Summary
Este protocolo descreve a quantificação das propriedades mecânicas de linhagens celulares cancerosas e não cancerosas in vitro. Diferenças conservadas na mecânica de células cancerosas e normais podem atuar como um biomarcador que pode ter implicações no prognóstico e diagnóstico.
Abstract
A biomecânica irregular é uma marca da biologia do câncer sujeita a extenso estudo. As propriedades mecânicas de uma célula são semelhantes às de um material. A resistência de uma célula ao estresse e à tensão, seu tempo de relaxamento e sua elasticidade são propriedades que podem ser derivadas e comparadas a outros tipos de células. Quantificar as propriedades mecânicas de células cancerosas (malignas) versus normais (não malignas) permite que os pesquisadores descubram ainda mais os fundamentos biofísicos desta doença. Embora as propriedades mecânicas das células cancerosas sejam conhecidas por diferir consistentemente das propriedades mecânicas das células normais, um procedimento experimental padrão para deduzir essas propriedades das células em cultura está faltando.
Este trabalho descreve um procedimento para quantificar as propriedades mecânicas de células isoladas in vitro usando um ensaio de cisalhamento fluido. O princípio por trás deste ensaio envolve a aplicação de tensão de cisalhamento de fluido em uma única célula e o monitoramento óptico da deformação celular resultante ao longo do tempo. As propriedades mecânicas celulares são posteriormente caracterizadas usando a análise de correlação digital de imagem (DIC) e ajustando um modelo viscoelástico apropriado aos dados experimentais gerados a partir da análise DIC. De modo geral, o protocolo aqui delineado visa fornecer um método mais eficaz e direcionado para o diagnóstico de cânceres de difícil tratamento.
Introduction
O estudo das diferenças biofísicas entre células cancerosas e não cancerosas permite novas oportunidades diagnósticas e terapêuticas1. A compreensão de como as diferenças na biomecânica/mecanobiologia contribuem para a progressão tumoral e resistência ao tratamento revelará novos caminhos para a terapia-alvo e o diagnóstico precoce2.
Embora se saiba que as propriedades mecânicas das células cancerosas diferem das células normais (por exemplo, viscoelasticidade da membrana plasmática e do envelope nuclear)3,4,5, faltam métodos robustos e reprodutíveis para medir essas propriedades em células vivas6. O método de ensaio de cisalhamento é utilizado para quantificar as propriedades mecânicas de células, submetendo células isoladas à tensão de cisalhamento fluida e analisando suas respostas individuais e resistência à tensão aplicada 3,4,5,7,8,9. Embora vários métodos e técnicas tenham sido utilizados para caracterizar as propriedades mecânicas de células isoladas, estes tendem a afetar as propriedades do material celular por i) perfurar/danificar a membrana celular devido à profundidade de indentação, geometrias complexas da ponta ou enrijecimento do substrato associado à microscopia de força atômica (AFM)10,11, ii) induzir fotodano celular durante o aprisionamento óptico12, 13, ou iii) indução de estados complexos de estresse associados à aspiração por micropipetas14,15. Esses efeitos externos estão associados a incertezas significativas na acurácia das medidas de viscoelasticidade celular 6,16,17.
Para resolver essas limitações, o método de ensaio de cisalhamento descrito aqui fornece uma abordagem altamente controlável e simples para simular o fluxo fisiológico no corpo sem afetar as propriedades do material celular no processo. As tensões de cisalhamento de fluidos neste ensaio representam tensões mecânicas experimentadas pelas células do corpo, seja por fluidos dentro do interstício tumoral ou no sangue durante a circulação18,19,20. Além disso, esses estresses fluidos promovem vários comportamentos malignos nas células cancerosas, incluindo progressão, migração, metástase e morte celular 19,21,22,23, que variam entre células tumorigênicas e não tumorigênicas. Além disso, as características mecânicas alteradas das células cancerosas (isto é, muitas vezes são mais "moles" do que as células normais encontradas dentro do mesmo órgão) permitem que elas persistam em microambientes tumorais hostis, invadam tecidos normais circundantes e metastatizem para locais distantes24,25,26. Ao criar um ambiente pseudobiológico onde as células experimentam níveis fisiológicos de tensão de cisalhamento de fluidos, um processo que é fisiologicamente relevante e não destrutivo para a célula é alcançado. As respostas celulares a estas tensões de cisalhamento de fluidos aplicadas permitem caracterizar as propriedades mecânicas celulares.
Este trabalho fornece um protocolo de ensaio de cisalhamento para o estudo extensivo das propriedades mecânicas e comportamento de células cancerosas e não cancerosas sob estresse de cisalhamento aplicado. As células respondem às forças externas de forma elástica e viscosa, podendo, portanto, ser idealizadas como um material viscoelástico3. Esta técnica é categorizada em: (i) cultura celular de células isoladas dispersas, (ii) aplicação controlada de tensão de cisalhamento fluido, (iii) imagem in situ e observação do comportamento celular (incluindo resistência ao estresse e deformação), (iv) análise de deformação de células para determinar a extensão da deformação e (v) caracterização das propriedades viscoelásticas de células isoladas. Ao interrogar essas propriedades e comportamentos mecânicos, mecanobiologia celular complexa pode ser destilada para dados quantificáveis. Um protocolo delineando este método permite a catalogação e comparação entre vários tipos de células malignas e não malignas. A quantificação dessas diferenças tem o potencial de estabelecer biomarcadores diagnósticos e terapêuticos.
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Protocol
1. Preparação para o ensaio de cisalhamento unicelular
- Cultura celular
- Semeando aproximadamente 50.000 células isoladas suspensas em uma placa de Petri de 35 mm x 10 mm contendo 2 mL de meio de cultura.
NOTA: Vórtice as células suspensas antes da semeadura para quebrar os agregados celulares. - Incubar as células a 37 °C e permitir entre 10 a 48 h para a ligação celular e formação completa de proteínas do citoesqueleto.
NOTA: Considere a duração da ligação celular, bem como as taxas de proliferação e crescimento, para garantir o crescimento e a ligação celular adequados, evitando a agregação celular. Esses parâmetros variam de acordo com o tipo de célula.
- Semeando aproximadamente 50.000 células isoladas suspensas em uma placa de Petri de 35 mm x 10 mm contendo 2 mL de meio de cultura.
2. Experimento de ensaio de cisalhamento
- Preparação de meios viscosos de fluxo para ensaio de cisalhamento
- Para garantir um meio de fluxo ligeiramente viscoso (0,015-0,02 Pa·s), medir e adicionar 0,05% em peso de metilcelulose não tóxica e não alergênica (4 Pa·s) aos meios de cultura.
- Para garantir uma mistura homogênea, pré-aqueça o meio de cultura base por ~10-20 min a uma temperatura de ~60-70 °C com um agitador magnético/placa quente. Ao agitar continuamente o meio, adicione suavemente a metilcelulose de tal forma que ela se disperse rapidamente, para evitar a coagulação das partículas de metilcelulose. Permita que este processo continue por ~15-24 h para garantir uma solução clara de mídia + celulose.
NOTA: Evite o aquecimento excessivo da solução. - Para medir a viscosidade do meio de fluxo, teste ~0,5-1 mL do meio de fluxo representativo usando um reômetro. A partir da leitura, determinar a viscosidade do fluido e utilizar este valor para representar a viscosidade do meio fluido de cisalhamento (μ) para calcular a tensão de cisalhamento usando a equação (2).
- Configuração do aparelho de cisalhamento
- Instalar o sistema de ensaio de cisalhamento de seringas duplas (60 mL ou 100 mL) conectadas a uma bomba de seringa programável para infusão e retirada do meio de cultura viscoso (Figura 1).
- Conecte ambas as seringas à câmara de fluxo por meio de conectores de tubulação e tubulação de 1/16 polegada.
- Fixe uma junta de borracha para fornecer um fluxo controlado e uniforme em células individuais ao longo do caminho de fluxo (Figura 1). A junta de borracha tem tamanhos diferentes dependendo do perfil de fluxo a ser atingido (laminar ou turbulento) e da área de observação desejada (por exemplo, comprimento de 22,5 mm, largura de 2,5 mm e altura de 0,254 mm) (Figura 1).
- Programe a bomba para infundir e retirar um determinado volume de líquido (por exemplo, 60 mL) a uma taxa designada (por exemplo, 1 mL/min) e selecione as seringas correspondentes (por exemplo, 60 mL).
NOTA: Considere as predefinições de volume máximo de perfusão e retirada para evitar emperramento ou mau funcionamento. Use a equação (2) para o cálculo da taxa de cisalhamento da bomba requerida (supondo que a tensão e a viscosidade necessárias sejam conhecidas).
- Configuração pré-cisalhamento
- Encha a seringa com o meio de fluxo viscoso preparado.
- Conecte a seringa, preenchida com 60 ou 100 mL (ou conforme necessário) de meio de fluxo viscoso, e uma seringa vazia de 60 mL em seus respectivos locais na bomba de seringa programável. Através de conectores de tubulação e tubulação, conecte ambas as seringas à câmara de fluxo.
- Para garantir a fácil identificação de células individuais e uma conexão fixa entre a câmara de fluxo e a placa de Petri, conecte a junta de borracha à câmara de fluxo.
- Aspirar o meio de cultura celular da placa de Petri contendo as células de interesse.
- Lave as células mortas e as células frouxamente ligadas usando solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Aspirar o PBS.
- Insira e fixe a câmara de fluxo e a junta de borracha (~34 mm x 9 mm) na placa de Petri (35 mm x 10 mm) que contém as células conectadas.
- Coloque a câmara de fluxo microfluídica encaixada + células em uma placa cultivada em um microscópio invertido, com uma objetiva de microscópio alta o suficiente para obter imagens de alta qualidade com altos valores de pixels (geralmente entre 40x e 63x de aumento) e um monitor de exibição.
- Selecione a opção de imagem ao vivo (time-lapse em algum software) no software do microscópio no monitor de exibição. Verifique se o software do microscópio no PC tem uma funcionalidade t (time-lapse) ou pode fazer gravações de vídeo.
- Focalizar a objetiva do microscópio, garantindo contraste adequado e bordas celulares distintas. Isso é necessário para a análise da imagem pós-cisalhamento. Mova o estágio do microscópio para garantir que as células sejam claramente visíveis no monitor de exibição e sejam imagens ao vivo.
- Selecione uma célula ou várias células distintas dentro do caminho de imagem/fluxo da câmara de fluxo encaixada + placa de Petri (a área/caminho criado pelo encaixe da junta na câmara de fluxo).
- Cisalhamento e geração de imagens
- Para manter um fluxo uniforme contínuo, selecione taxas de infusão e retirada semelhantes e garanta o fluxo laminar do fluido, geralmente entre 1 mL/min e 5 mL/min. Para regimes de baixo fluxo laminar, garanta um número de Re < 100 de Reynold.
- Clique em Executar na bomba de cisalhamento para injetar e retirar o fluido de cisalhamento (meio viscoso preparado) a uma taxa contínua. Certifique-se de que não haja bolhas durante a infusão de fluidos, pois isso pode introduzir estresse externo não contabilizado nas células.
- Comece a gravar um vídeo clicando em gravar no software do microscópio antes que o fluido de cisalhamento infundido entre em contato com a(s) célula(s) de interesse sob o microscópio.
- Continue a gravar por 7 min, ou pela duração desejada da exposição ao estresse, ou até que a(s) célula(s) de interesse se desprenda do fundo do prato. Clique em parar a gravação no software do microscópio quando a execução for concluída conforme desejado.
- Salve a gravação e extraia como .tiff arquivos. De preferência, extraia imagens a 1 quadro por segundo para facilitar a análise.
3. Processamento de dados
- Procedimento de correlação de imagem digital (análise de imagem)
- Se a gravação do microscópio foi extraída como um arquivo de vídeo, converta-a em quadros de imagem (de preferência .tiff formato de arquivo).
- Importar as imagens derivadas da gravação do ensaio de cisalhamento para o software Davis 10.1.2 (software DIC) para rastrear o movimento das estruturas naturalmente padronizadas da célula, localizando cada bloco de pixel (subconjunto) da imagem de referência nas respectivas novas imagens (imagens deformadas) (Figura 2).
- Para uma correlação otimizada, utilize um tamanho de subconjunto de 31 x 31 pixels, um tamanho de passo (distância de deformação de cada subconjunto) de 20 pixels e a soma da opção de trilha diferencial , que rastreia a deformação de uma nova imagem em relação à última imagem. O resultado dessa correlação é um gráfico de tempo de deformação (Figura 3) que pode ser exportado como um arquivo .csv para análise posterior no MATLAB.
- Mapeie a região de interesse para uma única célula escolhida. Selecione pontos arbitrários dentro da célula mapeada para rastrear a deformação. Para uma forma irregular, como a célula, use uma máscara de polígono para mapear a geometria da célula.
- Após o mapeamento, escolha pontos específicos na célula (núcleo ou citoplasma) a serem analisados, clicando em adicionar extensômetro e desenhando extensômetros individuais em pontos dentro do limite celular definido.
- Clique em Executar para iniciar o processamento da tensão e obter dados de tensão versus tempo.
- Clique duas vezes (ou clique com o botão direito do mouse) no gráfico de tempo de tensão gerado e selecione exportar dados como uma planilha.
4. Caracterização das propriedades mecânicas
- Caracterização das propriedades viscoelásticas
- Salve o arquivo .csv que contém os dados de tempo de tensão do software DIC em uma pasta separada para facilitar a leitura pelo MATLAB.
- Execute o MATLAB e clique na guia do editor para abrir uma página do editor para escrever um código que leia a planilha, célula por célula.
- Altere o caminho do MATLAB (o caminho da pasta que acessa o arquivo de interesse) para acessar a pasta que contém os dados a serem analisados, por exemplo, Usuários/Nome de usuário/Área de trabalho/dados.
- Na página do editor MATLAB, acesse os dados da planilha usando o código personalizado. Por exemplo: a1= xlsread('data','run1','A4:A183'), onde a1 representa o identificador, xlsread é a função MATLAB que lê o arquivo .csv (neste caso, como uma planilha), data é o nome do arquivo, run1 é o nome da planilha e A4:A183 é o intervalo de dados de interesse na célula A dos dados da planilha a serem analisados. Para um ajuste completo, analise x e y (tempo e tensão, respectivamente). Por exemplo:
a1=xlsread('dados','run1','A4:A183');
b1=xlsread('dados','run1','B4:B183');
a1 = x (tempo) e b1 = y (tensão). - No MATLAB, clique em Aplicativos | Montador de Curvas | Equação personalizada. Limpe a equação personalizada representativa e insira a equação do modelo viscoelástico [equação (1)], onde ε representa a variável x e t representa a variável y.
(1º)
Aqui, ε representa a deformação, σ representa a tensão de cisalhamento, η1 representa a viscosidade, E representa a elasticidade, t representa o tempo e τ representa o tempo de relaxação, que caracteriza o tempo máximo necessário para que a célula retorne à sua forma original após a deformação primária. É expresso como τ =
, onde η2 é o termo de viscosidade secundária para o segundo dashpot (Figura 4). - Reatribua novas variáveis aos parâmetros viscoelásticos dentro da interface de equação personalizada. (ε, η1, E, σ, t e τ = ) representará (x, a, b, K, y e c), respectivamente. Aqui, x e y são as variáveis independentes e dependentes, respectivamente. A tensão de cisalhamento (σ) pode ser determinada usando a equação (2):
(2º)
Aqui, μ representa a viscosidade do meio fluido de cisalhamento, Q é a vazão da bomba, e w e h são a largura e a altura do canal de fluxo mostradas na Figura 1C, respectivamente. - Clique em Selecionar Dados para selecionar a Hora (a1) e a Tensão (b1) para cada conjunto de dados.
- Verifique se a opção Caixa de ajuste automático está marcada. Isso executa o ajuste automaticamente quando os dados (x e y) são selecionados.
- Selecione os métodos de ajuste para apertar as condições de contorno. Clique em Opções avançadas na categoria Métodos e selecione Mínimos quadrados não lineares. Em Robusto, selecione Desativado e, em Algoritmo, selecione Região de Confiança. Deixe todos os outros parâmetros como estão.
- As novas variáveis pós-ajuste (a, b e c) representam as propriedades viscoelásticas, viscosidade, elasticidade e tempo de relaxação (η1, E, EQUAT) da célula, respectivamente (Figura 5).
- Procure um alto valor R-quadrado do ajuste (R2 > 80%) para garantir que a saída de dados possa ser considerada um ajuste verdadeiro do modelo viscoelástico (Figura 3)
(1º)
, onde η2 é o termo de viscosidade secundária para o segundo dashpot (Figura 4).
(2º)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O protocolo de ensaio de cisalhamento acoplado à análise de deformação usando DIC e um modelo viscoelástico é bem sucedido em quantificar as propriedades mecânicas de uma única célula in vitro. Esse método foi testado em linhagens celulares humanas e murinas, incluindo células mamárias humanas normais (MCF-10A)3,4,9, células de câncer de mama triplo-negativas menos metastáticas (MDA-MB-468)3, células de câncer de mama triplo-negativas (MDA-MB-231)3, células de osteossarcoma humano7,8 e, mais recentemente, células de glioblastoma (Figura 3). A CID de quadros de imagem extraídos de registros de ensaios de cisalhamento é bem-sucedida na produção de dados de tempo de deformação compatíveis com a resposta de tensão de fluência (Figura 3), que se ajusta a um modelo viscoelástico (Figura 4). Com o uso do MATLAB, o modelo viscoelástico pode ser usado para ajustar os dados de tempo de deformação para obter as propriedades viscoelásticas das diferentes células.
A Figura 5 descreve a gama de propriedades que foram previamente estudadas usando a técnica de ensaio de cisalhamento. Propriedades mecânicas adicionais podem ser caracterizadas usando este método, dependendo do parâmetro de interesse. Os resultados desses estudos utilizando a técnica de ensaio de cisalhamento mostraram que as células cancerosas eram geralmente mais complacentes mecanicamente e menos viscosas do que as células normais (Figura 6)3,4,7,8. A Figura 6A-C descreve as propriedades mecânicas de células normais da mama (MCF-10A) e células de câncer de mama triplo-negativas (MDA-MB-468 menos metastático e MDA-MB-231 altamente metastático). Na Figura 6A,B, observa-se que a rigidez e a viscosidade das células diminuem com o aumento da progressão do câncer, de um estado celular normal, para um estado levemente metastático e para um estado altamente metastático. Variações estatisticamente significativas foram encontradas entre as células MCF-10A normais e as células MDA-MB-231 altamente metastáticas, e entre as células MDA-MB-468 menos metastáticas e as células MDA-MB-231 altamente metastáticas. Não houve variações significativas entre as células MCF-10A normais e as células MDA-MB-468 menos metastáticas. A Figura 6C mostra o tempo de relaxamento para esses tipos celulares, que não apresentaram variações significativas; Isso pode variar com outros tipos de células.
Figura 1: Montagem experimental do ensaio de cisalhamento. O método envolve o uso de (A) uma bomba de seringa programável para infundir e retirar meios de fluxo viscosos para dentro e para fora de (B) uma câmara de fluxo a uma taxa de cisalhamento constante. (C) Uma junta de borracha contendo uma janela retangular (dimensões: 20,5 mm x 2,5 mm x 0,254 mm) e sucção a vácuo é encaixada em uma placa de Petri de 35 mm x 10 mm contendo células cultivadas de interesse para estabelecer um campo de fluxo. (D) As células são submetidas ao escoamento dentro do campo estabelecido e são deformadas por tensão de cisalhamento fluido, que é derivada através de (E) uma equação para tensão de cisalhamento de parede. (F) Uma célula de interesse dentro do campo de fluxo é fotografada usando um microscópio em aumento de 63x, e a deformação em tempo real é capturada e registrada usando o software do microscópio no monitor. A tensão de cisalhamento do fluido induzida é utilizada juntamente com a deformação imageada para quantificar as propriedades mecânicas da célula única. Esse número é modificado de Hu et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise de deformações por correlação digital de imagens. Imagens extraídas de uma gravação do ensaio de cisalhamento mostram a tensão máxima de cisalhamento experimentada por células individuais ao longo do experimento. O DIC rastreia as alterações na estrutura naturalmente padronizada das células, localizando e rastreando um bloco de pixels subdefinido dentro de cada quadro ou imagem. (A) A imagem da célula antes da análise DIC. (B) Mascaramento das células, seleção da região de interesse e semeadura das células para auxiliar no rastreamento da deformação. (C) O início da deformação. (D) Acúmulo de deformação. (E) Deformação crescente ao longo do tempo. (F) Aplicação de extensômetros para quantificar a deformação durante a deformação. Abreviação: DIC = correlação de imagem digital. Esse número é modificado de Hu et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Amostra representativa de deformação versus dados de tempo de células de glioblastoma e modelagem matemática do modelo viscoelástico . (A) Os dados de deformação versus tempo obtidos pela DIC mostram diferentes regimes de fluência (primária, secundária e terciária) da célula. (B) Os dados de deformação versus tempo são exportados para o MATLAB para quantificação das propriedades mecânicas da célula individual. Abreviação: DIC = correlação de imagem digital. Esse número é modificado de Hu et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Modelo viscoelástico para determinação das propriedades viscoelásticas. Modelo generalizado de Maxwell com três parâmetros, composto pelos modelos Kelvin (dashpot) e Voigt (dashpot + mola) conectados em série, para caracterização do comportamento viscoelástico das células. O resultado da modelagem viscoelástica usando a técnica de cisalhamento é a elasticidade, viscosidade e tempo de relaxamento da célula. Esse número é modificado de Hu et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Representação gráfica dos tipos de propriedades materiais das células que podem ser extraídas da técnica de ensaio de cisalhamento, incluindo rigidez, viscosidade, fluência e tempo de relaxação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Propriedades materiais das células obtidas a partir da técnica de ensaio de cisalhamento. A rigidez celular foi significativamente diferente entre o núcleo e o citoplasma de células mamárias normais (MCF-10A) e mamárias altamente metastáticas (MDA-MB-231), e entre células menos metastáticas (MDA-MB-468) e células altamente metastáticas (MDA-MB-231) (A). Entretanto, não houve diferença significativa entre a rigidez do núcleo e citoplasma de células normais (MCF-10A) e células menos metastáticas (MDA-MB-468). Tendências semelhantes também foram encontradas nas viscosidades nuclear e citoplástica (B). Os tempos de relaxamento dessas células não apresentaram diferenças mecânicas significativas (C), embora outros tipos celulares possam existir. Esse número é modificado de Hu et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método de ensaio de cisalhamento, que inclui a criação de um ambiente pseudomecanobiológico para simular a interação das células com o microambiente mecânico circundante e suas respostas a estresses mecânicos, produziu um catálogo de propriedades mecânicas celulares, cujos padrões mostram atipias físicas conservadas entre linhagens de células cancerosas3,4,5,7,8. Este método combina uma compreensão da mecânica básica dos fluidos e da física para caracterizar propriedades mecânicas únicas das células e fornece potenciais biomarcadores materiais ou mecânicos para a detecção de vários cânceres difíceis de tratar 3,4.
A técnica de ensaio de cisalhamento tem certas limitações. Garantir uma cultura de célula única pode ser um desafio, devido ao rápido crescimento e proliferação de certos tipos celulares, dificultando a visualização e análise de células únicas. A tolerância ao estresse e a resposta celular podem ser heterogêneas de uma célula para outra, dependendo da linhagem celular, e como tal requer muitas células e solução de problemas, para determinar o estresse crítico médio necessário para deformar estruturalmente as células, mantendo sua viabilidade para analisar suas propriedades materiais como células vivas.
A solução de problemas para esta técnica inclui determinar i) as taxas de crescimento e proliferação das linhagens celulares de interesse e ii) o tempo necessário para as células aderirem ao substrato antes da tensão de cisalhamento. Os pesquisadores que utilizam esse protocolo podem optar por avaliar a expressão de proteínas-chave do citoesqueleto e aderentes, como actina, caderinas e outras proteínas de adesão focal. Também é necessário determinar as magnitudes críticas de tensão necessárias para induzir a deformação celular ótima para o software de análise de deformação (DIC).
A técnica de ensaio de cisalhamento pode servir como uma técnica eficaz para explorar os comportamentos mecânicos únicos e as propriedades mecânicas inerentes de diferentes tipos de células, potencialmente auxiliando na identificação e diagnósticos específicos e sensíveis que são independentes dos marcadores de superfície celular tipicamente usados nos métodos atuais de diagnóstico de células cancerosas. Ele também fornece melhorias significativas em relação aos métodos de caracterização mecânica existentes que rompem a membrana celular antes do teste.
A técnica única de ensaio de cisalhamento tem sido extensivamente explorada há mais de duas décadas para a caracterização do comportamento de células biológicas e a determinação de suas propriedades mecânicas. Esta configuração experimental imita de perto os efeitos das tensões de cisalhamento de fluido no corpo, aplicando tensões de cisalhamento de fluido controladas nas células in vitro. Observa-se que células normais e cancerosas respondem a esses estresses de forma diferente e, portanto, esta técnica fornece informações sobre suas propriedades estruturais e mecânicas e comportamentos. Esta técnica foi explorada em vários estudos anteriores para determinar as propriedades viscoelásticas das células e, curiosamente, diferenças mecânicas celulares significativas foram observadas em células normais saudáveis e células cancerosas3,4,9. Além disso, diferenças mecânicas intracelulares significativas foram observadas entre o núcleo e o citoplasma das células. Estas propriedades mecânicas únicas podem, portanto, ser exploradas como potenciais biomarcadores mecânicos para a detecção de diferentes cânceres em ambientes clínicos.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecem aos pesquisadores anteriores do grupo Soboyejo do Instituto Politécnico de Worcester que foram pioneiros nesta técnica: Drs. Yifang Cao, Jingjie Hu e Vanessa Uzonwanne. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional do Câncer (NIH/NCI K22 CA258410 a M.D.). As figuras foram criadas com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| Centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| Gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| Micropipette | any | For sterile cell culture | |
| Micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| Pipetman | any | For sterile cell culture | |
| Pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| Magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| Magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| Methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| Syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
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