Summary
Dit protocol schetst de kwantificering van de mechanische eigenschappen van kankerachtige en niet-kankerachtige cellijnen in vitro. Geconserveerde verschillen in de mechanica van kankercellen en normale cellen kunnen fungeren als een biomarker die implicaties kan hebben voor de prognose en diagnose.
Abstract
Onregelmatige biomechanica is een kenmerk van kankerbiologie die uitgebreid wordt bestudeerd. De mechanische eigenschappen van een cel zijn vergelijkbaar met die van een materiaal. De weerstand van een cel tegen stress en spanning, de ontspanningstijd en de elasticiteit zijn allemaal eigenschappen die kunnen worden afgeleid en vergeleken met andere soorten cellen. Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van kankerachtige (kwaadaardige) versus normale (niet-kwaadaardige) cellen stelt onderzoekers in staat om de biofysische fundamenten van deze ziekte verder te ontdekken. Hoewel bekend is dat de mechanische eigenschappen van kankercellen consequent verschillen van de mechanische eigenschappen van normale cellen, ontbreekt een standaard experimentele procedure om deze eigenschappen af te leiden van cellen in cultuur.
Dit artikel schetst een procedure om de mechanische eigenschappen van afzonderlijke cellen in vitro te kwantificeren met behulp van een vloeistofschuiftest. Het principe achter deze test omvat het toepassen van vloeistofschuifspanning op een enkele cel en het optisch monitoren van de resulterende cellulaire vervorming in de loop van de tijd. Celmechanische eigenschappen worden vervolgens gekarakteriseerd met behulp van digitale beeldcorrelatie (DIC) -analyse en het aanpassen van een geschikt visco-elastisch model aan de experimentele gegevens die uit de DIC-analyse worden gegenereerd. Over het algemeen is het hier beschreven protocol gericht op het bieden van een effectievere en gerichtere methode voor de diagnose van moeilijk te behandelen kankers.
Introduction
Het bestuderen van de biofysische verschillen tussen kankercellen en niet-kankercellen biedt nieuwe diagnostische en therapeutische mogelijkheden1. Inzicht in hoe verschillen in biomechanica / mechanobiologie bijdragen aan tumorprogressie en behandelingsresistentie zal nieuwe wegen onthullen voor gerichte therapie en vroege diagnose2.
Hoewel bekend is dat de mechanische eigenschappen van kankercellen verschillen van normale cellen (bijv. Visco-elasticiteit van het plasmamembraan en de nucleaire envelop)3,4,5, ontbreken robuuste en reproduceerbare methoden voor het meten van deze eigenschappen in levende cellen 6. De shear assay-methode wordt gebruikt om de mechanische eigenschappen van cellen te kwantificeren door afzonderlijke cellen te onderwerpen aan vloeistofschuifspanning en hun individuele reacties en weerstand tegen de toegepaste spanningte analyseren 3,4,5,7,8,9. Hoewel verschillende methoden en technieken zijn gebruikt om de mechanische eigenschappen van afzonderlijke cellen te karakteriseren, hebben deze de neiging om de eigenschappen van het celmateriaal te beïnvloeden door i) het celmembraan te perforeren / beschadigen als gevolg van de inkepingsdiepte, complexe tipgeometrieën of substraatverstijving geassocieerd met atoomkrachtmicroscopie (AFM) 10,11, ii) het induceren van cellulaire fotoschade tijdens optische overvulling 12, 13, of iii) het induceren van complexe stresstoestanden geassocieerd met micropipetaspiratie14,15. Deze externe effecten gaan gepaard met aanzienlijke onzekerheden in de nauwkeurigheid van celvisco-elasticiteitsmetingen 6,16,17.
Om deze beperkingen aan te pakken, biedt de hier beschreven afschuiftestmethode een zeer controleerbare en eenvoudige benadering om de fysiologische stroming in het lichaam te simuleren zonder de eigenschappen van cellulair materiaal in het proces te beïnvloeden. Vloeistofschuifspanningen in deze test vertegenwoordigen mechanische spanningen die door cellen in het lichaam worden ervaren, hetzij door vloeistoffen in het tumorinterstitium of in het bloed tijdens circulatie18,19,20. Verder bevorderen deze vloeistofspanningen verschillende kwaadaardige gedragingen in kankercellen, waaronder progressie, migratie, metastase en celdood 19,21,22,23 die variëren tussen tumorogene en niet-tumorigene cellen. Bovendien stellen de veranderde mechanische kenmerken van kankercellen (d.w.z. ze zijn vaak "zachter" dan normale cellen in hetzelfde orgaan) hen in staat om te blijven bestaan in vijandige tumormicro-omgevingen, omliggende normale weefsels binnen te dringen en uit te zaaien naar verre locaties24,25,26. Door een pseudo-biologische omgeving te creëren waar cellen fysiologische niveaus van vloeistofschuifspanning ervaren, wordt een proces bereikt dat fysiologisch relevant is en niet destructief voor de cel. De cellulaire reacties op deze toegepaste vloeistofschuifspanningen stellen ons in staat om celmechanische eigenschappen te karakteriseren.
Dit artikel biedt een afschuiftestprotocol voor de uitgebreide studie van de mechanische eigenschappen en het gedrag van kankercellen en niet-kankercellen onder toegepaste schuifspanning. Cellen reageren op externe krachten op een elastische en stroperige manier en kunnen daarom worden geïdealiseerd als een visco-elastisch materiaal3. Deze techniek is onderverdeeld in: (i) celcultuur van gedispergeerde afzonderlijke cellen, (ii) gecontroleerde toepassing van vloeistofschuifspanning, (iii) in situ beeldvorming en observatie van cellulair gedrag (inclusief weerstand tegen stress en vervorming), (iv) spanningsanalyse van cellen om de mate van vervorming te bepalen, en (v) karakterisering van de visco-elastische eigenschappen van afzonderlijke cellen. Door deze mechanische eigenschappen en gedragingen te onderzoeken, kan complexe cellulaire mechanobiologie worden gedestilleerd tot kwantificeerbare gegevens. Een protocol dat deze methode beschrijft, maakt het mogelijk om verschillende kwaadaardige en niet-kwaadaardige celtypen te catalogiseren en te vergelijken. Het kwantificeren van deze verschillen heeft het potentieel om diagnostische en therapeutische biomarkers vast te stellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding voor de eencellige afschuiftest
- Celkweek
- Zaai ongeveer 50.000 gesuspendeerde enkele cellen in een petrischaal van 35 mm x 10 mm met 2 ml kweekmedia.
OPMERKING: Vortex de gesuspendeerde cellen voorafgaand aan het zaaien om celaggregaten uit elkaar te halen. - Incubeer de cellen bij 37 °C en laat tussen 10 en 48 uur voor celaanhechting en volledige cytoskeletale eiwitvorming.
OPMERKING: Overweeg de duur van cellulaire hechting, evenals proliferatie en groeisnelheden, om voldoende cellulaire groei en hechting te garanderen terwijl celaggregatie wordt vermeden. Deze parameters variëren per celtype.
- Zaai ongeveer 50.000 gesuspendeerde enkele cellen in een petrischaal van 35 mm x 10 mm met 2 ml kweekmedia.
2. Shear assay experiment
- Bereiding van afschuifassay viskeuze stromingsmedia
- Om een licht viskeus stromingsmedium (0,015-0,02 Pa·s) te garanderen, meet en voeg 0,05 wt% niet-toxische en niet-allergene methylcellulose (4 Pa·s) toe aan de kweekmedia.
- Om een homogeen mengsel te garanderen, verwarmt u de basiscultuurmedia gedurende ~10-20 minuten bij een temperatuur van ~60-70 °C voor met een magnetische roerder/hete plaat. Terwijl u voortdurend de media roert, voegt u de methylcellulose voorzichtig toe, zodat deze zich snel verspreidt, om coagulatie van de methylcellulosedeeltjes te voorkomen. Laat dit proces ~ 15-24 uur doorgaan om een duidelijke oplossing van media + cellulose te garanderen.
OPMERKING: Vermijd overmatige verwarming van de oplossing. - Om de viscositeit van de stroommedia te meten, test u ~ 0,5-1 ml van de representatieve stroommedia met behulp van een rheometer. Bepaal uit de uitlezing de vloeistofviscositeit en gebruik deze waarde om de viscositeit van het afschuifvloeistofmedium (μ) weer te geven om de schuifspanning te berekenen met behulp van vergelijking (2).
- Afschuifapparatuur instellen
- Stel het afschuiftestsysteem in van dubbele spuiten (60 ml of 100 ml) die zijn aangesloten op een programmeerbare spuitpomp voor infusie en opzuigen van de viskeuze kweekmedia (figuur 1).
- Bevestig beide spuiten aan de stroomkamer via 1/16 inch slang- en buisconnectoren.
- Bevestig een rubberen pakking voor een gecontroleerde, uniforme stroom op afzonderlijke cellen langs het stroompad (figuur 1). De rubberen pakking is verkrijgbaar in verschillende maten, afhankelijk van het te bereiken stromingsprofiel (laminair of turbulent) en het gewenste waarnemingsgebied (bijv. lengte van 22,5 mm, breedte van 2,5 mm en hoogte van 0,254 mm) (figuur 1).
- Programmeer de pomp om een bepaald volume vloeistof (bijv. 60 ml) met een bepaalde snelheid (bijv. 1 ml / min) te injecteren en op te zuigen en selecteer de bijbehorende spuiten (bijv. 60 ml).
OPMERKING: Houd rekening met de maximale infusie- en opzuigvolumevoorinstellingen om vastlopen of storingen te voorkomen. Gebruik vergelijking (2) voor de berekening van de vereiste pompafschuifsnelheid (ervan uitgaande dat de vereiste spanning en viscositeit bekend zijn).
- Pre-shear setup
- Vul de spuit met de voorbereide viskeuze stroommedia.
- Bevestig de spuit, gevuld met 60 of 100 ml (of indien nodig) viskeuze stroommedia, en een lege spuit van 60 ml op hun respectieve locaties op de programmeerbare spuitpomp. Verbind via slang- en buisconnectoren beide spuiten met de stroomkamer.
- Om een eenvoudige identificatie van afzonderlijke cellen en een bevestigde verbinding tussen de stroomkamer en de petrischaal te garanderen, bevestigt u de rubberen pakking aan de stroomkamer.
- Zuig de celkweekmedia op uit de petrischaal met de cellen van belang.
- Was dode cellen en losjes gehechte cellen af met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Zuig de PBS op.
- Plaats en bevestig de stroomkamer en rubberen pakking (~ 34 mm x 9 mm) op de petrischaal (35 mm x 10 mm) met de aangesloten cellen.
- Plaats de aangebrachte microfluïdische stroomkamer + cellen op een gekweekte schaal op een omgekeerde microscoop, met een microscoopobjectief dat hoog genoeg is om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen met hoge pixelwaarden (meestal tussen 40x en 63x vergroting) en een beeldscherm.
- Selecteer de optie live beeld (time-lapse op sommige software) in de microscoopsoftware op de beeldscherm. Zorg ervoor dat de microscoopsoftware op de pc een t-functionaliteit (time-lapse) heeft of video-opnamen kan maken.
- Focus het microscoopobjectief en zorg voor voldoende contrast en duidelijke celranden. Dit is nodig voor de beeldanalyse post-shear. Verplaats het microscoopstadium om ervoor te zorgen dat de cellen duidelijk zichtbaar zijn op het beeldscherm en live beelden zijn.
- Selecteer een cel of meerdere afzonderlijke cellen binnen het beeldvormings-/stroompad van de aangebrachte stroomkamer + petrischaal (het gebied/pad dat ontstaat door de pakking op de stroomkamer aan te sluiten).
- Afschuiving en beeldvorming
- Om een continue uniforme stroom te behouden, selecteert u vergelijkbare infusie- en opzuigsnelheden en zorgt u voor laminaire stroming van de vloeistof, meestal tussen 1 ml / min en 5 ml / min. Voor lage laminaire stromingsregimes, zorg voor een Reynold's aantal Re < 100.
- Klik op Uitvoeren op de afschuifpomp om de schuifvloeistof (voorbereide viskeuze media) continu te injecteren en op te zuigen. Zorg ervoor dat er geen bubbels zijn tijdens vloeistofinfusie, omdat dit externe niet-geregistreerde stress op de cellen kan veroorzaken.
- Begin met het opnemen van een video door op opnemen in de microscoopsoftware te klikken voordat de geïnfundeerde schuifvloeistof contact maakt met de cel (en) van belang onder de microscoop.
- Blijf opnemen gedurende 7 minuten, of voor de gewenste duur van stressblootstelling, of totdat de cel (en) van belang de bodem van de schaal afscheert. Klik op stoppen met opnemen op de microscoopsoftware wanneer de run naar wens is voltooid.
- Sla de opname op en pak ze uit als .tiff bestanden. Extraheer bij voorkeur afbeeldingen met 1 frame per seconde voor eenvoudige analyse.
3. Gegevensverwerking
- Procedure voor digitale beeldcorrelatie (beeldanalyse)
- Als de opname van de microscoop is geëxtraheerd als een videobestand, converteert u deze naar beeldframes (bij voorkeur .tiff bestandsindeling).
- Importeer de beelden die zijn afgeleid van de afschuiftestopname naar Davis 10.1.2-software (DIC-software) om de beweging van de natuurlijk patroonstructuren van de cel te volgen door elk blok pixel (subset) van het referentiebeeld in de respectieve nieuwe afbeeldingen (vervormde afbeeldingen) te lokaliseren (figuur 2).
- Gebruik voor een geoptimaliseerde correlatie een subsetgrootte van 31 x 31 pixels, een stapgrootte (vervormingsafstand van elke subset) van 20 pixels en de som van de differentiaaltrackoptie , die de vervorming van een nieuwe afbeelding ten opzichte van de laatste afbeelding bijhoudt. Het resultaat van deze correlatie is een rektijdplot (figuur 3) die kan worden geëxporteerd als een .csv-bestand voor verdere analyse in MATLAB.
- Breng het interessegebied voor een gekozen enkele cel in kaart. Selecteer willekeurige punten in de toegewezen cel om vervorming bij te houden. Voor een onregelmatige vorm, zoals de cel, gebruikt u een veelhoekmasker om de geometrie van de cel in kaart te brengen.
- Kies na het in kaart brengen specifieke punten op de cel (kern of cytoplasma) die moeten worden geanalyseerd door op spanningsmeter toevoegen te klikken en individuele rekstrookjes uit te tekenen op punten binnen de gedefinieerde cellulaire grens.
- Klik op Uitvoeren om de stamverwerking te starten en stam- versus tijdgegevens te verkrijgen.
- Dubbelklik (of klik met de rechtermuisknop) op de gegenereerde stamtijdplot en selecteer gegevens exporteren als spreadsheet.
4. Karakterisering van mechanische eigenschappen
- Visco-elastische eigenschapskarakterisering
- Sla het .csv bestand met de stamtijdgegevens van de DIC-software op in een aparte map voor eenvoudige leesbaarheid door MATLAB.
- Voer MATLAB uit en klik op het editortabblad om een editorpagina te openen om een code te schrijven die de spreadsheet cel voor cel leest.
- Wijzig het MATLAB-pad (het mappad dat toegang heeft tot het gewenste bestand) om toegang te krijgen tot de map met de te analyseren gegevens, bijvoorbeeld Gebruikers / Gebruikersnaam / Bureaublad / gegevens.
- Open op de MATLAB-editorpagina de spreadsheetgegevens met behulp van de aangepaste code. Bijvoorbeeld: a1= xlsread('data','run1','A4:A183'), waarbij a1 de identifier vertegenwoordigt, xlsread de MATLAB-functie die het .csv bestand leest (in dit geval als spreadsheet), data de bestandsnaam is, run1 de bladnaam en A4:A183 het bereik van gegevens is dat van belang is in cel A van de spreadsheetgegevens die moeten worden geanalyseerd. Voor een volledige pasvorm analyseer je x en y (respectievelijk tijd en spanning). Bijvoorbeeld:
a1=xlsread('data','run1','A4:A183');
b1=xlsread('data','run1','B4:B183');
a1 = x (tijd) en b1 = y (spanning). - Klik in MATLAB op Apps | Curve Fitter Aangepaste vergelijking. Wis de representatieve aangepaste vergelijking en voer de visco-elastische modelvergelijking [vergelijking (1)] in, waarbij ε de x-variabele vertegenwoordigt en t de y-variabele.
(1)
Hier vertegenwoordigt ε de spanning, σ de schuifspanning, η1 de viscositeit vertegenwoordigt, E de elasticiteit vertegenwoordigt, t de tijd vertegenwoordigt en τ de ontspanningstijd vertegenwoordigt, die de maximale tijd karakteriseert die nodig is voor de cel om terug te keren naar zijn oorspronkelijke vorm na primaire vervorming. Het wordt uitgedrukt als τ =
, waarbij η2 de secundaire viscositeitsterm is voor de tweede dashpot (figuur 4). - Wijs nieuwe variabelen opnieuw toe aan de visco-elastische parameters binnen de aangepaste vergelijkingsinterface. (ε, η1, E, σ, t en τ = ) staat voor respectievelijk (x, a, b, K, y en c). Hier zijn x en y respectievelijk de onafhankelijke en afhankelijke variabelen. Schuifspanning (σ) kan worden bepaald met behulp van vergelijking (2):
(2)
Hier vertegenwoordigt μ de viscositeit van het afschuifvloeistofmedium, Q is het pompdebiet en b en h zijn de breedte en hoogte van het stroomkanaal weergegeven in respectievelijk figuur 1C. - Klik op Gegevens selecteren om de tijd (a1) en spanning (b1) voor elke set gegevens te selecteren.
- Zorg ervoor dat het selectievakje Automatisch aanpassen is ingeschakeld. Hiermee wordt de fit automatisch uitgevoerd wanneer gegevens (x en y) zijn geselecteerd.
- Selecteer de montagemethoden om de randvoorwaarden aan te scherpen. Klik op Geavanceerde opties onder de categorie Methoden en selecteer Niet-lineaire kleinste kwadraten. Selecteer onder Robuust de optie Uit en onder Algoritme de optie Vertrouwensregio. Laat elke andere parameter zoals deze is.
- De nieuwe variabelen na het passen (a, b en c) vertegenwoordigen respectievelijk de visco-elastische eigenschappen, viscositeit, elasticiteit en relaxatietijd (η1, E, EQUAT) van de cel (figuur 5).
- Zoek naar een hoge R-kwadraatwaarde van de pasvorm (R2 > 80%) om ervoor te zorgen dat de gegevensuitvoer kan worden beschouwd als een echte pasvorm van het visco-elastische model (figuur 3)
(1)
, waarbij η2 de secundaire viscositeitsterm is voor de tweede dashpot (figuur 4).
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het afschuiftestprotocol in combinatie met deformatieanalyse met behulp van DIC en een visco-elastisch model is succesvol in het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van een enkele cel in vitro. Deze methode is getest op menselijke en muizencellijnen, waaronder normale menselijke borstcellen (MCF-10A)3,4,9, minder gemetastaseerde triple-negatieve borstkankercellen (MDA-MB-468)3, triple-negatieve borstkankercellen (MDA-MB-231)3, menselijke osteosarcoomcellen 7,8 en meest recent glioblastoomcellen (figuur 3)). DIC van beeldframes geëxtraheerd uit afschuifassayopnamen is succesvol in het produceren van rektijdgegevens die compatibel zijn met de kruipspanningsrespons (figuur 3), die geschikt is voor een visco-elastisch model (figuur 4). Met behulp van MATLAB kan het visco-elastische model worden gebruikt om de rektijdgegevens aan te passen om de visco-elastische eigenschappen van de verschillende cellen te verkrijgen.
Figuur 5 beschrijft het scala aan eigenschappen die eerder zijn bestudeerd met behulp van de shear assay-techniek. Extra mechanische eigenschappen kunnen met behulp van deze methode worden gekarakteriseerd, afhankelijk van de parameter van belang. De resultaten van deze studies met behulp van de shear assay-techniek toonden aan dat kankercellen over het algemeen mechanisch meer compliant en minder viskeus waren dan normale cellen (figuur 6)3,4,7,8. Figuur 6A-C beschrijft de mechanische eigenschappen van normale borstcellen (MCF-10A) en triple-negatieve borstkankercellen (minder gemetastaseerde MDA-MB-468 en sterk gemetastaseerde MDA-MB-231). In figuur 6A,B kunnen de stijfheid en viscositeit van de cellen worden waargenomen om af te nemen met verhoogde kankerprogressie, van een normale celtoestand naar een licht gemetastaseerde toestand en naar een sterk gemetastaseerde toestand. Statistisch significante variaties werden gevonden tussen de normale MCF-10A-cellen en sterk gemetastaseerde MDA-MB-231-cellen, en tussen de minder gemetastaseerde MDA-MB-468-cellen en de sterk gemetastaseerde MDA-MB-231-cellen. Er waren geen significante variaties tussen de normale MCF-10A en de minder gemetastaseerde MDA-MB-468 cellen. Figuur 6C toont de relaxatietijd voor deze celtypen, die geen significante variaties vertoonde; Dit kan variëren met andere soorten cellen.
Figuur 1: Shear assay experimentele opstelling. De methode omvat het gebruik van (A) een programmeerbare spuitpomp om zowel viskeuze stroommedia in en uit (B) een stroomkamer te inbrengen als op te zuigen met een constante afschuifsnelheid. (C) Een rubberen pakking met een rechthoekig venster (afmetingen: 20,5 mm x 2,5 mm x 0,254 mm) en vacuümafzuiging wordt in een petrischaal van 35 mm x 10 mm geplaatst met gekweekte cellen die van belang zijn om een stromingsveld te creëren. (D) De cellen worden onderworpen aan stroming binnen het gevestigde veld en worden vervormd door vloeistofschuifspanning, die wordt afgeleid via (E) een vergelijking voor wandschuifspanning. (F) Een cel van belang binnen het stromingsveld wordt afgebeeld met behulp van een microscoop met een vergroting van 63x en real-time vervorming wordt vastgelegd en geregistreerd met behulp van de microscoopsoftware op de monitor. De geïnduceerde vloeistofschuifspanning wordt samen met de afgebeelde vervorming gebruikt om de mechanische eigenschappen van de enkele cel te kwantificeren. Dit cijfer is aangepast van Hu et al.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Spanningsanalyse met behulp van digitale beeldcorrelatie. Beelden geëxtraheerd uit een opname van de afschuiftest tonen de maximale schuifspanning die individuele cellen tijdens het experiment ervaren. DIC volgt veranderingen in de natuurlijke patroonstructuur van de cellen door een blok pixels-subset binnen elk frame of afbeelding te lokaliseren en te volgen. (A) Het beeld van de cel vóór de DIC-analyse. (B) Het maskeren van de cellen, het selecteren van het interessegebied en het zaaien van de cellen om het volgen van vervorming te vergemakkelijken. (C) Het begin van vervorming. D) opbouw van vervorming. (E) Toenemende vervorming in de loop van de tijd. (F) Toepassing van rekstrookjes om de spanning tijdens de vervorming te kwantificeren. Afkorting: DIC = digitale beeldcorrelatie. Dit cijfer is aangepast van Hu et al.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve steekproef van stam versus tijd gegevens van glioblastoom cellen en wiskundige modellering van het visco-elastische model . (A) De stam versus tijd gegevens verkregen door DIC tonen verschillende kruipregimes (primair, secundair en tertiair) van de cel. (B) De stam versus tijd gegevens worden geëxporteerd naar MATLAB voor kwantificering van de mechanische eigenschappen van de individuele cel. Afkorting: DIC = digitale beeldcorrelatie. Dit cijfer is aangepast van Hu et al.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Visco-elastisch model voor de bepaling van visco-elastische eigenschappen. Een gegeneraliseerd Maxwell-model met drie parameters, dat bestaat uit Kelvin (dashpot) en Voigt (dashpot + veer) modellen die in serie zijn verbonden, voor de karakterisering van het visco-elastische gedrag van cellen. Het resultaat van de visco-elastische modellering met behulp van de afschuiftechniek is de elasticiteit, viscositeit en ontspanningstijd van de cel. Dit cijfer is aangepast van Hu et al.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Grafische weergave van de soorten materiaaleigenschappen van cellen die kunnen worden geëxtraheerd uit de shear assay-techniek, waaronder stijfheid, viscositeit, kruip en ontspanningstijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Materiaaleigenschappen van cellen verkregen uit de shear assay techniek. Celstijfheid was significant verschillend tussen de kern en het cytoplasma van normale borstcellen (MCF-10A) en sterk gemetastaseerde borstcellen (MDA-MB-231), en tussen minder gemetastaseerde cellen (MDA-MB-468) en sterk gemetastaseerde cellen (MDA-MB-231) (A). Er was echter geen significant verschil tussen de stijfheid van de kern en het cytoplasma van normale cellen (MCF-10A) en minder gemetastaseerde cellen (MDA-MB-468). Vergelijkbare trends werden ook gevonden in nucleaire en cytoplastische viscositeiten (B). De relaxatietijden van deze cellen vertoonden geen significante mechanische verschillen (C), hoewel andere celtypen dat wel kunnen. Dit cijfer is aangepast van Hu et al.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De shear assay-methode, die het opzetten van een pseudo-mechanobiologische omgeving omvat om de interactie van cellen met de omringende mechanische micro-omgeving en hun reacties op mechanische spanningen te simuleren, heeft een catalogus van cellulaire mechanische eigenschappen geproduceerd, waarvan de patronen geconserveerde fysieke atypie tonen onder kankerachtige cellijnen 3,4,5,7,8 . Deze methode combineert een goed begrip van de fundamentele vloeistofmechanica en fysica om unieke mechanische eigenschappen van cellen te karakteriseren en biedt potentiële materiële of mechanische biomarkers voor de detectie van verschillende moeilijk te behandelen kankers 3,4.
De shear assay techniek heeft bepaalde beperkingen. Het waarborgen van een eencellige cultuur kan een uitdaging zijn, vanwege de snelle groei en proliferatie van bepaalde celtypen, waardoor het moeilijk is om afzonderlijke cellen te visualiseren en te analyseren. Stresstolerantie en de cellulaire respons kunnen heterogeen zijn van de ene cel naar de andere, afhankelijk van de cellijn, en als zodanig vereist veel cellen en probleemoplossing, om de gemiddelde kritische stress te bepalen die nodig is om de cellen structureel te vervormen met behoud van hun levensvatbaarheid om hun materiële eigenschappen als levende cellen te analyseren.
Probleemoplossing voor deze techniek omvat het bepalen van i) de groei- en proliferatiesnelheden van cellijnen van belang en ii) de tijd die cellen nodig hebben om zich aan het substraat te hechten voorafgaand aan schuifspanning. Onderzoekers die dit protocol gebruiken, kunnen ervoor kiezen om de expressie van belangrijke cytoskeletale en adherente eiwitten te beoordelen, zoals actine, cadherinen en andere focale adhesie-eiwitten. Het is ook noodzakelijk om de kritische spanningsgrootheden te bepalen die nodig zijn om de optimale celvervorming voor de stamanalysesoftware (DIC) te induceren.
De shear assay-techniek kan dienen als een effectieve techniek om het unieke mechanische gedrag en de inherente mechanische eigenschappen van verschillende soorten cellen te onderzoeken, mogelijk helpend bij specifieke en gevoelige identificatie en diagnoses die onafhankelijk zijn van celoppervlakmarkers die doorgaans worden gebruikt in de huidige diagnostische methoden voor kankercellen. Het biedt ook aanzienlijke verbeteringen ten opzichte van bestaande mechanische karakteriseringsmethoden die het celmembraan scheuren voorafgaand aan het testen.
De unieke shear assay-techniek is al meer dan twee decennia uitgebreid onderzocht voor de karakterisering van het gedrag van biologische cellen en de bepaling van hun mechanische eigenschappen. Deze experimentele opstelling bootst de effecten van vloeistofschuifspanningen in het lichaam nauw na door in vitro gecontroleerde vloeistofschuifspanning op cellen toe te passen. Normale en kankercellen worden waargenomen om anders op deze spanningen te reageren, en dus biedt deze techniek inzicht in hun structurele en mechanische eigenschappen en gedrag. Deze techniek is onderzocht in verschillende eerdere studies om de visco-elastische eigenschappen van cellen te bepalen, en interessant genoeg werden significante cellulaire mechanische verschillen waargenomen in gezonde normale cellen en kankercellen 3,4,9. Verder werden significante intracellulaire mechanische verschillen waargenomen tussen de kern en het cytoplasma van cellen. Deze unieke mechanische eigenschappen kunnen daarom worden onderzocht als potentiële mechanische biomarkers voor de detectie van verschillende kankers in klinische omgevingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs bedanken eerdere onderzoekers van de Soboyejo-groep aan het Worcester Polytechnic Institute die voor het eerst pionierden met deze techniek: Drs. Yifang Cao, Jingjie Hu en Vanessa Uzonwanne. Dit werk werd ondersteund door het National Cancer Institute (NIH / NCI K22 CA258410 tot MD). Figuren werden gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| Centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| Gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| Micropipette | any | For sterile cell culture | |
| Micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| Pipetman | any | For sterile cell culture | |
| Pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| Magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| Magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| Methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| Syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
- Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).
- Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I.
- Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).
- Onwudiwe, K., et al. Investigation of creep properties and the cytoskeletal structures of non-tumorigenic breast cells and triple-negative breast cancer cells. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 110 (5), 1004-1020 (2022).
- Ani, C. J., et al. A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 91, 76-90 (2019).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomaterialia. 3 (4), 413-438 (2007).
- Cao, Y., et al. Investigation of the viscoelasticity of human osteosarcoma cells using a shear assay method. Journal of Materials Research. 21 (8), 1922-1930 (2006).
- Cao, Y. On the measurement of human osteosarcoma cell elastic modulus using shear assay experiments. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 18 (1), 103-109 (2007).
- Onwudiwe, K., et al. Actin cytoskeletal structure and the statistical variations of the mechanical properties of non-tumorigenic breast and triple-negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 119, 104505 (2021).
- Kirmizis, D., Logothetidis, S. Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics. International Journal of Nanomedicine. 5, 137-145 (2010).
- Haase, K., Pelling, A. E. Investigating cell mechanics with atomic force microscopy. Journal of the Royal Society. Interface. 12 (104), 20140970 (2015).
- Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society. Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
- Peterman, E. J. G., Gittes, F., Schmidt, C. F.
- Hochmuth, R. M.
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and corticcal tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophysical Journal. 56 (1), 151-160 (1989).
- Van Vliet, K. J., Bao, G., Suresh, S. The biomechanics toolbox: experimental approaches for living cells and biomolecules. Acta Materialia. 51 (19), 5881-5905 (2003).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
- Choi, H. Y., et al. Hydrodynamic shear stress promotes epithelial-mesenchymal transition by downregulating ERK and GSK3beta activities. Breast Cancer Research. 21 (1), 6 (2019).
- Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 17 (2018).
- Onwudiwe, K., Najera, J., Siri, S., Datta, M. Do tumor mechanical stresses promote cancer immune escape. Cells. 11 (23), 3840 (2022).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Mao, B. H., Nguyen Thi, K. M., Tang, M. J., Kamm, R. D., Tu, T. Y. The interface stiffness and topographic feature dictate interfacial invasiveness of cancer spheroids. Biofabrication. 15 (1), (2023).
- Kashani, A. S., Packirisamy, M. Cancer cells optimize elasticity for efficient migration. Royal Society Open Science. 7 (10), 200747 (2020).
- Riehl, B. D., Kim, E., Bouzid, T., Lim, J. Y. The role of microenvironmental cues and mechanical loading milieus in breast cancer cell progression and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 608526 (2021).
