Summary
يحدد هذا البروتوكول القياس الكمي للخصائص الميكانيكية لخطوط الخلايا السرطانية وغير السرطانية في المختبر. يمكن أن تعمل الاختلافات المحفوظة في ميكانيكا الخلايا السرطانية والطبيعية كعلامة حيوية قد يكون لها آثار في التشخيص والتشخيص.
Abstract
الميكانيكا الحيوية غير المنتظمة هي السمة المميزة لبيولوجيا السرطان الخاضعة لدراسة مستفيضة. الخواص الميكانيكية للخلية مماثلة لتلك الخاصة بالمادة. مقاومة الخلية للإجهاد والإجهاد ، ووقت استرخاءها ، ومرونتها كلها خصائص يمكن اشتقاقها ومقارنتها بأنواع أخرى من الخلايا. يسمح تحديد الخواص الميكانيكية للخلايا السرطانية (الخبيثة) مقابل الخلايا الطبيعية (غير الخبيثة) للباحثين بالكشف عن الأساسيات الفيزيائية الحيوية لهذا المرض. في حين أنه من المعروف أن الخواص الميكانيكية للخلايا السرطانية تختلف باستمرار عن الخواص الميكانيكية للخلايا الطبيعية ، إلا أنه لا يوجد إجراء تجريبي قياسي لاستنتاج هذه الخصائص من الخلايا في الثقافة.
تحدد هذه الورقة إجراء لتحديد الخواص الميكانيكية للخلايا المفردة في المختبر باستخدام مقايسة قص السوائل. يتضمن المبدأ الكامن وراء هذا الفحص تطبيق إجهاد قص السوائل على خلية واحدة ومراقبة التشوه الخلوي الناتج بصريا بمرور الوقت. يتم بعد ذلك توصيف الخواص الميكانيكية للخلية باستخدام تحليل ارتباط الصورة الرقمية (DIC) وتركيب نموذج لزج مرن مناسب للبيانات التجريبية الناتجة عن تحليل DIC. بشكل عام ، يهدف البروتوكول الموضح هنا إلى توفير طريقة أكثر فعالية واستهدافا لتشخيص السرطانات التي يصعب علاجها.
Introduction
تتيح دراسة الاختلافات الفيزيائية الحيوية بين الخلايا السرطانية وغير السرطانية فرصا تشخيصية وعلاجية جديدة1. إن فهم كيفية مساهمة الاختلافات في الميكانيكا الحيوية / علم الأحياء الميكانيكي في تطور الورم ومقاومة العلاج سيكشف عن طرق جديدة للعلاج الموجه والتشخيص المبكر2.
في حين أنه من المعروف أن الخواص الميكانيكية للخلايا السرطانية تختلف عن الخلايا الطبيعية (على سبيل المثال ، مرونة اللزوجة في غشاء البلازما والغلاف النووي)3،4،5 ، إلا أن الطرق القوية والقابلة للتكرار لقياس هذه الخصائص في الخلايا الحية غير موجودة6. تستخدم طريقة مقايسة القص لتحديد الخواص الميكانيكية للخلايا عن طريق إخضاع الخلايا المفردة لإجهاد القص السائل وتحليل استجاباتها الفردية ومقاومتها للإجهاد المطبق3،4،5،7،8،9. على الرغم من استخدام العديد من الطرق والتقنيات لتوصيف الخواص الميكانيكية للخلايا المفردة ، إلا أنها تميل إلى التأثير على خصائص مادة الخلية عن طريق i) تثقيب / إتلاف غشاء الخلية بسبب عمق المسافة البادئة ، أو هندسة الطرف المعقدة ، أو تصلب الركيزة المرتبط بمجهر القوة الذرية (AFM) 10،11 ، ii) إحداث تلف ضوئي خلوي أثناء الاصطياد البصري12 ، 13 ، أو iii) إحداث حالات إجهاد معقدة مرتبطة بشفط الماصةالدقيقة 14,15. ترتبط هذه التأثيرات الخارجية بشكوك كبيرة في دقة قياسات مرونة لزوجة الخلية6،16،17.
لمعالجة هذه القيود ، توفر طريقة فحص القص الموصوفة هنا نهجا بسيطا ويمكن التحكم فيه بدرجة كبيرة لمحاكاة التدفق الفسيولوجي في الجسم دون التأثير على خصائص المواد الخلوية في العملية. تمثل إجهادات قص السوائل في هذا الفحص ضغوطا ميكانيكية تعاني منها الخلايا في الجسم إما عن طريق السوائل داخل الخلالي للورم أو في الدم أثناء الدورة الدموية18،19،20. علاوة على ذلك ، تعزز ضغوط السوائل هذه السلوكيات الخبيثة المختلفة في الخلايا السرطانية ، بما في ذلك التقدم والهجرة وورم خبيث وموت الخلايا19،21،22،23 والتي تختلف بين الخلايا السرطانية وغير السرطانية. علاوة على ذلك ، فإن السمات الميكانيكية المتغيرة للخلايا السرطانية (أي أنها غالبا ما تكون "أكثر ليونة" من الخلايا الطبيعية الموجودة داخل نفس العضو) تسمح لها بالاستمرار في البيئات الدقيقة المعادية للورم ، وغزو الأنسجة الطبيعية المحيطة ، والانتقال إلى مواقع بعيدة24،25،26. من خلال خلق بيئة بيولوجية زائفة حيث تعاني الخلايا من مستويات فسيولوجية من إجهاد قص السوائل ، يتم تحقيق عملية ذات صلة من الناحية الفسيولوجية وليست مدمرة للخلية. تسمح لنا الاستجابات الخلوية لضغوط قص السوائل المطبقة هذه بتوصيف الخواص الميكانيكية للخلية.
يقدم هذا البحث بروتوكول مقايسة القص للدراسة المكثفة للخصائص الميكانيكية وسلوك الخلايا السرطانية وغير السرطانية تحت إجهاد القص المطبق. تستجيب الخلايا للقوى الخارجية بطريقة مرنة ولزجة وبالتالي يمكن أن تكون مثالية كمادة لزجةمرنة 3. يتم تصنيف هذه التقنية إلى: (i) زراعة الخلايا للخلايا المفردة المشتتة ، (ii) التطبيق المتحكم فيه لإجهاد قص السوائل ، (iii) التصوير في الموقع ومراقبة السلوك الخلوي (بما في ذلك مقاومة الإجهاد والتشوه) ، (iv) تحليل سلالة الخلايا لتحديد مدى التشوه ، و (v) توصيف الخصائص اللزجة المرنة للخلايا المفردة. من خلال استجواب هذه الخصائص والسلوكيات الميكانيكية ، يمكن تقطير البيولوجيا الميكانيكية الخلوية المعقدة إلى بيانات قابلة للقياس الكمي. يسمح البروتوكول الذي يحدد هذه الطريقة بفهرسة ومقارنة أنواع الخلايا الخبيثة وغير الخبيثة المختلفة. إن القياس الكمي لهذه الاختلافات لديه القدرة على إنشاء مؤشرات حيوية تشخيصية وعلاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التحضير لمقايسة القص أحادية الخلية
- زراعة الخلايا
- بذر ما يقرب من 50000 خلية مفردة معلقة في طبق بتري 35 مم × 10 مم يحتوي على 2 مل من وسائط الاستزراع.
ملاحظة: دوامة الخلايا العالقة قبل البذر لتفكيك مجاميع الخلايا. - احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية والسماح ما بين 10 إلى 48 ساعة لربط الخلية وتكوين البروتين الهيكلي الخلوي الكامل.
ملاحظة: ضع في اعتبارك مدة التعلق الخلوي ، بالإضافة إلى معدلات الانتشار والنمو ، لضمان نمو الخلايا وتعلقها بشكل كاف مع تجنب تراكم الخلايا. تختلف هذه المعلمات باختلاف نوع الخلية.
- بذر ما يقرب من 50000 خلية مفردة معلقة في طبق بتري 35 مم × 10 مم يحتوي على 2 مل من وسائط الاستزراع.
2. تجربة مقايسة القص
- تحضير وسائط التدفق اللزج لمقايسة القص
- لضمان وسائط تدفق لزجة قليلا (0.015-0.02 باسكال ثانية) ، قم بقياس وإضافة 0.05٪ بالوزن من ميثيل سلولوز غير سام وغير مسبب للحساسية (4 باسكال ثانية) إلى وسائط الاستزراع.
- لضمان مزيج متجانس ، سخن وسائط الاستزراع الأساسية لمدة ~ 10-20 دقيقة عند درجة حرارة ~ 60-70 °C باستخدام محرك مغناطيسي / لوح تسخين. أثناء تحريك الوسائط باستمرار ، أضف الميثيل سلولوز برفق بحيث يتشتت بسرعة ، لتجنب تخثر جزيئات ميثيل سلولوز. اسمح لهذه العملية بالاستمرار لمدة ~ 15-24 ساعة لضمان حل واضح للوسائط + السليلوز.
ملاحظة: تجنب التسخين المفرط للمحلول. - لقياس لزوجة وسائط التدفق ، اختبر ~ 0.5-1 مل من وسائط التدفق التمثيلية باستخدام مقياس ريومتر. من القراءة ، حدد لزوجة السائل واستخدم هذه القيمة لتمثيل لزوجة وسط مائع القص (μ) لحساب إجهاد القص باستخدام المعادلة (2).
- إعداد جهاز القص
- قم بإعداد نظام فحص القص للمحاقن المزدوجة (60 مل أو 100 مل) المتصل بمضخة حقنة قابلة للبرمجة لتسريب وسحب وسائط الثقافة اللزجة (الشكل 1).
- قم بتوصيل كلا المحقنتين بغرفة التدفق عبر موصلات أنابيب وأنابيب مقاس 1/16 بوصة.
- اربط حشية مطاطية لتوفير تدفق موحد متحكم فيه على خلايا مفردة على طول مسار التدفق (الشكل 1). تأتي الحشية المطاطية بأحجام مختلفة اعتمادا على ملف تعريف التدفق المراد تحقيقه (رقائقي أو مضطرب) ومنطقة المراقبة المرغوبة (على سبيل المثال ، طول 22.5 مم ، عرض 2.5 مم ، وارتفاع 0.254 مم) (الشكل 1).
- قم ببرمجة المضخة لضخ وسحب حجم معين من السوائل (على سبيل المثال ، 60 مل) بمعدل معين (على سبيل المثال ، 1 مل / دقيقة) وحدد المحاقن المقابلة (على سبيل المثال ، 60 مل).
ملاحظة: ضع في اعتبارك الحد الأقصى للإعدادات المسبقة لحجم التسريب والسحب لتجنب التشويش أو العطل. استخدم المعادلة (2) لحساب معدل قص المضخة المطلوب (بافتراض أن الإجهاد واللزوجة المطلوبين معروفان).
- إعداد ما قبل القص
- املأ المحقنة بوسائط التدفق اللزج المعدة.
- قم بتوصيل المحقنة المملوءة ب 60 أو 100 مل (أو حسب الحاجة) من وسائط التدفق اللزجة ، ومحقنة فارغة سعة 60 مل في مواقعها على مضخة المحقنة القابلة للبرمجة. عبر موصلات الأنابيب والأنابيب ، قم بتوصيل كلا المحاقن بغرفة التدفق.
- لضمان سهولة التعرف على الخلايا المفردة والاتصال المثبت بين غرفة التدفق وطبق بتري ، قم بتوصيل الحشية المطاطية بغرفة التدفق.
- نضح وسائط زراعة الخلايا من طبق بتري الذي يحتوي على الخلايا محل الاهتمام.
- اغسل الخلايا الميتة والخلايا المرتبطة بشكل فضفاض باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- نضح برنامج تلفزيوني.
- أدخل وثبت غرفة التدفق والحشية المطاطية (~ 34 مم × 9 مم) على طبق بتري (35 مم × 10 مم) الذي يحتوي على الخلايا المرفقة.
- ضع غرفة تدفق الموائع الدقيقة المجهزة + الخلايا على طبق مثقف على مجهر مقلوب ، مع هدف مجهر مرتفع بما يكفي للحصول على صور عالية الجودة بقيم بكسل عالية (عادة بين 40x و 63x تكبير) وشاشة عرض.
- حدد خيار الصورة الحية (الفاصل الزمني في بعض البرامج) من برنامج المجهر على شاشة العرض. تأكد من أن برنامج المجهر على جهاز الكمبيوتر لديه وظيفة t (الفاصل الزمني) أو يمكنه التقاط تسجيلات الفيديو.
- ركز هدف المجهر ، مما يضمن التباين الكافي وحواف الخلايا المميزة. هذا ضروري لتحليل الصورة بعد القص. حرك مرحلة المجهر للتأكد من أن الخلايا مرئية بوضوح على شاشة العرض وأنها صور حية.
- حدد خلية أو عدة خلايا مميزة داخل مسار التصوير / التدفق لغرفة التدفق المجهزة + طبق بتري (المنطقة / المسار الذي تم إنشاؤه بواسطة تركيب الحشية في غرفة التدفق).
- القص والتصوير
- للحفاظ على تدفق موحد مستمر ، حدد معدلات ضخ وسحب مماثلة وتأكد من التدفق الصفحي للسائل ، عادة بين 1 مل / دقيقة و 5 مل / دقيقة. بالنسبة لأنظمة التدفق الصفحي المنخفض ، تأكد من أن عدد Re < 100 في Re من رينولد.
- انقر فوق تشغيل على مضخة القص لحقن وسحب سائل القص (الوسائط اللزجة المحضرة) بمعدل مستمر. تأكد من عدم وجود فقاعات أثناء ضخ السوائل ، لأن هذا قد يؤدي إلى ضغط خارجي غير محسوب على الخلايا.
- ابدأ في تسجيل مقطع فيديو بالنقر فوق تسجيل على برنامج المجهر قبل أن يتلامس سائل القص المشبع مع الخلية (الخلايا) ذات الأهمية تحت المجهر.
- استمر في التسجيل لمدة 7 دقائق ، أو طوال المدة المطلوبة للتعرض للإجهاد ، أو حتى تنفصل الخلية (الخلايا) ذات الأهمية عن قاع الطبق. انقر فوق إيقاف التسجيل على برنامج المجهر عند اكتمال التشغيل حسب الرغبة.
- احفظ التسجيل واستخرجه كملفات .tiff. على نحو مفضل ، استخراج الصور بمعدل 1 إطار في الثانية للتحليل السهل.
3. معالجة البيانات
- إجراء ارتباط الصورة الرقمية (تحليل الصورة)
- إذا تم استخراج التسجيل من المجهر كملف فيديو ، فقم بتحويله إلى إطارات صور (يفضل .tiff تنسيق الملف).
- قم باستيراد الصور المشتقة من تسجيل مقايسة القص إلى برنامج Davis 10.1.2 (برنامج DIC) لتتبع حركة الهياكل المنقوشة بشكل طبيعي للخلية عن طريق تحديد موقع كل كتلة بكسل (مجموعة فرعية) من الصورة المرجعية في الصور الجديدة المعنية (الصور المشوهة) (الشكل 2).
- للحصول على ارتباط محسن ، استخدم حجم مجموعة فرعية يبلغ 31 × 31 بكسل ، وحجم خطوة (مسافة تشوه كل مجموعة فرعية) يبلغ 20 بكسل ، ومجموع خيار المسار التفاضلي ، الذي يتتبع تشوه صورة جديدة فيما يتعلق بالصورة الأخيرة. نتيجة هذا الارتباط هي مخطط وقت الإجهاد (الشكل 3) الذي يمكن تصديره كملف .csv لمزيد من التحليل في MATLAB.
- حدد منطقة الاهتمام لخلية مفردة مختارة. حدد النقاط العشوائية داخل الخلية المعينة لتعقب التشوه. بالنسبة لشكل غير منتظم، مثل الخلية، استخدم قناع مضلع لرسم خريطة هندسية للخلية.
- بعد التعيين ، اختر نقاطا محددة على الخلية (النواة أو السيتوبلازم) ليتم تحليلها بالنقر فوق إضافة مقياس إجهاد ورسم مقاييس إجهاد فردية في نقاط داخل الحدود الخلوية المحددة.
- انقر فوق تشغيل لبدء معالجة الإجهاد والحصول على بيانات الإجهاد مقابل الوقت.
- انقر نقرا مزدوجا (أو انقر بزر الماوس الأيمن) على مخطط وقت الإجهاد الذي تم إنشاؤه وحدد تصدير البيانات كجدول بيانات.
4. توصيف الخواص الميكانيكية
- توصيف خاصية اللزوجة المرنة
- احفظ ملف .csv الذي يحتوي على بيانات وقت الإجهاد من برنامج DIC في مجلد منفصل لسهولة القراءة بواسطة MATLAB.
- قم بتشغيل MATLAB وانقر فوق علامة تبويب المحرر لفتح صفحة محرر لكتابة رمز يقرأ جدول البيانات ، خلية تلو الأخرى.
- قم بتغيير مسار MATLAB (مسار المجلد الذي يصل إلى ملف الاهتمام) للوصول إلى المجلد الذي يحتوي على البيانات المراد تحليلها ، على سبيل المثال ، المستخدمون / اسم المستخدم / سطح المكتب / البيانات.
- في صفحة محرر MATLAB ، قم بالوصول إلى بيانات جدول البيانات باستخدام الرمز المخصص. على سبيل المثال: a1 = xlsread ('data'، 'run1'، 'A4: A183')، حيث يمثل a1 المعرف، xlsread هي دالة MATLAB التي تقرأ ملف .csv (في هذه الحالة، كجدول بيانات)، والبيانات هي اسم الملف، وrun1 هو اسم الورقة، وA4: A183 هو نطاق البيانات ذات الأهمية في الخلية A لبيانات جدول البيانات المراد تحليلها. للحصول على ملاءمة كاملة ، قم بتحليل x و y (الوقت والإجهاد ، على التوالي). على سبيل المثال:
a1 = xlsread ('data','run1','A4:A183');
b1 = xlsread ('data','run1','B4:B183');
A1 = x (الوقت) ، و B1 = Y (سلالة). - في MATLAB ، انقر فوق التطبيقات | مجرب المنحنى | معادلة مخصصة. امسح المعادلة المخصصة التمثيلية وأدخل معادلة النموذج اللزج المرن [المعادلة (1)] ، حيث يمثل ε المتغير x ويمثل t المتغير y.
(1)
هنا ، يمثل ε الإجهاد ، σ يمثل إجهاد القص ، η1 يمثل اللزوجة ، E يمثل المرونة ، t يمثل الوقت ، و τ يمثل وقت الاسترخاء ، والذي يميز الحد الأقصى للوقت اللازم للخلية للعودة إلى شكلها الأصلي بعد التشوه الأولي. يتم التعبير عنها ك τ =
، حيث η2 هو مصطلح اللزوجة الثانوية ل dashpot الثاني (الشكل 4). - إعادة تعيين متغيرات جديدة للمعلمات اللزجة المرنة داخل واجهة المعادلة المخصصة. (ε ، η1 ، E ، σ ، t ، و τ = ) سيمثل (x و a و b و K و y و c) على التوالي. هنا ، x و y هما المتغيران المستقل والتابع ، على التوالي. يمكن تحديد إجهاد القص (σ) باستخدام المعادلة (2):
(2)
هنا ، يمثل μ لزوجة وسط مائع القص ، و Q هو معدل تدفق المضخة ، و w و h هما عرض وارتفاع قناة التدفق الموضحة في الشكل 1C ، على التوالي. - انقر فوق تحديد البيانات لتحديد الوقت (a1) والإجهاد (b1) لكل مجموعة من البيانات.
- تأكد من تحديد خيار مربع الاحتواء التلقائي . يؤدي هذا إلى تشغيل الملاءمة تلقائيا عند تحديد البيانات (x و y).
- حدد طرق التركيب لتشديد شروط الحدود. انقر فوق خيارات متقدمة ضمن فئة الطرق وحدد المربعات الصغرى غير الخطية. ضمن قوي، حدد إيقاف، وضمن خوارزمية، حدد منطقة الثقة. اترك كل معلمة أخرى كما هي.
- تمثل المتغيرات الجديدة بعد التركيب (a و b و c) الخصائص اللزجة المرنة واللزوجة والمرونة ووقت الاسترخاء (η1 ، E ، EQUAT) ، للخلية ، على التوالي (الشكل 5).
- ابحث عن قيمة مربع R عالية للملاءمة (R2 > 80٪) للتأكد من أن إخراج البيانات يمكن اعتباره مناسبا حقيقيا للنموذج اللزج المرن (الشكل 3)
(1)
، حيث η2 هو مصطلح اللزوجة الثانوية ل dashpot الثاني (الشكل 4).
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بروتوكول مقايسة القص المقترن بتحليل التشوه باستخدام DIC ونموذج المرونة اللزجة ناجح في تحديد الخواص الميكانيكية لخلية واحدة في المختبر. تم اختبار هذه الطريقة على خطوط خلايا الإنسان والفئران ، بما في ذلك خلايا الثدي البشرية الطبيعية (MCF-10A) 3،4،9 ، وخلايا سرطان الثدي الثلاثية السلبية الأقل نقيلي (MDA-MB-468) 3 ، وخلايا سرطان الثدي الثلاثية السلبية (MDA-MB-231) 3 ، وخلايا الساركوما العظمية البشرية7،8 ، ومؤخرا خلايا الورم الأرومي الدبقي (الشكل 3). تنجح DIC لإطارات الصور المستخرجة من تسجيلات مقايسة القص في إنتاج بيانات وقت الإجهاد المتوافقة مع استجابة إجهاد الزحف (الشكل 3) ، والتي تتناسب مع نموذج لزج مرن (الشكل 4). باستخدام MATLAB ، يمكن استخدام النموذج اللزج المرن لتناسب بيانات وقت الإجهاد للحصول على الخصائص اللزجة المرنة للخلايا المختلفة.
يصف الشكل 5 نطاق الخصائص التي تمت دراستها مسبقا باستخدام تقنية مقايسة القص. يمكن تمييز الخواص الميكانيكية الإضافية باستخدام هذه الطريقة ، اعتمادا على معلمة الاهتمام. أظهرت نتائج هذه الدراسات باستخدام تقنية مقايسة القص أن الخلايا السرطانية كانت بشكل عام أكثر توافقا ميكانيكيا وأقل لزوجة من الخلايا الطبيعية (الشكل 6) 3،4،7،8. يصف الشكل 6A-C الخواص الميكانيكية لخلايا الثدي الطبيعية (MCF-10A) وخلايا سرطان الثدي الثلاثية السلبية (MDA-MB-468 النقيلي الأقل و MDA-MB-231 النقيلي للغاية). في الشكل 6 أ ، ب ، يمكن ملاحظة انخفاض صلابة ولزوجة الخلايا مع زيادة تطور السرطان ، من حالة الخلية الطبيعية ، إلى حالة نقيلية قليلا ، وإلى حالة نقيلية للغاية. تم العثور على اختلافات ذات دلالة إحصائية بين خلايا MCF-10A العادية وخلايا MDA-MB-231 شديدة النقائل ، وبين خلايا MDA-MB-468 الأقل نقيلي وخلايا MDA-MB-231 شديدة الانبثاق. لم تكن هناك اختلافات ذات دلالة إحصائية بين خلايا MCF-10A العادية وخلايا MDA-MB-468 الأقل نقيلية. يوضح الشكل 6C وقت الاسترخاء لهذه الأنواع من الخلايا ، والتي لم تظهر أي اختلافات كبيرة. قد يختلف هذا مع أنواع أخرى من الخلايا.
الشكل 1: الإعداد التجريبي لمقايسة القص. تتضمن الطريقة استخدام (أ) مضخة حقنة قابلة للبرمجة لبث وسحب وسائط التدفق اللزجة داخل وخارج (ب) غرفة التدفق بمعدل قص ثابت. (ج) حشية مطاطية تحتوي على نافذة مستطيلة (الأبعاد: 20.5 مم × 2.5 مم × 0.254 مم) وشفط فراغي مناسب في طبق بتري 35 مم × 10 مم يحتوي على خلايا مستزرعة ذات أهمية لإنشاء مجال تدفق. (د) تتعرض الخلايا للتدفق داخل المجال المحدد وتشوه بفعل إجهاد القص المائع، الذي يشتق عن طريق (ه) معادلة إجهاد قص الجدار. (F) يتم تصوير خلية مهمة داخل مجال التدفق باستخدام مجهر عند تكبير 63x ، ويتم التقاط التشوه في الوقت الفعلي وتسجيله باستخدام برنامج المجهر على الشاشة. يتم استخدام إجهاد قص السوائل المستحث جنبا إلى جنب مع التشوه المصور لتحديد الخواص الميكانيكية للخلية المفردة. تم تعديل هذا الرقم من Hu et al.3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل الإجهاد باستخدام ارتباط الصورة الرقمية. تظهر الصور المستخرجة من تسجيل مقايسة القص أقصى إجهاد قص تعاني منه الخلايا الفردية طوال التجربة. يتتبع DIC التغييرات في البنية المنقوشة بشكل طبيعي للخلايا عن طريق تحديد وتتبع مجموعة فرعية من وحدات البكسل داخل كل إطار أو صورة. (أ) صورة الخلية قبل تحليل مدينة دبي للإنترنت. ب: إخفاء الخلايا، واختيار المنطقة محل الاهتمام، وبذر الخلايا للمساعدة في تتبع التشوه. ج: بداية التشوه. د: تراكم التشوه. ه: زيادة التشوه بمرور الوقت. (و) تطبيق مقاييس الإجهاد لتحديد الإجهاد أثناء التشوه. الاختصار: DIC = ارتباط الصورة الرقمية. تم تعديل هذا الرقم من Hu et al.3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: عينة تمثيلية من بيانات الإجهاد مقابل الوقت لخلايا الورم الأرومي الدبقي والنمذجة الرياضية للنموذج اللزج المرن . (أ) تظهر بيانات الإجهاد مقابل الوقت التي حصلت عليها مدينة دبي للإنترنت أنظمة زحف مختلفة (أولية وثانوية وثالثية) للخلية. (ب) يتم تصدير بيانات الإجهاد مقابل الوقت إلى MATLAB لتحديد الخواص الميكانيكية للخلية الفردية. الاختصار: DIC = ارتباط الصورة الرقمية. تم تعديل هذا الرقم من Hu et al.3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نموذج لزج مرن لتحديد الخواص اللزجة المرنة. نموذج ماكسويل المعمم ثلاثي المعلمات ، والذي يشتمل على نماذج كلفن (dashpot) و Voigt (dashpot + spring) متصلة في سلسلة ، لتوصيف السلوك اللزج المرن للخلايا. نتيجة النمذجة اللزجة المرنة باستخدام تقنية القص هي مرونة الخلية ولزوجتها ووقت الاسترخاء. تم تعديل هذا الرقم من Hu et al.3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تصوير بياني لأنواع خواص المواد للخلايا التي يمكن استخلاصها من تقنية مقايسة القص ، بما في ذلك الصلابة واللزوجة والزحف ووقت الاسترخاء. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: الخواص المادية للخلايا التي تم الحصول عليها من تقنية مقايسة القص. كان تصلب الخلايا مختلفا بشكل كبير بين النواة والسيتوبلازم لخلايا الثدي الطبيعية (MCF-10A) وخلايا الثدي شديدة الانبثاق (MDA-MB-231) ، وبين الخلايا الأقل نقيلي (MDA-MB-468) والخلايا النقيلية للغاية (MDA-MB-231) (A). ومع ذلك ، لم يكن هناك فرق كبير بين صلابة النواة والسيتوبلازم للخلايا الطبيعية (MCF-10A) والخلايا النقيلية الأقل (MDA-MB-468). كما تم العثور على اتجاهات مماثلة في اللزوجة النووية واللزوجة الخلوية (B). لم تظهر أوقات استرخاء هذه الخلايا اختلافات ميكانيكية كبيرة (C) ، على الرغم من أن أنواع الخلايا الأخرى قد تظهر. تم تعديل هذا الرقم من Hu et al.3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أنتجت طريقة فحص القص ، والتي تتضمن إنشاء بيئة ميكانيكية بيولوجية زائفة لمحاكاة تفاعل الخلايا مع البيئة الدقيقة الميكانيكية المحيطة واستجاباتها للضغوط الميكانيكية ، كتالوجا للخصائص الميكانيكية الخلوية ، التي تظهر أنماطها اللانمطية الفيزيائية المحفوظة بين خطوط الخلايا السرطانية3،4،5،7،8. تجمع هذه الطريقة بين فهم ميكانيكا الموائع الأساسية والفيزياء لتوصيف الخصائص الميكانيكية الفريدة للخلايا وتوفر مواد محتملة أو مؤشرات حيوية ميكانيكية للكشف عن العديد من السرطانات التي يصعب علاجها 3,4.
تقنية فحص القص لها قيود معينة. قد يكون ضمان زراعة خلية واحدة أمرا صعبا ، نظرا للنمو السريع وانتشار أنواع معينة من الخلايا ، مما يجعل من الصعب تصور وتحليل الخلايا المفردة. يمكن أن يكون تحمل الإجهاد والاستجابة الخلوية غير متجانسة من خلية إلى أخرى اعتمادا على خط الخلية ، وعلى هذا النحو يتطلب العديد من الخلايا واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، لتحديد متوسط الإجهاد الحرج المطلوب لتشويه الخلايا هيكليا مع الحفاظ على صلاحيتها لتحليل خصائصها المادية كخلايا حية.
يتضمن استكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذه التقنية تحديد أ) معدلات نمو وانتشار خطوط الخلايا ذات الأهمية و ب) الوقت اللازم للخلايا للالتصاق بالركيزة قبل إجهاد القص. قد يختار الباحثون الذين يستخدمون هذا البروتوكول تقييم التعبير عن البروتينات الهيكلية الخلوية والملتصقة الرئيسية ، مثل الأكتين والكادهيرين وبروتينات الالتصاق البؤري الأخرى. من الضروري أيضا تحديد مقادير الإجهاد الحرجة المطلوبة للحث على تشوه الخلية الأمثل لبرنامج تحليل الإجهاد (DIC).
يمكن أن تكون تقنية فحص القص بمثابة تقنية فعالة لاستكشاف السلوكيات الميكانيكية الفريدة والخصائص الميكانيكية المتأصلة لأنواع مختلفة من الخلايا ، مما قد يساعد في تحديد وتشخيصات محددة وحساسة مستقلة عن علامات سطح الخلية المستخدمة عادة في طرق تشخيص الخلايا السرطانية الحالية. كما أنه يوفر تحسينات كبيرة على طرق التوصيف الميكانيكية الحالية التي تمزق غشاء الخلية قبل الاختبار.
تم استكشاف تقنية فحص القص الفريدة على نطاق واسع لأكثر من عقدين من الزمن لتوصيف سلوك الخلايا البيولوجية وتحديد خصائصها الميكانيكية. يحاكي هذا الإعداد التجريبي عن كثب تأثيرات إجهادات قص السوائل في الجسم من خلال تطبيق إجهاد قص السوائل المتحكم فيه على الخلايا في المختبر. لوحظ أن الخلايا الطبيعية والسرطانية تستجيب لهذه الضغوط بشكل مختلف ، وبالتالي توفر هذه التقنية رؤى لخصائصها وسلوكياتها الهيكلية والميكانيكية. تم استكشاف هذه التقنية في العديد من الدراسات السابقة لتحديد الخصائص اللزجة المرنة للخلايا ، ومن المثير للاهتمام ، لوحظت اختلافات ميكانيكية خلوية كبيرة في الخلايا الطبيعية السليمة والخلايا السرطانية3،4،9. علاوة على ذلك ، لوحظت اختلافات ميكانيكية كبيرة داخل الخلايا بين النواة وسيتوبلازم الخلايا. لذلك يمكن استكشاف هذه الخصائص الميكانيكية الفريدة كمؤشرات حيوية ميكانيكية محتملة للكشف عن أنواع السرطان المختلفة في البيئات السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة يكشفون عنها.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون الباحثين السابقين من مجموعة Soboyejo في معهد Worcester Polytechnic الذين كانوا رائدين في هذه التقنية لأول مرة: Drs. Yifang Cao و Jingjie Hu و Vanessa Uzonwanne. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسرطان (NIH / NCI K22 CA258410 إلى MD.). تم إنشاء الأرقام مع BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| Centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| Gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| Micropipette | any | For sterile cell culture | |
| Micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| Pipetman | any | For sterile cell culture | |
| Pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| Magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| Magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| Methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| Syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
- Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).
- Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I.
- Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).
- Onwudiwe, K., et al. Investigation of creep properties and the cytoskeletal structures of non-tumorigenic breast cells and triple-negative breast cancer cells. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 110 (5), 1004-1020 (2022).
- Ani, C. J., et al. A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 91, 76-90 (2019).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomaterialia. 3 (4), 413-438 (2007).
- Cao, Y., et al. Investigation of the viscoelasticity of human osteosarcoma cells using a shear assay method. Journal of Materials Research. 21 (8), 1922-1930 (2006).
- Cao, Y. On the measurement of human osteosarcoma cell elastic modulus using shear assay experiments. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 18 (1), 103-109 (2007).
- Onwudiwe, K., et al. Actin cytoskeletal structure and the statistical variations of the mechanical properties of non-tumorigenic breast and triple-negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 119, 104505 (2021).
- Kirmizis, D., Logothetidis, S. Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics. International Journal of Nanomedicine. 5, 137-145 (2010).
- Haase, K., Pelling, A. E. Investigating cell mechanics with atomic force microscopy. Journal of the Royal Society. Interface. 12 (104), 20140970 (2015).
- Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society. Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
- Peterman, E. J. G., Gittes, F., Schmidt, C. F.
- Hochmuth, R. M.
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and corticcal tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophysical Journal. 56 (1), 151-160 (1989).
- Van Vliet, K. J., Bao, G., Suresh, S. The biomechanics toolbox: experimental approaches for living cells and biomolecules. Acta Materialia. 51 (19), 5881-5905 (2003).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
- Choi, H. Y., et al. Hydrodynamic shear stress promotes epithelial-mesenchymal transition by downregulating ERK and GSK3beta activities. Breast Cancer Research. 21 (1), 6 (2019).
- Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 17 (2018).
- Onwudiwe, K., Najera, J., Siri, S., Datta, M. Do tumor mechanical stresses promote cancer immune escape. Cells. 11 (23), 3840 (2022).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Mao, B. H., Nguyen Thi, K. M., Tang, M. J., Kamm, R. D., Tu, T. Y. The interface stiffness and topographic feature dictate interfacial invasiveness of cancer spheroids. Biofabrication. 15 (1), (2023).
- Kashani, A. S., Packirisamy, M. Cancer cells optimize elasticity for efficient migration. Royal Society Open Science. 7 (10), 200747 (2020).
- Riehl, B. D., Kim, E., Bouzid, T., Lim, J. Y. The role of microenvironmental cues and mechanical loading milieus in breast cancer cell progression and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 608526 (2021).
