Summary

Skjuvanalysprotokoll för bestämning av encelliga materialegenskaper

Published: May 19, 2023
doi:

Summary

Detta protokoll beskriver kvantifieringen av de mekaniska egenskaperna hos cancerösa och icke-cancerösa cellinjer in vitro. Bevarade skillnader i mekaniken hos cancerceller och normala celler kan fungera som en biomarkör som kan få konsekvenser för prognos och diagnos.

Abstract

Oregelbunden biomekanik är ett kännetecken för cancerbiologi som är föremål för omfattande studier. De mekaniska egenskaperna hos en cell liknar dem hos ett material. En cells motståndskraft mot stress och belastning, dess avslappningstid och dess elasticitet är alla egenskaper som kan härledas och jämföras med andra typer av celler. Kvantifiering av de mekaniska egenskaperna hos cancer (maligna) kontra normala (icke-maligna) celler gör det möjligt för forskare att ytterligare avslöja de biofysiska grunderna för denna sjukdom. Medan de mekaniska egenskaperna hos cancerceller är kända för att konsekvent skilja sig från de mekaniska egenskaperna hos normala celler, saknas ett standardexperimentellt förfarande för att härleda dessa egenskaper från celler i odling.

Detta dokument beskriver ett förfarande för att kvantifiera de mekaniska egenskaperna hos enskilda celler in vitro med hjälp av en vätskeskjuvningsanalys. Principen bakom denna analys innebär att vätskeskjuvspänning appliceras på en enda cell och optiskt övervakar den resulterande cellulära deformationen över tiden. Cellmekaniska egenskaper karakteriseras därefter med hjälp av digital bildkorrelation (DIC) -analys och anpassning av en lämplig viskoelastisk modell till experimentella data som genereras från DIC-analysen. Sammantaget syftar det protokoll som beskrivs här till att tillhandahålla en effektivare och mer målinriktad metod för diagnos av svårbehandlade cancerformer.

Introduction

Att studera de biofysiska skillnaderna mellan cancerceller och icke-cancerceller möjliggör nya diagnostiska och terapeutiska möjligheter1. Att förstå hur skillnader i biomekanik / mekanobiologi bidrar till tumörprogression och behandlingsresistens kommer att avslöja nya vägar för riktad terapi och tidig diagnos2.

Även om det är känt att cancercellernas mekaniska egenskaper skiljer sig från normala celler (t.ex. viskoelasticitet hos plasmamembranet och kärnhöljet)3,4,5, saknas robusta och reproducerbara metoder för att mäta dessa egenskaper i levande celler6. Skjuvanalysmetoden används för att kvantifiera cellernas mekaniska egenskaper genom att utsätta enskilda celler för vätskeskjuvspänning och analysera deras individuella svar och motstånd mot den applicerade spänningen 3,4,5,7,8,9. Även om flera metoder och tekniker har använts för att karakterisera de mekaniska egenskaperna hos enskilda celler, tenderar dessa att påverka cellmaterialets egenskaper genom att i) perforera / skada cellmembranet på grund av indragningsdjupet, komplexa spetsgeometrier eller substratförstyvning associerad med atomkraftmikroskopi (AFM) 10,11, ii) inducerande cellulär fotodamage under optisk fångst 12, 13, eller iii) inducerande av komplexa spänningstillstånd associerade med mikropipettaspiration14,15. Dessa externa effekter är förknippade med signifikanta osäkerheter i noggrannheten hos cellviskoelasticitetsmätningar 6,16,17.

För att ta itu med dessa begränsningar ger skjuvanalysmetoden som beskrivs här ett mycket kontrollerbart och enkelt tillvägagångssätt för att simulera fysiologiskt flöde i kroppen utan att påverka cellulära materialegenskaper i processen. Vätskeskjuvspänningar i denna analys representerar mekaniska påfrestningar som upplevs av celler i kroppen antingen av vätskor i tumörinterstitium eller i blodet under cirkulation18,19,20. Vidare främjar dessa vätskespänningar olika maligna beteenden i cancerceller, inklusive progression, migration, metastasering och celldöd 19,21,22,23 som varierar mellan tumörframkallande och icke-tumörframkallande celler. Dessutom tillåter de förändrade mekaniska egenskaperna hos cancerceller (dvs de är ofta “mjukare” än normala celler som finns inom samma organ) dem att kvarstå i fientliga tumörmikromiljöer, invadera omgivande normala vävnader och metastasera till avlägsna platser24,25,26. Genom att skapa en pseudobiologisk miljö där celler upplever fysiologiska nivåer av vätskeskjuvspänning uppnås en process som är fysiologiskt relevant och inte destruktiv för cellen. De cellulära svaren på dessa applicerade vätskeskjuvspänningar tillåter oss att karakterisera cellmekaniska egenskaper.

Detta dokument tillhandahåller ett skjuvanalysprotokoll för omfattande studier av de mekaniska egenskaperna och beteendet hos cancerceller och icke-cancerceller under applicerad skjuvspänning. Celler svarar på yttre krafter på ett elastiskt och visköst sätt och kan därför idealiseras som ett viskoelastiskt material3. Denna teknik kategoriseras i: (i) cellodling av dispergerade enskilda celler, (ii) kontrollerad applicering av vätskeskjuvspänning, (iii) in situ-avbildning och observation av cellulärt beteende (inklusive motståndskraft mot stress och deformation), (iv) töjningsanalys av celler för att bestämma graden av deformation, och (v) karakterisering av de viskoelastiska egenskaperna hos enskilda celler. Genom att undersöka dessa mekaniska egenskaper och beteenden kan komplex cellulär mekanobiologi destilleras till kvantifierbara data. Ett protokoll som beskriver denna metod möjliggör katalogisering av och jämförelse mellan olika maligna och icke-maligna celltyper. Att kvantifiera dessa skillnader har potential att etablera diagnostiska och terapeutiska biomarkörer.

Protocol

1. Förberedelse för encellsskjuvningstestet CellodlingFrö cirka 50 000 suspenderade enskilda celler i en 35 mm x 10 mm petriskål innehållande 2 ml odlingsmedia.OBS: Virvla de suspenderade cellerna före sådd för att bryta isär cellaggregat. Inkubera cellerna vid 37 °C och låt cellbindning och fullständig bildning av cytoskelettprotein ske mellan 10 och 48 timmar.OBS: Tänk på varaktigheten av cellulär bindning, såväl som proliferation och tillväxthasti…

Representative Results

Skjuvanalysprotokollet tillsammans med deformationsanalys med DIC och en viskoelastisk modell är framgångsrik i att kvantifiera de mekaniska egenskaperna hos en enda cell in vitro. Denna metod har testats på humana och murina cellinjer, inklusive normala humana bröstceller (MCF-10A)3,4,9, mindre metastaserande trippelnegativa bröstcancerceller (MDA-MB-468)3, trippelnegativa bröstcancerceller (MDA-MB-231)3, humana osteosarkomceller <sup…

Discussion

Skjuvanalysmetoden, som inkluderar att inrätta en pseudo-mekanobiologisk miljö för att simulera cellernas interaktion med den omgivande mekaniska mikromiljön och deras svar på mekaniska påfrestningar, har producerat en katalog över cellulära mekaniska egenskaper, vars mönster visar bevarad fysisk atypi bland cancercellinjer 3,4,5,7,8 . Denna metod kom…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna tackar tidigare forskare från Soboyejo-gruppen vid Worcester Polytechnic Institute som först var banbrytande för denna teknik: Drs. Yifang Cao, Jingjie Hu och Vanessa Uzonwanne. Detta arbete stöddes av National Cancer Institute (NIH / NCI K22 CA258410 till MD). Siffror skapades med BioRender.com.

Materials

CELL CULTURE
.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate Corning 25-053-ci For cellular detachment from substrate in cell culture
15 mL centrifuge tubes Falcon by Corning 05-527-90
35 mm Petri dishes Corning 430165
50 mL centrifuge tubes Falcon by Corning 14-432-22
centrifuge any For sterile cell culture
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x Corning 10-013-cv Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells
gloves any For sterile cell culture
Heracell Vios 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 51033770 For Incubation during cell culture
Hood any For sterile cell culture
micropipette any For sterile cell culture
micropipette tips any For sterile cell culture
Microscope Leica/any For sterile cell culture
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x Corning 21-040-CM
pipetman any For sterile cell culture
pipette tips any For sterile cell culture
Precision GP 10 liquid incubator Thermo Scientific TSGP02
T25 flask Corning 430639
T75 flask Corning 430641U
SHEAR ASSAY
100 mL beaker any For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
DMEM Corning
Flow chamber + rubber gasket Glycotech 31-001 Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes)
Hybrid Rheometer HR-2 Discovery Hybrid Rheometer For determination of shear fluid viscosity
magnetic stir bar any For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
magnetic stir plate any For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
methyl cellulose any To increase viscosity of DMEM in flow media
Syringe Pump KD Scientific Geminin 88 plus 788088 For programming fluid infusion and withdrawal
syringes, tubing, and connectors For shear apparatus setup
SOFTWARE
ABAQUS software Simulia
Digitial Image Correlation software LaVision, Germany DAVIS 10.1.2
Imaging software Leica/any microscope software
MATLAB MATLAB MATLAB_R2020B

References

  1. Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).
  2. Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I. Biomechanical properties of cancer cells. Cells. 10 (4), 887 (2021).
  3. Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).
  4. Onwudiwe, K., et al. Investigation of creep properties and the cytoskeletal structures of non-tumorigenic breast cells and triple-negative breast cancer cells. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 110 (5), 1004-1020 (2022).
  5. Ani, C. J., et al. A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 91, 76-90 (2019).
  6. Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomaterialia. 3 (4), 413-438 (2007).
  7. Cao, Y., et al. Investigation of the viscoelasticity of human osteosarcoma cells using a shear assay method. Journal of Materials Research. 21 (8), 1922-1930 (2006).
  8. Cao, Y. On the measurement of human osteosarcoma cell elastic modulus using shear assay experiments. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 18 (1), 103-109 (2007).
  9. Onwudiwe, K., et al. Actin cytoskeletal structure and the statistical variations of the mechanical properties of non-tumorigenic breast and triple-negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 119, 104505 (2021).
  10. Kirmizis, D., Logothetidis, S. Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics. International Journal of Nanomedicine. 5, 137-145 (2010).
  11. Haase, K., Pelling, A. E. Investigating cell mechanics with atomic force microscopy. Journal of the Royal Society. Interface. 12 (104), 20140970 (2015).
  12. Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society. Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
  13. Peterman, E. J. G., Gittes, F., Schmidt, C. F. Laser-induced heating in optical traps. Biophysical Journal. 84, 1308-1316 (2003).
  14. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
  15. Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and corticcal tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophysical Journal. 56 (1), 151-160 (1989).
  16. Van Vliet, K. J., Bao, G., Suresh, S. The biomechanics toolbox: experimental approaches for living cells and biomolecules. Acta Materialia. 51 (19), 5881-5905 (2003).
  17. Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
  18. Choi, H. Y., et al. Hydrodynamic shear stress promotes epithelial-mesenchymal transition by downregulating ERK and GSK3beta activities. Breast Cancer Research. 21 (1), 6 (2019).
  19. Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 17 (2018).
  20. Onwudiwe, K., Najera, J., Siri, S., Datta, M. Do tumor mechanical stresses promote cancer immune escape. Cells. 11 (23), 3840 (2022).
  21. Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
  22. Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
  23. Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
  24. Mao, B. H., Nguyen Thi, K. M., Tang, M. J., Kamm, R. D., Tu, T. Y. The interface stiffness and topographic feature dictate interfacial invasiveness of cancer spheroids. Biofabrication. 15 (1), (2023).
  25. Kashani, A. S., Packirisamy, M. Cancer cells optimize elasticity for efficient migration. Royal Society Open Science. 7 (10), 200747 (2020).
  26. Riehl, B. D., Kim, E., Bouzid, T., Lim, J. Y. The role of microenvironmental cues and mechanical loading milieus in breast cancer cell progression and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 608526 (2021).

Play Video

Cite This Article
Holen, L. J., Onwudiwe, K., Najera, J., Zarodniuk, M., Obayemi, J. D., Soboyejo, W. O., Datta, M. Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties. J. Vis. Exp. (195), e65333, doi:10.3791/65333 (2023).

View Video