubMed-forskning for FFPE-immunfarging av NET. Denne tabellen viser variablene i immunfargingsprotokollen i de undersøkte studiene. Protokollene som ble brukt ble delt inn i deres essensielle trinn og deretter sammenlignet med hverandre. Trinnene med de mest lovende forskjellene ble deretter tatt som de viktigste trinnene for optimalisering og tilpasset protokollen vår. Skritt som stort sett tilsvarte hverandre, ble ikke endret, som inkubasjonstiden for primærantistoffet (over natten, 4 °C). Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Basert på våre funn konkluderte vi med at antistoffene som ble valgt for å målrette epitopene var det første kritiske trinnet. Minst 10 forskjellige protokoller brukte triH3cit-antistoffet (se tabell 1; Primær antistoffkolonne). Ikke desto mindre fant Thålin et al. at H3cit (R8) -klonen viste mindre kryssreaktivitet utenfor målet mot ikke-citrullinerte histoner og viste ubetydelig variasjon mellom partiene. Derfor bestemte vi oss for å sammenligne fargeresultatene for triH3cit og H3cit (R8) med hverandre28.

Fire studier brukte MPO-antistoffet fra menneske/mus. Videre gjaldt to andre protokoller MPO (2D4) for musevev og MPO (2C7) for humant vev (se tabell 1; Primær antistoffkolonne). Derfor sammenlignet vi MPO (2C7) separat med human/mus MPO-antistoff for humant vev og MPO (2D4) med MPO-antistoff mot menneske/mus for musevev. NE ble påvist med minst fem ulike antistoffer, men bare tre av dem viste gode fargeresultater på bildene som ble gitt. Imidlertid var ett antistoff ikke lenger tilgjengelig på markedet, så vi sammenlignet NE-antistoffet fra en kaninvert med et fra en musevert for vår testserie i humant vev. For museprøver syntes det ikke å være noe tilgjengelig og pålitelig alternativ til NE-antistoffet som ble hevet i kaninvert ved starten av denne studien. Siden ett NE- og begge H3cit-antistoffene er avledet fra samme kaninvert, kan de ikke kombineres for dobbeltfarging med denne protokollen. Det sekundære antistoffet er spesifikt for den konstante regionen av det primære antistoffet, som bestemmes av verten det ble reist i. Hvis to primære antistoffer avledet fra samme vert brukes, kan det sekundære antistoffet binde seg til begge primære antistoffer, og fargingen vil være uspesifikk. Imidlertid foretrekkes dobbeltfarging fremfor enkeltfarging fordi flere NET-komponenter kan detekteres og samlokaliseres. Derfor vil fargeresultatet være mer spesifikt. Derfor dobbeltfarget vi for H3cit og MPO for å få en mer robust deteksjonsprotokoll.

Til tross for likhetene i antistoffene som ble brukt, varierte fortynningene for antistoffene i nesten alle protokollene; For triH3cit var for eksempel konsentrasjonsområdet fra 0,5 μg/ml til 20 μg/ml17,18. For hvert antistoff som ble brukt, prøvde vi forskjellige fortynninger og oppnådde tilfredsstillende fargeresultater i hele spekteret som er rapportert i litteraturen.

Videre kunne man finne mange likheter i inkubasjonstiden for det primære antistoffet (over natten ved 4 °C) og bruk og fortynning av det sekundære antistoffet (se tabell 1; Inkubasjon primær antistoffkolonne). Derfor endret vi ikke disse trinnene i testserien vår og utførte dem i henhold til protokollen beskrevet ovenfor.

Det neste kritiske trinnet bestemt fra litteraturen var antigeninnhentingen. Dette trinnet er viktig fordi epitopene for antistoffene på grunn av formalinfiksering maskeres gjennom metylenbroer, som kan reverseres ved oppvarming av vevsseksjonen i en passende buffer29. Citrat TRS ved pH 6 og EDTA TRS buffer ved pH 9 ble brukt like ofte i litteraturen og ga tilsvarende resultater (se tabell 1; TRS-bufferkolonne). Dermed bestemte vi oss for pH 6 citrate TRS for vår testserie. For antigenuthenting testet vi to forskjellige oppvarmingsmetoder: en mikrobølgeovn (først 1 min ved 360 W og deretter påfølgende med 9 min ved 90 W) og et vannbad (60 °C i 90 min, 96 °C i 10 minutter).

Det siste trinnet som viste en viss variasjon i litteraturen var permeabiliseringen med Triton X-100. Dette trinnet krevde optimalisering fordi med vaskemiddelbehandling blir cellemembranen gjennomtrengelig for antistoffer, og intracellulære epitoper kan nås30. De tidligere protokollene brukte forskjellige Triton X-100-konsentrasjoner fra 1% til 0,1% (se tabell 1; Permeabilisering kolonne). Derfor prøvde vi to Triton X-100 konsentrasjoner (0,2% og 0,5%) og en serie uten Triton permeabilisering.

Etter å ha identifisert disse viktige trinnene, endret vi dem og prøvde å optimalisere protokollen. Deretter ble bildene undersøkt i henhold til et evalueringsark, og forskjellene ble registrert semi-kvantitativt og sammenlignet (se tabell 2).

Tabell 2: Tabell over resultater for optimalisering av protokolltrinnene. Denne tabellen viser resultatene for de tilpassede trinnene: autofluorescensreduserende middel, antigenuthenting og permeabilisering. Før vi begynte denne testserien, testet vi for den beste antistoffkombinasjonen og konsentrasjonen. Skredene ble evaluert i 10 ulike områder, og deretter ble ett representativt område skåret fra (-) for negativt resultat til (++) for positivt NET-holdig resultat. De delvis positive resultatene inkluderte en høyere diffus bakgrunnsfarging av ikke-nøytrofile celler. Forkortelser: n/u = ikke brukt; - = negativt resultat; +/- delvis positiv farging; + = moderat spesifikk farging; + = god farging av NET og nøytrofiler. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Primære antistoffer
Før vi tilpasset protokollen, prøvde vi å finne den beste antistoffkombinasjonen. Her viste triH3cit mer intracellulær histonfarging enn H3cit (R8). For å oppdage NET bestemte vi oss for å bruke H3cit (R8)-antistoffet for protokolloptimalisering. Dette antistoffet bandt seg kun til ekstracellulær H3cit og viste ingen farging av intracellulær H3cit ved denne konsentrasjonen (se figur 1A,B).

For MPO-farging sammenlignet vi MPO-antistoff fra menneske/mus med MPO (2C7) for humant vev (se figur 1C,D) og MPO (2D4) for musevev (se figur 1E,F). MPO (2D4) og MPO (2C7) antistoffene kunne ikke oppnå konsistent farging for flere vevstyper, mens menneske / mus MPO resulterte i pålitelig, god farging for MPO. Dermed valgte vi menneske/mus MPO for fargeprotokollen vår.

For NE prøvde vi et NE-antistoff fra en musevert på humant vev, som viste NE-farging bare i en av fem prøver sammenlignet med pålitelig farging av NE-antistoffet fra en kaninvert. I tillegg er NE-antistoffet fra en kaninvert anvendelig for vev fra mennesker og mus. (se figur 1G,H).

Figure 1
Figur 1 Primær antistoffsammenligning i forskjellige vev. (A) Humant neonatalt enterokolitt (NEC) vev farget med H3cit (R8) (rød). Her kan bare et ekstracellulært signal detekteres. (B) Samme vev farget med triH3cit (R2,8,17) (rød). Dette antistoffet skaper et bredere signal med intens intracellulær farging av citrullinerte histoner (gule piler). (C,E) Humant NEC-vev (C) og musevolvulusvev (E) med god farging for H3cit (R8) (rød) og mus/human MPO (grønn). Samlokaliseringen av H3cit-, MPO- og DAPI-signalet (blått) indikerer NET-dannelse (hvite piler). (D,F) Til sammenligning, (D) ved bruk av MPO (2C7) for humant NEC-vev og (F) MPO (2D4) (grønt) for musevolvulusvev, kunne det ikke oppnås MPO-signal. (G) Brent human hudprøve med meget sterk farging for NE antistoff fra en kaninvert (magenta) sammenlignet med (H) negativt fargeresultat for NE antistoff fra en musevert. For isotypekontrollen, se tilleggsfigur Isokontroll 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Deparaffinisering
Her ble xylen erstattet med limonen, som viste tilsvarende bedre deparaffinisering av vevsprøvene sammenlignet med xylen, med mindre autofluorescens i bakgrunnen (se figur 2A,B).

Autofluorescensreduserende middel
Det bruksklare autofluorescensreduserende middelet basert på Sudan Black kan påføres i 2-20 minutter. Her brukte vi den i 0 min, 5 min og 10 min. Når ingen blokkering ble brukt, viste noen museprøver mer uspesifikk farging, og delvis positiv farging kunne nås (se figur 2C). Blokkeringstiden på 5 minutter viste gode resultater i alle vevstypene bortsett fra H3cit og MPO i musens lunge- og hudvev (se tabell 2). Ved 10 min blokkeringstid i noen prøver begynte fargingen å bli mindre lys, så tidsrammen på 5 minutter er det beste valget for å blokkere autofluorescens (se figur 2D, E).

Figure 2
Figur 2: Deparaffiniseringsmetoder og bruk av et autofluorescensreduserende middel. (A) Humant spondylodiskittvev deparaffinert med limonen og farget for H3cit (rød) og MPO (grønn). Den strandede dannelsen av signalene og delvis samlokalisering indikerer tilstedeværelsen av NET (hvit pil). (B) Samme vevsprøve deparaffinisert med xylen, noe som resulterer i lignende fargeresultater, noe som indikerer at den mye brukte xylen kan erstattes med et erstatningsmedium. (VG Nett) Musens lungevev etter indusert sepsis som viser forskjellige NE-fargemønstre (magenta) når forskjellige inkubasjonstider for det autofluorescensreduserende middel brukes. Uten autofluorescensreduksjon brukt, viser bilde C fortsatt en svak bakgrunnsfarging av erytrocytter (rød pil). I kontrast viser bilde D at etter 5 min inkubasjon med et autofluorescensreduserende middel, sendes et klart signal. Etter 10 minutter synker fargekvaliteten i bilde E, og signalet blir mindre lyst. For isotypekontrollen, se Supplerende figur Isokontroll 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Antigen henting metoder
For NE-farging varmet vi prøvene i pH 6 citratbuffer i 10 minutter i mikrobølgeovnen (først i 1 min ved 360 W og deretter i 9 minutter ved 90 W), i 10 minutter i vannbad ved 96 °C, eller i 90 minutter i vannbad ved 60 °C. Her viste de høyere temperaturene i mikrobølgeovn og vannbad gjennomgående moderat til god antigenuthenting (se figur 3A). Det ble ikke funnet noen signifikant forskjell mellom mikrobølgeovnen og vannbadet på 96 °C (se tabell 2). Videre ble det vist at det i et vannbad på 60 °C bare var delvis positiv til ingen farging (se figur 3B). Bare humant ileum og humant myokard viste gode spesifikke resultater. Da det ikke var mulig å oppnå tilstrekkelig farging for NE med vannbadet på 60 °C, ble testserien for vannbad på 60 °C for H3cit og MPO kassert.

For dobbeltfarging med MPO og H3cit varmet vi prøvene i pH 6 citratbuffer i mikrobølgeovnen i 10 minutter (først i 1 min ved 360 W og deretter i 9 min ved 90 W) eller i vannbad ved 96 °C i 10 minutter. Her viste begge metodene gode spesifikke resultater, med litt gunstigere resultater for vannbadet på 96 °C (se figur 3C). Bare musens lunge- og hudvev kunne oppnå en moderat samlet rangering (se tabell 2).

Overskridelse av inkubasjonstiden på 40 min ved 96 °C resulterte imidlertid i mindre intens antistofffarging, mens betydelig mer bakgrunnsfarging kunne observeres (se figur 3D).

Figure 3
Figur 3: Antigenuthentingsmetoder. (A) Vev fra volvulus fra mus farget for NE (magenta) med en inkubasjonstid på 10 minutter ved 96 °C for varmeuthenting, viser et signifikant sterkere signal enn (B) ved inkubering av prøven i 90 minutter i et vannbad på 60 °C. (C) Videre resulterer 10 minutters inkubasjon i 96 °C antigenuthenting også i et sterkt signal for H3cit (rød) og MPO (grønn) med kombinert NET-farging (hvite piler). D: Koking av prøvene i mer enn 40 minutter resulterer imidlertid i mindre spesifikk ekstracellulær H3cit-farging og ingen MPO-farging. For isotypekontrollen, se Supplerende figur Isokontroll 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Permeabilisering
Vi prøvde å permeabilisere prøvene med Triton X-100 i to fortynninger (0,2% og 0,5%) i 10 min og sammenlignet dette med 10 min i avionisert vann. Her oppnådde 10 min med Triton 0,2% gode resultater på tvers av alle vevstyper, selv om forskjellene var små sammenlignet med 0,5% Triton og avioniserte vannforhold (se tabell 2).

Tilleggsfigur Isokontroll 1: Isotypekontroller for figur 1. Alle bildene viser god DAPI (blå) farging, men ingen signal for det fluorescerende antistoffet. Dette bekrefter at bindingen av primære antistoffer i figur 1 er spesifikk for målantigenet og ikke et resultat av uspesifikk binding eller proteininteraksjoner. (A) Humant neonatalt enterokolitt (NEC) vev farget med isokontrollantistoffet for H3cit (R8) (rød). (B) NEC-vev farget med isokontrollantistoffet for H3cit (R2,8,17) (rød). (C) NEC-vev (E) og musevolvulusvev farget med isokontrollantistoffene for H3cit (R8) (rød) og mus/human MPO (grønn). (D) NEC-vev farget med isokontrollantistoffene for H3cit (R8) (rød) og MPO (2C7) (grønn). (F) Mus volvulus vev farget med isokontroll antistoffer for H3cit (R8) (rød) og MPO 2D4 (grønn). G: Brent menneskelig hudprøve farget med isocontrol antistoff for NE antistoff fra en kaninvert (magenta). (H) Samme vev farget med isokontroll antistoff for NE antistoff fra en mus vert (magenta). Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur Isokontroll 2: Isotypekontroller for figur 2. Alle bildene viser god DAPI (blå) farging, men ingen signal for det fluorescerende antistoffet. Dette bekrefter den spesifikke bindingen av de primære antistoffene i figur 2. Bilder C-E viser fortsatt noe bakgrunnsfarging i magenta på grunn av de lange eksponeringstidene. NE-signalet i figur 2 kan imidlertid skilles fra bakgrunnsfargingen. (A) Humant spondylodiskittvev deparaffinisert med limonen og farget med isokontrollantistoffene for H3cit (R8) (rød) og mus/human MPO (grønn). (B) Samme vevsprøve deparaffinisert med xylen og farget med isokontrollantistoffene for H3cit (rød) og MPO (grønn). (C) Mus lungevev farget med isocontrol antistoff for NE (magenta), uten autofluorescens-reduserende middel brukt. (D) Samme vev farget med isokontrollantistoffet for NE (magenta) og 5 min inkubasjon med et autofluorescensreduserende middel. (E) Samme vev farget med isokontroll antistoff for NE (magenta) og 10 min inkubasjon med et autofluorescensreduserende middel. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur Isokontroll 3: Isotypekontroller for figur 3. Alle bildene viser god DAPI (blå) farging, men ikke noe spesifikt signal for det fluorescerende antistoffet. Dette bekrefter den spesifikke bindingen av de primære antistoffene i figur 3. (A) Mus volvulus vev farget med isokontroll antistoff for NE (magenta) ved hjelp av en 10 min inkubasjonstid ved 96 ° C for varmeinnhenting. (B) Samme vev farget med isokontroll antistoff for NE (magenta) og varmeinnhenting i 90 minutter i et 60 °C vannbad. (C) Samme vev farget med isokontrollantistoffet for H3cit (rød) og MPO (grønn) og med identiske varmeinnhentingsbetingelser som i A. Den grønne prikken viser en fargeartefakt av aggregerte sekundære antistoffer. (D) Samme vev farget med isocontrol antistoff for H3cit (rød) og MPO (grønn) og ved bruk av en 40 min inkubasjonstid ved 96 ° C for varmeinnhenting. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur Isokontroll 4: Isotypekontroller for figur 4. Alle følgende isokontroller er fra samme lysbilde som det tilsvarende "mislykkede" eksperimentet. De mislykkede forsøkene ble ikke gjort med vilje, så noen isokontroller ser ut til å være brukbare, mens prøven ikke var det. (A) NEC-vev farget med isokontrollantistoffet for H3cit (rød) og MPO (grønn). Denne prøven ble behandlet raskere uten uttørking. Derfor er ingen overdreven bakgrunnsfarging synlig. De grønne og røde strukturene er sekundære antistoffaggregater. (B) Spondylodiskittvev farget med isokontroll antistoff for NE (magenta). Her var deparaffiniseringen vellykket, så ingen parafinrester kan sees. (C) NEC-vev farget med isokontrollantistoffet for H3cit (rød) og MPO (grønn). Selv om de samme feillagrede sekundære antistoffene ble brukt, ville det ikke forventes noen farging for dette isokontrollbildet. Derfor kan ikke dette bildet brukes til å evaluere det tilsvarende bildets spesifikke binding. (D) Brent menneskelig hud farget med isocontrol antistoff for H3cit (rød) og MPO (grønn). Her ble monteringen gjort mer nøye, og ingen lysspredning gjennom luftbobler kan sees. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbeidet hadde vi som mål å tilpasse og optimalisere de eksisterende protokollene for avbildning av NET til flere vevstyper, og begynte med selve fargeprosessen. Det første kritiske trinnet for denne metoden er valget av de mest egnede antistoffene. For NE prøvde vi et NE-antistoff fra en musevert på humant vev, som ikke viste noen pålitelig farging sammenlignet med NE fra en kaninvert. Videre foreslo Thålin et al. H3cit (R8) som et mer spesifikt antistoff for ekstracellulær farging. Vi sammenlignet dette antistoffet med det mye brukte triH3cit (R2, R8, R17). Vår studie viste at H3cit (R8) antistoffet kun farget for et ekstracellulært signal ved de brukte konsentrasjonene, noe som muliggjorde lettere gjenkjenning av NET på lysbildene. Dette funnet støtter påstandene fra Thålin et al. om at H3cit (R8) -klonen kan gi et godt NET-signal med redusert kryssreaktivitet utenfor målet til ikke-citrullinerte histoner28. Vi sammenlignet også MPO-antistoffer for humant og musevev for MPO-farging. Våre resultater viser at mus / humant MPO-antistoff viste mer pålitelig farging og kan brukes samtidig på humane og museprøver, noe som forenkler bruken i laboratoriet. Derfor anbefaler vi å bruke denne antistoffkombinasjonen, H3cit (R8) og mus / human MPO, for fremtidig forskning og implementert den i vår protokoll.

Det er imidlertid en begrensning for flere fargeforsøk med dette antistoffvalget. Denne protokollen ble modifisert for å bruke primære antistoffer fra forskjellige verter. Ellers kan ett sekundært antistoff binde seg til begge primære antistoffer. H3cit-antistoffet kommer fra samme vert som NE-antistoffet, så vi kunne ikke farge NE og H3cit sammen. Selv om ingen trippelfarging (NE, H3cit, MPO) ble gjort i denne studien, kan denne protokollen tjene som grunnlag for trippelfargingseksperimenter i fremtiden. Et mulig alternativ for trippelfarging eller NE og H3cit dobbeltfarging kan være å bytte ut et av disse antistoffene med et pålitelig antistoff fra en annen vert. I dette tilfellet kan en mulig kombinasjonspartner være NE-antistoffet (Santa Cruz; sc-55549) fra sauer brukt av Knackstedt et al.24. Et annet alternativ av Duler et al. ble publisert i 2021, hvor de brukte en påfølgende dobbeltfargemetode og kombinerte NE og H3cit fra en kaninvert26. En ytterligere lovende anvendelse av en flerfargemetode er for diskriminering mellom intra- og ekstravaskulær NET-dannelse. I stedet for trippelfarging for NET-markører, kan dobbel NET-farging kombineres med ytterligere vaskulær farging. Videre har et økende antall studier undersøkt intra- og ekstravaskulær distribusjon av NET for å få mer kunnskap om patomekanismene til spesifikke sykdommer, som Alzheimers sykdom. Smyth et al.31 beskrev en lovende og grundig protokoll som ligner vår for å skille mellom de to mulige lokaliseringene. De modifiserte sin eksisterende NET-fargeprotokoll ved å legge til et biotinylert lektin for å merke endotelceller og brukte en fluoroforkonjugert streptatidin for immunfluorescensfarging av lektin. Ved å undersøke samlokalisering av lektin- og NET-markører i samme bilde, kunne de identifisere intravaskulære NET31. I denne sammenheng er det behov for ytterligere studier for å utvide anvendelsen av protokollen vår.

Etter å ha funnet den mest passende antistoffkombinasjonen, er det neste kritiske trinnet å introdusere et autofluorescensreduserende middel. Eksogene faktorer som prøvefiksering ved bruk av formaldehydfikseringsmidler og endogene faktorer som erytrocytter kan resultere i høy autofluorescens, noe som gjør det vanskelig å bestemme samlokalisering32. Dette problemet oppstår hovedsakelig i det blå (eksitasjonsområde: 430-480 nm) og grønt fluorescensspektra (eksitasjonsområde: 500-550 nm) og kan resultere i inkonklusive fargeresultater når et fluorescensantistoff med samme eksitasjonsområde brukes3. Litteraturen rapporterer Sudan Black å være et effektivt middel for å redusere iboende vevsautofluorescens33. Sudan Black gjør det mulig å oppnå klarere fargeresultater ved hjelp av de blå eller grønne fluorescenskanalene. Dette eksitasjonsområdet vil være nødvendig for fremtidige flere fargeforsøk fordi de blå og grønne kanalene er nødvendige når du bruker et fjerde fluorescerende fargestoff. Vår studie viser at den optimale inkubasjonstiden avhenger av hvilken type vev og antistoff som brukes i fargeprosessen. Likevel, i dette arbeidet, ga 5 min autofluorescensreduserende middel generelt gode resultater på alle vevstyper og hadde fordelen av å farge prøven svart, noe som gjorde det lettere å se på lysbildene. Dette forhindret manglende deler av vevet i fargeprosessen, spesielt med små prøver.

En annen viktig faktor for suksessen til denne protokollen er en konstant høy temperatur for antigenhentingstrinnet. Vår forskning viste at 10 av de 15 tidligere studiene brukte temperaturer over 96 °C for antigenuthenting 13,15,16,17,19,21,22,25,26,27. Dette stemte overens med våre resultater, der ruging av prøvene i et vannbad eller mikrobølgeovn på 96 °C ga gode resultater uten signifikante forskjeller. Likevel anbefaler vi å bruke et vannbad for jevn varmefordeling. Ved bruk av mikrobølgeovnen fant vi en temperaturgradient i bufferen på opptil 5 °C mellom toppen og bunnen av fargeglasset. I tillegg er vannbadet enklere å bruke og har lavere risiko for at bufferen koker over. For permeabilisering fant vi at Triton X-100 hadde mindre effekt på fargingen. Så det er mulig å hoppe over dette trinnet i protokollen uten å påvirke utfallet negativt. Generelt ga menneskelige prøver bedre resultater enn museprøver. En grunn til dette kan være at mennesker har en høyere prosentandel nøytrofiler enn mus34,35. I tillegg viste muselungeprøver ingen synlig makroskopisk betennelse og færre nøytrofiler, mens musetarmprøver var makroskopisk betente og viste gode fargeresultater. Dermed kan de lavere skårene i vår studie skyldes den lave betennelsen og ikke skyldes at protokollen ikke fungerer optimalt.

Ved feilsøking kan mindre feil i protokollen eller manglende håndtering av prøvene nøye ha store effekter på fargeresultatene. Et stort problem som vi identifiserte var prøvedehydrering. Her fant vi ut at håndtering av mer enn 10-15 lysbilder samtidig var kritisk fordi hvert trinn er tidkrevende og kan resultere i dehydrering av prøvene. Dehydrerte prøver er ikke lenger brukbare på grunn av høy bakgrunnsfarging og ingen påviselig spesifikt fluorescenssignal (se figur 4A). I tillegg bør prøvene være fullstendig deparaffinisert før du starter fargeprotokollen. Parafinrester ga et sterkt bakgrunnssignal, og skjærelinjene kunne sees i den fargede parafinen (se figur 4B). Videre, etter mer enn 20 fryse-tine-sykluser, kunne det ikke påvises noe signal for det sekundære antistoffet mot MPO (se figur 4C). Et annet viktig skritt med stor innvirkning på bildekvaliteten er håndteringen av det endelige monteringstrinnet. I dette arbeidet resulterte luftbobler under dekselet i spredning av det fluorescerende signalet og dermed et uskarpt bilde (se figur 4D).

Figure 4
Figur 4: Feilsøkingstips . (A) Dette panelet viser konsekvensen av en uttørket prøve. Den solide røde bakgrunnsfargingen hindrer enhver evaluering av prøven. (B) Her viser den røde pilen parafinrester, preget av bølgeblikk, etter utilstrekkelig deparaffinisering. Disse restene resulterer i et høyt bakgrunnssignal og bilder av lavere kvalitet. (C) Utilstrekkelig antistofflagring eller mer enn 20 frysetinesykluser resulterer i aggregering av det sekundære antistoffet (grønne piler) og ingen binding til MPO. (D) Montering som ikke gjøres forsiktig kan resultere i luftbobler og dermed spredning av det fluorescerende lyset (blå pil). Dette kan påvirke bildekvaliteten betydelig, spesielt når spredningen gjør målet uskarpt. For isotypekontrollen, se tilleggsfigur Isokontroll 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Selv om NET blir stadig mer populært i vitenskapelig forskning, er det fortsatt ikke nok studier som fokuserer på metodene for NET-deteksjon 3,13,17,26. Så vidt vi vet, presenterer vi den første studien som sammenligner protokoller fra ulike studier for immunfluorescensavbildning av NET i FFPE-vev. De tidligere publiserte tilpassede protokollene var forskjellige i antistoff- eller antigenhentingsmetoder og ble ofte designet for bare en vevstype, noe som gjorde sammenligning av NET-bilderesultatene vanskeligere. Derfor, i denne studien, identifiserte vi kritiske trinn og etablerte en protokoll som passer for forskjellige mus og menneskelige vev. Vi oppnådde dette ved å bruke et nytt primært antistoff for H3cit-farging og redusere bakgrunnsfargingen med et autofluorescensreduserende middel. Videre viste vi at en konstant høy temperatur er avgjørende, og forsiktig håndtering av prøver er grunnleggende for vellykket NET-farging. Derfor gir denne studien de viktigste trinnene for å utvikle en generelt anvendelig protokoll for farging av NET.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble grunnlagt av det tyske forskningsselskapet (BO5534). Vi takker Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dr. Annika Heuer og PD Dr. Ingo Königs for å gi oss prøver. I tillegg takker forfatterne teamet fra UKE Microscopy Imaging Facility (Core facility, UKE Medical School) for støtte med immunfluorescensmikroskopien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
         Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg abcam Ab 68672  1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg abcam Ab 5103 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg abcam Ab 25989 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg abcam Ab 90810 1:50
Axiovision Microscopy Software  Zeiss 4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml GeneTex  GTX30972
Coverslips Marienfeld 0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) Dako S2369
DAPI 25 mg Roth 6335.1 1:25000
DCS antibody dilution 500 mL DCS diagnostics DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3 JacksonImmunoResearch 705-165-147 1:200
Donkey anti rabbit AF647 JacksonImmunoResearch 711-605-152 1:200
Donkey anti rabbit Cy3 JacksonImmunoResearch 711-165-152 1:200
Fluoromount-G Mounting Medium Invitrogen 00-4958-02
Glass slide rack Roth H552.1
Human/Mouse MPO Antibody R&D Systems AF 3667  1:20
Hydrophobic Pen KISKER MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg abcam Ab 37415 1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml Maxvision MB-L
Microscopy camera Zeiss AxioCamHR3
Microwave Bosch HMT84M421
Mouse IgG1 negative control Dako X0931 Aglient 1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control R&D Systems AB-108-C  1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x) Sigma-Aldrich P-3813
PMP staining jar Roth 2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg abcam Ab 219406 1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg abcam Ab 172730 1:300
ROTI Histol Roth  6640
SuperFrost Plus slides R. Langenbrinck 03-0060
TBS Tris buffered saline (x10) Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Water bath Memmert 830476
Water bath rice cooker reishunger RCP-30
Wet chamber Weckert Labortechnik 600016
Zeiss Widefield microscope Zeiss Axiovert 200M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
  3. Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).
  4. Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
  5. Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
  6. Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
  7. Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
  8. Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
  9. Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
  10. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
  11. Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
  12. Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
  13. Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).
  14. de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
  15. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  16. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  17. Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
  18. Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
  19. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  20. Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
  21. Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).
  22. Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
  23. Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).
  24. Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
  25. Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
  26. Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).
  27. Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
  28. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  29. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
  30. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  31. Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).
  32. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
  33. Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).
  34. Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).
  35. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).

Tags

Bildediagnostikk av immunfluorescens nøytrofile ekstracellulære feller NET bakteriell infeksjon traumatisk vevsskade autoimmune sykdommer steril inflammasjon dobbeltstrengede DNA-filamenter histoner antimikrobielle proteiner patogener homeostatisk regulering blodplateadhesjon koagulasjon sepsis autoimmune sykdommer terapeutisk inngrep elektronmikroskopi fargemetoder antistoffer autofluorescensreduserende midler antigeninnhentingsmetoder permeabilisering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 09/29/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:

Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

Immunfluorescensavbildning av nøytrofile ekstracellulære feller i vev fra mennesker og mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schoenfeld, L., Appl, B.,… More

Schoenfeld, L., Appl, B., Pagerols-Raluy, L., Heuer, A., Reinshagen, K., Boettcher, M. Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (198), e65272, doi:10.3791/65272 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter