Summary
Denne protokollen skisserer kvantifiseringen av de mekaniske egenskapene til kreft- og ikke-kreftcellelinjer in vitro. Bevarte forskjeller i mekanikken til kreft og normale celler kan fungere som en biomarkør som kan ha implikasjoner i prognose og diagnose.
Abstract
Uregelmessig biomekanikk er et kjennetegn på kreftbiologi som er gjenstand for omfattende studier. De mekaniske egenskapene til en celle ligner på et materiale. En celles motstand mot stress og belastning, dens avslapningstid og dens elastisitet er alle egenskaper som kan utledes og sammenlignes med andre typer celler. Kvantifisering av de mekaniske egenskapene til kreft (ondartet) versus normale (ikke-ondartede) celler gjør det mulig for forskere å avdekke de biofysiske grunnleggende av denne sykdommen. Mens de mekaniske egenskapene til kreftceller er kjent for å konsekvent avvike fra de mekaniske egenskapene til normale celler, mangler en standard eksperimentell prosedyre for å utlede disse egenskapene fra celler i kultur.
Denne artikkelen skisserer en prosedyre for å kvantifisere de mekaniske egenskapene til enkeltceller in vitro ved hjelp av en væskeskjæranalyse. Prinsippet bak denne analysen innebærer å påføre væskeskjærspenning på en enkelt celle og optisk overvåke den resulterende cellulære deformasjonen over tid. Cellemekaniske egenskaper karakteriseres deretter ved hjelp av digital bildekorrelasjonsanalyse (DIC) og tilpasning av en passende viskoelastisk modell til eksperimentelle data generert fra DIC-analysen. Samlet sett har protokollen som er skissert her som mål å gi en mer effektiv og målrettet metode for diagnostisering av vanskelig å behandle kreft.
Introduction
Å studere de biofysiske forskjellene mellom kreft- og ikke-kreftceller gir nye diagnostiske og terapeutiske muligheter1. Å forstå hvordan forskjeller i biomekanikk / mekanobiologi bidrar til tumorprogresjon og behandlingsresistens vil avsløre nye veier for målrettet terapi og tidlig diagnose2.
Selv om det er kjent at kreftcellenes mekaniske egenskaper skiller seg fra normale celler (f.eks. viskoelastisiteten til plasmamembranen og nukleær konvolutt)3,4,5, mangler robuste og reproduserbare metoder for å måle disse egenskapene i levende celler6. Skjæranalysemetoden brukes til å kvantifisere de mekaniske egenskapene til celler ved å utsette enkeltceller for væskeskjærspenning og analysere deres individuelle responser og motstand mot den påførte spenningen 3,4,5,7,8,9. Selv om flere metoder og teknikker har blitt brukt til å karakterisere de mekaniske egenskapene til enkeltceller, har disse en tendens til å påvirke cellematerialets egenskaper ved å i) perforere / skade cellemembranen på grunn av innrykksdybden, komplekse spissgeometrier eller substratavstivning assosiert med atomkraftmikroskopi (AFM) 10,11, ii) indusere cellulær fotoskade under optisk fangst 12, 13, eller iii) indusere komplekse stresstilstander assosiert med mikropipetteaspirasjon14,15. Disse eksterne effektene er forbundet med betydelige usikkerheter i nøyaktigheten av celleviskoelastisitetsmålinger 6,16,17.
For å løse disse begrensningene gir skjæranalysemetoden beskrevet her en svært kontrollerbar og enkel tilnærming for å simulere fysiologisk strømning i kroppen uten å påvirke cellulære materialegenskaper i prosessen. Væskeskjærspenninger i denne analysen representerer mekaniske påkjenninger som oppleves av celler i kroppen enten av væsker i tumorinterstitium eller i blodet under sirkulasjon18,19,20. Videre fremmer disse væskespenningene ulike ondartede atferd i kreftceller, inkludert progresjon, migrasjon, metastase og celledød 19,21,22,23 som varierer mellom tumorigene og ikke-tumorigene celler. Videre tillater de endrede mekaniske egenskapene til kreftceller (dvs. de er ofte "mykere" enn normale celler som finnes i samme organ) at de vedvarer i fiendtlige tumormikromiljøer, invaderer omkringliggende normalt vev og metastaserer til fjerne steder24,25,26. Ved å skape et pseudobiologisk miljø hvor celler opplever fysiologiske nivåer av væskeskjærspenning, oppnås en prosess som er fysiologisk relevant og ikke ødeleggende for cellen. De cellulære responsene på disse påførte væskeskjærspenningene tillater oss å karakterisere cellemekaniske egenskaper.
Dette papiret gir en skjæranalyseprotokoll for den omfattende studien av de mekaniske egenskapene og oppførselen til kreft- og ikke-kreftceller under påført skjærspenning. Celler reagerer på ytre krefter på en elastisk og viskøs måte og kan derfor idealiseres som et viskoelastisk materiale3. Denne teknikken er kategorisert i: (i) cellekultur av dispergerte enkeltceller, (ii) kontrollert anvendelse av væskeskjærspenning, (iii) in situ-avbildning og observasjon av cellulær oppførsel (inkludert motstand mot stress og deformasjon), (iv) belastningsanalyse av celler for å bestemme omfanget av deformasjon, og (v) karakterisering av de viskoelastiske egenskapene til enkeltceller. Ved å undersøke disse mekaniske egenskapene og atferdene, kan kompleks cellulær mekanobiologi destilleres til kvantifiserbare data. En protokoll som beskriver denne metoden gjør det mulig å katalogisere og sammenligne mellom forskjellige ondartede og ikke-ondartede celletyper. Kvantifisering av disse forskjellene har potensial til å etablere diagnostiske og terapeutiske biomarkører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse for enkeltcelleskjæranalysen
- Cellekultur
- Frø ca. 50 000 suspenderte enkeltceller i en 35 mm x 10 mm petriskål inneholdende 2 ml kulturmedier.
MERK: Vortex de suspenderte cellene før såing for å bryte fra hverandre celleaggregater. - Inkuber cellene ved 37 °C og tillat mellom 10 og 48 timer for cellefeste og fullstendig cytoskeletal proteindannelse.
MERK: Vurder varigheten av cellulær tilknytning, samt spredning og veksthastighet, for å sikre tilstrekkelig cellulær vekst og vedlegg samtidig som du unngår celleaggregering. Disse parametrene varierer med celletype.
- Frø ca. 50 000 suspenderte enkeltceller i en 35 mm x 10 mm petriskål inneholdende 2 ml kulturmedier.
2. Skjæranalyseeksperiment
- Fremstilling av skjæranalyse, viskøse strømningsmedier
- For å sikre et svakt viskøst strømningsmedium (0,015-0,02 Pa·s), mål og tilsett 0,05 vekt% giftfri og ikke-allergifremkallende metylcellulose (4 Pa·s) til kulturmediet.
- For å sikre en homogen blanding, forvarm basiskulturmediet i ~10-20 minutter ved en temperatur på ~60-70 °C med en magnetisk omrører/kokeplate. Under kontinuerlig omrøring av mediet, tilsett metylcellulosen forsiktig slik at den raskt sprer seg, for å unngå koagulering av metylcellulosepartiklene. La denne prosessen fortsette i ~ 15-24 timer for å sikre en klar løsning av media + cellulose.
MERK: Unngå overdreven oppvarming av løsningen. - For å måle viskositeten til strømningsmediet, test ~ 0,5-1 ml av det representative strømningsmediet ved hjelp av et reometer. Fra avlesningen bestemmer du væskeviskositeten og bruker denne verdien til å representere viskositeten til skjærvæskemediet (μ) for å beregne skjærspenning ved hjelp av ligning (2).
- Oppsett av skjæreapparat
- Definer skjæranalysesystemet med doble sprøyter (60 ml eller 100 ml) koblet til en programmerbar sprøytepumpe for infusjon og uttak av det viskøse dyrkningsmediet (figur 1).
- Fest begge sprøytene til strømningskammeret via 1/16 tommers slange- og slangekontakter.
- Fest en gummipakning for å gi en kontrollert, jevn flyt på enkeltceller langs strømningsbanen (figur 1). Gummipakningen leveres i forskjellige størrelser avhengig av strømningsprofilen som skal oppnås (laminær eller turbulent) og ønsket observasjonsområde (f.eks. lengde på 22,5 mm, bredde på 2,5 mm og høyde på 0,254 mm) (figur 1).
- Programmer pumpen til å infundere og trekke ut et visst volum væske (f.eks. 60 ml) med en angitt hastighet (f.eks. 1 ml/min) og velg de tilsvarende sprøytene (f.eks. 60 ml).
MERK: Ta hensyn til maksimal forhåndsinnstilling for infusjons- og opptrekksvolum for å unngå fastkjøring eller funksjonsfeil. Bruk ligning (2) for beregning av nødvendig pumpeskjærhastighet (forutsatt at nødvendig spenning og viskositet er kjent).
- Oppsett før skjær
- Fyll sprøyten med klargjort viskøs strømningsmedium.
- Fest sprøyten, fylt med 60 eller 100 ml (eller etter behov) viskøse strømningsmedier, og en tom 60 ml sprøyte på sine respektive steder på den programmerbare sprøytepumpen. Koble begge sprøytene til strømningskammeret via slange- og slangekoblinger.
- For å sikre enkel identifisering av enkeltceller og en festet forbindelse mellom strømningskammeret og petriskålen, fest gummipakningen til strømningskammeret.
- Aspirer cellekulturmediet fra petriskålen som inneholder cellene av interesse.
- Vask av døde celler og løst festede celler ved hjelp av fosfatbufret saltvann (PBS).
- Aspirer PBS.
- Sett inn og fest strømningskammeret og gummipakningen (~34 mm x 9 mm) på petriskålen (35 mm x 10 mm) som inneholder de vedlagte cellene.
- Plasser det monterte mikrofluidiske strømningskammeret + celler på en kultivert tallerken på et omvendt mikroskop, med et mikroskopmål høyt nok til å oppnå bilder av høy kvalitet med høye pikselverdier (vanligvis mellom 40x og 63x forstørrelse) og en skjerm.
- Velg alternativet live image (time-lapse på noen programvare) fra mikroskopprogramvaren på skjermen. Forsikre deg om at mikroskopprogramvaren på PC-en enten har en t-funksjon (time-lapse) eller kan ta videoopptak.
- Fokuser mikroskopmålet, og sørg for tilstrekkelig kontrast og tydelige cellekanter. Dette er nødvendig for bildeanalysen etter skjær. Flytt mikroskoptrinnet for å sikre at cellene er tydelig synlige på skjermen og er levende bilder.
- Velg en celle eller flere distinkte celler i avbildnings-/strømningsbanen til det monterte strømningskammeret + petriskålen (området/banen som opprettes ved montering av pakningen i strømningskammeret).
- Skjær og avbildning
- For å opprettholde en kontinuerlig jevn strømning, velg lignende infusjons- og opptrekkshastigheter og sikre laminær strømning av væsken, vanligvis mellom 1 ml / min og 5 ml / min. For lavlaminære strømningsregimer, sørg for et Reynolds antall Re < 100.
- Klikk på Kjør på skjærpumpen for å injisere og trekke ut skjærvæsken (preparert tyktflytende medium) med en kontinuerlig hastighet. Sørg for at det ikke er bobler under væskeinfusjon, da dette kan føre til ekstern uforklarlig belastning på cellene.
- Begynn å spille inn en video ved å klikke opptak på mikroskopprogramvaren før den infunderte skjærvæsken kommer i kontakt med cellen (e) av interesse under mikroskopet.
- Fortsett å ta opp i 7 minutter, eller for ønsket varighet av stresseksponering, eller til cellen (e) av interesse skjærer av bunnen av parabolen. Klikk stopp opptak på mikroskopprogramvaren når kjøringen er fullført som ønsket.
- Lagre innspillingen og pakk ut som .tiff filer. Trekk helst ut bilder med 1 ramme per sekund for enkel analyse.
3. Databehandling
- Prosedyre for digital bildekorrelasjon (bildeanalyse)
- Hvis opptaket fra mikroskopet ble trukket ut som en videofil, konverter den til bilderammer (helst .tiff filformat).
- Importer bildene avledet fra skjæranalyseopptaket til Davis 10.1.2-programvaren (DIC-programvare) for å spore bevegelsen til de naturlig mønstrede strukturene i cellen ved å finne hver pikselblokk (delmengde) av referansebildet i de respektive nye bildene (deformerte bilder) (figur 2).
- For en optimalisert korrelasjon, bruk en delmengdestørrelse på 31 x 31 piksler, en trinnstørrelse (deformasjonsavstand for hver delmengde) på 20 piksler, og summen av differensialsporalternativet , som sporer deformasjonen av et nytt bilde i forhold til det siste bildet. Resultatet av denne sammenhengen er et tøyningstidsplott (figur 3) som kan eksporteres som en .csv-fil for videre analyse i MATLAB.
- Kartlegg interesseområdet for en valgt enkeltcelle. Velg vilkårlige punkter i den tilordnede cellen for å spore deformasjon. For en uregelmessig form, for eksempel cellen, bruker du en mangekantmaske til å kartlegge cellens geometri.
- Etter kartlegging velger du spesifikke punkter på cellen (kjerne eller cytoplasma) som skal analyseres ved å klikke på legg til strekkmåler og tegne ut individuelle strekkmålere på punkter innenfor den definerte cellulære grensen.
- Klikk på Kjør for å starte belastningsbehandlingen og få belastnings- kontra tidsdata.
- Dobbeltklikk (eller høyreklikk) på det genererte strain-time-plottet og velg eksporter data som et regneark.
4. Mekanisk egenskapskarakterisering
- Viskoelastisk egenskap karakterisering
- Lagre den .csv filen som inneholder tøyningstidsdata fra DIC-programvaren i en egen mappe for enkel lesbarhet av MATLAB.
- Kjør MATLAB og klikk på redigeringsfanen for å åpne en redigeringsside for å skrive en kode som leser regnearket, celle for celle.
- Endre MATLAB-banen (mappebanen som får tilgang til den interessante filen) for å få tilgang til mappen som inneholder dataene som skal analyseres, for eksempel Brukere/brukernavn/skrivebord/data.
- På MATLAB-redigeringssiden får du tilgang til regnearkdataene ved hjelp av den tilpassede koden. For eksempel: a1= xlsread('data','run1','A4:A183'), der a1 representerer identifikatoren, xlsread er MATLAB-funksjonen som leser den .csv filen (i dette tilfellet som et regneark), data er filnavnet, run1 er arknavnet og A4:A183 er dataområdet av interesse i celle A i regnearkdataene som skal analyseres. For en komplett passform, analyser x og y (henholdsvis tid og belastning). For eksempel:
a1=xlsread('data','run1','A4:A183');
b1=xlsread('data','run1','B4:B183');
A1 = X (tid), og B1 = Y (belastning). - I MATLAB klikker du på Apper | Kurve montør | Egendefinert ligning. Fjern den representative egendefinerte ligningen og skriv inn den viskoelastiske modellligningen [ligning (1)], der ε representerer x-variabelen og t representerer y-variabelen.
(1)
Her representerer ε belastningen, σ representerer skjærspenningen, η1 representerer viskositeten, E representerer elastisiteten, t representerer tiden og τ representerer avslapningstiden, som karakteriserer den maksimale tiden som kreves for at cellen skal gå tilbake til sin opprinnelige form etter primær deformasjon. Det uttrykkes som τ =
, hvor η2 er den sekundære viskositetsbetegnelsen for den andre strekpotten (figur 4). - Tilordne nye variabler til de viskoelastiske parameterne i det egendefinerte formelgrensesnittet. (ε, η1, E, σ, t og τ = ) vil representere (x, a, b, K, y og c), henholdsvis. Her er x og y henholdsvis de uavhengige og avhengige variablene. Skjærspenning (σ) kan bestemmes ved hjelp av ligning (2):
(2)
Her representerer μ viskositeten til skjærvæskemediet, Q er pumpens strømningshastighet, og w og h er bredden og høyden på strømningskanalen vist i henholdsvis figur 1C. - Klikk på Velg data for å velge Tid (a1) og Belastning (b1) for hvert sett med data.
- Forsikre deg om at alternativet Autotilpassing er merket av. Dette kjører tilpasningen automatisk når data (x og y) er valgt.
- Velg tilpasningsmetoder for å stramme inn grenseforholdene. Klikk på Avanserte alternativer under kategorien Metoder og velg Ikke-lineære minste kvadrater. Under Robust velger du Av, og under Algoritme velger du Klareringsområde. La alle andre parametere være som de er.
- De nye variablene etter tilpasning (a, b og c) representerer henholdsvis cellens viskoelastiske egenskaper, viskositet, elastisitet og relaksasjonstid (η1, E, EQUAT) (figur 5).
- Se etter en høy R-kvadratverdi av tilpasningen (R2 > 80 %) for å sikre at datautgangen kan betraktes som en sann passform for den viskoelastiske modellen (figur 3)
(1)
, hvor η2 er den sekundære viskositetsbetegnelsen for den andre strekpotten (figur 4).
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skjæranalyseprotokollen kombinert med deformasjonsanalyse ved bruk av DIC og en viskoelastisk modell er vellykket i å kvantifisere de mekaniske egenskapene til en enkelt celle in vitro. Denne metoden er testet på humane og murine cellelinjer, inkludert normale humane brystceller (MCF-10A)3,4,9, mindre metastatiske trippel-negative brystkreftceller (MDA-MB-468)3, trippel-negative brystkreftceller (MDA-MB-231)3, humane osteosarkomceller 7,8 og senest glioblastomceller (figur 3). DIC av bilderammer hentet fra skjæranalyseopptak lykkes med å produsere tøyningstidsdata som er kompatible med deformasjonsspenningsresponsen (figur 3), som passer til en viskoelastisk modell (figur 4). Ved bruk av MATLAB kan den viskoelastiske modellen brukes til å tilpasse tøyningstidsdataene for å oppnå de viskoelastiske egenskapene til de forskjellige cellene.
Figur 5 beskriver rekkevidden av egenskaper som tidligere er studert ved hjelp av skjæranalyseteknikken. Ytterligere mekaniske egenskaper kan karakteriseres ved hjelp av denne metoden, avhengig av parameteren av interesse. Resultatene av disse studiene ved hjelp av skjæranalyseteknikken viste at kreftceller generelt var mer mekanisk kompatible og mindre viskøse enn normale celler (figur 6) 3,4,7,8. Figur 6A-C beskriver de mekaniske egenskapene til normale brystceller (MCF-10A) og trippel-negative brystkreftceller (mindre metastatisk MDA-MB-468 og svært metastatisk MDA-MB-231). I figur 6A,B kan stivheten og viskositeten til cellene observeres å avta med økt kreftprogresjon, fra en normal celletilstand, til en litt metastatisk tilstand og til en svært metastatisk tilstand. Statistisk signifikante variasjoner ble funnet mellom normale MCF-10A-celler og sterkt metastatiske MDA-MB-231-celler, og mellom de mindre metastatiske MDA-MB-468-cellene og de svært metastatiske MDA-MB-231-cellene. Det var ingen signifikante variasjoner mellom de normale MCF-10A- og de mindre metastatiske MDA-MB-468-cellene. Figur 6C viser relaksasjonstiden for disse celletypene, som ikke viste noen signifikante variasjoner; Dette kan variere med andre typer celler.
Figur 1: Eksperimentelt oppsett med skjæranalyse. Metoden innebærer bruk av (A) en programmerbar sprøytepumpe for både å infundere og trekke ut viskøse strømningsmedier inn i og ut av (B) et strømningskammer med konstant skjærhastighet. (C) En gummipakning som inneholder et rektangulært vindu (dimensjoner: 20,5 mm x 2,5 mm x 0,254 mm) og vakuumsug passer i en 35 mm x 10 mm petriskål som inneholder dyrkede celler av interesse for å etablere et strømningsfelt. (D) Cellene blir utsatt for strømning innenfor det etablerte feltet og deformeres av væskeskjærspenning, som er avledet via (E) en ligning for veggskjærspenning. (F) En celle av interesse innenfor strømningsfeltet avbildes ved hjelp av et mikroskop ved 63x forstørrelse, og sanntidsdeformasjon fanges opp og registreres ved hjelp av mikroskopprogramvaren på skjermen. Den induserte væskeskjærspenningen utnyttes sammen med den avbildede deformasjonen for å kvantifisere de mekaniske egenskapene til enkeltcellen. Denne figuren er modifisert fra Hu et al.3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tøyningsanalyse med digital bildekorrelasjon. Bilder hentet fra et opptak av skjæranalysen viser den maksimale skjærbelastningen som oppleves av individuelle celler gjennom hele eksperimentet. DIC sporer endringer i den naturlig mønstrede strukturen til cellene ved å finne og spore en blokk med piksler delmengde innenfor hver ramme eller bilde. (A) Bildet av cellen før DIC-analysen. (B) Maskering av cellene, valg av interesseområde og såing av cellene for å hjelpe deformasjonssporing. (C) Utbruddet av deformasjon. (D) Deformasjonsoppbygging. (E) Økende deformasjon over tid. (F) Anvendelse av strekklapper for å kvantifisere tøyning under deformasjon. Forkortelse: DIC = digital bildekorrelasjon. Denne figuren er modifisert fra Hu et al.3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativt utvalg av tøynings- versus tidsdata for glioblastomceller og matematisk modellering av den viskoelastiske modellen . (A) Belastnings- versus tidsdata oppnådd av DIC viser forskjellige kryperegimer (primære, sekundære og tertiære) av cellen. (B) Tøynings-mot-tid-data eksporteres til MATLAB for kvantifisering av de mekaniske egenskapene til den enkelte celle. Forkortelse: DIC = digital bildekorrelasjon. Denne figuren er modifisert fra Hu et al.3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Viskoelastisk modell for bestemmelse av viskoelastiske egenskaper. En tre-parameter generalisert Maxwell-modell, som består av Kelvin (dashpot) og Voigt (dashpot + fjær) modeller koblet i serie, for karakterisering av cellens viskoelastiske oppførsel. Resultatet av den viskoelastiske modelleringen ved hjelp av skjærteknikken er cellens elastisitet, viskositet og avslapningstid. Denne figuren er modifisert fra Hu et al.3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Grafisk fremstilling av hvilke typer materialegenskaper til celler som kan ekstraheres fra skjæranalyseteknikken, inkludert stivhet, viskositet, kryp og avslapningstid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Materialegenskaper til celler oppnådd fra skjæranalyseteknikken. Cellestivhet var signifikant forskjellig mellom kjernen og cytoplasmaet til normale brystceller (MCF-10A) og sterkt metastatiske brystceller (MDA-MB-231), og mellom mindre metastaserende celler (MDA-MB-468) og svært metastaserende celler (MDA-MB-231) (A). Det var imidlertid ingen signifikant forskjell mellom stivheten i kjernen og cytoplasma hos normale celler (MCF-10A) og mindre metastaserende celler (MDA-MB-468). Lignende trender ble også funnet i nukleære og cytoplastiske viskositeter (B). Avslapningstidene til disse cellene viste ikke signifikante mekaniske forskjeller (C), selv om andre celletyper kan. Denne figuren er modifisert fra Hu et al.3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skjæranalysemetoden, som inkluderer å sette opp et pseudo-mekanobiologisk miljø for å simulere samspillet mellom celler med det omkringliggende mekaniske mikromiljøet og deres respons på mekaniske påkjenninger, har produsert en katalog over cellulære mekaniske egenskaper, hvis mønstre viser konservert fysisk atypi blant kreftcellelinjer 3,4,5,7,8 . Denne metoden kombinerer en forståelse av grunnleggende fluidmekanikk og fysikk for å karakterisere unike mekaniske egenskaper til celler og gir potensielle materielle eller mekaniske biomarkører for påvisning av flere vanskelige å behandle kreft 3,4.
Skjæranalyseteknikken har visse begrensninger. Å sikre en enkeltcellekultur kan være utfordrende på grunn av rask vekst og spredning av visse celletyper, noe som gjør det vanskelig å visualisere og analysere enkeltceller. Stresstoleranse og cellulær respons kan være heterogen fra en celle til en annen, avhengig av cellelinjen, og som sådan krever mange celler og feilsøking, for å bestemme gjennomsnittlig kritisk stress som kreves for å strukturelt deformere cellene samtidig som de opprettholder deres levedyktighet for å analysere deres materielle egenskaper som levende celler.
Feilsøking for denne teknikken inkluderer å bestemme i) vekst- og proliferasjonshastighetene til cellelinjer av interesse og ii) tiden det tar for celler å feste seg til substratet før skjærspenning. Forskere som bruker denne protokollen kan velge å vurdere ekspresjonen av viktige cytoskeletale og adherente proteiner, som aktin, cadheriner og andre fokaladhesjonsproteiner. Det er også nødvendig å bestemme de kritiske spenningsstørrelsene som kreves for å indusere den optimale celledeformasjonen for tøyningsanalyseprogramvaren (DIC).
Skjæranalyseteknikken kan tjene som en effektiv teknikk for å utforske den unike mekaniske oppførselen og iboende mekaniske egenskapene til forskjellige typer celler, som potensielt hjelper til med spesifikk og sensitiv identifisering og diagnoser som er uavhengige av celleoverflatemarkører som vanligvis brukes i dagens kreftcellediagnostiske metoder. Det gir også betydelige forbedringer i forhold til eksisterende mekaniske karakteriseringsmetoder som bryter cellemembranen før testing.
Den unike skjæranalyseteknikken har blitt grundig utforsket i over to tiår for karakterisering av oppførselen til biologiske celler og bestemmelse av deres mekaniske egenskaper. Dette eksperimentelle oppsettet etterligner nøye effekten av væskeskjærspenninger i kroppen ved å bruke kontrollert væskeskjærspenning på celler in vitro. Normale og kreftceller observeres å reagere på disse påkjenningene annerledes, og dermed gir denne teknikken innsikt i deres strukturelle og mekaniske egenskaper og atferd. Denne teknikken har blitt utforsket i flere tidligere studier for å bestemme de viskoelastiske egenskapene til celler, og interessant nok ble signifikante cellulære mekaniske forskjeller observert i friske normale celler og kreftceller 3,4,9. Videre ble signifikante intracellulære mekaniske forskjeller observert mellom kjernen og cytoplasma av celler. Disse unike mekaniske egenskapene kan derfor utforskes som potensielle mekaniske biomarkører for påvisning av forskjellige kreftformer i kliniske omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser å opplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takker tidligere forskere fra Soboyejo-gruppen ved Worcester Polytechnic Institute som først var banebrytende for denne teknikken: Dr. Yifang Cao, Jingjie Hu og Vanessa Uzonwanne. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute (NIH / NCI K22 CA258410 til MD). Figurer ble laget med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| Centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| Gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| Micropipette | any | For sterile cell culture | |
| Micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| Pipetman | any | For sterile cell culture | |
| Pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| Magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| Magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| Methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| Syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
- Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).
- Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I.
- Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).
- Onwudiwe, K., et al. Investigation of creep properties and the cytoskeletal structures of non-tumorigenic breast cells and triple-negative breast cancer cells. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 110 (5), 1004-1020 (2022).
- Ani, C. J., et al. A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 91, 76-90 (2019).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomaterialia. 3 (4), 413-438 (2007).
- Cao, Y., et al. Investigation of the viscoelasticity of human osteosarcoma cells using a shear assay method. Journal of Materials Research. 21 (8), 1922-1930 (2006).
- Cao, Y. On the measurement of human osteosarcoma cell elastic modulus using shear assay experiments. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 18 (1), 103-109 (2007).
- Onwudiwe, K., et al. Actin cytoskeletal structure and the statistical variations of the mechanical properties of non-tumorigenic breast and triple-negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 119, 104505 (2021).
- Kirmizis, D., Logothetidis, S. Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics. International Journal of Nanomedicine. 5, 137-145 (2010).
- Haase, K., Pelling, A. E. Investigating cell mechanics with atomic force microscopy. Journal of the Royal Society. Interface. 12 (104), 20140970 (2015).
- Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society. Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
- Peterman, E. J. G., Gittes, F., Schmidt, C. F.
- Hochmuth, R. M.
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and corticcal tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophysical Journal. 56 (1), 151-160 (1989).
- Van Vliet, K. J., Bao, G., Suresh, S. The biomechanics toolbox: experimental approaches for living cells and biomolecules. Acta Materialia. 51 (19), 5881-5905 (2003).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
- Choi, H. Y., et al. Hydrodynamic shear stress promotes epithelial-mesenchymal transition by downregulating ERK and GSK3beta activities. Breast Cancer Research. 21 (1), 6 (2019).
- Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 17 (2018).
- Onwudiwe, K., Najera, J., Siri, S., Datta, M. Do tumor mechanical stresses promote cancer immune escape. Cells. 11 (23), 3840 (2022).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Mao, B. H., Nguyen Thi, K. M., Tang, M. J., Kamm, R. D., Tu, T. Y. The interface stiffness and topographic feature dictate interfacial invasiveness of cancer spheroids. Biofabrication. 15 (1), (2023).
- Kashani, A. S., Packirisamy, M. Cancer cells optimize elasticity for efficient migration. Royal Society Open Science. 7 (10), 200747 (2020).
- Riehl, B. D., Kim, E., Bouzid, T., Lim, J. Y. The role of microenvironmental cues and mechanical loading milieus in breast cancer cell progression and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 608526 (2021).
