Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Anrikning av mRNA- och bisulfit-mRNA-biblioteksberedning för nästa generations sekvensering

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65352
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

Summary

Detta protokoll ger ett arbetsflöde som är lätt att följa för att utföra poly(A) RNA-rening, bisulfitomvandling och biblioteksberedning med hjälp av standardiserad utrustning för ett biologiskt prov av intresse.

Abstract

RNA-posttranskriptionsmodifieringar i olika typer av RNA-transkript är associerade med olika RNA-reglering i eukaryota celler. Avvikande RNA 5-metylcytosinmodifieringar och det dysreglerade uttrycket av RNA-metyltransferaser har visat sig vara associerade med olika sjukdomar, inklusive cancer. Transkriptomomfattande bisulfitsekvensering utvecklades för att karakterisera positionerna och de kvantitativa cytosinmetyleringsnivåerna i det bisulfitomvandlade RNA:t vid basparsupplösningen. Häri presenterar detta protokoll procedurerna för två omgångar av poly(A) RNA-rening, tre cykler av bisulfitreaktion och biblioteksförberedelse i detalj för att möjliggöra transkriptomomfattande kartläggning av mRNA 5-metylcytosinmodifieringsställen. Bedömningen av RNA-kvantitet och -kvalitet efter huvudreaktionen är avgörande för att övervaka RNA-integriteten och är ett kritiskt steg för att säkerställa sekvenseringsbibliotek av hög kvalitet. Helst kan procedurerna slutföras inom tre dagar. Med detta protokoll kan man genom att använda högkvalitativt total-RNA som ingång praktiskt bygga upp robusta bisulfit-mRNA-bibliotek för nästa generations sekvensering från det aktuella provet.

Introduction

Bland över 150 typer av post-transkriptionella modifieringar1 har modifiering av 5-metylcytosin (m5C) identifierats i olika typer av RNA, inklusive ribosomalt RNA, transfer-RNA, budbärar-RNA, mikro-RNA, långt icke-kodande RNA, valv-RNA, förstärkar-RNA och små cajal-kroppsspecifika RNA2. RNA m 5 C är associerat med olika biologiska och patologiska mekanismer såsom reglering av växtrotutveckling3, viralt genuttryck4 och cancerprogression5. Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla strömlinjeformade pipelines för att karakterisera den transkriptomomfattande mRNA m5C-modifieringsprofilen för biologiska prover i olika utvecklingsstadier eller i sjukdomsmiljön. Transkriptomomfattande bisulfitsekvensering utvecklades för att karakterisera positionerna och de kvantitativa cytosinmetyleringsnivåerna i det bisulfitomvandlade RNA:t vid basparsupplösning 6,7,8,9. Detta är särskilt användbart när man studerar sambandet mellanm5C och genuttryck och RNA-öde som är involverat i de biologiska regleringsmekanismerna i celler. I däggdjurscellen finns det två kända m 5 C-läsare: ALYREF kan känna igen m 5 C vid kärnan och fungerar som en mRNA-kärna-till-cytosol-transportör10, medan YBX1 kan känna igen m5C i cytoplasman och ökamRNA-stabiliseringen11. Avvikande m5C-mRNArelaterade till immunvägar rapporterades i systemiska lupus erythematosus CD4+ T-celler12. Studier har visat ett samband mellan mRNAm5C-modifiering och modulering av cancerimmunitet och cancerprogression13,14. Kartläggning avm5C-modifieringsprofilen på mRNA kan därför ge viktig information för att belysa det potentiella regulatoriska maskineriet.

För att undersöka de funktionella rollerna för RNA m5 C-modifiering under vissa biologiska förhållanden kan de bisulfitomvandlingsbaserade (bsRNA-seq) och antikroppsaffinitetsanrikningsbaserade metoderna såsom m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq och 5-Aza-seq kombineras med sekvenseringsplattformen med hög genomströmning för att ge effektiv detektion av målregioner och sekvenser med m5C-modifieringarna på en transkriptomomfattande skala15, 16. veckor Fördelen med detta protokoll ger det omfattande RNA m 5 C-landskapet med en enda basupplösning eftersom den antikroppsaffinitetsanrikningsbaserade metoden är beroende av tillgången på antikroppar av hög kvalitet och kan uppnå upplösningen av ett fragment av m5C-metyleringslandskap17.

Alla RNA-prover kommer att bearbetas med två omgångar mRNA-anrikning med oligo(dT)-pärlor, tre cykler av bisulfitreaktion och sekvenseringsbibliotekets beredning. För att övervaka RNA-kvaliteten kommer varje RNA-prov att undersökas med kapillärgelelektrofores före och efter procedurerna för mRNA-rening och bisulfitreaktion för att bedöma fragmentfördelningen. De renade biblioteken kommer att undersökas med hjälp av deras PCR-amplikonkvaliteter, DNA-storleksfördelningsfragment med kapillärgelelektrofores och deras totala kvantiteter kommer att undersökas med fluorescensfärgningsbaserade kvantitativa analyser före sekvensering. Systemet kan också användas för att analysera ett brett spektrum av biologiska prover såsom jordbruksprodukter, isolerade virioner, cellinjer, modellorganismer och patologiska prover.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rening av poly(A)RNA

OBS: Använd det totala RNA som behandlats med DNas I och undersök den totala RNA-kvaliteten och integriteten genom kapillär eller konventionell gelelektroforesbedömning innan du fortsätter till poly(A) RNA-rening. Utredarna bör kunna identifiera 28S och 18S rRNA-ribosombanden i högmolekylviktsfältet och 5,8S rRNA-bandet i lågmolekylviktsfältet utan några signifikanta utstryksband i elektroferogrammet. Reningsstegen följer i huvudsak tillverkarens instruktioner med mindre ändringar som anges i de specifika stegen. Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material och instrument som används i detta protokoll.

  1. Förberedelse
    1. Värm upp reagens, tvättbuffert, oligo(dT)-pärlor och lyseringsbuffert i rumstemperatur i 30 minuter innan du utför följande procedurer.
    2. För isolering av poly(A)-anrikat RNA, bered 10–20 μg av en alikvot av högkvalitativt total-RNA som utgångsmaterial genom att överföra en tillräcklig mängd RNA till ett nukleasfritt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Inkubera i värmeblocket vid 70 °C i 5 min, lägg sedan isen i 2 min.
      OBS: Mängderna totalt RNA som utgångsmaterial bör justeras på lämpligt sätt beroende på önskad mängd mRNA och vilken typ av celler som används. Empiriskt kan det poly(A)-berikade RNA:t stå för 1-5 % av det totala RNA:t. En alikvot på 10 μg total-RNA av hög kvalitet bör ge poly(A)-anrikat RNA av hög kvalitet i intervallet 100–500 ng för bisulfitomvandling nedströms.
    3. Under tiden återsuspenderar du oligo(dT)-pärlorna helt. Överför de nödvändiga mängderna pärlsuspension till ett nytt 1.5 ml mikrocentrifugrör, placera sedan på magneten i 3 minuter tills de magnetiska pärlorna bildar en pellet.
      OBS: Använd 50 μL oligo(dT)-pärlor för 10 μg total RNA-ingång. Volymen av pärlor i detta steg kan optimeras ytterligare beroende på vilka celler som används.
    4. Ta bort supernatanten och återsuspendera oligo(dT)-kulorna med lika stora mängder (volymen av kulsuspensionen som användes i steg 1.1.3) lyseringsbuffert och placera på magneten i 3 minuter innan supernatanten avlägsnas.
      OBS: Torka inte pärlorna för mycket; Användaren bör snabbt gå vidare till steg 1.2.1.
  2. Den första reningsrundan
    1. Tillsätt lysbuffert till RNA-provröret (volymförhållande 4:1) och blanda noggrant innan du överför till oligo(dT)-pärlorna.
      OBS: Om RNA-provvolymen är 20 μL, tillsätt sedan 80 μL lysbuffert.
    2. Återsuspendera RNA: lysbuffertblandning och oligo(dT)-pärlor helt genom pipettering minst 10x.
    3. Låt proverna inkuberas kontinuerligt i 15 minuter i rumstemperatur.
    4. Placera provet på magneten i 5 minuter eller tills supernatanten är klar. Kassera supernatanten.
    5. Tillsätt 600 μL Wash Buffer 1 till pärlorna och blanda försiktigt för att återsuspendera pärlorna.
    6. Placera tuben på magneten i 5 minuter eller tills supernatanten är klar, kassera supernatanten och upprepa tvättsteg 1.2.5 en gång.
    7. Tvätta pärlorna genom att tillsätta 300 μL Wash Buffer 2 och blanda försiktigt om pärlorna.
    8. Placera tuben på magneten i 5 minuter eller tills supernatanten är klar, kassera supernatanten och upprepa tvättsteg 1.2.7 en gång.
    9. Tillsätt 30 μl kall 10 mM Tris-HCl (elueringsbuffert) till provröret och inkubera vid 70 °C i 5 minuter.
    10. Överför snabbt röret till magneten, och när suspensionen är klar efter 20 s eller mer, överför supernatanten som innehåller eluerat poly(A)-anrikat RNA till det nya 1,5 ml mikrocentrifugröret.
  3. Den andra reningsrundan
    1. Tillsätt 120 μL (4 gånger volymen av eluerat prov) lysbuffert till det eluerade RNA-provet och blanda noggrant.
    2. Tvätta pärlorna som användes i den första reningsomgången med en lika stor mängd lysbuffert som steg 1.1.4, pipett 10 gånger för att återsuspendera pärlorna och placera dem sedan på magneten i 5 minuter innan du kasserar supernatanten.
    3. Överför RNA: lysbuffertblandningen till de tvättade pärlorna och blanda noggrant genom att pipettera minst 10 gånger.
    4. Inkubera provet med kontinuerlig rotation i 15 minuter vid rumstemperatur.
    5. Upprepa steg 1.2.4 till 1.2.8 för att avlägsna salt och andra RNA-subtyper.
      OBS: Tvättbuffertens volym kan minskas till 300 μL tvättbuffert 1 och 150 μL tvättbuffert 2.
    6. Tillsätt 25 μL (önskad volym) kall 10 mM Tris-HCl (elueringsbuffert) till provröret och inkubera vid 70 °C i 5 min.
    7. Överför snabbt röret till magneten, och när suspensionen är klar efter 20 s eller mer, överför supernatanten som innehåller eluerat poly(A)-anrikat RNA till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    8. Överför 2,2 μL till 8-strip-rör för kvalitetsbedömning av RNA-kvantitet och -kvalitet med hjälp av RNA-högkänsliga analyser.
    9. Förvara provet vid -20 °C under korta perioder och -70 °C under en längre period.
      OBS: Detta kan vara en pauspunkt i protokollet.

2. Omvandling av bisulfit

OBS: Centrifugeringsstegen utfördes alla vid rumstemperatur. Procedurerna utförs i huvudsak i enlighet med tillverkarens instruktioner, men med ytterligare steg 2.2 för att lägga till spike-in-kontroll-mRNA-sekvenserna före bisulfitreaktionssteg 2.3.

  1. Överför 19 μL renat poly(A)-anrikat RNA-prov till ett 0,2 ml 8-striprör.
  2. Tillsätt 1,0 μl "spike-in"-kontroll, som är fri från modifieringar vid det förutbestämda kvantitetsförhållandet 1:10 000 (dvs. 0,1 ng luciferas-mRNA: 1 μg renat poly(A)-anrikat RNA) till RNA-provet i steg 2.1.
    OBS: Spik-in-kontrollsekvensen kan vara Firefly-luciferas-RNA, Renillaluciferas eller in vitro-transkriberad RNA-sekvens utan metylerade cytosiner.
  3. Tillsätt 130 μL omvandlingsregent till röret och vänd försiktigt upp och ner flera gånger för noggrann blandning.
  4. Placera röret i PCR-maskinen och utför tre cykler av uppvärmning vid 70 °C i 10 minuter följt av inkubation vid 64 °C i 45 minuter vardera och sedan ett sista steg för att svalna till 4 °C.
  5. Placera kolonnen på uppsamlingsröret och överför 250 μl RNA-bindningsbuffert till kolonnen.
  6. Överför sample från steg 2.4 till kolonnen från steg 2.5 och pipett noggrant.
  7. Tillsätt 400 μL 95-100 % etanol till kolonnen, stäng snabbt locket och vänd upp och ner flera gånger.
  8. Centrifugera vid 10 000 × g i 30 s vid 25 °C och kassera genomströmningen.
  9. Tillsätt 200 μl RNA-tvättbuffert till kolonnen.
  10. Centrifugera vid 10 000 × g i 30 s vid 25 °C och kassera genomströmningen.
  11. Tillsätt 200 μl avsvavlingsbuffert och inkubera i rumstemperatur i 30 minuter.
  12. Centrifugera vid 10 000 × g i 30 s vid 25 °C och kassera genomströmningen.
  13. Tillsätt 400 μl RNA-tvättbuffert och centrifugera vid 10 000 × g i 30 s vid 25 °C och kassera genomströmningen. Upprepa detta steg en gång.
  14. Centrifugera igen vid 10 000 × g i 2 minuter vid 25 °C för att helt ta bort den kvarvarande tvättbufferten.
    OBS: Det andra centrifugeringssteget 2.14 i 2 minuter före eluering är att helt ta bort tvättbufferten. Tvättsteget utförs två gånger för att tvätta bort komponenten med hög salthalt från bisulfitreagenset och avsvavlingsbufferten på kolonnen.
  15. Överför kolonnen till ett nytt 1.5 ml mikrocentrifugrör.
  16. Tillsätt 20–30 μl nukleasfritt H2O till kolonnen och låt stå i rumstemperatur i 1 min.
  17. Centrifugera vid 10 000 × g i 30 s vid 25 °C.
  18. Överför 2,2 μL till 8-strip-rör för bedömning av RNA-kvantitet och -kvalitet.
  19. Förvara det bisulfitbehandlade RNA-provet vid -20 °C under korta perioder och -70 °C under en längre period.
    OBS: Detta kan vara en pauspunkt i protokollet.

3. Beredning av bisulfitbehandlade mRNA-bibliotek

OBS: Följ bibliotekets förberedelseinstruktionsprotokoll avsnitt 4 för användning med renat mRNA eller rRNA-utarmat RNA. Det första primingsteget bör följa FFPE RNA-protokollet eftersom bisulfitbehandlingen fragmenterar RNA:t. Utför varje steg i den laminära flödeshuven och tillsätt reaktionsblandningen på ett iskylt kylställ.

  1. Priming av indata-RNA
    1. Överför önskad mängd bisulfitbehandlat mRNA-prov i totalt högst 5 μL eller tillsätt nukleasfritt H2O för att göra totalt 5 μL.
      OBS: Minst 10 ng bisulfitbehandlat mRNA som indata rekommenderas för denna typ av RNA-biblioteksberedning och för att generera den slutliga molariteten för 4nM-biblioteksprodukten.
    2. Tillsätt 1 μl Random primer (lila) till provet och blanda med pipettering.
    3. Placera provröret i PCR-maskinens förinställda temperatur på 65 °C och lock vid 105 °C i 5 minuter och håll kvar vid 4 °C.
  2. Första strängens cDNA-syntes
    1. Tillsätt 4 μl syntesreaktionsbuffert (syren), 8 μl strängspecificitetsreagens (brun) och 2 μl syntesenzymblandning (brun) till provet, vilket ger en total volym på 20 μL. Blanda noggrant genom att pipettera minst 10 gånger och centrifugera snabbt ner.
    2. Placera provröret i PCR-maskinen förinställt på 25 °C i 10 minuter, 42 °C i 50 minuter, 70 °C i 15 minuter och håll i 4 °C.
      OBS: För insatser över 200 baser föreslås en inkubationstid på 42 °C på 50 minuter; För skärstorlek under 200 baser föreslås en inkubationstid på 15 minuter vid 42 °C.
  3. Andrasträngad cDNA-syntes
    1. Tillsätt 8 μL syntesreaktionsbuffert med dUTP-blandning (apelsin), 4 μL syntesenzymblandning (apelsin) och 48 μL nukleasfri H2O. Blanda noggrant genom att pipettera minst 10 gånger och centrifugera snabbt.
    2. Placera provröret i PCR-maskinens förinställda temperatur på 16 °C i 1 timme med locket avstängt eller ≤40 °C.
  4. Rening av dubbelsträngat cDNA med DNA-reningspärlor
    1. Förvärm DNA-reningspärlorna 30 minuter innan du utför reningen och virvlar för att återsuspendera pärlorna.
    2. Tillsätt 144 μl resuspenderade DNA-reningspärlor till cDNA-provet från steg 3.3.2 och blanda noggrant genom att pipettera minst 10 gånger.
    3. Inkubera i rumstemperatur i 5 min.
    4. Placera provröret på ett magnetiskt ställ i 5 minuter tills lösningen är klar och ta sedan bort supernatanten och behåll pärlorna som innehåller DNA.
    5. Tillsätt 200 μL nygjord 80 % etanol till röret med pärlorna medan du håller provet på magnetstället och inkuberar i rumstemperatur i 30 s.
    6. Ta bort supernatanten och upprepa steg 3.4.5 en gång, men ta denna gång försiktigt bort alla kvarvarande supernatanter.
    7. Lufttorka pärlorna i 1-5 minuter samtidigt som provet hålls kvar på magneten.
      OBS: Torka inte pärlorna för mycket; Färgen ska vara mörkbrun.
    8. Ta bort sample från magnetstället och eluera DNA genom att tillsätta 53 μL 0,1x TE (10 mM Tris-HCl och 1 mM EDTA, pH 8,0) buffert till pärlorna. Blanda ordentligt genom att pipettera minst 10 gånger och inkubera i rumstemperatur i 2 min.
    9. Placera röret på magnetstället i 5 minuter eller tills lösningen är klar.
    10. Överför 50 μL supernatant som innehåller dubbelsträngat cDNA till ett nytt 8-bandsrör.
      OBS: Protokollet kan stoppas vid denna tidpunkt och sample kan förvaras vid -30 °C.
  5. Avsluta beredning av cDNA-bibliotek
    1. Tillsätt 7 μl slutpolerande reaktionsbuffert (grön) och 3 μl slutpolerande enzymblandning (grön) till det eluerade dubbelsträngade cDNA-provet.
    2. Blanda blandningen genom att pipettera 10x med en volyminställning på 50 μL utan att skapa bubblor, centrifugera sedan snabbt ner provet.
    3. Placera provet i en PCR-maskin och inkubera vid 20 °C i 30 minuter, 65 °C i 30 minuter och håll vid 4 °C.
  6. Adapter ligering
    1. Späd adaptern (röd) enligt tillverkarens instruktioner.
    2. Tillsätt 2,5 μL av den utspädda adaptern, 1 μL ligeringsförstärkare (röd) och 30 μL Ligation Master Mix (röd) till provet.
    3. Blanda blandningen genom att pipettera 10x med en volyminställning på 80 μL utan att skapa bubblor, centrifugera sedan snabbt ner provet.
    4. Placera provet i en PCR-maskin och inkubera vid 20 °C i 15 minuter.
    5. Tillsätt 3 μl av blandningen av uracil-DNA-glykosylas och DNA-glyas-lyas-endonukleas VIII (blått) till provet och pipetten ordentligt.
    6. Lägg tillbaka provet i PCR-maskinen och inkubera vid 37 °C i 15 minuter med locket inställt på 75 °C.
  7. Rening av ligeringsreaktionsbehandlade cDNA
    OBS: Storleksvalet med SPRIselect-pärlor, eller valfritt med AMpure XP-pärlor kan båda användas för detta ändamål18.
    1. Förvärm pärlorna 30 minuter innan du utför reningen och virveln för att återsuspendera dem.
    2. Överför 25 μl återsuspenderade kulor till cDNA-provet från steg 3.6.6 och blanda noggrant genom att pipettera minst 10 gånger.
    3. Inkubera i rumstemperatur i 5 min.
    4. Placera provröret på ett magnetställ i 5 minuter tills lösningen är klar och överför sedan supernatanten till ett nytt 8-stavsrör och kassera pärlorna.
    5. Tillsätt 10 μl omsuspenderade pärlor till supernatanten och blanda noggrant genom att pipettera minst 10 gånger.
    6. Placera provröret på ett magnetställ i 5 minuter tills lösningen är klar och kassera sedan supernatanten och stör inte pärlorna.
    7. Tillsätt 200 μL nygjord 80 % etanol till röret med pärlorna medan du håller provet på magnetstället och inkuberar i rumstemperatur i 30 s.
    8. Ta bort supernatanten och upprepa steg 3.7.7 en gång, men denna gång tar du försiktigt bort alla kvarvarande supernatanter.
    9. Lufttorka pärlorna i 1-5 minuter medan du håller provet på magneten.
      OBS: Torka inte pärlorna för mycket; Färgen ska vara mörkbrun.
    10. Ta bort provet från magnetstället och eluera DNA:t genom att tillsätta 17 μL 0,1x TE-buffert till pärlorna. Blanda ordentligt genom att pipettera minst 10 gånger och inkubera i rumstemperatur i 2 min.
    11. Placera röret på magnetstället i 5 minuter tills lösningen är klar.
    12. Överför 15 μL supernatant, som innehåller måländpreparerat dsDNA till ett nytt 8-strip-rör.
  8. PCR-anrikning av adapter-ligerat DNA
    1. Tillsätt 25 μl masterblandning (blå), 5 μl 5'-adapterprimer och 5 μL 3'-adapterprimer till adapter-ligated DNA-provet. Blanda ordentligt genom att pipettera minst 10 gånger.
    2. Placera provet i PCR-maskinen och utför PCR-amplifiering med hjälp av följande steg: (1) 98 °C i 30 s, (2) 98 °C i 10 s, (3) 65 °C i 75 s, (4) 65 °C i 5 min och (5) håll vid 4 °C; där stegen (2) och (3) ska upprepas för ett N+2-cykelnummer där N är lika med RNA-ingångsmängden i bruksanvisningen. Detta innebär att ytterligare 2 cykler behövs på grund av det dubbelsidiga storleksvalet av samples som utfördes i steg 3.7.
      OBS: Till exempel skulle 8 ng av den renade mRNA-ingången rekommenderas med 9-10 cykler av PCR; men med dubbelsidigt, storlekselekterat, ligerat cDNA i steg 3.7 skulle den rekommenderade PCR-cykeln vara 11-12 cykler.
  9. Rening av PCR-förstärkta bibliotek
    1. Förvärm DNA-reningspärlorna i 30 minuter innan du utför reningen och virvlar för att återsuspendera pärlorna.
    2. Överför 45 μl (0,9 gånger) återsuspenderade kulor till PCR-produkten från steg 3.8.2 och blanda noggrant genom att pipettera minst 10 gånger.
    3. Inkubera i rumstemperatur i 5 min.
    4. Placera provröret på ett magnetställ i 5 minuter tills lösningen är klar och ta sedan bort supernatanten och behåll pärlorna som innehåller DNA.
    5. Tillsätt 200 μL nygjord 80 % etanol till röret med pärlorna, lämna provet på magnetstället och låt det stå i rumstemperatur i 30 s.
    6. Ta bort supernatanten och upprepa steg 3.9.5 en gång, men den här gången tar du försiktigt bort alla kvarvarande supernatanter.
    7. Lufttorka pärlorna i 1-5 minuter medan du håller provet på magneten.
      OBS: Torka inte pärlorna för mycket; Färgen ska vara mörkbrun.
    8. Ta provet från magnetstället och tillsätt 22 μL 0,1x TE-buffert till kulorna för att eluera DNA:t. Blanda ordentligt genom att pipettera minst 10 gånger och inkubera i rumstemperatur i 2 min.
    9. Placera röret på magnetstället och låt det stå i 5 minuter eller tills lösningen är klar i rumstemperatur.
    10. Överför 20 μL supernatant till ett nytt 8-stavsrör.
    11. Överför 2,2 μL till 8-stavsrör för kvalitetsbedömning av bibliotekets kvantitet och kvalitet.
      OBS: Bibliotekets kvantitet kan också detekteras med qPCR (se materialtabellen).
    12. Förvara bsRNA-seq-biblioteksprovet vid -20 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En serie bsRNA-seq-bibliotek från cellinjer19 genererades genom att följa procedurerna i denna rapport (Figur 1). Efter total RNA-rening åtföljd av DNase-behandling utförd på cellinjeprover och kvaliteten kontrollerad med gelelektrofores och UV-Vis-spektrofotometri (A260/A280), kan RNA-provet gå vidare till poly(A) RNA-anrikning. För att avgöra om dubbelreningen kunde avlägsna majoriteten av ribosomalt RNA, bedömdes reningseffektiviteten för poly(A) RNA genom kapillärelektrofores total RNA-analys som automatiskt kan beräkna rRNA-kontamineringsprocenten (figur 2). Från RNA-fragmentets toppmönster och rRNA-kontamineringsprocenten visade RNA-prover med två gånger rening faktiskt minskad kontaminering av ribosomalt RNA från 6,5 % till 2,2 % och 2,6 % till 1,1 % i AsPC-1 respektive BxPC-3. Med humana bukspottkörtelcancercellinjer kan två omgångar av rening av pärlor nå i genomsnitt 2,8 ± 1 % poly(A)-berikade RNA-halter från de totala RNA-proverna. Därför minimerade poly(A)-RNA-anrikningen av oligo(dT)-pärlor med dubbla reningssteg ribosomalt RNA och representerar en möjlig mRNA-provanrikning för nedströmsexperimenten.

Protokollen för bisulfitomvandling har rapporterats i flera studier om RNA 5-metylcytosinmodifiering (tabell 1). Bisulfitreaktionen kan utföras med en reaktionsblandning bestående av 40 % natriumbisulfit och 600 mM hydrokinon i vattenlösningen (pH 5.1) vid 75 °C i 4 timmar10,20,21. Alternativt kan en strängare bisulfitbehandling av RNA-prov också utföras med ett kommersiellt kit; som i ett antal studier från andra och vår 6,22,23,24 förlängde bisulfitreaktionstiden till tre inkubationscykler. Eftersom inkubationssteget med tre cykler effektivt omvandlar ometylerat cytosin i det in vitro-transkriberade och strukturellt mer veckade Escherichia coli 16S rRNA-segmentet8, tillämpades inkubationssteget med tre cykler även i detta protokoll.

Med två gånger poly(A)-anrikning och trecykelbisulfitomvandling bedömdes RNA-kvaliteten före och efter reaktionen med kapillärelektrofores. RNA-storleksfördelningen efter bisulfitbehandlingen visade en topp på ~200-500 nukleotider på grund av fragmentering orsakad av bisulfitreaktionen (Figur 3). Dessutom är det fragmenterade bsRNA:t idealiskt för biblioteksförberedelse utan att behöva utföra ytterligare fragmenteringssteg. Totalt 8-10 ng bsRNA som indata användes för att konstruera biblioteket enligt detta protokoll genom att använda 9 till 11 cykler i den slutliga PCR-amplifieringen av adapter-ligerat DNA. Kapillärelektroforesen i ampliconen visade en ganska framgångsrik bibliotekspreparering, med endast en liten del av primern kvar och ingen topp av överförstärkning (Figur 4). För att kontrollera omvandlingseffektiviteten i varje provbibliotek tillsattes det ometylerade eldflugeluciferas-RNA:t som en spike-in-kontrollsekvens till provet innan bisulfitbehandlingen utfördes. Efter sekvensläsningar anpassade till referenssekvensen med hjälp av meRanTK-verktygssatser25, mappades genomsnittet av 2 440 (0,006 %) av de totala läsningarna till spiksekvensen, och den totala analyserade C-till-T-konverteringsfrekvensen nådde i genomsnitt 99,81 %; Statusen kan visas i Integrated Genomics Viewer (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Arbetsflödesdiagram för bisulfit-mRNA-sekvensering. Pipelinen består av tre huvudprotokoll, inklusive mRNA-anrikning, bisulfitomvandling och biblioteksberedning. Förkortning: bsRNA = bisulfit-mRNA; QC. = kvalitetskontroll. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Kvalitetskontrollresultat av poly(A)-anrikade RNA-prover med kapillärelektrofores. (A) Den representativa kapillärelektroforesprofilen för totalt RNA från BxPC-3-celler. B ) De representativa kapillärelektroforesprofilerna för prover som bearbetats med oligo(dT)-rening från AsPC-1- och BxPC-3-celler. mRNA E1, mRNA-eluering från engångsrening; mRNA E2, mRNA-eluering från tvåfaldig rening. Uppskattningarna av rRNA-kontamination beräknades med elektroforesoperationssystemet som styr den totala RNA-analysanalysen. (C) Kapillärelektroforesprofilen för stegmarkörerna erhölls i samma körning med prover som presenterades i panel B. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Kvalitetsbedömning av RNA-prover med kapillärelektrofores. De representativa kapillärelektroforesprofilerna för (A) totalt RNA, (B) poly(A)-anrikat mRNA från två gångers rening och (C) det bisulfitbehandlade mRNA från BxPC-3-cellerna. Förkortningar: B_empty = BxPC-3-celler transducerade med tom vektor; B_shScr = BxPC-3-celler som transduceras med blandningssekvenserna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Kvalitetsbedömning av bsRNA-seq-bibliotek. (A-C) Tre uppsättningar representativa kapillärelektroforesprofiler av konstruerade bsRNA-seq-bibliotek amplifierade med PCR vid olika PCR-cykelnummer på 9 och 11 cykler med hjälp av bsRNA från en uppsättning BxPC-3-celler. Den uppskattade indatamängden av det bisulfitbehandlade RNA:t bestämdes genom en högkänslig RNA-kvantifieringsanalys. Totalt 8, 8,4 och 9,6 ng bsRNA användes i (A) BxPC-3 mock, (B) BxPC-3 tom respektive (C) BxPC-3 shN2UN2 samples. Stegmarkörens toppar vid 35 bp och 10 380 bp representerar de interna standarderna för den nedre och övre gränsen i elektroforesprofilen för varje prov. En framträdande topp på cirka 100 bp respektive en obskyr topp på cirka 127 bp indikerar PCR-primrarna (<100 bp) och adapter-dimeren (~127 bp), som stannade kvar i eluatet efter PCR-sanering. Förkortningar: BxPC-3 mock = otransducerade BxPC-3-celler; BxPC-3 tom = BxPC-3-celler transducerade med den tomma vektorkontrollen; BxPC-3 shN2UN2 = BxPC-3-celler transducerade med shNSUN2-konstruktionerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Sekvensjusteringsprofilerna för varje bsRNA-seq-bibliotek mappade till referenssekvensen för spik-i-kontroll. De representativa anpassningsprofilerna för BxPC-3 mock-, empty-, scramble- och shNSUN2 bsRNA-seq-biblioteken till eldflugans luciferas-spik-in-kontrollreferenssekvens (indikerad som "Z"-genen); 2 representativa regioner visades. Grå staplar indikerar alla avläsningar som presenterar matchade konsensusnukleotider vid den angivna baspositionen till referenssekvensen. Röda staplar markerar tymidinidentiteten (T) vid läsarnas basposition. blå staplar indikerar de läsningar som har cytosin (C)-identiteten vid positionen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Jämförelse av bisulfitreaktionsprotokoll och omvandlingshastigheten. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll uppnåddes en detaljerad pipeline av poly(A)-anrikning, bisulfitkonvertering och biblioteksförberedelse genom att använda standardiserade komponenter. Ytterligare sekvenseringsanalys gav identifiering av mRNA 5-metylcytosin i prover av intresse.

Det kritiska steget är kvaliteten på startmaterialet - totalt RNA - eftersom nedbrytningen av RNA skulle påverka återvinningshastigheten för poly(A) RNA-rening. Provet ska hanteras noggrant och RNas-kontaminering undvikas innan poly(A) RNA-reningssteget utförs. En annan viktig del av proceduren är antalet PCR-cykler i biblioteksberedningen. Beslutet om cykelnummer beror på mängden bisulfitbehandlat mRNA som används för biblioteksberedning och om användningen av ett storleksval eller dubbelt storleksval i steget före PCR. De lämpliga cykelnumren för det aktuella provet skulle därför kräva en provkörning och en bedömning av PCR-produktens storleksfördelning med kapillärelektrofores för att bestämma det optimala cykelantalet för samma cellinje eller vävnad.

I detta protokoll användes två omgångar av rening av oligo(dT)-pärlor för att anrika och rena poly(A) RNA och eliminerade en majoritet av ribosomala RNA och andra RNA. Det finns andra metoder för att ta bort ribosomalt RNA och behålla andra RNA-typer i provet, såsom oligobaserad utarmning av rRNA26. Sedan kan 5-metylcytosinmodifieringen som finns i andra RNA-typer också tas med i analys och utöka förståelsen av 5-metylcytosinfunktioner i mRNA och andra RNA.

Bisulfitreaktion är känd för att inte kunna skiljam5C från andra modifieringar, inklusive 5-hydroximetylcytosin (hm5C), 3-metylcytidin (m3C) och N4-metylcytidin (m4C)27. Den experimentella designen inklusive m5 C RNA-metyltransferas knockdown eller knockout bör dock ge informativa bevis för attm5C-platser reglerasmed hög konfidens. Dessutom kan validering med hjälp av olika metoder, t.ex. antikroppsbaserad anrikning följt av sekvensering eller PCR- eller LC-MS/MS-baserade metoder, i huvudsak autentisera kandidatens m5C-platser16. Den framväxande tekniken för direkt nanopor-RNA-sekvensering ger också potentiell identifiering av RNA-modifiering via beräkningsanalys av den aktuella signalen eller basens kallade "fel"-egenskaper28,29,30.

En nyligen genomförd studie av Johnson et al. visade att tillägg av fragmenteringssteget i mitokondrie-RNA-prover efter tre omgångar av bisulfitkonvertering verkligen visade en högre omvandlingshastighet och ökade utbytet av cDNA-biblioteksprodukt31. Denna artikel analyserade specifikt omvandlingshastigheten och läser kvalitet mappad till mitokondriegenomet, inte mRNA-transkriptomet. Därför har användningen av fragmenteringssteget uppdaterats i tabell 1 för att belysa om de publicerade rapporterna inkluderade ett RNA-fragmenteringssteg så att tittarna enkelt kan replikera protokollet. En annan studie av Zhang et al. visade att användning av in vitro-transkriberat modifieringsfritt RNA-bibliotek som en negativ kontroll är effektivt för att eliminera den falskt positiva signalen från bisulfitbehandling32. Nyligen genomförda studier har jämfört olika protokoll som används för bibliotekskonstruktion33. Användaren kan vidare välja att genomföra bsRNA-seq-pipeline med eller utan ett ytterligare fragmenteringssteg och in vitro-transkriberat modifieringsfritt RNA-bibliotek för att anpassa lämpligt arbetsflöde.

Transkriptomomfattande identifiering avm5C med olika principer kan stärka fynden av modifieringslandskapen och ge mer förståelse för de reglerande mekanismerna för RNA-modifieringar i friska eller sjukdomsmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Taiwans nationella vetenskaps- och teknikråd. [NSTC 111-2314-B-006-003]

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System Agilent, Santa Clara, CA RNA quality detection
AMpure XP beads Beckman Coulter A63881 purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-4626 DNA quality detection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-1513 RNA quality detection
DiaMag02 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000001 assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000003 assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 61011 poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol J.T.Baker 64-17-5
EZ RNA methylation kit Zymo, Irvine, CA R5002 bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA Promega, Madison, WI, USA L4561 spike in control seqeunce 
KAPA Library Quantification Kits Roche, Switzerland KK4824 library quantification
Nanodrop spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) New England Biolabs, Ipswich, MA E7335S library preparation
NEBNext Ultra Equation 1 Directional RNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs, Ipswich, MA E7760S library preparation
Nuclease-free Water Thermo Fisher Scientific AM9932
P2 pipetman Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 4641010
Qubit 2.0 fluorometer  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32854 DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32852 RNA quantity detection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
  2. Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102 (2019).
  3. Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959 (2023).
  4. Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
  5. Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
  6. Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
  7. Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
  8. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).
  9. Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40 (2020).
  10. Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606 (2017).
  11. Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
  12. Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430 (2020).
  13. Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15 (2022).
  14. Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43 (2020).
  15. Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
  16. Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
  17. Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231 (2020).
  18. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 18, Unit 18.12 (2009).
  19. Chen, S. -Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
  20. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  21. Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
  22. Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
  23. Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
  24. Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
  25. Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
  26. Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281 (2019).
  27. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602 (2013).
  28. Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
  29. Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198 (2021).
  30. Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
  31. Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045 (2022).
  32. Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
  33. Chao, H. -P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).

Tags

MRNA-anrikning beredning av bisulfit-mRNA-bibliotek nästa generations sekvensering RNA-posttranskriptionsmodifieringar RNA-reglering eukaryota celler RNA 5-metylcytosinmodifieringar RNA-metyltransferaser sjukdomar cancer transkriptomomfattande bisulfitsekvensering cytosinmetyleringsnivåer poly(A) RNA-rening bisulfitreaktion biblioteksberedning MRNA 5-metylcytosinmodifieringsplatser RNA-kvantitets- och kvalitetsbedömning RNA-integritetsövervakning hög kvalitet Bibliotek för sekvensering
Anrikning av mRNA- och bisulfit-mRNA-biblioteksberedning för nästa generations sekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S. Y., Huang, P. H. Enrichment … More

Chen, S. Y., Huang, P. H. Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (197), e65352, doi:10.3791/65352 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter