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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

एकल-सेल सामग्री गुणों के निर्धारण के लिए कतरनी परख प्रोटोकॉल

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65333
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Aerospace and Mechanical Engineering, University of Notre Dame, 2Departments of Mechanical and Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल विट्रो में कैंसर और गैर-कैंसर सेल लाइनों के यांत्रिक गुणों की मात्रा का निर्धारण करता है। कैंसर और सामान्य कोशिकाओं के यांत्रिकी में संरक्षित अंतर एक बायोमार्कर के रूप में कार्य कर सकते हैं जो रोग का निदान और निदान में निहितार्थ हो सकते हैं।

Abstract

अनियमित बायोमैकेनिक्स व्यापक अध्ययन के अधीन कैंसर जीव विज्ञान की एक पहचान हैं। एक सेल के यांत्रिक गुण एक सामग्री के समान होते हैं। तनाव और तनाव के लिए एक सेल का प्रतिरोध, इसका विश्राम समय, और इसकी लोच सभी गुण हैं जिन्हें प्राप्त किया जा सकता है और अन्य प्रकार की कोशिकाओं से तुलना की जा सकती है। कैंसर (घातक) बनाम सामान्य (गैर-घातक) कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को निर्धारित करने से शोधकर्ताओं को इस बीमारी के बायोफिज़िकल मूल सिद्धांतों को और उजागर करने की अनुमति मिलती है। जबकि कैंसर कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को सामान्य कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों से लगातार भिन्न होने के लिए जाना जाता है, संस्कृति में कोशिकाओं से इन गुणों को कम करने के लिए एक मानक प्रयोगात्मक प्रक्रिया की कमी है।

यह पेपर एक द्रव कतरनी परख का उपयोग करके विट्रो में एकल कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को निर्धारित करने के लिए एक प्रक्रिया को रेखांकित करता है। इस परख के पीछे के सिद्धांत में एक एकल कोशिका पर द्रव कतरनी तनाव लागू करना और समय के साथ परिणामस्वरूप सेलुलर विरूपण की ऑप्टिकल निगरानी करना शामिल है। सेल मैकेनिकल गुणों को बाद में डिजिटल छवि सहसंबंध (डीआईसी) विश्लेषण का उपयोग करके और डीआईसी विश्लेषण से उत्पन्न प्रयोगात्मक डेटा के लिए एक उपयुक्त विस्कोस्टिक मॉडल फिट करने की विशेषता है। कुल मिलाकर, यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल का उद्देश्य कैंसर के निदान के लिए अधिक प्रभावी और लक्षित विधि प्रदान करना है।

Introduction

कैंसर और गैर-कैंसर कोशिकाओं के बीच बायोफिज़िकल अंतर का अध्ययन करने से नए नैदानिक और चिकित्सीय अवसर1 की अनुमति मिलती है। मेकेनोबायोलॉजी में अंतर ट्यूमर की प्रगति और उपचार प्रतिरोध में कैसे योगदान देता है, यह समझना लक्षित चिकित्सा और प्रारंभिक निदानके लिए नए रास्ते प्रकट करेगा।

जबकि यह ज्ञात है कि कैंसर सेल यांत्रिक गुण सामान्य कोशिकाओं से भिन्न होते हैं (उदाहरण के लिए, प्लाज्मा झिल्ली और परमाणु लिफाफे की विस्कोस्टिकिटी) 3,4,5, जीवित कोशिकाओं में इन गुणों को मापने के लिए मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीकोंकी कमी है। कतरनी परख विधि का उपयोग एकल कोशिकाओं को द्रव कतरनी तनाव के अधीन करके और लागू तनाव 3,4,5,7,8,9 के लिए उनकी व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं और प्रतिरोध का विश्लेषण करके कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। यद्यपि एकल कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को चिह्नित करने के लिए कई तरीकों और तकनीकों का उपयोग किया गया है, ये कोशिका सामग्री गुणों को प्रभावित करते हैं i) इंडेंटेशन गहराई, जटिल टिप ज्यामिति, या परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) 10,11 से जुड़े सब्सट्रेट कठोरता के कारण कोशिका झिल्ली को नुकसान पहुंचाना/ 13, या iii) माइक्रोपिपेट एस्पिरेशन14,15 से जुड़े जटिल तनाव अवस्थाओं को प्रेरित करना। ये बाहरी प्रभाव सेल विस्कोस्टिकिटी माप 6,16,17 की सटीकता में महत्वपूर्ण अनिश्चितताओं से जुड़े हैं।

इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, यहां वर्णित कतरनी परख विधि प्रक्रिया में सेलुलर सामग्री गुणों को प्रभावित किए बिना शरीर में शारीरिक प्रवाह का अनुकरण करने के लिए एक अत्यधिक नियंत्रणीय और सरल दृष्टिकोण प्रदान करती है। इस परख में द्रव कतरनी तनाव शरीर में कोशिकाओं द्वारा अनुभव किए गए यांत्रिक तनाव का प्रतिनिधित्व करते हैं या तो ट्यूमर इंटरस्टिटियम के भीतर तरल पदार्थ द्वारा या परिसंचरण के दौरान रक्त में18,19,20। इसके अलावा, ये द्रव तनाव कैंसर कोशिकाओं में विभिन्न घातक व्यवहारों को बढ़ावा देते हैं, जिसमें प्रगति, प्रवासन, मेटास्टेसिस और कोशिका मृत्यु19,21,22,23 शामिल हैं जो ट्यूमरोजेनिक और गैर-ट्यूमरोजेनिक कोशिकाओं के बीच भिन्न होते हैं। इसके अलावा, कैंसर कोशिकाओं की परिवर्तित यांत्रिक विशेषताएं (यानी, वे अक्सर एक ही अंग के भीतर पाई जाने वाली सामान्य कोशिकाओं की तुलना में "नरम" होती हैं) उन्हें शत्रुतापूर्ण ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में बने रहने, आसपास के सामान्य ऊतकों पर आक्रमण करने और दूर के स्थानों 24,25,26 पर मेटास्टेसाइज करने की अनुमति देती हैं। एक छद्म-जैविक वातावरण बनाकर जहां कोशिकाएं द्रव कतरनी तनाव के शारीरिक स्तर का अनुभव करती हैं, एक प्रक्रिया जो शारीरिक रूप से प्रासंगिक है और कोशिका के लिए विनाशकारी नहीं है, प्राप्त की जाती है। इन लागू द्रव कतरनी तनावों के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाएं हमें सेल यांत्रिक गुणों को चिह्नित करने की अनुमति देती हैं।

यह पेपर लागू कतरनी तनाव के तहत कैंसर और गैर-कैंसर कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों और व्यवहार के व्यापक अध्ययन के लिए एक कतरनी परख प्रोटोकॉल प्रदान करता है। कोशिकाएं एक लोचदार और चिपचिपा तरीके से बाहरी बलों का जवाब देती हैं और इसलिए इसे एक विस्कोस्टिक सामग्री के रूप में आदर्श ीकृत किया जा सकताहै। इस तकनीक को वर्गीकृत किया गया है: (i) छितरी हुई एकल कोशिकाओं की कोशिका संस्कृति, (ii) द्रव कतरनी तनाव का नियंत्रित अनुप्रयोग, (iii) सीटू इमेजिंग और सेलुलर व्यवहार का अवलोकन (तनाव और विरूपण के प्रतिरोध सहित), (iv) विरूपण की सीमा निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं का तनाव विश्लेषण, और (v) एकल कोशिकाओं के विस्कोस्टिक गुणों का लक्षण वर्णन। इन यांत्रिक गुणों और व्यवहारों से पूछताछ करके, जटिल सेलुलर मेकेनोबायोलॉजी को मात्रात्मक डेटा के लिए आसुत किया जा सकता है। इस विधि को रेखांकित करने वाला एक प्रोटोकॉल विभिन्न घातक और गैर-घातक सेल प्रकारों के बीच कैटलॉगिंग और तुलना की अनुमति देता है। इन अंतरों को निर्धारित करने से नैदानिक और चिकित्सीय बायोमाकर्स स्थापित करने की क्षमता है।

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Protocol

1. एकल-सेल कतरनी परख के लिए तैयारी

  1. सेल संस्कृति
    1. बीज 35 मिमी x 10 मिमी पेट्री डिश में लगभग 50,000 निलंबित एकल कोशिकाओं में 2 एमएल कल्चर मीडिया होता है।
      नोट: सेल समुच्चय को तोड़ने के लिए बीज बोने से पहले निलंबित कोशिकाओं को भंवर करें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और सेल अटैचमेंट और पूर्ण साइटोस्केलेटल प्रोटीन गठन के लिए 10 से 48 घंटे के बीच अनुमति दें।
      नोट: सेल एकत्रीकरण से बचते हुए पर्याप्त सेलुलर विकास और लगाव सुनिश्चित करने के लिए सेलुलर लगाव की अवधि, साथ ही प्रसार और विकास दर पर विचार करें। ये पैरामीटर सेल प्रकार के साथ भिन्न होते हैं।

2. कतरनी परख प्रयोग

  1. कतरनी परख चिपचिपा प्रवाह मीडिया की तैयारी।
    1. थोड़ा चिपचिपा प्रवाह मीडिया (0.015-0.02 Pa's) सुनिश्चित करने के लिए, संस्कृति मीडिया में गैर-विषाक्त और गैर-एलर्जेनिक मिथाइलसेल्यूलोज (4 Pa's) के 0.05 wt% को मापें और जोड़ें।
    2. एक सजातीय मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए, चुंबकीय हलचल / गर्म प्लेट के साथ ~ 60-70 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर ~ 10-20 मिनट के लिए बेस कल्चर मीडिया को प्रीहीट करें। मीडिया को लगातार हिलाते हुए, धीरे से मिथाइलसेल्यूलोज जोड़ें ताकि यह जल्दी से फैल जाए, ताकि मिथाइलसेल्यूलोज कणों के जमावट से बचा जा सके। मीडिया + सेल्यूलोज का स्पष्ट समाधान सुनिश्चित करने के लिए इस प्रक्रिया को ~ 15-24 घंटे तक जारी रखने की अनुमति दें।
      नोट: घोल के अत्यधिक गर्म होने से बचें।
    3. प्रवाह मीडिया की चिपचिपाहट को मापने के लिए, एक रिओमीटर का उपयोग करके प्रतिनिधि प्रवाह मीडिया के ~ 0.5-1 एमएल का परीक्षण करें। रीडआउट से, द्रव चिपचिपाहट का निर्धारण करें और समीकरण (2) का उपयोग करके कतरनी तनाव की गणना करने के लिए कतरनी द्रव माध्यम (μ) की चिपचिपाहट का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस मूल्य का उपयोग करें।
  2. कतरनी उपकरण सेटअप
    1. चिपचिपा कल्चर मीडिया के जलसेक और वापसी के लिए एक प्रोग्राम करने योग्य सिरिंज पंप से जुड़े दोहरे सिरिंज (60 एमएल या 100 एमएल) की कतरनी परख प्रणाली स्थापित करें (चित्रा 1)।
    2. 1/16 इंच टयूबिंग और ट्यूबिंग कनेक्टर के माध्यम से दोनों सिरिंज को प्रवाह कक्ष में संलग्न करें।
    3. प्रवाह पथ के साथ एकल कोशिकाओं पर एक नियंत्रित, समान प्रवाह प्रदान करने के लिए एक रबर गैसकेट को बांधें (चित्रा 1)। रबर गैसकेट प्रवाह प्रोफ़ाइल (लामिनार या अशांत) और अवलोकन के वांछित क्षेत्र (जैसे, 22.5 मिमी की लंबाई, 2.5 मिमी की चौड़ाई और 0.254 मिमी की ऊंचाई) के आधार पर विभिन्न आकारों में आता है (चित्रा 1)।
    4. पंप को एक निर्दिष्ट दर (जैसे, 1 एमएल / मिनट) पर तरल पदार्थ की एक निश्चित मात्रा (जैसे, 60 एमएल) को डालने और निकालने के लिए प्रोग्राम करें और संबंधित सिरिंज (जैसे, 60 एमएल) का चयन करें।
      नोट: जाम या खराबी से बचने के लिए अधिकतम इन्फ्यूजन और निकासी वॉल्यूम प्रीसेट के लिए खाता बनाएं। आवश्यक पंप कतरनी दर की गणना के लिए समीकरण (2) का उपयोग करें (यह मानते हुए कि आवश्यक तनाव और चिपचिपाहट ज्ञात है)।
  3. प्री-शीयर सेटअप
    1. तैयार चिपचिपा प्रवाह मीडिया के साथ सिरिंज भरें।
    2. 60 या 100 एमएल (या आवश्यकतानुसार) चिपचिपा प्रवाह मीडिया से भरे सिरिंज को संलग्न करें, और प्रोग्राम करने योग्य सिरिंज पंप पर अपने संबंधित स्थानों पर एक खाली 60 एमएल सिरिंज। ट्यूबिंग और ट्यूबिंग कनेक्टर के माध्यम से, दोनों सिरिंज को प्रवाह कक्ष से कनेक्ट करें।
    3. एकल कोशिकाओं की आसान पहचान और प्रवाह कक्ष और पेट्री डिश के बीच एक मजबूत कनेक्शन सुनिश्चित करने के लिए, रबर गैसकेट को प्रवाह कक्ष से संलग्न करें।
    4. पेट्री डिश से सेल कल्चर मीडिया को एस्पिरेट करें जिसमें रुचि की कोशिकाएं होती हैं।
    5. फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (पीबीएस) का उपयोग करके मृत कोशिकाओं और शिथिल रूप से संलग्न कोशिकाओं को धोएं।
    6. पीबीएस को एस्पिरेट करें।
    7. संलग्न कोशिकाओं वाले पेट्री डिश (35 मिमी x 10 मिमी) पर प्रवाह कक्ष और रबर गैसकेट (~ 34 मिमी x 9 मिमी) डालें और ठीक करें।
    8. फिट किए गए माइक्रोफ्लुइडिक फ्लो चैंबर + कोशिकाओं को एक सुसंस्कृत डिश पर एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर रखें, जिसमें एक माइक्रोस्कोप उद्देश्य उच्च पिक्सेल मूल्यों (आमतौर पर 40x और 63x आवर्धन के बीच) और एक डिस्प्ले मॉनिटर के साथ उच्च गुणवत्ता वाली छवियां प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है।
    9. डिस्प्ले मॉनिटर पर माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर से लाइव छवि (कुछ सॉफ़्टवेयर पर टाइम-लैप्स) विकल्प का चयन करें। सुनिश्चित करें कि पीसी पर माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर में या तो टी (टाइम-लैप्स) कार्यक्षमता है या वीडियो रिकॉर्डिंग ले सकते हैं।
    10. माइक्रोस्कोप उद्देश्य पर ध्यान केंद्रित करें, पर्याप्त कंट्रास्ट और विशिष्ट सेल किनारों को सुनिश्चित करें। यह छवि विश्लेषण पोस्ट-कतरनी के लिए आवश्यक है। माइक्रोस्कोप चरण को स्थानांतरित करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोशिकाएं डिस्प्ले मॉनिटर पर स्पष्ट रूप से दिखाई दे रही हैं और लाइव छवियां हैं।
    11. फिट किए गए प्रवाह कक्ष + पेट्री डिश (प्रवाह कक्ष में गैसकेट की फिटिंग द्वारा बनाया गया क्षेत्र / पथ) के इमेजिंग / प्रवाह पथ के भीतर एक सेल या कई अलग-अलग कोशिकाओं का चयन करें।
  4. कतरनी और इमेजिंग
    1. एक निरंतर समान प्रवाह बनाए रखने के लिए, समान जलसेक और निकासी दरों का चयन करें और तरल पदार्थ के लामिनर प्रवाह को सुनिश्चित करें, आमतौर पर 1 एमएल / मिनट और 5 एमएल / मिनट के बीच। कम लामिनर प्रवाह व्यवस्था के लिए, रेनॉल्ड की संख्या 100 रुपये < सुनिश्चित करें।
    2. निरंतर दर पर कतरनी द्रव (तैयार चिपचिपा मीडिया) को इंजेक्ट करने और वापस लेने के लिए कतरनी पंप पर रन पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि द्रव जलसेक के दौरान कोई बुलबुले नहीं हैं, क्योंकि यह कोशिकाओं पर बाहरी बेहिसाब तनाव पेश कर सकता है।
    3. इससे पहले कि संक्रमित कतरनी द्रव माइक्रोस्कोप के नीचे रुचि के सेल (सेल) के साथ संपर्क करे, माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर पर रिकॉर्ड पर क्लिक करके एक वीडियो रिकॉर्ड करना शुरू करें।
    4. 7 मिनट के लिए, या तनाव जोखिम की वांछित अवधि के लिए रिकॉर्ड करना जारी रखें, या जब तक कि डिश के निचले हिस्से से ब्याज की सेल (ओं) कतरनी न हो जाए। इच्छानुसार रन पूरा होने पर माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर पर रिकॉर्डिंग बंद करें पर क्लिक करें।
    5. रिकॉर्डिंग सहेजें और .tiff फ़ाइलों के रूप में निकालें। अधिमानतः, आसान विश्लेषण के लिए 1 फ्रेम प्रति सेकंड पर चित्र निकालें।

3. डेटा प्रोसेसिंग

  1. डिजिटल छवि सहसंबंध प्रक्रिया (छवि विश्लेषण)
    1. यदि माइक्रोस्कोप से रिकॉर्डिंग को वीडियो फ़ाइल के रूप में निकाला गया था, तो इसे छवि फ्रेम (अधिमानतः फ़ाइल प्रारूप .tiff) में परिवर्तित करें।
    2. कतरनी परख रिकॉर्डिंग से प्राप्त छवियों को डेविस 10.1.2 सॉफ्टवेयर (डीआईसी सॉफ्टवेयर) में आयात करें ताकि संबंधित नई छवियों (विकृत छवियों) में संदर्भ छवि के पिक्सेल (उप-समूह) के प्रत्येक ब्लॉक का पता लगाकर सेल की स्वाभाविक रूप से पैटर्न संरचनाओं के आंदोलन को ट्रैक किया जा सके (चित्रा 2)।
    3. एक अनुकूलित सहसंबंध के लिए, 31 x 31 पिक्सेल के उप-समूह आकार, 20 पिक्सेल के एक चरण आकार (प्रत्येक उप-समूह की विरूपण दूरी) और अंतर ट्रैक विकल्प के योग का उपयोग करें, जो अंतिम छवि के संबंध में एक नई छवि के विरूपण को ट्रैक करता है। इस सहसंबंध का परिणाम एक तनाव-समय प्लॉट (चित्रा 3) है जिसे MATLAB में आगे के विश्लेषण के लिए एक .csv फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जा सकता है।
    4. एक चुने हुए एकल सेल के लिए रुचि के क्षेत्र को मैप करें। विरूपण को ट्रैक करने के लिए मैप किए गए सेल के भीतर मनमाने बिंदुओं का चयन करें। एक अनियमित आकार के लिए, जैसे कि सेल, सेल की ज्यामिति को मैप करने के लिए एक बहुभुज मुखौटा का उपयोग करें।
    5. मैपिंग के बाद, सेल (न्यूक्लियस या साइटोप्लाज्म) पर विशिष्ट बिंदुओं का चयन करें, जिनका विश्लेषण तनाव गेज जोड़ें पर क्लिक करके और परिभाषित सेलुलर सीमा के भीतर बिंदुओं पर अलग-अलग तनाव गेज खींचकर किया जाए।
    6. तनाव प्रसंस्करण शुरू करने और तनाव बनाम समय डेटा प्राप्त करने के लिए रन पर क्लिक करें।
    7. जेनरेट किए गए स्ट्रेन-टाइम प्लॉट पर डबल-क्लिक (या राइट-क्लिक) करें और स्प्रेडशीट के रूप में निर्यात डेटा का चयन करें।

4. यांत्रिक संपत्ति लक्षण वर्णन

  1. विस्कोस्टिक गुण लक्षण वर्णन।
    1. MATLAB द्वारा आसान पठनीयता के लिए DIC सॉफ़्टवेयर से तनाव-समय डेटा वाली .csv फ़ाइल को एक अलग फ़ोल्डर में सहेजें।
    2. MATLAB चलाएं और एक कोड लिखने के लिए एक संपादक पृष्ठ खोलने के लिए संपादक टैब पर क्लिक करें जो स्प्रेडशीट, सेल दर सेल पढ़ता है।
    3. विश्लेषण किए जाने वाले डेटा वाले फ़ोल्डर तक पहुँचने के लिए MATLAB पथ (फ़ोल्डर पथ जो रुचि की फ़ाइल तक पहुँचता है) परिवर्तित करें, उदाहरण के लिए, उपयोगकर्ता / उपयोगकर्ता नाम / डेस्कटॉप/ डेटा।
    4. MATLAB संपादक पृष्ठ पर, अनुकूलित कोड का उपयोग करके स्प्रेडशीट डेटा तक पहुँचें। उदाहरण के लिए: a1 = xlsread ('डेटा', 'run1', 'A4:A183'), जहां a1 पहचानकर्ता का प्रतिनिधित्व करता है, xlsread MATLAB फ़ंक्शन है जो .csv फ़ाइल को पढ़ता है (इस मामले में, एक स्प्रेडशीट के रूप में), डेटा फ़ाइल नाम है, run1 शीट का नाम है, और A4: A183 विश्लेषण किए जाने वाले स्प्रेडशीट डेटा के सेल A में रुचि के डेटा की श्रेणी है। एक पूर्ण फिट के लिए, एक्स और वाई (समय और तनाव, क्रमशः) का विश्लेषण करें। उदाहरण के लिए:
      a1=xlsread('डेटा', 'run1', 'A4:A183');
      b1=xlsread('डेटा', 'run1', 'B4:B183');
      a1 = x (समय), और b1 = y (तनाव)।
    5. MATLAB में, एप्लिकेशन क्लिक करें | कर्व फिटर | कस्टम समीकरण. प्रतिनिधि कस्टम समीकरण को साफ़ करें और विस्कोस्टिक मॉडल समीकरण [समीकरण (1)] को इनपुट करें, जहां ε x चर का प्रतिनिधित्व करता है और t y चर का प्रतिनिधित्व करता है।
      Equation 1(1)
      यहां, ε तनाव का प्रतिनिधित्व करता है, σ कतरनी तनाव का प्रतिनिधित्व करता है, η1 चिपचिपाहट का प्रतिनिधित्व करता है, ई लोच का प्रतिनिधित्व करता है, टी समय का प्रतिनिधित्व करता है, और " विश्राम समय का प्रतिनिधित्व करता है, जो प्राथमिक विरूपण के बाद सेल को अपने मूल आकार में लौटने के लिए आवश्यक अधिकतम समय का वर्णन करता है। इसे इस रूप में व्यक्त किया जाता है : = Equation 2, जहां η2 दूसरे डैशपॉट के लिए द्वितीयक चिपचिपाहट शब्द है (चित्रा 4)।
    6. कस्टम समीकरण इंटरफ़ेस के भीतर विस्कोस्टिक मापदंडों के लिए नए चर पुन: असाइन करें। (ε, η1, E, σ, t, और o = Equation 2) क्रमशः (x, a, b, K, y, और c) का प्रतिनिधित्व करेंगे। यहां, एक्स और वाई क्रमशः स्वतंत्र और निर्भर चर हैं। कतरनी तनाव (σ) समीकरण (2) का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है:
      Equation 3(2)
      यहां, μ कतरनी द्रव माध्यम की चिपचिपाहट का प्रतिनिधित्व करता है, क्यू पंप प्रवाह दर है, और डब्ल्यू और एच क्रमशः चित्रा 1 सी में दिखाए गए प्रवाह चैनल की चौड़ाई और ऊंचाई हैं।
    7. डेटा के प्रत्येक सेट के लिए समय (a1) और तनाव (b1) का चयन करने के लिए डेटा का चयन करें पर क्लिक करें।
    8. सुनिश्चित करें कि ऑटो फिट बॉक्स विकल्प की जांच की गई है। जब डेटा (x और y) का चयन किया जाता है तो यह स्वचालित रूप से फिट चलाता है।
    9. सीमा की स्थिति को कसने के लिए फिटिंग विधियों का चयन करें। विधि श्रेणी के अंतर्गत उन्नत विकल्प पर क्लिक करें और नॉनलाइनियर न्यूनतम वर्ग का चयन करें। मजबूत के अंतर्गत, बंद करें का चयन करें, और एल्गोरिथ्म के अंतर्गत, विश्वास-क्षेत्र का चयन करें. हर दूसरे पैरामीटर को वैसे ही छोड़ दें जैसा कि यह है।
    10. नए चर पोस्ट-फिटिंग (ए, बी, और सी) क्रमशः सेल के विस्कोस्टिक गुणों, चिपचिपाहट, लोच और विश्राम समय (η1, ई, ईक्यूएटी) का प्रतिनिधित्व करते हैं (चित्रा 5)।
    11. फिट के उच्च आर-वर्ग मूल्य (आर2 > 80%) की तलाश करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि डेटा आउटपुट को विस्कोस्टिक मॉडल (चित्रा 3) का सही फिट माना जा सकता है।

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Representative Results

डीआईसी और एक विस्कोस्टिक मॉडल का उपयोग करके विरूपण विश्लेषण के साथ युग्मित कतरनी परख प्रोटोकॉल विट्रो में एकल कोशिका के यांत्रिक गुणों को निर्धारित करने में सफल है। इस विधि का परीक्षण मानव और मुराइन सेल लाइनों पर किया गया है, जिसमें सामान्य मानव स्तन कोशिकाएं (एमसीएफ -10 ए) 3,4,9, कम मेटास्टैटिक ट्रिपल-नकारात्मक स्तन कैंसर कोशिकाएं (एमडीए-एमबी -468)3, ट्रिपल-नकारात्मक स्तन कैंसर कोशिकाएं (एमडीए-एमबी -231)3, मानव ओस्टियोसारकोमा कोशिकाएं7,8, और हाल ही में ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाएं (चित्रा 3) शामिल हैं।). कतरनी परख रिकॉर्डिंग से निकाले गए छवि फ्रेम का डीआईसी क्रीप स्ट्रेस रिस्पांस (चित्रा 3) के साथ संगत तनाव-समय डेटा का उत्पादन करने में सफल है, जो एक विस्कोस्टिक मॉडल (चित्रा 4) के लिए फिट है। MATLAB के उपयोग के साथ, विभिन्न कोशिकाओं के विस्कोस्टिक गुणों को प्राप्त करने के लिए तनाव-समय डेटा को फिट करने के लिए विस्कोस्टिक मॉडल का उपयोग किया जा सकता है।

चित्रा 5 उन गुणों की श्रेणी का वर्णन करता है जिनका पहले कतरनी परख तकनीक का उपयोग करके अध्ययन किया गया है। रुचि के पैरामीटर के आधार पर, इस विधि का उपयोग करके अतिरिक्त यांत्रिक गुणों की विशेषता बताई जा सकती है। कतरनी परख तकनीक का उपयोग करके इन अध्ययनों के परिणामों से पता चला है कि कैंसर कोशिकाएं आम तौर पर सामान्य कोशिकाओं की तुलना में अधिक यांत्रिक रूप से अनुरूप और कम चिपचिपी थीं (चित्रा 6)3,4,7,8। चित्रा 6 ए-सी सामान्य स्तन कोशिकाओं (एमसीएफ -10 ए) और ट्रिपल-नकारात्मक स्तन कैंसर कोशिकाओं (कम मेटास्टैटिक एमडीए-एमबी -468 और अत्यधिक मेटास्टैटिक एमडीए-एमबी -231) के यांत्रिक गुणों का वर्णन करता है। चित्रा 6 ए, बी में, कोशिकाओं की कठोरता और चिपचिपाहट को कैंसर की प्रगति में वृद्धि के साथ कम किया जा सकता है, एक सामान्य कोशिका अवस्था से, थोड़ा मेटास्टैटिक स्थिति में, और अत्यधिक मेटास्टैटिक स्थिति में। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण भिन्नताएं सामान्य एमसीएफ -10 ए कोशिकाओं और अत्यधिक मेटास्टैटिक एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं के बीच और कम मेटास्टैटिक एमडीए-एमबी -468 कोशिकाओं और अत्यधिक मेटास्टैटिक एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं के बीच पाई गईं। सामान्य एमसीएफ -10 ए और कम मेटास्टैटिक एमडीए-एमबी -468 कोशिकाओं के बीच कोई महत्वपूर्ण भिन्नता नहीं थी। चित्रा 6 सी इन सेल प्रकारों के लिए विश्राम समय दिखाता है, जिसने कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं दिखाया; यह अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ भिन्न हो सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: कतरनी परख प्रयोगात्मक सेटअप। विधि में (ए) एक प्रोग्राम करने योग्य सिरिंज पंप का उपयोग शामिल है ताकि चिपचिपा प्रवाह मीडिया को (बी) एक निरंतर कतरनी दर पर प्रवाह कक्ष में और बाहर निकालने दोनों के लिए किया जा सके। (सी) एक आयताकार खिड़की (आयाम: 20.5 मिमी x 2.5 मिमी x 0.254 मिमी) और वैक्यूम सक्शन युक्त एक रबर गैसकेट एक प्रवाह क्षेत्र स्थापित करने के लिए रुचि की सुसंस्कृत कोशिकाओं वाले 35 मिमी x 10 मिमी पेट्री डिश में फिट होता है। (डी) कोशिकाओं को स्थापित क्षेत्र के भीतर प्रवाह के अधीन किया जाता है और द्रव कतरनी तनाव द्वारा विकृत किया जाता है, जो (ई) दीवार कतरनी तनाव के लिए एक समीकरण के माध्यम से प्राप्त होता है। (एफ) प्रवाह क्षेत्र के भीतर रुचि के एक सेल को 63x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया जाता है, और मॉनिटर पर माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग करके वास्तविक समय विरूपण को कैप्चर और रिकॉर्ड किया जाता है। एकल कोशिका के यांत्रिक गुणों को निर्धारित करने के लिए छवि विरूपण के साथ प्रेरित द्रव कतरनी तनाव का उपयोग किया जाता है। यह आंकड़ा हू एट अल.3 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: डिजिटल छवि सहसंबंध का उपयोग करके तनाव विश्लेषण। कतरनी परख की रिकॉर्डिंग से निकाली गई छवियां पूरे प्रयोग में व्यक्तिगत कोशिकाओं द्वारा अनुभव किए गए अधिकतम कतरनी तनाव को दिखाती हैं। डीआईसी प्रत्येक फ्रेम या छवि के भीतर पिक्सेल उप-समूह के एक ब्लॉक का पता लगाकर और ट्रैक करके कोशिकाओं की स्वाभाविक रूप से पैटर्न संरचना में परिवर्तन को ट्रैक करता है। (ए) डीआईसी विश्लेषण से पहले सेल की छवि। (बी) कोशिकाओं को मास्क करना, रुचि के क्षेत्र का चयन करना, और विरूपण ट्रैकिंग में सहायता के लिए कोशिकाओं को सीडिंग करना। (सी) विरूपण की शुरुआत। (डी) विरूपण निर्माण। (ई) समय के साथ बढ़ती विकृति। (च) विरूपण के दौरान तनाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए तनाव गेज का अनुप्रयोग। संक्षिप्त नाम: डीआईसी = डिजिटल छवि सहसंबंध। यह आंकड़ा हू एट अल.3 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के तनाव बनाम समय डेटा का प्रतिनिधि नमूना और विस्कोस्टिक मॉडल का गणितीय मॉडलिंग । (ए) डीआईसी द्वारा प्राप्त तनाव बनाम समय डेटा सेल के विभिन्न रेंगने वाले शासन (प्राथमिक, माध्यमिक और तृतीयक) को दर्शाता है। (बी) तनाव बनाम समय डेटा को अलग-अलग सेल के यांत्रिक गुणों की मात्रा का ठहराव के लिए मैटलैब को निर्यात किया जाता है। संक्षिप्त नाम: डीआईसी = डिजिटल छवि सहसंबंध। यह आंकड़ा हू एट अल.3 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: विस्कोस्टिक गुणों के निर्धारण के लिए विस्कोस्टिक मॉडल। एक तीन-पैरामीटर सामान्यीकृत मैक्सवेल मॉडल, जिसमें कोशिकाओं के विस्कोस्टिक व्यवहार के लक्षण वर्णन के लिए श्रृंखला में जुड़े केल्विन (डैशपॉट) और वोइट (डैशपॉट + स्प्रिंग) मॉडल शामिल हैं। कतरनी तकनीक का उपयोग करके विस्कोस्टिक मॉडलिंग का परिणाम सेल की लोच, चिपचिपाहट और विश्राम समय है। यह आंकड़ा हू एट अल.3 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: कोशिकाओं के भौतिक गुणों के प्रकारों का ग्राफिकल चित्रण जो कतरनी परख तकनीक से निकाला जा सकता है, जिसमें कठोरता, चिपचिपाहट, रेंगना और विश्राम समय शामिल है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: कतरनी परख तकनीक से प्राप्त कोशिकाओं के भौतिक गुण। सेल कठोरता सामान्य स्तन कोशिकाओं (एमसीएफ -10 ए) और अत्यधिक मेटास्टैटिक स्तन कोशिकाओं (एमडीए-एमबी -231) के नाभिक और साइटोप्लाज्म के बीच और कम मेटास्टैटिक कोशिकाओं (एमडीए-एमबी -468) और अत्यधिक मेटास्टैटिक कोशिकाओं (एमडीए-एमबी -231) (ए) के बीच काफी भिन्न थी। हालांकि, सामान्य कोशिकाओं (एमसीएफ -10 ए) और कम मेटास्टैटिक कोशिकाओं (एमडीए-एमबी -468) के नाभिक और साइटोप्लाज्म की कठोरता के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। इसी तरह के रुझान परमाणु और साइटोप्लास्टिक चिपचिपाहट (बी) में भी पाए गए थे। इन कोशिकाओं के विश्राम समय ने महत्वपूर्ण यांत्रिक अंतर (सी) प्रदर्शित नहीं किया, हालांकि अन्य सेल प्रकार हो सकते हैं। यह आंकड़ा हू एट अल.3 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

कतरनी परख विधि, जिसमें आसपास के यांत्रिक माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ कोशिकाओं की बातचीत और यांत्रिक तनाव के प्रति उनकी प्रतिक्रियाओं को अनुकरण करने के लिए एक छद्म-मेकेनोबायोलॉजिकल वातावरण स्थापित करना शामिल है, ने सेलुलर यांत्रिक गुणों की एक सूची तैयार की है, जिसके पैटर्न कैंसर कोशिका लाइनों 3,4,5,7,8 के बीच संरक्षित शारीरिक एटिपिया दिखाते हैं।. यह विधि कोशिकाओं के अद्वितीय यांत्रिक गुणों को चिह्नित करने के लिए बुनियादी द्रव यांत्रिकी और भौतिकी की समझ को जोड़ती है और कई मुश्किल-से-इलाज कैंसर 3,4 का पता लगाने के लिए संभावित सामग्री या यांत्रिक बायोमार्कर प्रदानकरती है।

कतरनी परख तकनीक की कुछ सीमाएं हैं। एकल-सेल संस्कृति सुनिश्चित करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, कुछ सेल प्रकारों के त्वरित विकास और प्रसार के कारण, जिससे एकल कोशिकाओं की कल्पना और विश्लेषण करना मुश्किल हो जाता है। सेल लाइन के आधार पर तनाव सहिष्णुता और सेलुलर प्रतिक्रिया एक सेल से दूसरे सेल में विषम हो सकती है, और इस तरह कई कोशिकाओं और समस्या निवारण की आवश्यकता होती है, ताकि कोशिकाओं को संरचनात्मक रूप से विकृत करने के लिए आवश्यक औसत महत्वपूर्ण तनाव निर्धारित किया जा सके, जबकि जीवित कोशिकाओं के रूप में उनके भौतिक गुणों का विश्लेषण करने के लिए उनकी व्यवहार्यता बनाए रखी जा सके।

इस तकनीक के लिए समस्या निवारण में यह निर्धारित करना शामिल है i) ब्याज की सेल लाइनों की वृद्धि और प्रसार दर और ii) कतरनी तनाव से पहले कोशिकाओं को सब्सट्रेट का पालन करने के लिए आवश्यक समय। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले शोधकर्ता प्रमुख साइटोस्केलेटल और अनुयायी प्रोटीन, जैसे एक्टिन, कैडरिन और अन्य फोकल आसंजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति का आकलन करना चुन सकते हैं। तनाव विश्लेषण सॉफ्टवेयर (डीआईसी) के लिए इष्टतम सेल विरूपण को प्रेरित करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण तनाव परिमाण निर्धारित करना भी आवश्यक है।

कतरनी परख तकनीक विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के अद्वितीय यांत्रिक व्यवहार और अंतर्निहित यांत्रिक गुणों का पता लगाने के लिए एक प्रभावी तकनीक के रूप में काम कर सकती है, संभावित रूप से विशिष्ट और संवेदनशील पहचान और निदान में सहायता करती है जो आमतौर पर वर्तमान कैंसर सेल नैदानिक विधियों में उपयोग किए जाने वाले सेल सतह मार्करों से स्वतंत्र होती है। यह मौजूदा यांत्रिक लक्षण वर्णन विधियों पर महत्वपूर्ण सुधार भी प्रदान करता है जो परीक्षण से पहले कोशिका झिल्ली को तोड़ते हैं।

जैविक कोशिकाओं के व्यवहार के लक्षण वर्णन और उनके यांत्रिक गुणों के निर्धारण के लिए दो दशकों से अधिक समय तक अद्वितीय कतरनी परख तकनीक का बड़े पैमाने पर पता लगाया गया है। यह प्रयोगात्मक सेटअप विट्रो में कोशिकाओं पर नियंत्रित द्रव कतरनी तनाव लागू करके शरीर में द्रव कतरनी तनाव के प्रभावों की बारीकी से नकल करता है। सामान्य और कैंसर कोशिकाओं को इन तनावों का अलग-अलग जवाब देने के लिए देखा जाता है, और इस प्रकार यह तकनीक उनके संरचनात्मक और यांत्रिक गुणों और व्यवहारों को अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। इस तकनीक को कोशिकाओं के विस्कोस्टिक गुणों को निर्धारित करने के लिए कई पूर्व अध्ययनों में खोजा गया है, और दिलचस्प बात यह है कि स्वस्थ सामान्य कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं 3,4,9 में महत्वपूर्ण सेलुलर यांत्रिक अंतर देखे गए थे। इसके अलावा, कोशिकाओं के नाभिक और साइटोप्लाज्म के बीच महत्वपूर्ण इंट्रासेल्युलर यांत्रिक अंतर देखे गए। इसलिए इन अद्वितीय यांत्रिक गुणों को नैदानिक सेटिंग्स में विभिन्न कैंसर का पता लगाने के लिए संभावित यांत्रिक बायोमार्कर के रूप में खोजा जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

लेखक वॉर्सेस्टर पॉलिटेक्निक इंस्टीट्यूट में सोबोएजो समूह के पिछले शोधकर्ताओं को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने पहली बार इस तकनीक का नेतृत्व किया: डॉ यिफांग काओ, जिंगजी हू, और वैनेसा उज़ोनवाने। इस काम को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (एनआईएच / एनसीआई के 22 CA258410 एमडी) द्वारा समर्थित किया गया था। आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELL CULTURE
.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate Corning 25-053-ci For cellular detachment from substrate in cell culture
15 mL Centrifuge tubes Falcon by Corning 05-527-90
35 mm Petri dishes Corning 430165
50 mL Centrifuge tubes Falcon by Corning 14-432-22
Centrifuge any For sterile cell culture
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x Corning 10-013-cv Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells
Gloves any For sterile cell culture
Heracell Vios 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 51033770 For Incubation during cell culture
Hood any For sterile cell culture
Micropipette any For sterile cell culture
Micropipette tips any For sterile cell culture
Microscope Leica/any For sterile cell culture
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x Corning 21-040-CM
Pipetman any For sterile cell culture
Pipette tips any For sterile cell culture
Precision GP 10 liquid incubator Thermo Scientific TSGP02
T25 Flask Corning 430639
T75 Flask Corning 430641U
SHEAR ASSAY
100 mL beaker any For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
DMEM Corning
Flow chamber + rubber gasket Glycotech 31-001 Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes)
Hybrid Rheometer HR-2 Discovery Hybrid Rheometer For determination of shear fluid viscosity
Magnetic stir bar any For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
Magnetic stir plate any For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
Methyl cellulose any To increase viscosity of DMEM in flow media
Syringe Pump KD Scientific Geminin 88 plus 788088 For programming fluid infusion and withdrawal
Syringes, tubing, and connectors For shear apparatus setup
SOFTWARE
ABAQUS software Simulia
Digitial Image Correlation software LaVision, Germany DAVIS 10.1.2
Imaging software Leica/any microscope software
MATLAB MATLAB MATLAB_R2020B

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 195
एकल-सेल सामग्री गुणों के निर्धारण के लिए कतरनी परख प्रोटोकॉल
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Holen, L. J., Onwudiwe, K., Najera, J., Zarodniuk, M., Obayemi, J. D., Soboyejo, W. O., Datta, M. Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties. J. Vis. Exp. (195), e65333, doi:10.3791/65333 (2023).

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