Summary
Denne protokol skitserer kvantificeringen af de mekaniske egenskaber af kræftcellelinjer og ikke-kræftcellelinjer in vitro. Konserverede forskelle i mekanikken i kræftceller og normale celler kan fungere som en biomarkør, der kan have konsekvenser for prognose og diagnose.
Abstract
Uregelmæssig biomekanik er et kendetegn ved kræftbiologi, der er genstand for omfattende undersøgelse. De mekaniske egenskaber af en celle svarer til dem af et materiale. En celles modstand mod stress og belastning, dens afslapningstid og dens elasticitet er alle egenskaber, der kan udledes og sammenlignes med andre typer celler. Kvantificering af de mekaniske egenskaber af kræft (ondartede) versus normale (ikke-ondartede) celler giver forskere mulighed for yderligere at afdække de biofysiske fundamentale elementer i denne sygdom. Mens kræftcellernes mekaniske egenskaber vides konsekvent at afvige fra de mekaniske egenskaber hos normale celler, mangler der en standard eksperimentel procedure til at udlede disse egenskaber fra celler i kultur.
Dette papir skitserer en procedure til kvantificering af de mekaniske egenskaber af enkeltceller in vitro ved hjælp af et væskeforskydningsassay. Princippet bag dette assay indebærer påføring af væskeforskydningsspænding på en enkelt celle og optisk overvågning af den resulterende cellulære deformation over tid. Cellemekaniske egenskaber karakteriseres efterfølgende ved hjælp af digital billedkorrelation (DIC) analyse og tilpasning af en passende viskoelastisk model til de eksperimentelle data genereret fra DIC-analysen. Samlet set sigter den protokol, der er skitseret her, mod at give en mere effektiv og målrettet metode til diagnosticering af kræftformer, der er vanskelige at behandle.
Introduction
Undersøgelse af de biofysiske forskelle mellem kræftceller og ikke-kræftceller giver mulighed for nye diagnostiske og terapeutiske muligheder1. At forstå, hvordan forskelle i biomekanik / mekanobiologi bidrager til tumorprogression og behandlingsresistens, vil afsløre nye veje til målrettet terapi og tidlig diagnose2.
Selv om det er kendt, at kræftcellers mekaniske egenskaber adskiller sig fra normale celler (f.eks. plasmamembranens viskoelasticitet og den nukleare kappe)3,4,5, mangler der robuste og reproducerbare metoder til måling af disse egenskaber i levende celler 6. Forskydningsanalysemetoden bruges til at kvantificere cellernes mekaniske egenskaber ved at udsætte enkeltceller for væskeforskydningsspænding og analysere deres individuelle reaktioner og modstand mod den påførte spænding 3,4,5,7,8,9. Selvom flere metoder og teknikker er blevet brugt til at karakterisere enkeltcellers mekaniske egenskaber, har disse tendens til at påvirke cellematerialeegenskaber ved i) perforering/beskadigelse af cellemembranen på grund af indrykningsdybden, komplekse spidsgeometrier eller substratafstivning forbundet med atomkraftmikroskopi (AFM)10,11, ii) inducering af cellulær fotoskade under optisk fangst 12, 13, eller iii) inducering af komplekse stresstilstande forbundet med mikropipetteaspiration14,15. Disse eksterne virkninger er forbundet med betydelig usikkerhed i nøjagtigheden af celleviskoelasticitetsmålinger 6,16,17.
For at løse disse begrænsninger giver forskydningsanalysemetoden, der er beskrevet her, en meget kontrollerbar og enkel tilgang til at simulere fysiologisk flow i kroppen uden at påvirke cellulære materialeegenskaber i processen. Væskeforskydningsspændinger i dette assay repræsenterer mekaniske belastninger, der opleves af celler i kroppen enten af væsker i tumorinterstitium eller i blodet under cirkulation18,19,20. Endvidere fremmer disse væskespændinger forskellige ondartede adfærd i kræftceller, herunder progression, migration, metastase og celledød 19,21,22,23, som varierer mellem tumorigene og ikke-tumorigene celler. Desuden tillader de ændrede mekaniske egenskaber ved kræftceller (dvs. de er ofte "blødere" end normale celler, der findes i det samme organ) dem at fortsætte i fjendtlige tumormikromiljøer, invadere omgivende normale væv og metastasere til fjerne steder24,25,26. Ved at skabe et pseudobiologisk miljø, hvor celler oplever fysiologiske niveauer af væskeforskydningsstress, opnås en proces, der er fysiologisk relevant og ikke destruktiv for cellen. De cellulære reaktioner på disse anvendte væskeforskydningsspændinger giver os mulighed for at karakterisere cellemekaniske egenskaber.
Dette papir giver en forskydningsanalyseprotokol til omfattende undersøgelse af de mekaniske egenskaber og opførsel af kræftceller og ikke-kræftceller under anvendt forskydningsspænding. Celler reagerer på eksterne kræfter på en elastisk og viskøs måde og kan derfor idealiseres som et viskoelastisk materiale3. Denne teknik er kategoriseret i: (i) cellekultur af dispergerede enkeltceller, (ii) kontrolleret anvendelse af væskeforskydningsspænding, (iii) in situ-billeddannelse og observation af cellulær adfærd (herunder modstandsdygtighed over for stress og deformation), (iv) belastningsanalyse af celler for at bestemme omfanget af deformation og (v) karakterisering af enkeltcellers viskoelastiske egenskaber. Ved at undersøge disse mekaniske egenskaber og adfærd kan kompleks cellulær mekanobiologi destilleres til kvantificerbare data. En protokol, der skitserer denne metode, giver mulighed for katalogisering og sammenligning mellem forskellige maligne og ikke-maligne celletyper. Kvantificering af disse forskelle har potentiale til at etablere diagnostiske og terapeutiske biomarkører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse til enkeltcelleforskydningsanalysen
- Cellekultur
- Der sås ca. 50.000 suspenderede enkeltceller i en 35 mm x 10 mm petriskål indeholdende 2 ml kulturmedier.
BEMÆRK: Vortex de suspenderede celler før såning for at bryde celleaggregater fra hinanden. - Cellerne inkuberes ved 37 °C og tillades mellem 10 og 48 timer til cellebinding og fuldstændig cytoskeletal proteindannelse.
BEMÆRK: Overvej varigheden af cellulær vedhæftning samt spredning og væksthastigheder for at sikre tilstrækkelig cellulær vækst og vedhæftning, samtidig med at celleaggregering undgås. Disse parametre varierer afhængigt af celletypen.
- Der sås ca. 50.000 suspenderede enkeltceller i en 35 mm x 10 mm petriskål indeholdende 2 ml kulturmedier.
2. Eksperiment med forskydningsanalyse
- Fremstilling af forskydningsassay viskøse strømningsmedier
- For at sikre et let tyktflydende flowmedie (0,015-0,02 Pa·s) måles og tilsættes 0,05 vægt% ikke-toksisk og ikke-allergifremkaldende methylcellulose (4 Pa·s) til dyrkningsmediet.
- For at sikre en homogen blanding forvarmes basiskulturmediet i ~10-20 minutter ved en temperatur på ~60-70 °C med en magnetisk omrører/kogeplade. Under konstant omrøring tilsættes methylcellulosen forsigtigt, således at den hurtigt spredes, for at undgå koagulering af methylcellulosepartiklerne. Lad denne proces fortsætte i ~ 15-24 timer for at sikre en klar opløsning af medier + cellulose.
BEMÆRK: Undgå overdreven opvarmning af opløsningen. - For at måle flowmediets viskositet testes ~0,5-1 ml af det repræsentative flowmedie ved hjælp af et rheometer. Fra aflæsningen bestemmes væskeviskositeten og anvendes denne værdi til at repræsentere viskositeten af forskydningsvæskemediet (μ) til beregning af forskydningsspænding ved hjælp af ligning (2).
- Opsætning af forskydningsapparat
- Opsæt forskydningsanalysesystemet for dobbelte sprøjter (60 ml eller 100 ml), der er tilsluttet en programmerbar sprøjtepumpe til infusion og udtagning af det viskøse kulturmedie (figur 1).
- Fastgør begge sprøjter til flowkammeret via 1/16 tommer slange- og slangestik.
- Fastgør en gummipakning for at give et kontrolleret, ensartet flow på enkeltceller langs strømningsvejen (figur 1). Gummipakningen fås i forskellige størrelser afhængigt af den flowprofil, der skal opnås (laminar eller turbulent) og det ønskede observationsområde (f.eks. længde på 22,5 mm, bredde på 2,5 mm og højde på 0,254 mm) (figur 1).
- Programmér pumpen til at tilføre og udtrække en bestemt mængde væske (f.eks. 60 ml) med en bestemt hastighed (f.eks. 1 ml/min), og vælg de tilsvarende sprøjter (f.eks. 60 ml).
BEMÆRK: Tag højde for de maksimale forudindstillinger for infusions- og udtagningsvolumen for at undgå fastklemning eller funktionsfejl. Brug ligning (2) til beregning af den krævede pumpeforskydningshastighed (forudsat at den krævede spænding og viskositet er kendt).
- Opsætning før forskydning
- Fyld sprøjten med det tilberedte viskøse flowmedie.
- Fastgør sprøjten, fyldt med 60 eller 100 ml (eller efter behov) tyktflydende flowmedier, og en tom 60 ml sprøjte til deres respektive placeringer på den programmerbare sprøjtepumpe. Tilslut begge sprøjter til flowkammeret via slange- og slangetilslutninger.
- For at sikre nem identifikation af enkeltceller og en fastgjort forbindelse mellem flowkammeret og petriskålen skal du fastgøre gummipakningen til flowkammeret.
- Opsug cellekulturmediet fra petriskålen, der indeholder cellerne af interesse.
- Vask døde celler og løst fastgjorte celler ved hjælp af fosfatbufret saltvand (PBS).
- Opsug PBS.
- Indsæt og fastgør flowkammeret og gummipakningen (~34 mm x 9 mm) på petriskålen (35 mm x 10 mm), der indeholder de påsatte celler.
- Placer det monterede mikrofluidiske strømningskammer + celler på en kultiveret skål på et omvendt mikroskop med et mikroskopmål, der er højt nok til at opnå billeder i høj kvalitet med høje pixelværdier (normalt mellem 40x og 63x forstørrelse) og en skærmskærm.
- Vælg indstillingen Live Image (time-lapse på noget software) fra mikroskopsoftwaren på skærmen. Sørg for, at mikroskopsoftwaren på pc'en enten har en t (time-lapse) funktionalitet eller kan tage videooptagelser.
- Fokuser mikroskopets mål, hvilket sikrer tilstrækkelig kontrast og tydelige cellekanter. Dette er nødvendigt for billedanalysen efter forskydning. Flyt mikroskoptrinnet for at sikre, at cellerne er tydeligt synlige på skærmen og er levende billeder.
- Vælg en celle eller flere forskellige celler inden for billeddannelsen/strømningsstien for det tilpassede flowkammer + petriskål (det område/den sti, der skabes ved pakningens montering i flowkammeret).
- Forskydning og billedbehandling
- For at opretholde et kontinuerligt ensartet flow skal du vælge lignende infusions- og udtagningshastigheder og sikre laminær strømning af væsken, normalt mellem 1 ml / min og 5 ml / min. For regimer med lavt laminært flow skal du sikre et Reynolds antal Re < 100.
- Klik på Kør på forskydningspumpen for at injicere og trække forskydningsvæsken (forberedte viskøse medier) med kontinuerlig hastighed. Sørg for, at der ikke er bobler under væskeinfusion, da dette kan introducere ekstern uforklarlig stress på cellerne.
- Begynd at optage en video ved at klikke på optag på mikroskopsoftwaren, før den infunderede forskydningsvæske kommer i kontakt med cellen (e) af interesse under mikroskopet.
- Fortsæt med at optage i 7 minutter eller i den ønskede varighed af stresseksponering, eller indtil den eller de berørte celler skærer bunden af skålen. Klik på stop optagelse på mikroskopsoftwaren, når kørslen er afsluttet som ønsket.
- Gem optagelsen, og udpak som .tiff filer. Uddrag fortrinsvis billeder med 1 billede i sekundet til let analyse.
3. Databehandling
- Procedure for digital billedkorrelation (billedanalyse)
- Hvis optagelsen fra mikroskopet blev ekstraheret som en videofil, skal du konvertere den til billedrammer (helst .tiff filformat).
- Importer de billeder, der stammer fra forskydningsanalyseoptagelsen, til Davis 10.1.2-software (DIC-software) for at spore bevægelsen af cellens naturligt mønstrede strukturer ved at lokalisere hver pixelblok (delmængde) af referencebilledet i de respektive nye billeder (deformerede billeder) (figur 2).
- For en optimeret korrelation skal du bruge en delmængdestørrelse på 31 x 31 pixel, en trinstørrelse (deformationsafstand for hver delmængde) på 20 pixels og summen af differentiel sporindstilling, som sporer deformationen af et nyt billede i forhold til det sidste billede. Resultatet af denne sammenhæng er et belastningstidsplot (figur 3), der kan eksporteres som en .csv fil til yderligere analyse i MATLAB.
- Kortlæg interesseområdet for en valgt enkelt celle. Vælg vilkårlige punkter i den tilknyttede celle for at spore deformation. For en uregelmæssig form, såsom cellen, skal du bruge en polygonmaske til at kortlægge cellens geometri.
- Efter kortlægning skal du vælge specifikke punkter på cellen (kerne eller cytoplasma), der skal analyseres, ved at klikke på tilføj strain gauge og trække individuelle strain gauges ud på punkter inden for den definerede cellulære grænse.
- Klik på Kør for at starte belastningsbehandlingen og hente data om belastning versus tid.
- Dobbeltklik (eller højreklik) på det genererede belastningstidsplot, og vælg eksportér data som et regneark.
4. Karakterisering af mekaniske egenskaber
- Viskoelastisk egenskabskarakterisering
- Gem den .csv fil, der indeholder belastningstidsdataene fra DIC-softwaren, i en separat mappe for nem læsbarhed af MATLAB.
- Kør MATLAB, og klik på redigeringsfanen for at åbne en editorside for at skrive en kode, der læser regnearket, celle for celle.
- Skift MATLAB-stien (mappestien, der får adgang til filen af interesse) for at få adgang til den mappe, der indeholder de data, der skal analyseres, for eksempel Brugere / Brugernavn / Desktop / data.
- På MATLAB-editorsiden skal du få adgang til regnearksdataene ved hjælp af den tilpassede kode. For eksempel: a1= xlsread('data','run1','A4:A183'), hvor a1 repræsenterer identifikatoren, xlsread er MATLAB-funktionen , der læser .csv-filen (i dette tilfælde som et regneark), data er filnavnet, run1 er arknavnet, og A4:A183 er dataområdet af interesse i celle A i de regnearksdata , der skal analyseres. For en komplet pasform skal du analysere x og y (henholdsvis tid og belastning). For eksempel:
a1=xlsread('data','run1','A4:A183');
b1=xlsread('data','run1','B4:B183');
A1 = X (tid) og B1 = Y (belastning). - I MATLAB skal du klikke på Apps | Kurvemontør | Brugerdefineret ligning. Ryd den repræsentative brugerdefinerede ligning, og indtast den viskoelastiske modelligning [ligning (1)], hvor ε repræsenterer x-variablen, og t repræsenterer y-variablen.
(1)
Her repræsenterer ε stammen, σ repræsenterer forskydningsspændingen, η1 repræsenterer viskositeten, E repræsenterer elasticiteten, t repræsenterer tiden og τ repræsenterer afslapningstiden, som karakteriserer den maksimale tid, der kræves for cellen at vende tilbage til sin oprindelige form efter primær deformation. Det udtrykkes som τ =
, hvor η2 er den sekundære viskositetsbetegnelse for den anden dashpot (figur 4). - Tildel nye variabler til de viskoelastiske parametre i den brugerdefinerede ligningsgrænseflade. (ε, η1, E, σ, t og τ = ) vil repræsentere henholdsvis x, a, b, K, y og c). Her er x og y henholdsvis de uafhængige og afhængige variabler. Forskydningsspænding (σ) kan bestemmes ved hjælp af ligning (2):
(2)
Her repræsenterer μ forskydningsvæskemediets viskositet, Q er pumpens strømningshastighed, og w og h er bredden og højden af strømningskanalen vist i henholdsvis figur 1C. - Klik på Vælg data for at vælge tid (a1) og belastning (b1) for hvert datasæt.
- Sørg for, at indstillingen Auto Fit-boksen er markeret. Dette kører tilpasningen automatisk, når data (x og y) er valgt.
- Vælg monteringsmetoderne for at stramme grænsebetingelserne. Klik på Avancerede indstillinger under kategorien Metoder , og vælg Ikke-lineære mindste kvadrater. Under Robust skal du vælge Fra, og under Algoritme skal du vælge Tillidsområde. Lad alle andre parametre være, som de er.
- De nye variabler efter tilpasning (a, b og c) repræsenterer henholdsvis cellens viskoelastiske egenskaber, viskositet, elasticitet og afslapningstid (η1, E, EQUAT) (figur 5).
- Se efter en høj R-kvadratisk værdi af tilpasningen (R2 > 80%) for at sikre, at dataoutputtet kan betragtes som en ægte pasform af den viskoelastiske model (figur 3)
(1)
, hvor η2 er den sekundære viskositetsbetegnelse for den anden dashpot (figur 4).
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forskydningsanalyseprotokollen kombineret med deformationsanalyse ved hjælp af DIC og en viskoelastisk model har succes med at kvantificere de mekaniske egenskaber af en enkelt celle in vitro. Denne metode er blevet testet på humane og murincellelinjer, herunder normale humane brystceller (MCF-10A)3,4,9, mindre metastatiske triple-negative brystkræftceller (MDA-MB-468)3, triple-negative brystkræftceller (MDA-MB-231)3, humane osteosarkomceller 7,8 og senest glioblastomceller (figur 3). DIC af billedrammer ekstraheret fra forskydningsassayoptagelser har succes med at producere belastningstidsdata, der er kompatible med krybespændingsresponsen (figur 3), som passer til en viskoelastisk model (figur 4). Ved brug af MATLAB kan den viskoelastiske model bruges til at tilpasse belastningstidsdataene for at opnå de viskoelastiske egenskaber for de forskellige celler.
Figur 5 beskriver det udvalg af egenskaber, der tidligere er blevet undersøgt ved hjælp af forskydningsanalyseteknikken. Yderligere mekaniske egenskaber kan karakteriseres ved hjælp af denne metode afhængigt af parameteren af interesse. Resultaterne af disse undersøgelser ved hjælp af forskydningsanalyseteknikken viste, at kræftceller generelt var mere mekanisk kompatible og mindre viskøse end normale celler (figur 6)3,4,7,8. Figur 6A-C beskriver de mekaniske egenskaber af normale brystceller (MCF-10A) og triple-negative brystkræftceller (mindre metastatisk MDA-MB-468 og meget metastatisk MDA-MB-231). I figur 6A, B kan cellernes stivhed og viskositet observeres at falde med øget kræftprogression, fra en normal celletilstand til en let metastatisk tilstand og til en meget metastatisk tilstand. Statistisk signifikante variationer blev fundet mellem de normale MCF-10A-celler og stærkt metastatiske MDA-MB-231-celler og mellem de mindre metastatiske MDA-MB-468-celler og de meget metastatiske MDA-MB-231-celler. Der var ingen signifikante variationer mellem de normale MCF-10A og de mindre metastatiske MDA-MB-468 celler. Figur 6C viser afslapningstiden for disse celletyper, som ikke viste signifikante variationer; Dette kan variere med andre typer celler.
Figur 1: Opsætning af forskydningsanalyse eksperimentelt. Metoden indebærer anvendelse af (A) en programmerbar sprøjtepumpe til både infusion og tilbagetrækning af viskøse strømningsmedier ind og ud af (B) et flowkammer med konstant forskydningshastighed. (C) En gummipakning indeholdende et rektangulært vindue (dimensioner: 20,5 mm x 2,5 mm x 0,254 mm) og vakuumsugning passer i en 35 mm x 10 mm petriskål, der indeholder dyrkede celler af interesse for at etablere et flowfelt. (D) Cellerne udsættes for strømning inden for det etablerede felt og deformeres af væskeforskydningsspænding, som udledes via (E) en ligning for vægforskydningsspænding. (F) En celle af interesse inden for flowfeltet afbildes ved hjælp af et mikroskop ved 63x forstørrelse, og deformation i realtid fanges og registreres ved hjælp af mikroskopsoftwaren på skærmen. Den inducerede væskeforskydningsspænding anvendes sammen med den afbildede deformation til at kvantificere de mekaniske egenskaber af den enkelte celle. Dette tal er modificeret fra Hu et al.3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Stammeanalyse ved hjælp af digital billedkorrelation. Billeder udtrukket fra en optagelse af forskydningsanalysen viser den maksimale forskydningsbelastning, som individuelle celler oplever under hele eksperimentet. DIC sporer ændringer i cellernes naturligt mønstrede struktur ved at lokalisere og spore en pixelblok, der er delmængde inden for hver ramme eller billede. (A) Billedet af cellen før DIC-analysen. (B) Maskering af cellerne, udvælgelse af interesseområde og såning af cellerne for at hjælpe deformationssporing. (C) Begyndelsen af deformation. (D) Deformationsopbygning. (E) Øget deformation over tid. F) Anvendelse af strain gauges til kvantificering af belastning under deformation. Forkortelse: DIC = digital billedkorrelation. Dette tal er modificeret fra Hu et al.3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentativ prøve af stamme versus tidsdata for glioblastomceller og matematisk modellering af den viskoelastiske model . (A) Data om belastning versus tid opnået af DIC viser forskellige kryberegimer (primære, sekundære og tertiære) i cellen. (B) Data om belastning versus tid eksporteres til MATLAB til kvantificering af den enkelte celles mekaniske egenskaber. Forkortelse: DIC = digital billedkorrelation. Dette tal er modificeret fra Hu et al.3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Viskoelastisk model til bestemmelse af viskoelastiske egenskaber. En tre-parameter generaliseret Maxwell model, som omfatter Kelvin (dashpot) og Voigt (dashpot + fjeder) modeller forbundet i serie, til karakterisering af cellernes viskoelastiske opførsel. Resultatet af den viskoelastiske modellering ved hjælp af forskydningsteknikken er cellens elasticitet, viskositet og afslapningstid. Dette tal er modificeret fra Hu et al.3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Grafisk skildring af de typer af materialeegenskaber af celler, der kan ekstraheres fra forskydningsanalyseteknikken, herunder stivhed, viskositet, krybning og afslapningstid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Materialeegenskaber for celler opnået ved forskydningsanalyseteknikken. Cellestivhed var signifikant forskellig mellem kernen og cytoplasmaet i normale brystceller (MCF-10A) og stærkt metastatiske brystceller (MDA-MB-231) og mellem mindre metastatiske celler (MDA-MB-468) og stærkt metastatiske celler (MDA-MB-231) (A). Der var imidlertid ingen signifikant forskel mellem stivheden af kernen og cytoplasmaet i normale celler (MCF-10A) og mindre metastatiske celler (MDA-MB-468). Lignende tendenser blev også fundet i nukleare og cytoplastiske viskositeter (B). Afslapningstiderne for disse celler udviste ikke signifikante mekaniske forskelle (C), selvom andre celletyper kan. Dette tal er modificeret fra Hu et al.3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskydningsanalysemetoden, som omfatter oprettelse af et pseudomekanobiologisk miljø til simulering af cellernes interaktion med det omgivende mekaniske mikromiljø og deres reaktioner på mekaniske belastninger, har produceret et katalog over cellulære mekaniske egenskaber, hvis mønstre viser bevaret fysisk atypi blandt kræftcellelinjer 3,4,5,7,8 . Denne metode kombinerer en forståelse af grundlæggende væskemekanik og fysik for at karakterisere unikke mekaniske egenskaber hos celler og giver potentielle materielle eller mekaniske biomarkører til påvisning af flere vanskelige at behandle kræftformer 3,4.
Forskydningsanalyseteknikken har visse begrænsninger. At sikre en enkeltcellekultur kan være udfordrende på grund af den hurtige vækst og spredning af visse celletyper, hvilket gør det vanskeligt at visualisere og analysere enkeltceller. Stresstolerance og det cellulære respons kan være heterogent fra en celle til en anden afhængigt af cellelinjen og kræver som sådan mange celler og fejlfinding for at bestemme den gennemsnitlige kritiske stress, der kræves for strukturelt at deformere cellerne, samtidig med at deres levedygtighed opretholdes for at analysere deres materialeegenskaber som levende celler.
Fejlfinding for denne teknik omfatter bestemmelse af i) vækst- og spredningshastighederne for cellelinjer af interesse og ii) den tid, der er nødvendig for celler at klæbe til substratet før forskydningsspænding. Forskere, der bruger denne protokol, kan vælge at vurdere ekspressionen af vigtige cytoskeletale og klæbende proteiner, såsom actin, cadheriner og andre fokale adhæsionsproteiner. Det er også nødvendigt at bestemme de kritiske spændingsstørrelser, der kræves for at inducere den optimale celledeformation til belastningsanalysesoftwaren (DIC).
Forskydningsanalyseteknikken kan tjene som en effektiv teknik til at udforske den unikke mekaniske adfærd og iboende mekaniske egenskaber ved forskellige typer celler, hvilket potentielt hjælper med specifik og følsom identifikation og diagnoser, der er uafhængige af celleoverflademarkører, der typisk anvendes i nuværende kræftcellediagnostiske metoder. Det giver også betydelige forbedringer i forhold til eksisterende mekaniske karakteriseringsmetoder, der sprænger cellemembranen før test.
Den unikke forskydningsanalyseteknik er blevet grundigt udforsket i over to årtier til karakterisering af biologiske cellers adfærd og bestemmelse af deres mekaniske egenskaber. Denne eksperimentelle opsætning efterligner nøje virkningerne af væskeforskydningsspændinger i kroppen ved at anvende kontrolleret væskeforskydningsspænding på celler in vitro. Normale og kræftceller observeres at reagere forskelligt på disse belastninger, og dermed giver denne teknik indsigt i deres strukturelle og mekaniske egenskaber og adfærd. Denne teknik er blevet undersøgt i flere tidligere undersøgelser for at bestemme cellernes viskoelastiske egenskaber, og interessant nok blev der observeret signifikante cellulære mekaniske forskelle i sunde normale celler og kræftceller 3,4,9. Endvidere blev signifikante intracellulære mekaniske forskelle observeret mellem kernen og cytoplasmaet af celler. Disse unikke mekaniske egenskaber kan derfor udforskes som potentielle mekaniske biomarkører til påvisning af forskellige kræftformer i kliniske omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takker tidligere forskere fra Soboyejo-gruppen ved Worcester Polytechnic Institute, der først var banebrydende for denne teknik: Dr. Yifang Cao, Jingjie Hu og Vanessa Uzonwanne. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute (NIH / NCI K22 CA258410 til MD). Figurer blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| Centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| Gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| Micropipette | any | For sterile cell culture | |
| Micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| Pipetman | any | For sterile cell culture | |
| Pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| Magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| Magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| Methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| Syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
- Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).
- Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I.
- Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).
- Onwudiwe, K., et al. Investigation of creep properties and the cytoskeletal structures of non-tumorigenic breast cells and triple-negative breast cancer cells. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 110 (5), 1004-1020 (2022).
- Ani, C. J., et al. A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 91, 76-90 (2019).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomaterialia. 3 (4), 413-438 (2007).
- Cao, Y., et al. Investigation of the viscoelasticity of human osteosarcoma cells using a shear assay method. Journal of Materials Research. 21 (8), 1922-1930 (2006).
- Cao, Y. On the measurement of human osteosarcoma cell elastic modulus using shear assay experiments. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 18 (1), 103-109 (2007).
- Onwudiwe, K., et al. Actin cytoskeletal structure and the statistical variations of the mechanical properties of non-tumorigenic breast and triple-negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 119, 104505 (2021).
- Kirmizis, D., Logothetidis, S. Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics. International Journal of Nanomedicine. 5, 137-145 (2010).
- Haase, K., Pelling, A. E. Investigating cell mechanics with atomic force microscopy. Journal of the Royal Society. Interface. 12 (104), 20140970 (2015).
- Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society. Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
- Peterman, E. J. G., Gittes, F., Schmidt, C. F.
- Hochmuth, R. M.
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and corticcal tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophysical Journal. 56 (1), 151-160 (1989).
- Van Vliet, K. J., Bao, G., Suresh, S. The biomechanics toolbox: experimental approaches for living cells and biomolecules. Acta Materialia. 51 (19), 5881-5905 (2003).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
- Choi, H. Y., et al. Hydrodynamic shear stress promotes epithelial-mesenchymal transition by downregulating ERK and GSK3beta activities. Breast Cancer Research. 21 (1), 6 (2019).
- Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 17 (2018).
- Onwudiwe, K., Najera, J., Siri, S., Datta, M. Do tumor mechanical stresses promote cancer immune escape. Cells. 11 (23), 3840 (2022).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Mao, B. H., Nguyen Thi, K. M., Tang, M. J., Kamm, R. D., Tu, T. Y. The interface stiffness and topographic feature dictate interfacial invasiveness of cancer spheroids. Biofabrication. 15 (1), (2023).
- Kashani, A. S., Packirisamy, M. Cancer cells optimize elasticity for efficient migration. Royal Society Open Science. 7 (10), 200747 (2020).
- Riehl, B. D., Kim, E., Bouzid, T., Lim, J. Y. The role of microenvironmental cues and mechanical loading milieus in breast cancer cell progression and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 608526 (2021).
