Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften von krebsartigen und nicht-krebsartigen Zelllinien in vitro. Konservierte Unterschiede in der Mechanik von Krebszellen und normalen Zellen können als Biomarker dienen, der Auswirkungen auf die Prognose und Diagnose haben kann.
Abstract
Unregelmäßige Biomechanik ist ein Kennzeichen der Krebsbiologie und Gegenstand umfangreicher Untersuchungen. Die mechanischen Eigenschaften einer Zelle ähneln denen eines Materials. Die Stress- und Belastungsresistenz einer Zelle, ihre Relaxationszeit und ihre Elastizität sind Eigenschaften, die sich ableiten und mit anderen Zelltypen vergleichen lassen. Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften von krebsartigen (bösartigen) im Vergleich zu normalen (nicht-bösartigen) Zellen ermöglicht es den Forschern, die biophysikalischen Grundlagen dieser Krankheit weiter aufzudecken. Während bekannt ist, dass sich die mechanischen Eigenschaften von Krebszellen durchweg von den mechanischen Eigenschaften normaler Zellen unterscheiden, fehlt ein experimentelles Standardverfahren, um diese Eigenschaften aus Zellen in Kultur abzuleiten.
In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften einzelner Zellen in vitro mit Hilfe eines Fluid-Shear-Assays beschrieben. Das Prinzip hinter diesem Assay besteht darin, eine einzelne Zelle durch Flüssigkeitsscherspannung zu belasten und die daraus resultierende Zellverformung im Laufe der Zeit optisch zu überwachen. Die mechanischen Eigenschaften der Zelle werden anschließend mit Hilfe der digitalen Bildkorrelation (DIC) charakterisiert und ein geeignetes viskoelastisches Modell an die aus der DIC-Analyse generierten experimentellen Daten angepasst. Insgesamt zielt das hier skizzierte Protokoll darauf ab, eine effektivere und gezieltere Methode für die Diagnose schwer behandelbarer Krebserkrankungen bereitzustellen.
Introduction
Die Untersuchung der biophysikalischen Unterschiede zwischen krebsartigen und nicht-krebsartigen Zellen ermöglicht neue diagnostische und therapeutische Möglichkeiten1. Das Verständnis, wie Unterschiede in der Biomechanik/Mechanobiologie zum Fortschreiten von Tumoren und zur Therapieresistenz beitragen, wird neue Wege für eine zielgerichtete Therapie und Frühdiagnose aufzeigen2.
Während bekannt ist, dass sich die mechanischen Eigenschaften von Krebszellen von denen normaler Zellen unterscheiden (z. B. Viskoelastizität der Plasmamembran und der Kernhülle)3,4,5, fehlen robuste und reproduzierbare Methoden zur Messung dieser Eigenschaften in lebenden Zellen 6. Die Schermethode wird verwendet, um die mechanischen Eigenschaften von Zellen zu quantifizieren, indem einzelne Zellen einer Flüssigkeitsscherbelastung ausgesetzt und ihre individuellen Reaktionen und Beständigkeit gegen die angelegte Belastunganalysiert werden 3,4,5,7,8,9. Obwohl verschiedene Methoden und Techniken verwendet wurden, um die mechanischen Eigenschaften einzelner Zellen zu charakterisieren, neigen diese dazu, die Eigenschaften des Zellmaterials zu beeinflussen, indem sie i) die Zellmembran aufgrund der Eindringtiefe, komplexer Spitzengeometrien oder Substratversteifungen im Zusammenhang mit der Rasterkraftmikroskopie (AFM) perforieren/beschädigen10,11, ii) zelluläre Photoschäden während des optischen Einfangensinduzieren 12, 13 oder iii) Induktion komplexer Stresszustände, die mit der Mikropipettenaspiration verbunden sind14,15. Diese externen Effekte sind mit erheblichen Unsicherheiten in der Genauigkeit von Zellviskoelastizitätsmessungen verbunden 6,16,17.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, bietet die hier beschriebene Schertestmethode einen hochgradig kontrollierbaren und einfachen Ansatz, um den physiologischen Fluss im Körper zu simulieren, ohne dabei die zellulären Materialeigenschaften zu beeinträchtigen. Die Flüssigkeitsscherspannungen in diesem Assay stellen mechanische Belastungen dar, denen Zellen im Körper entweder durch Flüssigkeiten im Tumorinterstitium oder im Blut während der Zirkulation ausgesetzt sind18,19,20. Darüber hinaus fördern diese Flüssigkeitsbelastungen verschiedene bösartige Verhaltensweisen in Krebszellen, darunter Progression, Migration, Metastasierung und Zelltod 19,21,22,23, die zwischen tumorigenen und nicht-tumorigenen Zellen variieren. Darüber hinaus ermöglichen die veränderten mechanischen Eigenschaften von Krebszellen (d. h. sie sind oft "weicher" als normale Zellen, die sich im selben Organ befinden) es ihnen, in feindlichen Tumormikroumgebungen zu überleben, in umliegendes normales Gewebe einzudringen und an entfernte Stellen Metastasen zu bilden24,25,26. Durch die Schaffung einer pseudobiologischen Umgebung, in der die Zellen physiologischen Niveaus von Flüssigkeitsscherstress ausgesetzt sind, wird ein Prozess erreicht, der physiologisch relevant und nicht destruktiv für die Zelle ist. Die zellulären Reaktionen auf diese aufgebrachten Flüssigkeitsscherspannungen ermöglichen es uns, die mechanischen Eigenschaften der Zelle zu charakterisieren.
Dieser Artikel enthält ein Schertestprotokoll für die umfassende Untersuchung der mechanischen Eigenschaften und des Verhaltens von krebsartigen und nicht-krebsartigen Zellen unter angelegter Scherspannung. Zellen reagieren elastisch und viskos auf äußere Kräfte und können daher als viskoelastisches Material idealisiert werden3. Diese Technik wird kategorisiert in: (i) Zellkultur von dispergierten Einzelzellen, (ii) kontrollierte Anwendung von Flüssigkeitsscherspannung, (iii) In-situ-Bildgebung und Beobachtung des zellulären Verhaltens (einschließlich Beständigkeit gegen Stress und Verformung), (iv) Dehnungsanalyse von Zellen zur Bestimmung des Ausmaßes der Verformung und (v) Charakterisierung der viskoelastischen Eigenschaften einzelner Zellen. Durch die Untersuchung dieser mechanischen Eigenschaften und Verhaltensweisen kann die komplexe zelluläre Mechanobiologie zu quantifizierbaren Daten destilliert werden. Ein Protokoll, das diese Methode beschreibt, ermöglicht die Katalogisierung und den Vergleich zwischen verschiedenen malignen und nicht-malignen Zelltypen. Die Quantifizierung dieser Unterschiede hat das Potenzial, diagnostische und therapeutische Biomarker zu etablieren.
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Protocol
1. Vorbereitung für den Einzelzell-Schertest
- Zellkultur
- Säen Sie ca. 50.000 suspendierte Einzelzellen in einer 35 mm x 10 mm großen Petrischale mit 2 ml Nährmedien.
Anmerkungen: Wirbeln Sie die suspendierten Zellen vor der Aussaat, um Zellaggregate aufzubrechen. - Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und warten Sie zwischen 10 und 48 Stunden für die Zellanhaftung und die vollständige Bildung von Zytoskelettproteinen.
HINWEIS: Berücksichtigen Sie die Dauer der zellulären Anhaftung sowie die Proliferations- und Wachstumsraten, um ein angemessenes zelluläres Wachstum und eine angemessene Anhaftung zu gewährleisten und gleichzeitig eine Zellaggregation zu vermeiden. Diese Parameter variieren je nach Zelltyp.
- Säen Sie ca. 50.000 suspendierte Einzelzellen in einer 35 mm x 10 mm großen Petrischale mit 2 ml Nährmedien.
2. Scherproben-Experiment
- Herstellung von viskosen Fließmedien mit Scherprobe
- Um ein leicht viskoses Fließmedium (0,015-0,02 Pa·s) zu gewährleisten, messen Sie 0,05 Gew.-% ungiftige und nicht allergene Methylcellulose (4 Pa·s) ab und fügen Sie sie dem Nährmedium hinzu.
- Um eine homogene Mischung zu gewährleisten, erwärmen Sie die Basisnährmedien für ~10-20 min bei einer Temperatur von ~60-70 °C mit einem Magnetrührer/einer Heizplatte. Unter ständigem Rühren des Mediums wird die Methylcellulose vorsichtig hinzugefügt, damit sie sich schnell verteilt, um eine Koagulation der Methylcellulosepartikel zu vermeiden. Lassen Sie diesen Vorgang ~15-24 h laufen, um eine klare Lösung von Medium + Zellulose zu gewährleisten.
Anmerkungen: Vermeiden Sie eine übermäßige Erwärmung der Lösung. - Um die Viskosität des Fließmediums zu messen, testen Sie ~0,5-1 ml des repräsentativen Fließmediums mit einem Rheometer. Bestimmen Sie anhand der Anzeige die Viskosität des Fluids und verwenden Sie diesen Wert, um die Viskosität des Mediums des Scherfluids (μ) darzustellen, um die Scherspannung mithilfe von Gleichung (2) zu berechnen.
- Aufbau des Scherapparats
- Richten Sie das Scherprobensystem aus Doppelspritzen (60 ml oder 100 ml) ein, die an eine programmierbare Spritzenpumpe für die Infusion und Entnahme der viskosen Nährmedien angeschlossen sind (Abbildung 1).
- Befestigen Sie beide Spritzen über 1/16-Zoll-Schläuche und Schlauchanschlüsse an der Durchflusskammer.
- Befestigen Sie eine Gummidichtung, um einen kontrollierten, gleichmäßigen Durchfluss auf einzelnen Zellen entlang des Fließwegs zu gewährleisten (Abbildung 1). Die Gummidichtung ist in verschiedenen Größen erhältlich, abhängig vom zu erreichenden Strömungsprofil (laminar oder turbulent) und dem gewünschten Beobachtungsbereich (z. B. Länge von 22,5 mm, Breite von 2,5 mm und Höhe von 0,254 mm) (Abbildung 1).
- Programmieren Sie die Pumpe so, dass sie ein bestimmtes Flüssigkeitsvolumen (z. B. 60 ml) mit einer bestimmten Rate (z. B. 1 ml/min) ein- und ausführt, und wählen Sie die entsprechenden Spritzen (z. B. 60 ml) aus.
Anmerkungen: Berücksichtigen Sie die Voreinstellungen für das maximale Infusions- und Entzugsvolumen, um ein Verklemmen oder Fehlfunktionen zu vermeiden. Verwenden Sie Gleichung (2) für die Berechnung der erforderlichen Pumpenscherrate (unter der Annahme, dass die erforderliche Spannung und Viskosität bekannt sind).
- Vor-Scher-Setup
- Füllen Sie die Spritze mit den vorbereiteten viskosen Fließmedien.
- Befestigen Sie die Spritze, die mit 60 oder 100 ml (oder je nach Bedarf) viskosem Durchflussmedium gefüllt ist, und eine leere 60-ml-Spritze an ihren jeweiligen Positionen an der programmierbaren Spritzenpumpe. Verbinden Sie beide Spritzen über Schläuche und Schlauchanschlüsse mit der Durchflusskammer.
- Um eine einfache Identifizierung einzelner Zellen und eine befestigte Verbindung zwischen der Durchflusskammer und der Petrischale zu gewährleisten, befestigen Sie die Gummidichtung an der Durchflusskammer.
- Saugen Sie die Zellkulturmedien aus der Petrischale mit den gewünschten Zellen ab.
- Waschen Sie abgestorbene Zellen und lose anhaftende Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab.
- Aspirieren Sie das PBS.
- Setzen Sie die Durchflusskammer und die Gummidichtung (~34 mm x 9 mm) ein und befestigen Sie sie auf der Petrischale (35 mm x 10 mm), in der sich die angebrachten Zellen befinden.
- Legen Sie die eingebaute mikrofluidische Durchflusskammer + Zellen auf eine kultivierte Schale auf ein inverses Mikroskop mit einem Mikroskopobjektiv, das hoch genug ist, um qualitativ hochwertige Bilder mit hohen Pixelwerten (normalerweise zwischen 40-facher und 63-facher Vergrößerung) und einem Anzeigemonitor zu erhalten.
- Wählen Sie die Option Live-Bild (Zeitraffer bei einigen Softwares) aus der Mikroskopsoftware auf dem Bildschirm. Stellen Sie sicher, dass die Mikroskopsoftware auf dem PC entweder über eine Zeitrafferfunktion verfügt oder Videoaufnahmen machen kann.
- Fokussieren Sie das Mikroskopobjektiv und achten Sie auf einen ausreichenden Kontrast und deutliche Zellränder. Dies ist für die Bildanalyse nach der Scherung notwendig. Bewegen Sie den Mikroskoptisch, um sicherzustellen, dass die Zellen auf dem Monitor gut sichtbar sind und Live-Bilder sind.
- Wählen Sie eine Zelle oder mehrere unterschiedliche Zellen innerhalb des Bildgebungs-/Strömungspfads der eingebauten Durchflusskammer + Petrischale (die Fläche/der Pfad, der durch die Anpassung der Dichtung an die Strömungskammer entsteht).
- Scherung und Bildgebung
- Um einen kontinuierlichen, gleichmäßigen Durchfluss aufrechtzuerhalten, wählen Sie ähnliche Infusions- und Entzugsraten und stellen Sie einen laminaren Fluss der Flüssigkeit sicher, der in der Regel zwischen 1 ml/min und 5 ml/min liegt. Stellen Sie bei niedrigen laminaren Strömungsregimen sicher, dass die Reynold-Zahl von Re < 100 beträgt.
- Klicken Sie auf Laufen an der Scherpumpe, um die Scherflüssigkeit (vorbereitetes viskoses Medium) kontinuierlich einzuspritzen und zu entnehmen. Stellen Sie sicher, dass während der Flüssigkeitsinfusion keine Blasen entstehen, da dies zu externem, unerklärlichem Stress für die Zellen führen kann.
- Beginnen Sie mit der Aufnahme eines Videos, indem Sie in der Mikroskopsoftware auf Aufnahme klicken, bevor die infundierte Scherflüssigkeit mit der/den interessierenden(n) Zelle(n) unter dem Mikroskop in Kontakt kommt.
- Fahren Sie mit der Aufnahme für 7 Minuten oder für die gewünschte Dauer der Stressbelastung fort oder bis die interessierende(n) Zelle(n) vom Boden der Schüssel abschert. Klicken Sie in der Mikroskopsoftware auf Aufzeichnung beenden , wenn der Lauf wie gewünscht abgeschlossen ist.
- Speichern Sie die Aufnahme und extrahieren Sie sie als .tiff Dateien. Extrahieren Sie Bilder vorzugsweise mit 1 Bild pro Sekunde für eine einfache Analyse.
3. Datenverarbeitung
- Digitales Bildkorrelationsverfahren (Bildanalyse)
- Wenn die Aufnahme aus dem Mikroskop als Videodatei extrahiert wurde, konvertieren Sie sie in Bildrahmen (vorzugsweise .tiff Dateiformat).
- Importieren Sie die Bilder, die aus der Scherprobenaufzeichnung abgeleitet wurden, in die Software Davis 10.1.2 (DIC-Software), um die Bewegung der natürlich strukturierten Strukturen der Zelle zu verfolgen, indem Sie jeden Pixelblock (Teilmenge) des Referenzbildes in den jeweiligen neuen Bildern (deformierte Bilder) lokalisieren (Abbildung 2).
- Verwenden Sie für eine optimierte Korrelation eine Teilmengengröße von 31 x 31 Pixeln, eine Schrittweite (Verformungsabstand jeder Teilmenge) von 20 Pixeln und die Summe der differenziellen Spuroption , die die Verformung eines neuen Bildes in Bezug auf das letzte Bild verfolgt. Das Ergebnis dieser Korrelation ist ein Dehnungs-Zeit-Diagramm (Abbildung 3), das als .csv Datei zur weiteren Analyse in MATLAB exportiert werden kann.
- Ordnen Sie den Interessenbereich für eine ausgewählte einzelne Zelle zu. Wählen Sie beliebige Punkte innerhalb der zugeordneten Zelle aus, um die Verformung zu verfolgen. Verwenden Sie für eine unregelmäßige Form, z. B. die Zelle, eine Polygonmaske , um die Geometrie der Zelle darzustellen.
- Wählen Sie nach dem Mapping bestimmte Punkte auf der zu analysierenden Zelle (Zellkern oder Zytoplasma) aus, indem Sie auf Dehnungsmessstreifen hinzufügen klicken und einzelne Dehnungsmessstreifen an Punkten innerhalb der definierten Zellgrenze zeichnen.
- Klicken Sie auf Ausführen , um die Dehnungsverarbeitung zu starten und Dehnungs-Zeit-Daten zu erhalten.
- Doppelklicken Sie (oder klicken Sie mit der rechten Maustaste) auf das generierte Dehnungszeitdiagramm, und wählen Sie Daten als Tabelle exportieren aus.
4. Charakterisierung mechanischer Eigenschaften
- Charakterisierung viskoelastischer Eigenschaften
- Speichern Sie die .csv Datei mit den Dehnzeitdaten aus der DIC-Software in einem separaten Ordner, um sie für MATLAB leicht lesbar zu machen.
- Führen Sie MATLAB aus und klicken Sie auf die Registerkarte Editor , um eine Editorseite zu öffnen, auf der Sie einen Code schreiben können, der die Tabelle Zelle für Zelle liest.
- Ändern Sie den MATLAB-Pfad (den Ordnerpfad, der auf die gewünschte Datei zugreift), um auf den Ordner zuzugreifen, der die zu analysierenden Daten enthält, z. B. Benutzer/Benutzername/Desktop/Daten.
- Greifen Sie auf der Seite des MATLAB-Editors mit dem angepassten Code auf die Tabellenkalkulationsdaten zu. Beispiel: a1= xlsread('data','run1','A4:A183'), wobei a1 für den Bezeichner steht, xlsread für die MATLAB-Funktion , die die .csv Datei liest (in diesem Fall als Tabellenkalkulation), data für den Dateinamen, run1 für den Blattnamen und A4:A183 für den relevanten Datenbereich in Zelle A der zu analysierenden Tabellenkalkulationsdaten . Um eine vollständige Anpassung zu erhalten, analysieren Sie x und y (Zeit bzw. Dehnung). Zum Beispiel:
a1=xlsread('data','run1','A4:A183');
b1=xlsread('data','run1','B4:B183');
a1 = x (Zeit) und b1 = y (Dehnung). - Klicken Sie in MATLAB auf Apps | Curve Fitter | Benutzerdefinierte Gleichung. Löschen Sie die repräsentative benutzerdefinierte Gleichung, und geben Sie die viskoelastische Modellgleichung [Gleichung (1)] ein, wobei ε für die x-Variable und t für die y-Variable steht.
(1)
Dabei steht ε für die Dehnung, σ für die Schubspannung, η1 für die Viskosität, E für die Elastizität, t für die Zeit und τ für die Relaxationszeit, die die maximale Zeit charakterisiert, die die Zelle benötigt, um nach der Primärverformung in ihre ursprüngliche Form zurückzukehren. Sie wird ausgedrückt als τ =
, wobei η2 der sekundäre Viskositätsterm für den zweiten Dashpot ist (Abbildung 4). - Weisen Sie den viskoelastischen Parametern in der benutzerdefinierten Gleichungsschnittstelle neue Variablen zu. (ε, η1, E, σ, t und τ = ) repräsentiert (x, a, b, K, y und c). Hier sind x und y die unabhängigen bzw. abhängigen Variablen. Die Schubspannung (σ) kann mit Gleichung (2) ermittelt werden:
(2)
Hier steht μ für die Viskosität des Schermediums, Q für den Pumpendurchfluss und w und h für die Breite bzw. Höhe des in Abbildung 1C dargestellten Strömungskanals. - Klicken Sie auf Daten auswählen, um die Zeit (a1) und die Dehnung (b1) für jeden Datensatz auszuwählen.
- Stellen Sie sicher, dass die Option Automatisch anpassen aktiviert ist. Dadurch wird die Anpassung automatisch ausgeführt, wenn Daten (x und y) ausgewählt werden.
- Wählen Sie die Anpassungsmethoden aus, um die Randbedingungen zu verschärfen. Klicken Sie unter der Kategorie Methoden auf Erweiterte Optionen und wählen Sie Nichtlineare kleinste Quadrate aus. Wählen Sie unter "Robust" die Option "Aus" aus, und wählen Sie unter "Algorithmus" die Option "Trust-Region" aus. Lassen Sie alle anderen Parameter so, wie sie sind.
- Die neuen Variablen nach der Anpassung (a, b und c) stellen die viskoelastischen Eigenschaften, die Viskosität, die Elastizität und die Relaxationszeit (η1, E, EQUAT) der Zelle dar (Abbildung 5).
- Achten Sie auf einen hohen R-Quadrat-Wert der Anpassung (R2 > 80 %), um sicherzustellen, dass die Datenausgabe als echte Anpassung des viskoelastischen Modells angesehen werden kann (Abbildung 3)
(1)
, wobei η2 der sekundäre Viskositätsterm für den zweiten Dashpot ist (Abbildung 4).
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Das Schertestprotokoll in Verbindung mit der Deformationsanalyse mit DIC und einem viskoelastischen Modell ist bei der Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften einer einzelnen Zelle in vitro erfolgreich. Diese Methode wurde an humanen und murinen Zelllinien getestet, darunter normale menschliche Brustzellen (MCF-10A)3,4,9, weniger metastasierte dreifach negative Brustkrebszellen (MDA-MB-468)3, dreifach negative Brustkrebszellen (MDA-MB-231)3, humane Osteosarkomzellen 7,8 und zuletzt Glioblastomzellen (Abbildung 3). DIC von Bildbildern, die aus Scherprobenaufzeichnungen extrahiert wurden, ist erfolgreich bei der Erzeugung von Dehnungszeitdaten, die mit der Kriechspannungsantwort kompatibel sind (Abbildung 3), die an ein viskoelastisches Modell angepasst ist (Abbildung 4). Mit Hilfe von MATLAB kann das viskoelastische Modell verwendet werden, um die Dehnungs-Zeit-Daten anzupassen, um die viskoelastischen Eigenschaften der verschiedenen Zellen zu erhalten.
Abbildung 5 beschreibt die Bandbreite der Eigenschaften, die zuvor mit der Scherprobentechnik untersucht wurden. Mit dieser Methode können je nach interessierendem Parameter zusätzliche mechanische Eigenschaften charakterisiert werden. Die Ergebnisse dieser Studien mit der Scherassay-Technik zeigten, dass Krebszellen im Allgemeinen mechanisch nachgiebiger und weniger viskos waren als normale Zellen (Abbildung 6)3,4,7,8. Abbildung 6A-C beschreibt die mechanischen Eigenschaften von normalen Brustzellen (MCF-10A) und dreifach negativen Brustkrebszellen (weniger metastasiertes MDA-MB-468 und stark metastasiertes MDA-MB-231). In Abbildung 6A,B kann beobachtet werden, dass die Steifigkeit und Viskosität der Zellen mit zunehmender Krebsprogression von einem normalen Zellzustand zu einem leicht metastasierten Zustand und zu einem stark metastasierten Zustand abnimmt. Statistisch signifikante Unterschiede wurden zwischen den normalen MCF-10A-Zellen und den stark metastasierten MDA-MB-231-Zellen sowie zwischen den weniger metastasierten MDA-MB-468-Zellen und den stark metastasierten MDA-MB-231-Zellen gefunden. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den normalen MCF-10A- und den weniger metastasierten MDA-MB-468-Zellen. Abbildung 6C zeigt die Relaxationszeit für diese Zelltypen, die keine signifikanten Variationen aufwies; Dies kann bei anderen Zelltypen variieren.
Abbildung 1: Versuchsaufbau für Scherproben. Das Verfahren beinhaltet die Verwendung von (A) einer programmierbaren Spritzenpumpe, um viskose Durchflussmedien mit einer konstanten Scherrate in und aus (B) einer Durchflusskammer zu in- und entnehmen. (C) Eine Gummidichtung, die ein rechteckiges Fenster (Abmessungen: 20,5 mm x 2,5 mm x 0,254 mm) und eine Vakuumabsaugung enthält, wird in eine 35 mm x 10 mm große Petrischale eingepasst, die kultivierte Zellen von Interesse enthält, um ein Strömungsfeld zu erzeugen. (D) Die Zellen werden innerhalb des etablierten Feldes einer Strömung ausgesetzt und durch Fluidscherspannung verformt, die über (E) eine Gleichung für die Wandscherspannung abgeleitet wird. (F) Eine Zelle von Interesse innerhalb des Strömungsfeldes wird mit einem Mikroskop bei 63-facher Vergrößerung abgebildet, und die Verformung in Echtzeit wird mit der Mikroskopsoftware auf dem Monitor erfasst und aufgezeichnet. Die induzierte Fluidscherspannung wird zusammen mit der abgebildeten Verformung verwendet, um die mechanischen Eigenschaften der einzelnen Zelle zu quantifizieren. Diese Abbildung wurde von Hu et al.3 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Dehnungsanalyse mittels digitaler Bildkorrelation. Bilder, die aus einer Aufzeichnung des Schertests extrahiert wurden, zeigen die maximale Scherdehnung, der einzelne Zellen während des gesamten Experiments ausgesetzt waren. DIC verfolgt Änderungen in der natürlich strukturierten Struktur der Zellen, indem es eine Teilmenge von Pixeln in jedem Frame oder Bild lokalisiert und verfolgt. (A) Das Bild der Zelle vor der DIC-Analyse. (B) Maskierung der Zellen, Auswahl des interessierenden Bereichs und Aussaat der Zellen, um die Verfolgung von Verformungen zu unterstützen. (C) Der Beginn der Verformung. (D) Verformungsaufbau. (E) Zunehmende Verformung im Laufe der Zeit. (F) Anwendung von Dehnungsmessstreifen zur Quantifizierung der Dehnung während der Verformung. Abkürzung: DIC = Digital Image Correlation. Diese Abbildung wurde von Hu et al.3 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Stichprobe von Dehnungs-Zeit-Daten von Glioblastomzellen und mathematische Modellierung des viskoelastischen Modells . (A) Die von DIC erhaltenen Dehnungs-Zeit-Daten zeigen unterschiedliche Kriechregime (primär, sekundär und tertiär) der Zelle. (B) Die Dehnungs-Zeit-Daten werden zur Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften der einzelnen Zelle in MATLAB exportiert. Abkürzung: DIC = Digital Image Correlation. Diese Abbildung wurde von Hu et al.3 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Viskoelastisches Modell zur Bestimmung viskoelastischer Eigenschaften. Ein verallgemeinertes Maxwell-Modell mit drei Parametern, das in Reihe geschaltete Kelvin- (Dashpot) und Voigt-Modelle (Dashpot + Feder) umfasst, zur Charakterisierung des viskoelastischen Verhaltens von Zellen. Das Ergebnis der viskoelastischen Modellierung mit der Schertechnik ist die Elastizität, Viskosität und Relaxationszeit der Zelle. Diese Abbildung wurde von Hu et al.3 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Grafische Darstellung der Arten von Materialeigenschaften von Zellen, die aus der Schertesttechnik extrahiert werden können, einschließlich Steifigkeit, Viskosität, Kriechen und Relaxationszeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Materialeigenschaften von Zellen, die mit der Scherassay-Technik gewonnen wurden. Die Zellsteifigkeit unterschied sich signifikant zwischen Zellkern und Zytoplasma von normalen Brustzellen (MCF-10A) und stark metastasierten Brustzellen (MDA-MB-231) sowie zwischen weniger metastasierten Zellen (MDA-MB-468) und stark metastasierten Zellen (MDA-MB-231) (A). Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen der Steifigkeit des Zellkerns und des Zytoplasmas von normalen Zellen (MCF-10A) und weniger metastasierten Zellen (MDA-MB-468). Ähnliche Trends zeigten sich auch bei den nukleären und zytoplastischen Viskositäten (B). Die Relaxationszeiten dieser Zellen zeigten keine signifikanten mechanischen Unterschiede (C), andere Zelltypen hingegen schon. Diese Abbildung wurde von Hu et al.3 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Shear-Assay-Methode, die die Einrichtung einer pseudo-mechanobiologischen Umgebung umfasst, um die Interaktion von Zellen mit der umgebenden mechanischen Mikroumgebung und ihre Reaktionen auf mechanische Belastungen zu simulieren, hat einen Katalog zellulärer mechanischer Eigenschaften hervorgebracht, deren Muster konservierte physikalische Atypien zwischen krebsartigen Zelllinien aufweisen 3,4,5,7,8 . Diese Methode kombiniert ein grundlegendes Verständnis der Strömungsmechanik und -physik, um einzigartige mechanische Eigenschaften von Zellen zu charakterisieren, und liefert potenzielle materielle oder mechanische Biomarker für die Erkennung mehrerer schwer zu behandelnder Krebsarten 3,4.
Die Scherprobentechnik hat gewisse Einschränkungen. Die Sicherstellung einer Einzelzellkultur kann aufgrund des schnellen Wachstums und der schnellen Proliferation bestimmter Zelltypen eine Herausforderung darstellen, was die Visualisierung und Analyse einzelner Zellen erschwert. Die Stresstoleranz und die zelluläre Reaktion können je nach Zelllinie von einer Zelle zur anderen heterogen sein und erfordern daher viele Zellen und Fehlersuche, um den durchschnittlichen kritischen Stress zu bestimmen, der erforderlich ist, um die Zellen strukturell zu verformen und gleichzeitig ihre Lebensfähigkeit zu erhalten, ihre Materialeigenschaften als lebende Zellen zu analysieren.
Die Fehlerbehebung für diese Technik umfasst die Bestimmung i) der Wachstums- und Proliferationsraten der interessierenden Zelllinien und ii) der Zeit, die die Zellen benötigen, um vor der Scherspannung am Substrat zu haften. Forscher, die dieses Protokoll verwenden, können sich dafür entscheiden, die Expression von wichtigen Zytoskelett- und adhärenten Proteinen wie Aktin, Cadherinen und anderen fokalen Adhäsionsproteinen zu bewerten. Es ist auch notwendig, die kritischen Spannungsgrößen zu bestimmen, die erforderlich sind, um die optimale Zellverformung für die Dehnungsanalysesoftware (DIC) zu induzieren.
Die Shear-Assay-Technik kann als effektive Technik dienen, um das einzigartige mechanische Verhalten und die inhärenten mechanischen Eigenschaften verschiedener Zelltypen zu untersuchen und möglicherweise bei der spezifischen und empfindlichen Identifizierung und Diagnose zu helfen, die unabhängig von Zelloberflächenmarkern sind, die typischerweise in aktuellen Krebszell-Diagnosemethoden verwendet werden. Es bietet auch erhebliche Verbesserungen gegenüber bestehenden mechanischen Charakterisierungsmethoden, bei denen die Zellmembran vor dem Test aufgebrochen wird.
Die einzigartige Schertesttechnik wird seit über zwei Jahrzehnten ausgiebig erforscht, um das Verhalten biologischer Zellen zu charakterisieren und ihre mechanischen Eigenschaften zu bestimmen. Dieser Versuchsaufbau ahmt die Auswirkungen von Flüssigkeitsscherspannungen im Körper genau nach, indem er kontrollierte Flüssigkeitsscherspannungen auf Zellen in vitro anwendet. Es wird beobachtet, dass normale und krebsartige Zellen unterschiedlich auf diese Belastungen reagieren, und so liefert diese Technik Einblicke in ihre strukturellen und mechanischen Eigenschaften und Verhaltensweisen. Diese Technik wurde in mehreren früheren Studien untersucht, um die viskoelastischen Eigenschaften von Zellen zu bestimmen, und interessanterweise wurden signifikante zellmechanische Unterschiede in gesunden normalen Zellen und Krebszellen beobachtet 3,4,9. Darüber hinaus wurden signifikante intrazelluläre mechanische Unterschiede zwischen Zellkern und Zytoplasma von Zellen beobachtet. Diese einzigartigen mechanischen Eigenschaften können daher als potenzielle mechanische Biomarker für die Erkennung verschiedener Krebsarten im klinischen Umfeld erforscht werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken früheren Forschern der Soboyejo-Gruppe am Worcester Polytechnic Institute, die diese Technik als erste entwickelt haben: Dr. Yifang Cao, Dr. Jingjie Hu und Dr. Vanessa Uzonwanne. Diese Arbeit wurde vom National Cancer Institute (NIH/NCI K22 CA258410 to M.D.) unterstützt. Die Figuren wurden mit BioRender.com erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| Centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| Gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| Micropipette | any | For sterile cell culture | |
| Micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| Pipetman | any | For sterile cell culture | |
| Pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| Magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| Magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| Methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| Syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
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- Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I.
- Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).
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