Summary
Detta protokoll beskriver kvantifieringen av de mekaniska egenskaperna hos cancerösa och icke-cancerösa cellinjer in vitro. Bevarade skillnader i mekaniken hos cancerceller och normala celler kan fungera som en biomarkör som kan få konsekvenser för prognos och diagnos.
Abstract
Oregelbunden biomekanik är ett kännetecken för cancerbiologi som är föremål för omfattande studier. De mekaniska egenskaperna hos en cell liknar dem hos ett material. En cells motståndskraft mot stress och belastning, dess avslappningstid och dess elasticitet är alla egenskaper som kan härledas och jämföras med andra typer av celler. Kvantifiering av de mekaniska egenskaperna hos cancer (maligna) kontra normala (icke-maligna) celler gör det möjligt för forskare att ytterligare avslöja de biofysiska grunderna för denna sjukdom. Medan de mekaniska egenskaperna hos cancerceller är kända för att konsekvent skilja sig från de mekaniska egenskaperna hos normala celler, saknas ett standardexperimentellt förfarande för att härleda dessa egenskaper från celler i odling.
Detta dokument beskriver ett förfarande för att kvantifiera de mekaniska egenskaperna hos enskilda celler in vitro med hjälp av en vätskeskjuvningsanalys. Principen bakom denna analys innebär att vätskeskjuvspänning appliceras på en enda cell och optiskt övervakar den resulterande cellulära deformationen över tiden. Cellmekaniska egenskaper karakteriseras därefter med hjälp av digital bildkorrelation (DIC) -analys och anpassning av en lämplig viskoelastisk modell till experimentella data som genereras från DIC-analysen. Sammantaget syftar det protokoll som beskrivs här till att tillhandahålla en effektivare och mer målinriktad metod för diagnos av svårbehandlade cancerformer.
Introduction
Att studera de biofysiska skillnaderna mellan cancerceller och icke-cancerceller möjliggör nya diagnostiska och terapeutiska möjligheter1. Att förstå hur skillnader i biomekanik / mekanobiologi bidrar till tumörprogression och behandlingsresistens kommer att avslöja nya vägar för riktad terapi och tidig diagnos2.
Även om det är känt att cancercellernas mekaniska egenskaper skiljer sig från normala celler (t.ex. viskoelasticitet hos plasmamembranet och kärnhöljet)3,4,5, saknas robusta och reproducerbara metoder för att mäta dessa egenskaper i levande celler6. Skjuvanalysmetoden används för att kvantifiera cellernas mekaniska egenskaper genom att utsätta enskilda celler för vätskeskjuvspänning och analysera deras individuella svar och motstånd mot den applicerade spänningen 3,4,5,7,8,9. Även om flera metoder och tekniker har använts för att karakterisera de mekaniska egenskaperna hos enskilda celler, tenderar dessa att påverka cellmaterialets egenskaper genom att i) perforera / skada cellmembranet på grund av indragningsdjupet, komplexa spetsgeometrier eller substratförstyvning associerad med atomkraftmikroskopi (AFM) 10,11, ii) inducerande cellulär fotodamage under optisk fångst 12, 13, eller iii) inducerande av komplexa spänningstillstånd associerade med mikropipettaspiration14,15. Dessa externa effekter är förknippade med signifikanta osäkerheter i noggrannheten hos cellviskoelasticitetsmätningar 6,16,17.
För att ta itu med dessa begränsningar ger skjuvanalysmetoden som beskrivs här ett mycket kontrollerbart och enkelt tillvägagångssätt för att simulera fysiologiskt flöde i kroppen utan att påverka cellulära materialegenskaper i processen. Vätskeskjuvspänningar i denna analys representerar mekaniska påfrestningar som upplevs av celler i kroppen antingen av vätskor i tumörinterstitium eller i blodet under cirkulation18,19,20. Vidare främjar dessa vätskespänningar olika maligna beteenden i cancerceller, inklusive progression, migration, metastasering och celldöd 19,21,22,23 som varierar mellan tumörframkallande och icke-tumörframkallande celler. Dessutom tillåter de förändrade mekaniska egenskaperna hos cancerceller (dvs de är ofta "mjukare" än normala celler som finns inom samma organ) dem att kvarstå i fientliga tumörmikromiljöer, invadera omgivande normala vävnader och metastasera till avlägsna platser24,25,26. Genom att skapa en pseudobiologisk miljö där celler upplever fysiologiska nivåer av vätskeskjuvspänning uppnås en process som är fysiologiskt relevant och inte destruktiv för cellen. De cellulära svaren på dessa applicerade vätskeskjuvspänningar tillåter oss att karakterisera cellmekaniska egenskaper.
Detta dokument tillhandahåller ett skjuvanalysprotokoll för omfattande studier av de mekaniska egenskaperna och beteendet hos cancerceller och icke-cancerceller under applicerad skjuvspänning. Celler svarar på yttre krafter på ett elastiskt och visköst sätt och kan därför idealiseras som ett viskoelastiskt material3. Denna teknik kategoriseras i: (i) cellodling av dispergerade enskilda celler, (ii) kontrollerad applicering av vätskeskjuvspänning, (iii) in situ-avbildning och observation av cellulärt beteende (inklusive motståndskraft mot stress och deformation), (iv) töjningsanalys av celler för att bestämma graden av deformation, och (v) karakterisering av de viskoelastiska egenskaperna hos enskilda celler. Genom att undersöka dessa mekaniska egenskaper och beteenden kan komplex cellulär mekanobiologi destilleras till kvantifierbara data. Ett protokoll som beskriver denna metod möjliggör katalogisering av och jämförelse mellan olika maligna och icke-maligna celltyper. Att kvantifiera dessa skillnader har potential att etablera diagnostiska och terapeutiska biomarkörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse för encellsskjuvningstestet
- Cellodling
- Frö cirka 50 000 suspenderade enskilda celler i en 35 mm x 10 mm petriskål innehållande 2 ml odlingsmedia.
OBS: Virvla de suspenderade cellerna före sådd för att bryta isär cellaggregat. - Inkubera cellerna vid 37 °C och låt cellbindning och fullständig bildning av cytoskelettprotein ske mellan 10 och 48 timmar.
OBS: Tänk på varaktigheten av cellulär bindning, såväl som proliferation och tillväxthastigheter, för att säkerställa adekvat cellulär tillväxt och fastsättning samtidigt som cellaggregering undviks. Dessa parametrar varierar beroende på celltyp.
- Frö cirka 50 000 suspenderade enskilda celler i en 35 mm x 10 mm petriskål innehållande 2 ml odlingsmedia.
2. Skjuvanalysexperiment
- Beredning av skjuvanalys viskösa flödesmedier
- För att säkerställa ett svagt visköst flödesmedium (0,015-0,02 Pa·s), mät och tillsätt 0,05 viktprocent giftfri och icke-allergiframkallande metylcellulosa (4 Pa·s) till odlingsmediet.
- För att säkerställa en homogen blandning, förvärm basodlingsmediet i ~ 10-20 minuter vid en temperatur av ~ 60-70 ° C med en magnetomrörare / värmeplatta. Under ständig omrörning av mediet tillsätts försiktigt metylcellulosan så att den snabbt löses upp för att undvika koagulering av metylcellulosapartiklarna. Låt denna process fortsätta i ~ 15-24 timmar för att säkerställa en tydlig lösning av media + cellulosa.
OBS: Undvik överdriven uppvärmning av lösningen. - För att mäta flödesmediets viskositet, testa ~ 0,5-1 ml av det representativa flödesmediet med hjälp av en reometer. Från avläsningen bestämmer du vätskans viskositet och använder detta värde för att representera viskositeten hos skjuvvätskemediet (μ) för att beräkna skjuvspänningen med ekvation (2).
- Inställning av skjuvapparat
- Ställ in skjuvanalyssystemet med dubbla sprutor (60 ml eller 100 ml) anslutna till en programmerbar sprutpump för infusion och uttag av det viskösa odlingsmediet (figur 1).
- Fäst båda sprutorna i flödeskammaren via 1/16 tums slang- och slanganslutningar.
- Fäst en gummipackning för att ge ett kontrollerat, jämnt flöde på enskilda celler längs flödesbanan (figur 1). Gummipackningen finns i olika storlekar beroende på den flödesprofil som ska uppnås (laminär eller turbulent) och önskat observationsområde (t.ex. längd 22,5 mm, bredd 2,5 mm och höjd 0,254 mm) (figur 1).
- Programmera pumpen att infusera och dra ut en viss volym vätska (t.ex. 60 ml) med en bestämd hastighet (t.ex. 1 ml/min) och välj motsvarande sprutor (t.ex. 60 ml).
OBS: Ta hänsyn till förinställningarna för maximal infusions- och uttagsvolym för att undvika störning eller funktionsfel. Använd ekvation (2) för beräkning av erforderlig pumpskjuvhastighet (förutsatt att den erforderliga spänningen och viskositeten är kända).
- Inställning före skjuvning
- Fyll sprutan med det beredda viskösa flödesmediet.
- Fäst sprutan, fylld med 60 eller 100 ml (eller efter behov) visköst flödesmedium, och en tom 60 ml spruta på respektive plats på den programmerbara sprutpumpen. Anslut båda sprutorna till flödeskammaren via slang- och slanganslutningar.
- För att säkerställa enkel identifiering av enskilda celler och en fäst anslutning mellan flödeskammaren och petriskålen, fäst gummipackningen på flödeskammaren.
- Aspirera cellodlingsmediet från petriskålen som innehåller cellerna av intresse.
- Tvätta bort döda celler och löst fästa celler med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Aspirera PBS.
- Sätt in och fixera flödeskammaren och gummipackningen (~ 34 mm x 9 mm) på petriskålen (35 mm x 10 mm) som innehåller de bifogade cellerna.
- Placera den monterade mikrofluidiska flödeskammaren + cellerna på en odlad maträtt på ett inverterat mikroskop, med ett mikroskopmål tillräckligt högt för att få högkvalitativa bilder med höga pixelvärden (vanligtvis mellan 40x och 63x förstoring) och en bildskärm.
- Välj alternativet live-bild (tidsfördröjning på viss programvara) från mikroskopprogramvaran på bildskärmen. Se till att mikroskopprogramvaran på datorn har antingen en t (time-lapse) funktionalitet eller kan ta videoinspelningar.
- Fokusera mikroskopmålet, säkerställ tillräcklig kontrast och distinkta cellkanter. Detta är nödvändigt för bildanalysen efter skjuvning. Flytta mikroskopsteget för att säkerställa att cellerna är tydligt synliga på bildskärmen och är levande bilder.
- Välj en cell eller flera distinkta celler inom bild-/flödesvägen för den anpassade flödeskammaren + petriskålen (det område/bana som skapas genom packningens montering i flödeskammaren).
- Skjuvning och avbildning
- För att upprätthålla ett kontinuerligt jämnt flöde, välj liknande infusions- och uttagshastigheter och säkerställ laminärt flöde av vätskan, vanligtvis mellan 1 ml / min och 5 ml / min. För låga laminära flödesregimer, se till att Reynolds antal Re < 100.
- Klicka på Kör på skjuvpumpen för att injicera och dra ut skjuvvätskan (beredda viskösa medier) med kontinuerlig hastighet. Se till att det inte finns några bubblor under vätskeinfusion, eftersom detta kan införa extern oredovisad stress på cellerna.
- Börja spela in en video genom att klicka på spela in på mikroskopprogramvaran innan den infunderade skjuvvätskan kommer i kontakt med cellen / cellerna av intresse under mikroskopet.
- Fortsätt att spela in i 7 minuter, eller under önskad varaktighet av stressexponering, eller tills cellen / cellerna av intresse klipper av botten av skålen. Klicka på stoppa inspelningen på mikroskopprogrammet när körningen är klar som önskat.
- Spara inspelningen och extrahera som .tiff filer. Extrahera helst bilder med 1 bild per sekund för enkel analys.
3. Behandling av uppgifter
- Procedur för digital bildkorrelation (bildanalys)
- Om inspelningen från mikroskopet extraherades som en videofil, konvertera den till bildramar (helst .tiff filformat).
- Importera bilderna som härrör från skjuvanalysinspelningen till Davis 10.1.2-programvaran (DIC-programvara) för att spåra rörelsen hos cellens naturligt mönstrade strukturer genom att lokalisera varje pixelblock (delmängd) av referensbilden i respektive nya bilder (deformerade bilder) (figur 2).
- För en optimerad korrelation använder du en delmängdsstorlek på 31 x 31 pixlar, en stegstorlek ( deformationsavstånd för varje delmängd) på 20 pixlar och summan av differentialspåralternativet , som spårar deformationen av en ny bild med avseende på den sista bilden. Resultatet av denna korrelation är ett töjningstidsdiagram (figur 3) som kan exporteras som en .csv fil för vidare analys i MATLAB.
- Kartlägg intresseområdet för en vald enskild cell. Markera godtyckliga punkter i den mappade cellen för att spåra deformation. För en oregelbunden form, till exempel cellen, använd en polygonmask för att kartlägga cellens geometri.
- Efter kartläggning väljer du specifika punkter på cellen (kärna eller cytoplasma) som ska analyseras genom att klicka på lägg till töjningsmätare och dra ut enskilda töjningsmätare vid punkter inom den definierade cellulära gränsen.
- Klicka på Kör för att påbörja stambearbetningen och få belastning kontra tidsdata.
- Dubbelklicka (eller högerklicka) på det genererade töjningstidsdiagrammet och välj exportera data som ett kalkylblad.
4. Karakterisering av mekaniska egenskaper
- Karakterisering av viskoelastiska egenskaper
- Spara den .csv filen som innehåller belastningstidsdata från DIC-programvaran i en separat mapp för enkel läsbarhet av MATLAB.
- Kör MATLAB och klicka på redigeringsfliken för att öppna en redigeringssida för att skriva en kod som läser kalkylbladet, cell för cell.
- Ändra MATLAB-sökvägen (mappsökvägen som har åtkomst till filen av intresse) för att komma åt mappen som innehåller de data som ska analyseras, till exempel Användare / Användarnamn / Desktop / data.
- På MATLAB-redigeringssidan öppnar du kalkylbladsdata med den anpassade koden. Till exempel: a1= xlsread('data','run1','A4:A183'), där a1 representerar identifieraren, xlsread är MATLAB-funktionen som läser .csv-filen (i det här fallet som ett kalkylblad), data är filnamnet, run1 är arknamnet och A4:A183 är intervallet av data av intresse i cell A i kalkylbladsdata som ska analyseras. För en fullständig passform, analysera x och y (tid respektive belastning). Till exempel:
a1=xlsread('data','run1','A4:A183');
b1=xlsread('data','run1','B4:B183');
a1 = x (tid) och b1 = y (stam). - I MATLAB klickar du på Appar | Kurva Montör | Anpassad ekvation. Rensa den representativa anpassade ekvationen och mata in den viskoelastiska modellekvationen [ekvation (1)], där ε representerar x-variabeln och t representerar y-variabeln.
(1)
Här representerar ε töjningen, σ representerar skjuvspänningen, η1 representerar viskositeten, E representerar elasticiteten, t representerar tiden och τ representerar avkopplingstiden, vilket kännetecknar den maximala tid som krävs för att cellen ska återgå till sin ursprungliga form efter primär deformation. Den uttrycks som τ =
, där η2 är den sekundära viskositetstermen för den andra streckpotten (figur 4). - Tilldela om nya variabler till de viskoelastiska parametrarna i det anpassade ekvationsgränssnittet. (ε, η1, E, σ, t och τ = ) kommer att representera (x, a, b, K, y respektive c). Här är x och y de oberoende respektive beroende variablerna. Skjuvspänning (σ) kan bestämmas med ekvation (2):
(2)
Här representerar μ viskositeten hos skjuvvätskemediet, Q är pumpflödet och w och h är bredden och höjden på flödeskanalen som visas i figur 1C. - Klicka på Välj data för att välja tid (a1) och töjning (b1) för varje uppsättning data.
- Se till att rutan Autopassa är markerad. Detta kör passningen automatiskt när data (x och y) väljs.
- Välj anpassningsmetoder för att dra åt gränsvillkoren. Klicka på Avancerade alternativ under kategorin Metoder och välj Icke-linjära minsta kvadrater. Under Robust väljer du Av och under Algoritm väljer du Förtroenderegion. Lämna alla andra parametrar som de är.
- De nya variablerna efter anpassning (a, b och c) representerar cellens viskoelastiska egenskaper, viskositet, elasticitet och avkopplingstid (η1, E, EVAT) (figur 5).
- Leta efter ett högt R-kvadratvärde för passformen (R2 > 80%) för att säkerställa att datautgången kan betraktas som en sann passform för den viskoelastiska modellen (figur 3)
(1)
, där η2 är den sekundära viskositetstermen för den andra streckpotten (figur 4).
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skjuvanalysprotokollet tillsammans med deformationsanalys med DIC och en viskoelastisk modell är framgångsrik i att kvantifiera de mekaniska egenskaperna hos en enda cell in vitro. Denna metod har testats på humana och murina cellinjer, inklusive normala humana bröstceller (MCF-10A)3,4,9, mindre metastaserande trippelnegativa bröstcancerceller (MDA-MB-468)3, trippelnegativa bröstcancerceller (MDA-MB-231)3, humana osteosarkomceller 7,8 och senast glioblastomceller (figur 3). DIC för bildramar extraherade från skjuvanalysinspelningar lyckas producera töjningstidsdata som är kompatibla med krypspänningsresponsen (figur 3), som passar en viskoelastisk modell (figur 4). Med hjälp av MATLAB kan den viskoelastiska modellen användas för att passa töjningstidsdata för att erhålla de viskoelastiska egenskaperna hos de olika cellerna.
Figur 5 beskriver de olika egenskaper som tidigare har studerats med skjuvanalystekniken. Ytterligare mekaniska egenskaper kan karakteriseras med hjälp av denna metod, beroende på parametern av intresse. Resultaten av dessa studier med skjuvanalystekniken visade att cancerceller i allmänhet var mer mekaniskt kompatibla och mindre viskösa än normala celler (figur 6) 3,4,7,8. Figur 6A-C beskriver de mekaniska egenskaperna hos normala bröstceller (MCF-10A) och trippelnegativa bröstcancerceller (mindre metastaserande MDA-MB-468 och mycket metastaserande MDA-MB-231). I figur 6A,B kan cellernas styvhet och viskositet observeras minska med ökad cancerprogression, från ett normalt celltillstånd, till ett något metastatiskt tillstånd och till ett mycket metastatiskt tillstånd. Statistiskt signifikanta variationer hittades mellan de normala MCF-10A-cellerna och de mycket metastaserande MDA-MB-231-cellerna, och mellan de mindre metastaserande MDA-MB-468-cellerna och de mycket metastaserande MDA-MB-231-cellerna. Det fanns inga signifikanta variationer mellan de normala MCF-10A och de mindre metastaserande MDA-MB-468-cellerna. Figur 6C visar avslappningstiden för dessa celltyper, som inte visade några signifikanta variationer; Detta kan variera med andra typer av celler.
Bild 1: Experimentell inställning av skjuvanalys. Metoden innefattar användning av (A) en programmerbar sprutpump för att både infusera och dra ut viskösa flödesmedier in i och ut ur (B) en flödeskammare med konstant skjuvhastighet. (C) En gummipackning som innehåller ett rektangulärt fönster (mått: 20,5 mm x 2,5 mm x 0,254 mm) och vakuumsug passar i en petriskål på 35 mm x 10 mm som innehåller odlade celler av intresse för att upprätta ett flödesfält. (D) Cellerna utsätts för flöde inom det etablerade fältet och deformeras av vätskeskjuvspänning, som härleds via (E) en ekvation för väggskjuvspänning. (F) En cell av intresse inom flödesfältet avbildas med hjälp av ett mikroskop vid 63x förstoring, och realtidsdeformation fångas och registreras med hjälp av mikroskopprogramvaran på monitorn. Den inducerade vätskeskjuvspänningen utnyttjas tillsammans med den avbildade deformationen för att kvantifiera de mekaniska egenskaperna hos den enskilda cellen. Denna siffra är modifierad från Hu et al.3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Töjningsanalys med digital bildkorrelation. Bilder extraherade från en inspelning av skjuvanalysen visar den maximala skjuvbelastningen som upplevs av enskilda celler under hela experimentet. DIC spårar förändringar i cellernas naturligt mönstrade struktur genom att lokalisera och spåra ett block med pixlar i varje ram eller bild. (A) Bilden av cellen före DIC-analysen. (B) Maskering av cellerna, val av intresseområde och sådd av cellerna för att underlätta deformationsspårning. (C) Uppkomsten av deformation. (D) Uppbyggnad av deformation. (E) Ökande deformation över tiden. F) Anbringande av töjningsmätare för att kvantifiera töjning under deformation. Förkortning: DIC = digital bildkorrelation. Denna siffra är modifierad från Hu et al.3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativt urval av stam kontra tidsdata för glioblastomceller och matematisk modellering av den viskoelastiska modellen . (A) Belastning mot tidsdata erhållna av DIC visar olika krypregimer (primära, sekundära och tertiära) i cellen. (B) Töjnings-/tidsdata exporteras till MATLAB för kvantifiering av den enskilda cellens mekaniska egenskaper. Förkortning: DIC = digital bildkorrelation. Denna siffra är modifierad från Hu et al.3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Viskoelastisk modell för bestämning av viskoelastiska egenskaper. En treparametergeneraliserad Maxwell-modell, som består av Kelvin (dashpot) och Voigt (dashpot + fjäder) modeller kopplade i serie, för karakterisering av cellernas viskoelastiska beteende. Resultatet av den viskoelastiska modelleringen med skjuvtekniken är cellens elasticitet, viskositet och avkopplingstid. Denna siffra är modifierad från Hu et al.3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Grafisk avbildning av de typer av materialegenskaper hos celler som kan extraheras från skjuvanalystekniken, inklusive styvhet, viskositet, krypning och avkopplingstid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Materialegenskaper hos celler erhållna från skjuvanalystekniken. Cellstyvheten skilde sig signifikant mellan kärnan och cytoplasman i normala bröstceller (MCF-10A) och högmetastaserande bröstceller (MDA-MB-231), och mellan mindre metastaserande celler (MDA-MB-468) och mycket metastaserande celler (MDA-MB-231) (A). Det fanns emellertid ingen signifikant skillnad mellan styvheten hos kärnan och cytoplasman hos normala celler (MCF-10A) och mindre metastatiska celler (MDA-MB-468). Liknande trender hittades också i nukleära och cytoplastiska viskositeter (B). Avslappningstiderna för dessa celler uppvisade inte signifikanta mekaniska skillnader (C), även om andra celltyper kan. Denna siffra är modifierad från Hu et al.3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skjuvanalysmetoden, som inkluderar att inrätta en pseudo-mekanobiologisk miljö för att simulera cellernas interaktion med den omgivande mekaniska mikromiljön och deras svar på mekaniska påfrestningar, har producerat en katalog över cellulära mekaniska egenskaper, vars mönster visar bevarad fysisk atypi bland cancercellinjer 3,4,5,7,8 . Denna metod kombinerar en förståelse för grundläggande strömningsmekanik och fysik för att karakterisera unika mekaniska egenskaper hos celler och ger potentiella material- eller mekaniska biomarkörer för detektion av flera svårbehandlade cancerformer 3,4.
Skjuvanalystekniken har vissa begränsningar. Att säkerställa en encellsodling kan vara utmanande på grund av den snabba tillväxten och spridningen av vissa celltyper, vilket gör det svårt att visualisera och analysera enskilda celler. Stresstolerans och det cellulära svaret kan vara heterogent från en cell till en annan beroende på cellinjen, och som sådan kräver många celler och felsökning för att bestämma den genomsnittliga kritiska spänningen som krävs för att strukturellt deformera cellerna samtidigt som deras livskraft bibehålls för att analysera deras materialegenskaper som levande celler.
Felsökning för denna teknik inkluderar att bestämma i) tillväxt- och spridningshastigheterna för cellinjer av intresse och ii) den tid som behövs för celler att fästa vid substratet före skjuvspänning. Forskare som använder detta protokoll kan välja att bedöma uttrycket av viktiga cytoskeletala och vidhäftande proteiner, såsom aktin, kadheriner och andra fokala adhesionsproteiner. Det är också nödvändigt att bestämma de kritiska spänningsmagnituder som krävs för att inducera optimal celldeformation för töjningsanalysprogramvaran (DIC).
Skjuvanalystekniken kan fungera som en effektiv teknik för att utforska de unika mekaniska beteendena och inneboende mekaniska egenskaperna hos olika typer av celler, vilket potentiellt kan hjälpa till med specifik och känslig identifiering och diagnoser som är oberoende av cellytmarkörer som vanligtvis används i nuvarande cancercelldiagnostiska metoder. Det ger också betydande förbättringar jämfört med befintliga mekaniska karakteriseringsmetoder som brister cellmembranet före testning.
Den unika skjuvanalystekniken har utforskats i stor utsträckning i över två decennier för karakterisering av beteendet hos biologiska celler och bestämning av deras mekaniska egenskaper. Denna experimentella inställning efterliknar nära effekterna av vätskeskjuvspänningar i kroppen genom att applicera kontrollerad vätskeskjuvspänning på celler in vitro. Normala och cancerceller observeras för att reagera på dessa påfrestningar annorlunda, och därmed ger denna teknik insikter om deras strukturella och mekaniska egenskaper och beteenden. Denna teknik har undersökts i flera tidigare studier för att bestämma cellernas viskoelastiska egenskaper, och intressant nog observerades signifikanta cellulära mekaniska skillnader i friska normala celler och cancerceller 3,4,9. Vidare observerades signifikanta intracellulära mekaniska skillnader mellan cellkärnan och cytoplasman hos celler. Dessa unika mekaniska egenskaper kan därför undersökas som potentiella mekaniska biomarkörer för detektion av olika cancerformer i kliniska miljöer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar tidigare forskare från Soboyejo-gruppen vid Worcester Polytechnic Institute som först var banbrytande för denna teknik: Drs. Yifang Cao, Jingjie Hu och Vanessa Uzonwanne. Detta arbete stöddes av National Cancer Institute (NIH / NCI K22 CA258410 till MD). Siffror skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| Centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| Gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| Micropipette | any | For sterile cell culture | |
| Micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| Pipetman | any | For sterile cell culture | |
| Pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| Magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| Magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| Methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| Syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
- Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).
- Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I.
- Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).
- Onwudiwe, K., et al. Investigation of creep properties and the cytoskeletal structures of non-tumorigenic breast cells and triple-negative breast cancer cells. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 110 (5), 1004-1020 (2022).
- Ani, C. J., et al. A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 91, 76-90 (2019).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomaterialia. 3 (4), 413-438 (2007).
- Cao, Y., et al. Investigation of the viscoelasticity of human osteosarcoma cells using a shear assay method. Journal of Materials Research. 21 (8), 1922-1930 (2006).
- Cao, Y. On the measurement of human osteosarcoma cell elastic modulus using shear assay experiments. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 18 (1), 103-109 (2007).
- Onwudiwe, K., et al. Actin cytoskeletal structure and the statistical variations of the mechanical properties of non-tumorigenic breast and triple-negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 119, 104505 (2021).
- Kirmizis, D., Logothetidis, S. Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics. International Journal of Nanomedicine. 5, 137-145 (2010).
- Haase, K., Pelling, A. E. Investigating cell mechanics with atomic force microscopy. Journal of the Royal Society. Interface. 12 (104), 20140970 (2015).
- Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society. Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
- Peterman, E. J. G., Gittes, F., Schmidt, C. F.
- Hochmuth, R. M.
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and corticcal tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophysical Journal. 56 (1), 151-160 (1989).
- Van Vliet, K. J., Bao, G., Suresh, S. The biomechanics toolbox: experimental approaches for living cells and biomolecules. Acta Materialia. 51 (19), 5881-5905 (2003).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
- Choi, H. Y., et al. Hydrodynamic shear stress promotes epithelial-mesenchymal transition by downregulating ERK and GSK3beta activities. Breast Cancer Research. 21 (1), 6 (2019).
- Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 17 (2018).
- Onwudiwe, K., Najera, J., Siri, S., Datta, M. Do tumor mechanical stresses promote cancer immune escape. Cells. 11 (23), 3840 (2022).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Mao, B. H., Nguyen Thi, K. M., Tang, M. J., Kamm, R. D., Tu, T. Y. The interface stiffness and topographic feature dictate interfacial invasiveness of cancer spheroids. Biofabrication. 15 (1), (2023).
- Kashani, A. S., Packirisamy, M. Cancer cells optimize elasticity for efficient migration. Royal Society Open Science. 7 (10), 200747 (2020).
- Riehl, B. D., Kim, E., Bouzid, T., Lim, J. Y. The role of microenvironmental cues and mechanical loading milieus in breast cancer cell progression and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 608526 (2021).
