Immunofluorescensbilleddannelse af neutrofile ekstracellulære fælder i væv fra mennesker og mus

Summary

Neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er) er forbundet med forskellige sygdomme, og immunofluorescens bruges ofte til deres visualisering. Der er dog forskellige farvningsprotokoller, og i mange tilfælde undersøges kun en type væv. Her etablerer vi en generelt anvendelig protokol til farvning af NETs i muse- og humant væv.

Abstract

Neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er) frigives af neutrofiler som et svar på bakteriel infektion eller traumatisk vævsskade, men spiller også en rolle i autoimmune sygdomme og steril inflammation. De er weblignende strukturer sammensat af dobbeltstrengede DNA-filamenter, histoner og antimikrobielle proteiner. Når de er frigivet, kan NETs fange og dræbe ekstracellulære patogener i blod og væv. Desuden deltager NETs i homeostatisk regulering ved at stimulere blodpladeadhæsion og koagulation. Imidlertid har den dysregulerede produktion af NET’er også været forbundet med forskellige sygdomme, herunder sepsis eller autoimmune lidelser, hvilket gør dem til et lovende mål for terapeutisk intervention. Bortset fra elektronmikroskopi er visualisering af NET’er ved hjælp af immunfluorescensbilleddannelse i øjeblikket en af de eneste kendte metoder til at demonstrere NET-interaktioner i væv. Derfor er der anvendt forskellige farvningsmetoder til visualisering af NETs. I litteraturen beskrives forskellige farvningsprotokoller, og vi identificerede fire nøglekomponenter, der viser høj variabilitet mellem protokoller: (1) de anvendte typer antistoffer, (2) brugen af autofluorescensreducerende midler, (3) antigenhentningsmetoder og (4) permeabilisering. Derfor blev in vitro immunfluorescensfarvningsprotokoller systemisk tilpasset og forbedret i dette arbejde for at gøre dem anvendelige til forskellige arter (mus, mennesker) og væv (hud, tarm, lunge, lever, hjerte, rygmarvsskive). Efter fiksering og paraffinindlejring blev 3 μm tykke sektioner monteret på dias. Disse prøver blev farvet med primære antistoffer mod myeloperoxidase (MPO), citrullineret histon H3 (H3cit) og neutrofilelastase (NE) ifølge en modificeret farvningsprotokol. Lysbillederne blev farvet med sekundære antistoffer og undersøgt ved hjælp af et widefield fluorescensmikroskop. Resultaterne blev analyseret i henhold til et evalueringsark, og forskelle blev registreret semikvantitativt.

Her præsenterer vi en optimeret NET-farvningsprotokol, der passer til forskellige væv. Vi brugte et nyt primært antistof til at plette for H3cit og reducerede uspecifik farvning med et autofluorescensreducerende middel. Desuden demonstrerede vi, at NET-farvning kræver en konstant høj temperatur og omhyggelig håndtering af prøver.

Introduction

Neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er) blev først visualiseret af Brinkmann et al. som en vej til cellulær død forskellig fra apoptose og nekrose i 2004¹. I denne vej frigiver neutrofiler deres dekondenserede kromatin i det ekstracellulære rum for at danne store weblignende strukturer dækket af antimikrobielle proteiner, der tidligere blev opbevaret i granulatet eller cytosolen. Disse antimikrobielle proteiner omfatter neutrofil elastase (NE), myeloperoxidase (MPO) og citrullineret histon H3 (H3cit), som almindeligvis anvendes til indirekte immunofluorescensdetektion af NETs². Denne metode identificerer ikke kun den kvantitative tilstedeværelse af disse proteiner; Det har faktisk den fordel, at det specifikt detekterer NET-lignende strukturer. I NETs lokaliserer de nævnte proteiner sammen med ekstracellulært DNA, som kan detekteres ved en overlapning af fluorescenssignalerne for hvert farvet protein og det ekstracellulære DNA. I modsætning til de overlappende signaler på grund af ekstracellulær DNA- og protein-co-lokalisering i NET’er viser intakte neutrofiler ingen co-lokalisering. Her opbevares NET-komponenterne normalt separat i granulerne, kernerne og cytosol³.

Siden deres første opdagelse har det vist sig, at NETs spiller en central rolle i mange sygdomme, især dem, der involverer inflammation. NETs viser antimikrobielle funktioner under infektion gennem fangst og drab af ekstracellulære patogener i blod og væv ^4,5. Imidlertid har NETs også været forbundet med autoimmune sygdomme og hyperinflammatoriske reaktioner, som systemisk lupus erythematosus, reumatisk arthritis og allergisk astma ^6,7,8. NETs fremmer vaso-okklusion og betændelse i aterosklerose, blodpladeadhæsion, og spekuleres i at spille en rolle i metastatisk cancer 9,10,11. Ikke desto mindre menes de at have antiinflammatoriske egenskaber ved at reducere proinflammatoriske cytokinniveauer¹². Mens NETs vinder mere interesse for et bredere forskningsfelt, er en robust NET-detektionsmetode grundlæggende for fremtidig forskning.

Selvom visualiseringen af NET’er i forskellige væv ved hjælp af immunfluorescensbilleddannelse er kompleks og kræver tilpasning, bortset fra elektronmikroskopi, er det i øjeblikket en af de mest kendte metoder til visualisering af interaktionerne mellem NET’er og celler og anvendes overvejende i formalinfikserede paraffinindlejrede væv (FFPE)^13,14. Det er dog vanskeligt at sammenligne NET-billeddannelse, da forskellige laboratorier bruger deres egne tilpassede protokoller. Disse protokoller adskiller sig i deres brug af antistoffer, antigenhentning eller permeabiliseringsmetode og er ofte optimeret til en bestemt type væv 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27.

Efter at Brinkmann et al. offentliggjorde den første metodiske undersøgelse ved hjælp af immunofluorescerende visualisering af NET’er i FFPE-væv, ønskede vi at optimere denne protokol til en bredere vifte af væv og arter¹⁵. For at etablere en bredt anvendelig immunfluorescensprotokol testede vi desuden forskellige modificerede protokoller fra undersøgelser, der anvendte immunfluorescensmetoder i FFPE-væv til at detektere NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Desuden prøvede vi et nyt H3cit-antistof til mere specifik ekstracellulær farvning²⁸. Vi antager, at ved systematisk at tilpasse nuværende farvningsprotokoller til forskellige arter og væv, kan in vitro-billeddannelse forbedres, hvilket resulterer i en bedre repræsentation af interaktionen mellem neutrofiler og NET’er både lokalt og systemisk.

Protocol

Denne undersøgelse omfattede musevæv fra forsøg, der var godkendt af Hamburg State Administration for Animal Research, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, Tyskland (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). De anvendte væv var muselunge og tyktarm fra en septisk model og brændt hud. Vi brugte 8 uger gamle han- og hunmus. Det europæiske direktiv 2010/63/EU om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål, blev fulgt for alle forsøgene. De anonymiserede humane prøver omfattede væv fra …

Representative Results

Før vi startede vores protokoloptimering, identificerede vi vigtige trin for vellykket farvning ved at søge PubMed efter undersøgelser, der brugte FFPE-væv til immunfarvning af NET’er og sammenlignede deres protokoller. De mest lovende protokolforskelle blev identificeret som de vigtigste trin for protokoloptimeringen, mens trin, der for det meste svarede til hinanden, ikke blev ændret (tabel 1). Tabel 1: PubMed-forskning for FFPE-immunfarvning af NET’er. </strong…

Discussion

I dette arbejde havde vi til formål at tilpasse og optimere de eksisterende protokoller til billeddannelse af NET’er til flere vævstyper, begyndende med den faktiske farvningsproces. Det første kritiske trin for denne metode er udvælgelsen af de mest egnede antistoffer. For NE prøvede vi et NE-antistof fra en musevært på humant væv, som ikke viste nogen pålidelig farvning sammenlignet med NE fra en kaninvært. Desuden foreslog Thålin et al. H3cit (R8) som et mere specifikt antistof til ekstracellulær farvning….

Materials

			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] – Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M