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Biology

Enrichissement de la bibliothèque d’ARNm et de bisulfite-ARNm pour le séquençage de nouvelle génération

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65352
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

Summary

Ce protocole fournit un flux de travail facile à suivre pour effectuer la purification de l’ARN poly(A), la conversion du bisulfite et la préparation de la bibliothèque à l’aide d’un équipement normalisé pour un échantillon biologique d’intérêt.

Abstract

Les modifications post-transcriptionnelles de l’ARN dans divers types de transcrits d’ARN sont associées à une régulation diversifiée de l’ARN dans les cellules eucaryotes. Il a été démontré que les modifications aberrantes de l’ARN 5-méthylcytosine et l’expression dérégulée des ARN méthyltransférases sont associées à diverses maladies, y compris les cancers. Le séquençage au bisulfite à l’échelle du transcriptome a été développé pour caractériser les positions et les niveaux quantitatifs de méthylation de la cytosine dans l’ARN converti au bisulfite à la résolution de la paire de bases. Dans ce document, ce protocole présente en détail les procédures de deux cycles de purification de l’ARN poly(A), de trois cycles de réaction au bisulfite et de la préparation de la bibliothèque pour permettre la cartographie à l’échelle du transcriptome des sites de modification de l’ARNm 5-méthylcytosine. L’évaluation de la quantité et de la qualité de l’ARN après la réaction principale est essentielle pour surveiller l’intégrité de l’ARN et constitue une étape critique pour garantir des banques de séquençage de haute qualité. Idéalement, les procédures peuvent être terminées en trois jours. Avec ce protocole, l’utilisation d’ARN total de haute qualité comme entrée peut pratiquement constituer des banques robustes d’ARNm bisulfite pour le séquençage de nouvelle génération à partir de l’échantillon d’intérêt.

Introduction

Parmi plus de 150 types de modifications post-transcriptionnelles1, la modification de la 5-méthylcytosine (m5C) a été identifiée dans divers types d’ARN, y compris l’ARN ribosomique, l’ARN de transfert, l’ARN messager, le micro-ARN, l’ARN long non codant, l’ARN voûté, l’ARN enhancer et les ARN spécifiques du corps du petit cajal2. L’ARN m 5 C est associé à divers mécanismes biologiques et pathologiques tels que la régulation du développement racinaire des plantes 3, l’expressiondes gènes viraux4 et la progression du cancer5. L’objectif de ce protocole est de fournir des pipelines rationalisés pour caractériser le profil de modification de l’ARNm m5C à l’échelle du transcriptome d’échantillons biologiques à différents stades de développement ou dans le contexte de la maladie. Le séquençage au bisulfite à l’échelle du transcriptome a été développé pour caractériser les positions et les niveaux quantitatifs de méthylation de la cytosine dans l’ARN converti au bisulfite à la résolution de la paire de bases 6,7,8,9. Ceci est particulièrement utile lors de l’étude de l’association de m5C avec l’expression des gènes et le destin de l’ARN qui est impliqué dans les mécanismes de régulation biologique dans les cellules. Dans la cellule de mammifère, il existe deux lecteurs connus de m 5 C : ALYREF peut reconnaître m 5 C au niveau du noyau et sert de transporteur noyau d’ARNm vers cytosol10, tandis que YBX1 peut reconnaître m5C dans le cytoplasme et augmenter la stabilisation de l’ARNm11. Des ARNm m5C aberrants liés aux voies immunitaires ont été rapportés dans les lymphocytes T CD4+ du lupus érythémateux disséminé12. Des études ont révélé une association entre la modification de l’ARNm m5C et la modulation de l’immunité cancéreuse et la progression du cancer13,14. Par conséquent, la cartographie du profil de modification m5C sur l’ARNm peut fournir des informations cruciales pour élucider la machinerie réglementaire potentielle.

Pour étudier les rôles fonctionnels de lamodification de l’ARN m 5 C dans certaines conditions biologiques, les approches basées sur la conversion au bisulfite (bsRNA-seq) et l’enrichissement par affinité des anticorps telles que m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq et 5-Aza-seq peuvent être combinées avec la plate-forme de séquençage à haut débit pour fournir une détection efficace des régions et des séquences ciblées avec les modifications m5C à l’échelle du transcriptome15, Débloquer le niveau 16. L’avantage de ce protocole est d’obtenir le paysage complet de l’ARN m 5 C à une résolution à base unique, car l’approche basée sur l’enrichissement par affinité des anticorps repose sur la disponibilité d’anticorps de hautequalité et pourrait atteindre la résolution d’un seul fragment du paysage de méthylation m5C17.

Tous les échantillons d’ARN seront traités avec deux cycles d’enrichissement de l’ARNm à l’aide de billes d’oligo(dT), trois cycles de réaction au bisulfite et la préparation de la banque de séquençage. Pour surveiller la qualité de l’ARN, chaque échantillon d’ARN sera examiné par électrophorèse sur gel capillaire avant et après les procédures de purification de l’ARNm et de réaction au bisulfite afin d’évaluer la distribution des fragments. Les banques purifiées seront examinées en fonction de leurs qualités d’amplicon par PCR, de la distribution granulométrique des fragments d’ADN par électrophorèse sur gel capillaire et de leurs quantités globales examinées par des tests quantitatifs basés sur des colorants de fluorescence avant séquençage. Le système peut également être utilisé pour analyser un large éventail d’échantillons biologiques tels que des produits agricoles, des virions isolés, des lignées cellulaires, des organismes modèles et des échantillons pathologiques.

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Protocol

1. Purification de l’ARN poly(A)

REMARQUE : Utiliser l’ARN total traité avec la DNase I et examiner la qualité et l’intégrité de l’ARN total par électrophorèse capillaire ou conventionnelle sur gel avant de procéder à la purification de l’ARN poly(A). Les chercheurs devraient être en mesure d’identifier les bandes ribosomiques d’ARNr 28S et 18S dans le champ de poids moléculaire élevé et la bande d’ARNr 5,8S dans le champ de faible poids moléculaire sans bandes de frottis significatives dans l’électrophérogramme. Les étapes de purification suivent essentiellement les instructions du fabricant avec des modifications mineures indiquées dans les étapes spécifiques. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et instruments utilisés dans ce protocole.

  1. Préparation
    1. Réchauffez le réactif, le tampon de lavage, les billes d’oligo(dT) et le tampon de lyse à température ambiante pendant 30 minutes avant d’effectuer les procédures suivantes.
    2. Pour l’isolement de l’ARN enrichi en poly(A), préparer 10 à 20 μg d’une aliquote d’ARN total de haute qualité comme matière première en transférant une quantité adéquate d’ARN dans un tube de microcentrifugation sans nucléase de 1,5 mL. Incuber dans le bloc chauffant à 70 °C pendant 5 min, puis garder sur glace pendant 2 min.
      REMARQUE : Les quantités d’ARN total comme matière première doivent être ajustées de manière appropriée en fonction de la quantité souhaitée d’ARNm et de la nature des cellules utilisées. Empiriquement, l’ARN enrichi en poly(A) peut représenter 1 à 5 % de l’abondance de l’ARN total. Une aliquote de 10 μg d’ARN total de haute qualité devrait fournir un ARN enrichi en poly(A) de haute qualité dans la gamme de 100 à 500 ng pour la conversion en aval du bisulfite.
    3. Pendant ce temps, remettez complètement en suspension les billes oligo(dT). Transférez les quantités requises de suspension de billes dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml, puis placez-le sur l’aimant pendant 3 minutes jusqu’à ce que les billes magnétiques forment une pastille.
      REMARQUE : Utilisez des billes d’oligo(dT) de 50 μL pour 10 μg d’ARN total en entrée. Le volume des billes dans cette étape pourrait être encore optimisé en fonction des cellules utilisées.
    4. Retirez le surnageant et remettez en suspension les billes d’oligo(dT) avec des quantités égales (le volume de la suspension de billes utilisée à l’étape 1.1.3.) de tampon de lyse et placez-les sur l’aimant pendant 3 min avant de retirer le surnageant.
      REMARQUE : Ne séchez pas trop les perles ; L’utilisateur doit passer rapidement à l’étape 1.2.1.
  2. Le premier cycle de purification
    1. Ajouter le tampon de lyse dans le tube d’échantillon d’ARN (rapport de volume 4 :1) et bien mélanger avant de transférer dans les billes d’oligo(dT).
      REMARQUE : Si le volume de l’échantillon d’ARN est de 20 μL, ajouter 80 μL de tampon de lyse.
    2. Remettre en suspension l’ARN : mélange tampon de lyse et billes d’oligo(dT) complètement en pipetant au moins 10x.
    3. Laisser incuber les échantillons en rotation continue pendant 15 min à température ambiante.
    4. Placez l’échantillon sur l’aimant pendant 5 minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit clair ; Jeter le surnageant.
    5. Ajouter 600 μL de tampon de lavage 1 aux billes et mélanger soigneusement pour remettre les billes en suspension.
    6. Placez le tube sur l’aimant pendant 5 minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit clair, jetez le surnageant et répétez l’étape de lavage 1.2.5 une fois.
    7. Lavez les billes en ajoutant 300 μL de tampon de lavage 2 et remettez délicatement les billes en suspension.
    8. Placez le tube sur l’aimant pendant 5 minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit clair, jetez le surnageant et répétez l’étape de lavage 1.2.7 une fois.
    9. Ajouter 30 μL de Tris-HCl (tampon d’élution) à 10 mM froid dans le tube d’échantillon et incuber à 70 °C pendant 5 min.
    10. Transférez rapidement le tube sur l’aimant et, lorsque la suspension est claire après 20 s ou plus, transférez le surnageant contenant de l’ARN enrichi en poly(A) élué dans le nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
  3. Le deuxième cycle de purification
    1. Ajouter 120 μL (4 fois le volume de l’échantillon élué) tampon de lyse à l’échantillon d’ARN élué et bien mélanger.
    2. Lavez les billes utilisées lors du premier cycle de purification avec une quantité égale de tampon de lyse à l’étape 1.1.4, pipetez 10x pour remettre les billes en suspension, puis placez-les sur l’aimant pendant 5 min avant de jeter le surnageant.
    3. Transférez le mélange de tampon ARN : lyse sur les billes lavées et mélangez soigneusement en pipetant au moins 10 fois.
    4. Incuber l’échantillon en rotation continue pendant 15 min à température ambiante.
    5. Répétez les étapes 1.2.4 à 1.2.8 pour éliminer le sel et les autres sous-types d’ARN.
      REMARQUE : Le volume du tampon de lavage peut être réduit à 300 μL de tampon de lavage 1 et à 150 μL de tampon de lavage 2.
    6. Ajouter 25 μL (volume désiré) de Tris-HCl (tampon d’élution) à 10 mM froid dans le tube d’échantillon et incuber à 70 °C pendant 5 min.
    7. Transférez rapidement le tube sur l’aimant et, lorsque la suspension est claire après 20 s ou plus, transférez le surnageant contenant de l’ARN enrichi en poly(A) élué dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
    8. Transférez 2,2 μL dans des tubes à 8 bandelettes pour l’évaluation de la qualité de la quantité et de la qualité de l’ARN à l’aide de tests d’ARN à haute sensibilité.
    9. Conservez l’échantillon à -20 °C pendant de courtes périodes et à -70 °C pendant une période plus longue.
      REMARQUE : Il peut s’agir d’un point de pause dans le protocole.

2. Conversion du bisulfite

REMARQUE : Les étapes de centrifugation ont toutes été effectuées à température ambiante. Les procédures sont essentiellement exécutées conformément aux instructions du fabricant, mais avec une étape supplémentaire 2.2 pour l’ajout de la ou des séquences d’ARNm de contrôle de pointe avant l’étape 2.3 de la réaction au bisulfite.

  1. Transférez 19 μL d’échantillon d’ARN enrichi en poly(A) purifié dans un tube de 0,2 mL à 8 bandelettes.
  2. Ajouter 1,0 μL de contrôle de pointe, qui est exempt de toute modification au rapport de quantité prédéterminé de 1 :10 000 (c.-à-d. 0,1 ng d’ARNm de luciférase : 1 μg d’ARN enrichi en poly(A) purifié) dans l’échantillon d’ARN de l’étape 2.1.
    REMARQUE : La séquence de contrôle de pointe peut être l’ARN luciférase de Firefly, la Renilla luciférase ou la séquence d’ARN transcrite in vitro sans cytosines méthylées.
  3. Ajouter 130 μL de régent de conversion dans le tube et retourner doucement plusieurs fois pour bien mélanger.
  4. Placez le tube dans la machine PCR et effectuez trois cycles de chauffage à 70 °C pendant 10 min, suivis d’une incubation à 64 °C pendant 45 min chacun, puis d’une dernière étape pour refroidir à 4 °C.
  5. Placez la colonne sur le tube de collecte et transférez 250 μL de tampon de liaison à l’ARN dans la colonne.
  6. Transférez l’échantillon de l’étape 2.4 à la colonne de l’étape 2.5 et pipetez soigneusement.
  7. Ajoutez 400 μL d’éthanol à 95-100 % dans la colonne, fermez rapidement le bouchon et inversez plusieurs fois.
  8. Centrifuger à 10 000 × g pendant 30 s à 25 °C et jeter l’écoulement.
  9. Ajouter 200 μL de tampon de lavage d’ARN dans la colonne.
  10. Centrifuger à 10 000 × g pendant 30 s à 25 °C et jeter l’écoulement.
  11. Ajouter 200 μL de tampon de désulfonation et incuber à température ambiante pendant 30 min.
  12. Centrifuger à 10 000 × g pendant 30 s à 25 °C et jeter l’écoulement.
  13. Ajouter 400 μL de tampon de lavage d’ARN et centrifuger à 10 000 × g pendant 30 s à 25 °C et jeter l’écoulement. Répétez cette étape une fois.
  14. Centrifuger à nouveau à 10 000 × g pendant 2 min à 25 °C pour éliminer complètement le tampon de lavage résiduel.
    REMARQUE : L’autre étape de centrifugation 2.14 pendant 2 minutes avant l’élution consiste à éliminer complètement le tampon de lavage. L’étape de lavage est effectuée deux fois pour éliminer le composant riche en sel du réactif de bisulfite et du tampon de désulfonation sur la colonne.
  15. Transférez la colonne dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
  16. Ajouter 20 à 30 μL de H2O sans nucléase dans la colonne et laisser reposer à température ambiante pendant 1 min.
  17. Centrifugeuse à 10 000 × g pendant 30 s à 25 °C.
  18. Transférez 2,2 μL dans des tubes à 8 bandelettes pour l’évaluation de la quantité et de la qualité de l’ARN.
  19. Conservez l’échantillon d’ARN traité au bisulfite à -20 °C pendant de courtes périodes et à -70 °C pendant une période plus longue.
    REMARQUE : Il peut s’agir d’un point de pause dans le protocole.

3. Préparation d’une banque d’ARNm traitée au bisulfite

REMARQUE : Suivez la section 4 du protocole d’instructions de préparation de la bibliothèque pour une utilisation avec de l’ARNm purifié ou de l’ARN appauvri en ARNr. La première étape d’amorçage doit suivre le protocole de l’ARN FFPE puisque le traitement au bisulfite fragmente l’ARN. Effectuez chaque étape dans la hotte à flux laminaire et ajoutez le mélange réactionnel sur une grille de refroidissement glacée.

  1. Amorçage de l’ARN d’entrée
    1. Transférez la quantité désirée d’échantillon d’ARNm traité au bisulfite dans un maximum total de 5 μL ou ajoutez H2O sans nucléase pour obtenir un total de 5 μL.
      REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser au moins 10 ng d’ARNm traité au bisulfite en entrée pour ce type de préparation de la banque d’ARN et pour générer la molarité finale du produit de la bibliothèque de 4 nM.
    2. Ajouter 1 μL d’apprêt aléatoire (lilas) à l’échantillon et mélanger par pipetage.
    3. Placez le tube d’échantillon dans la machine PCR préréglée à 65 °C et le couvercle à 105 °C pendant 5 min et maintenez-le à 4 °C.
  2. Synthèse de l’ADNc premier brin
    1. Ajouter 4 μL de tampon de réaction de synthèse (lilas), 8 μL de réactif de spécificité de brin (brun) et 2 μL de mélange d’enzymes de synthèse (brun) à l’échantillon, ce qui donne un volume total de 20 μL. Bien mélanger en pipetant au moins 10 fois et essorer rapidement.
    2. Placez le tube d’échantillon dans la machine PCR préréglée à 25 °C pendant 10 min, 42 °C pendant 50 min, 70 °C pendant 15 min et maintenez-le à 4 °C.
      REMARQUE : Pour les inserts de plus de 200 bases, une période d’incubation de 42 °C de 50 min est suggérée ; pour les plaquettes d’une taille inférieure à 200 bases, une période d’incubation de 42 °C de 15 min est suggérée.
  3. Synthèse de l’ADNc deuxième brin
    1. Ajouter 8 μL de tampon de réaction de synthèse avec le mélange dUTP (orange), 4 μL de mélange d’enzymes de synthèse (orange) et 48 μL de H2O sans nucléase. Bien mélanger en pipetant au moins 10 fois et essorer rapidement.
    2. Placez le tube d’échantillon dans la machine PCR préréglée à 16 °C pendant 1 h avec le couvercle éteint ou ≤40 °C.
  4. Purification de l’ADNc double brin avec des billes de purification d’ADN
    1. Préchauffer les billes de purification de l’ADN 30 min avant de procéder à la purification et au vortex pour remettre les billes en suspension.
    2. Ajouter 144 μL de billes de purification d’ADN remises en suspension à l’échantillon d’ADNc de l’étape 3.3.2 et bien mélanger en pipetant au moins 10 fois.
    3. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
    4. Placez le tube d’échantillon sur une grille magnétique pendant 5 min jusqu’à ce que la solution soit claire, puis retirez le surnageant et conservez les billes qui contiennent l’ADN.
    5. Ajouter 200 μL d’éthanol fraîchement fabriqué à 80 % dans le tube avec les billes tout en conservant l’échantillon sur la grille magnétique et incuber à température ambiante pendant 30 s.
    6. Retirez le surnageant et répétez l’étape 3.4.5 une fois, mais cette fois avec précaution pour retirer tout le surnageant résiduel.
    7. Séchez les perles à l’air libre pendant 1 à 5 minutes tout en gardant l’échantillon sur l’aimant.
      REMARQUE : Ne séchez pas trop les perles ; La couleur doit être brun foncé.
    8. Retirez l’échantillon du rack magnétique et éluez l’ADN en ajoutant 53 μL de tampon 0,1x TE (10 mM Tris-HCl et 1 mM EDTA, pH 8,0) aux billes. Bien mélanger en pipetant au moins 10 fois et incuber à température ambiante pendant 2 min.
    9. Placez le tube sur la grille magnétique pendant 5 minutes ou jusqu’à ce que la solution soit claire.
    10. Transférez 50 μL de surnageant contenant de l’ADNc double brin dans un nouveau tube à 8 bandelettes.
      REMARQUE : Le protocole peut être arrêté à ce stade et l’échantillon peut être stocké à -30 °C.
  5. Fin de la préparation de la banque d’ADNc
    1. Ajouter 7 μL de tampon de réaction de polissage (vert) et 3 μL de mélange d’enzymes de polissage (vert) à l’échantillon d’ADNc double brin élué.
    2. Mélangez le mélange en pipetant 10 fois avec un volume de 50 μL sans créer de bulles, puis faites tourner rapidement l’échantillon.
    3. Placez l’échantillon dans un appareil PCR et incubez-le à 20 °C pendant 30 min, 65 °C pendant 30 min et maintenez-le à 4 °C.
  6. Ligature de l’adaptateur
    1. Diluez l’adaptateur (rouge) selon les instructions du fabricant.
    2. Ajouter 2,5 μL de l’adaptateur dilué, 1 μL d’activateur de ligature (rouge) et 30 μL de Ligation Master Mix (rouge) à l’échantillon.
    3. Mélangez le mélange en pipetant 10 fois avec un volume de 80 μL sans créer de bulles, puis faites tourner rapidement l’échantillon.
    4. Placez l’échantillon dans un appareil PCR et incubez à 20 °C pendant 15 min.
    5. Ajouter 3 μL du mélange d’uracile ADN glycosylase et d’ADN glycosylase-lyase endonucléase VIII (bleu) à l’échantillon et pipeter soigneusement.
    6. Remettez l’échantillon dans l’appareil PCR et incubez à 37 °C pendant 15 min avec le couvercle réglé à 75 °C.
  7. Purification d’ADNc traités par réaction de ligature
    REMARQUE : La sélection de la taille avec les perles SPRIselect ou, en option, avec les perles AMpure XP peut être utilisée à cette fin18.
    1. Préchauffez les billes 30 min avant de procéder à la purification et au vortex pour les remettre en suspension.
    2. Transférez 25 μL de billes remises en suspension dans l’échantillon d’ADNc de l’étape 3.6.6 et mélangez soigneusement en pipetant au moins 10 fois.
    3. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
    4. Placez le tube d’échantillon sur une grille magnétique pendant 5 minutes jusqu’à ce que la solution soit claire, puis transférez le surnageant dans un nouveau tube à 8 bandes et jetez les billes.
    5. Ajouter 10 μL de billes remises en suspension dans le surnageant et bien mélanger en pipetant au moins 10 fois.
    6. Placez le tube d’échantillon sur une grille magnétique pendant 5 minutes jusqu’à ce que la solution soit claire, puis jetez le surnageant et ne dérangez pas les billes.
    7. Ajouter 200 μL d’éthanol fraîchement fabriqué à 80 % dans le tube avec les billes tout en conservant l’échantillon sur la grille magnétique et incuber à température ambiante pendant 30 s.
    8. Retirez le surnageant et répétez l’étape 3.7.7 une fois, mais cette fois avec précaution tout le surnageant résiduel.
    9. Faites sécher les billes à l’air libre pendant 1 à 5 minutes tout en gardant l’échantillon sur l’aimant.
      REMARQUE : Ne séchez pas trop les perles ; La couleur doit être brun foncé.
    10. Retirez l’échantillon du rack magnétique et éluez l’ADN en ajoutant 17 μL de tampon TE 0,1x aux billes. Bien mélanger en pipetant au moins 10 fois et incuber à température ambiante pendant 2 min.
    11. Placez le tube sur la grille magnétique pendant 5 minutes jusqu’à ce que la solution soit claire.
    12. Transférez 15 μL de surnageant, qui contient l’ADNdb préparé à l’extrémité cible, dans un nouveau tube à 8 bandelettes.
  8. Enrichissement par PCR de l’ADN ligaturé par adaptateur
    1. Ajouter 25 μL de mélange maître (bleu), 5 μL d’amorce adaptateur 5' et 5 μL d’amorce adaptateur 3' à l’échantillon d’ADN ligaturé par adaptateur. Bien mélanger en pipetant au moins 10 fois.
    2. Placez l’échantillon dans l’appareil PCR et effectuez l’amplification PCR en suivant les étapes suivantes : (1) 98 °C pendant 30 s, (2) 98 °C pendant 10 s, (3) 65 °C pendant 75 s, (4) 65 °C pendant 5 min et (5) maintenir à 4 °C ; dans lequel les étapes (2) et (3) doivent être répétées pour un numéro de cycle N+2 où N est égal à la quantité d’ARN d’entrée dans le manuel d’instructions. Cela signifie que 2 cycles supplémentaires sont nécessaires en raison de la sélection de la taille des échantillons recto-verso effectuée à l’étape 3.7.
      REMARQUE : Par exemple, 8 ng de l’entrée d’ARNm purifié seraient recommandés avec 9 à 10 cycles de PCR ; mais avec l’ADNc ligaturé double face, de taille sélectionnée à l’étape 3.7, le cycle de PCR recommandé serait de 11 à 12 cycles.
  9. Purification de banques amplifiées par PCR
    1. Préchauffez les billes de purification de l’ADN pendant 30 min avant de procéder à la purification et au vortex pour remettre les billes en suspension.
    2. Transférez 45 μL (0,9x) de billes remises en suspension dans le produit PCR à partir de l’étape 3.8.2 et mélangez bien en pipetant au moins 10x.
    3. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
    4. Placez le tube d’échantillon sur une grille magnétique pendant 5 minutes jusqu’à ce que la solution soit claire, puis retirez le surnageant et conservez les billes qui contiennent l’ADN.
    5. Ajoutez 200 μL d’éthanol fraîchement fabriqué à 80 % dans le tube avec les billes, laissez l’échantillon sur la grille magnétique et laissez-le reposer à température ambiante pendant 30 s.
    6. Retirez le surnageant et répétez l’étape 3.9.5 une fois, mais cette fois avec précaution pour éliminer tout le surnageant résiduel.
    7. Faites sécher les billes à l’air libre pendant 1 à 5 minutes tout en gardant l’échantillon sur l’aimant.
      REMARQUE : Ne séchez pas trop les perles ; La couleur doit être brun foncé.
    8. Prélevez l’échantillon du rack magnétique et ajoutez 22 μL de tampon TE 0,1x aux billes pour éluer l’ADN. Bien mélanger en pipetant au moins 10 fois et incuber à température ambiante pendant 2 min.
    9. Placez le tube sur la grille magnétique et laissez-le reposer pendant 5 minutes ou jusqu’à ce que la solution soit claire à température ambiante.
    10. Transférez 20 μL de surnageant dans un nouveau tube à 8 bandes.
    11. Transférez 2,2 μL dans des tubes à 8 bandes pour l’évaluation de la qualité de la quantité et de la qualité de la bibliothèque.
      REMARQUE : La quantité de la bibliothèque peut également être détectée par qPCR (voir le tableau des matériaux).
    12. Conservez l’échantillon de la banque bsRNA-seq à -20 °C.

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Representative Results

Une série de banques de séquençage de l’ARNb à partir de lignéescellulaires 19 a été générée en suivant les procédures décrites dans ce rapport (Figure 1). Après une purification totale de l’ARN accompagnée d’un traitement à la DNase effectué sur des échantillons de lignées cellulaires et la vérification de la qualité par électrophorèse sur gel et spectrophotométrie UV-Vis (A260/A280), l’échantillon d’ARN peut procéder à l’enrichissement en ARN poly(A). Pour déterminer si la double purification pouvait éliminer la majorité de l’ARN ribosomique, l’efficacité de purification de l’ARN poly(A) a été évaluée par un test d’ARN total par électrophorèse capillaire qui peut calculer automatiquement le pourcentage de contamination par ARNr (Figure 2). À partir du modèle de pic des fragments d’ARN et du pourcentage de contamination par l’ARNr, les échantillons d’ARN avec double purification ont en effet montré une diminution de la contamination de l’ARN ribosomique de 6,5 % à 2,2 % et de 2,6 % à 1,1 % dans AsPC-1 et BxPC-3, respectivement. Avec des lignées cellulaires de cancer du pancréas humain, deux cycles de purification de billes pourraient atteindre une moyenne de 2,8 ± 1% d’ARN enrichi en poly(A) à partir des échantillons d’ARN totaux. Par conséquent, l’enrichissement en ARN poly(A) par des billes d’oligo(dT) avec des étapes de purification doubles a minimisé l’ARN ribosomique et représente un enrichissement d’échantillon d’ARNm réalisable pour les expériences en aval.

Les protocoles de conversion au bisulfite ont été rapportés dans plusieurs études sur la modification de l’ARN 5-méthylcytosine (tableau 1). La réaction au bisulfite peut être réalisée avec un mélange réactionnel reconstitué par l’utilisateur composé de 40 % de bisulfite de sodium et de 600 mM d’hydroquinone dans la solution aqueuse (pH 5,1) à 75 °C pendant 4 heures10,20,21. Alternativement, un traitement plus rigoureux au bisulfite de l’échantillon d’ARN peut également être effectué avec un kit commercial ; qui, dans un certain nombre d’études menées par d’autres et les nôtres 6,22,23,24, a prolongé le temps de réaction du bisulfite à trois cycles d’incubation. Étant donné que l’étape d’incubation à trois cycles convertit efficacement la cytosine non méthylée dans le segment8 de l’ARNr d’Escherichia coli 16S transcrit in vitro et structurellement plus replié, l’étape d’incubation à trois cycles a également été appliquée dans ce protocole.

Avec un enrichissement en poly(A deux fois) et la conversion en trois cycles du bisulfite, la qualité de l’ARN avant et après la réaction a été évaluée par électrophorèse capillaire. La distribution de la taille de l’ARN après le traitement au bisulfite a montré un pic de ~200-500 nucléotides en raison de la fragmentation causée par la réaction au bisulfite (Figure 3). De plus, l’ARNb fragmenté est idéal pour la préparation d’une banque sans qu’il soit nécessaire d’effectuer une autre étape de fragmentation. Un total de 8 à 10 ng d’ARNb en entrée a été utilisé pour construire la bibliothèque selon ce protocole en utilisant 9 à 11 cycles dans l’amplification PCR finale de l’ADN ligaturé par adaptateur. L’électrophorèse capillaire de l’amplicon a montré une préparation assez réussie de la bibliothèque, avec seulement une petite partie de l’amorce restante et aucun pic de suramplification (Figure 4). Pour vérifier l’efficacité de conversion dans chaque bibliothèque d’échantillons, l’ARN luciférase non méthylé de luciole a été ajouté à l’échantillon avant d’effectuer le traitement au bisulfite. Après que les lectures de séquençage aient été alignées sur la séquence de référence à l’aide des kits d’outils meRanTK25, la moyenne de 2 440 (0,006 %) des lectures totales a été mappée à la séquence de pointe, et le taux de conversion total de C-to-T analysé a atteint une moyenne de 99,81 % ; l’état peut être consulté dans la visionneuse de génomique intégrée (Figure 5).

Figure 1
Figure 1 : Diagramme de déroulement du séquençage de l’ARNm au bisulfite. Le pipeline se compose de trois protocoles principaux, dont l’enrichissement de l’ARNm, la conversion du bisulfite et la préparation de la bibliothèque. Abréviation : ARNb = ARNm bisulfite ; QC. = contrôle de la qualité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Résultats du contrôle de la qualité d’échantillons d’ARN enrichis en poly(A) par électrophorèse capillaire. (A) Le profil représentatif de l’électrophorèse capillaire de l’ARN total des cellules BxPC-3. (B) Les profils représentatifs d’électrophorèse capillaire d’échantillons traités par purification oligo(dT) à partir de cellules AsPC-1 et BxPC-3. ARNm E1, élution d’ARNm à partir d’une purification unique ; ARNm E2, élution d’ARNm à partir d’une purification deux fois. Les estimations de la contamination par l’ARNr ont été calculées par le système d’opération d’électrophorèse qui contrôle le test d’analyse de l’ARN total. (C) Le profil d’électrophorèse capillaire des marqueurs Ladder a été obtenu au cours du même cycle avec des échantillons présentés dans le panneau B. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Évaluation de la qualité des échantillons d’ARN par électrophorèse capillaire. Les profils représentatifs de l’électrophorèse capillaire (A) de l’ARN total, (B) de l’ARNm enrichi en poly(A) à partir de deux fois la purification, et (C) de l’ARNm traité au bisulfite des cellules BxPC-3. Abréviations : B_empty = cellules BxPC-3 transduites avec un vecteur vide ; B_shScr = cellules BxPC-3 transduites avec les séquences de brouillage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Évaluation de la qualité des banques de bsRNA-seq. (A-C) Trois ensembles de profils représentatifs d’électrophorèse capillaire de banques de séquençage de l’ARNb construites, amplifiés par PCR à différents numéros de cycle de PCR de 9 et 11 cycles en utilisant l’ARNb d’un ensemble de cellules BxPC-3. La quantité d’entrée estimée de l’ARN traité au bisulfite a été déterminée par un test de quantification de l’ARN à haute sensibilité. Au total, 8, 8,4 et 9,6 ng d’ARNb ont été utilisés dans les échantillons fictifs (A) de BxPC-3, (B) de BxPC-3 vide et (C) de BxPC-3 shN2UN2, respectivement. Le marqueur de l’échelle culmine à 35 pb et les 10 380 pb représentent les étalons internes de la limite inférieure et supérieure du profil d’électrophorèse de chaque échantillon. Un pic proéminent d’environ 100 pb et un pic obscur d’environ 127 pb, respectivement, indiquent les amorces PCR (<100 pb) et l’adaptateur-dimère (~127 pb), qui sont restés dans l’éluat après le nettoyage de la PCR. Abréviations : BxPC-3 mock = cellules BxPC-3 non transduites ; BxPC-3 vide = cellules BxPC-3 transduites avec le contrôle vectoriel vide ; BxPC-3 shN2UN2 = cellules BxPC-3 transduites avec les constructions shNSUN2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Les profils d’alignement de séquence de chaque banque de bsRNA-seq mappés à la séquence de référence de contrôle de pointe. Les profils d’alignement représentatifs des banques BxPC-3 bsRNA-seq simulées, vides, brouillées et shNSUN2 avec la séquence de référence de contrôle de la luciférase de luciférase (indiquée par le gène « Z ») ; 2 régions représentatives ont été représentées. Les barres grises indiquent toutes les lectures qui présentent des nucléotides consensus correspondants à la position de base indiquée par rapport à la séquence de référence. Les barres rouges mettent en évidence l’identité de la thymidine (T) à la position de base des lectures ; Les barres bleues indiquent les lectures ayant l’identité de la cytosine (C) à la position. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Comparaison des protocoles de réaction au bisulfite et du taux de conversion. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Dans ce protocole, un pipeline détaillé d’enrichissement en poly(A), de conversion de bisulfite et de préparation de la bibliothèque a été réalisé en utilisant des composants standardisés. D’autres analyses de séquençage ont permis d’identifier l’ARNm 5-méthylcytosine dans des échantillons d’intérêt.

L’étape critique est la qualité du matériau de départ - l’ARN total - car la dégradation de l’ARN aurait un impact sur le taux de récupération de la purification de l’ARN poly(A). L’échantillon doit être manipulé avec précaution et la contamination par la RNase doit être évitée avant de procéder à l’étape de purification de l’ARN poly(A). Une autre partie cruciale de la procédure est le nombre de cycles de PCR dans la préparation de la bibliothèque. La décision du nombre de cycles dépend de la quantité d’ARNm traité au bisulfite utilisée pour la préparation de la banque et de l’utilisation d’une sélection de taille unique ou double dans l’étape précédant la PCR. Les numéros de cycle appropriés pour l’échantillon d’intérêt nécessiteraient donc un essai et une évaluation de la distribution granulométrique du produit PCR par électrophorèse capillaire afin de déterminer le numéro de cycle optimal pour la même lignée cellulaire ou le même tissu.

Dans ce protocole, deux cycles de purification de billes d’oligo(dT) ont été utilisés pour enrichir et purifier l’ARN poly(A) et éliminer une majorité d’ARN ribosomique et d’autres ARN. Il existe d’autres méthodes pour éliminer l’ARN ribosomique et conserver d’autres types d’ARN dans l’échantillon, comme l’appauvrissement oligo-basé sur l’ARNr26. Ensuite, la modification de la 5-méthylcytosine présente dans d’autres types d’ARN peut également être prise en analyse et étendre la compréhension des caractéristiques de la 5-méthylcytosine dans l’ARNm et d’autres ARN.

La réaction au bisulfite est connue pour ne pas êtrecapable de distinguer m 5 C des autres modifications, y compris la 5-hydroxyméthylcytosine (hm5C), la 3-méthylcytidine (m3C) et la N4-méthylcytidine (m4C)27. Cependant, le plan expérimental incluant le knockdown ou le knock-out de l’ARN m 5 C méthyltransférase devrait fournir des preuvesinformatives de l’existence de sites m5C régulés à haut degré de confiance. De plus, la validation à l’aide de différentes méthodes telles que l’enrichissement à base d’anticorps suivi d’un séquençage ou de méthodes PCR ou LC-MS/MS pourrait essentiellement authentifier les sites candidats m5C16. La technique émergente de séquençage direct de l’ARN par nanopores permet également d’identifier potentiellement la modification de l’ARN via l’analyse informatique du signal actuel ou des caractéristiques d’erreur dites de base28,29,30.

Une étude récente de Johnson et al. a montré que l’ajout de l’étape de fragmentation dans des échantillons d’ARN de mitochondries après trois cycles de conversion au bisulfite montrait en effet un taux de conversion plus élevé et augmentait le rendement du produit de la bibliothèque d’ADNc31. Cet article a spécifiquement analysé le taux de conversion et la qualité des lectures correspondant au génome des mitochondries, et non au transcriptome de l’ARNm. Par conséquent, l’utilisation de l’étape de fragmentation a été mise à jour dans le tableau 1 pour indiquer si les rapports publiés comprenaient une étape de fragmentation de l’ARN afin que les observateurs puissent facilement reproduire le protocole. Une autre étude de Zhang et al. a démontré que l’utilisation d’une bibliothèque d’ARN transcrite in vitro sans modification comme contrôle négatif est efficace pour éliminer le signal faussement positif du traitement au bisulfite32. Des études récentes ont comparé différents protocoles utilisés pour la construction de bibliothèques33. L’utilisateur peut en outre choisir d’effectuer un pipeline de séquençage de l’ARNb avec ou sans étape de fragmentation supplémentaire et une bibliothèque d’ARN transcrite in vitro sans modification pour personnaliser le flux de travail approprié.

L’identification à l’échelle du transcriptome de m5C par différents principes pourrait renforcer les résultats des paysages de modification et permettre une meilleure compréhension des mécanismes de régulation des modifications de l’ARN dans des modèles sains ou pathologiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Conseil national de la science et de la technologie de Taïwan. [NSTC 111-2314-B-006-003]

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System Agilent, Santa Clara, CA RNA quality detection
AMpure XP beads Beckman Coulter A63881 purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-4626 DNA quality detection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-1513 RNA quality detection
DiaMag02 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000001 assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000003 assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 61011 poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol J.T.Baker 64-17-5
EZ RNA methylation kit Zymo, Irvine, CA R5002 bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA Promega, Madison, WI, USA L4561 spike in control seqeunce 
KAPA Library Quantification Kits Roche, Switzerland KK4824 library quantification
Nanodrop spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) New England Biolabs, Ipswich, MA E7335S library preparation
NEBNext Ultra Equation 1 Directional RNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs, Ipswich, MA E7760S library preparation
Nuclease-free Water Thermo Fisher Scientific AM9932
P2 pipetman Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 4641010
Qubit 2.0 fluorometer  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32854 DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32852 RNA quantity detection

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Chen, S. Y., Huang, P. H. Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (197), e65352, doi:10.3791/65352 (2023).

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