Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Anrikning av mRNA og bisulfitt-mRNA-bibliotekforberedelse for neste generasjons sekvensering

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65352
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

Summary

Denne protokollen gir en enkel å følge arbeidsflyt for å gjennomføre poly (A) RNA-rensing, bisulfittkonvertering og bibliotekforberedelse ved hjelp av standardisert utstyr for en biologisk prøve av interesse.

Abstract

RNA posttranskripsjonelle modifikasjoner i forskjellige typer RNA-transkripsjoner er assosiert med mangfoldig RNA-regulering i eukaryote celler. Avvikende RNA 5-metylcytosinmodifikasjoner og det dysregulerte uttrykket av RNA-metyltransferaser har vist seg å være assosiert med forskjellige sykdommer, inkludert kreft. Transkriptombrede bisulfittsekvensering ble utviklet for å karakterisere posisjonene og de kvantitative cytosinmetyleringsnivåene i det bisulfittkonverterte RNA ved baseparoppløsningen. Her presenterer denne protokollen prosedyrene for to runder med poly (A) RNA-rensing, tre sykluser av bisulfittreaksjon og bibliotekforberedelse i detalj for å tillate transkriptomomfattende kartlegging av mRNA 5-metylcytosinmodifikasjonssteder. Vurderingen av RNA-kvantitet og kvalitet etter hovedreaksjonen er avgjørende for å overvåke RNA-integriteten og er et kritisk skritt for å sikre sekvenseringsbiblioteker av høy kvalitet. Ideelt sett kan prosedyrene fullføres innen tre dager. Med denne protokollen kan bruk av total RNA av høy kvalitet som inngang praktisk talt bygge opp robuste bisulfitt-mRNA-biblioteker for neste generasjons sekvensering fra prøven av interesse.

Introduction

Blant over 150 typer post-transkripsjonelle modifikasjoner1, 5-metylcytosin (m5C) modifikasjon har blitt identifisert i ulike typer RNA, inkludert ribosomal RNA, overføring RNA, messenger RNA, mikro RNA, lang ikke-kodende RNA, vault RNA, enhancer RNA og små cajal kroppsspesifikke RNA2. RNA m 5 C er assosiert med ulike biologiske og patologiske mekanismer som regulering av planterotutvikling3, viral genuttrykk4 og kreftprogresjon5. Målet med denne protokollen er å gi strømlinjeformede rørledninger for å karakterisere den transkriptombrede mRNA m5C modifikasjonsprofilen til biologiske prøver i forskjellige utviklingsstadier eller i sykdomsinnstillingen. Transkriptombrede bisulfittsekvensering ble utviklet for å karakterisere posisjonene og de kvantitative cytosinmetyleringsnivåene i det bisulfittkonverterte RNA ved baseparoppløsning 6,7,8,9. Dette er spesielt nyttig når man studerer sammenhengen mellom m5C og genuttrykk og RNA-skjebne som er involvert i de biologiske reguleringsmekanismene i celler. I pattedyrcellen er det to kjente m 5 C-lesere: ALYREF kan gjenkjenne m 5 C ved kjernen og fungerer som en mRNA-kjerne-til-cytosoltransportør10, mens YBX1 kan gjenkjenne m5C i cytoplasma og øke mRNA-stabilisering11. Avvikende m5C mRNA relatert til immunveier ble rapportert i systemiske Lupus Erythematosus CD4+ T-celler12. Studier har vist en sammenheng mellom mRNA m5C modifikasjon og modulering av kreftimmunitet og kreftprogresjon13,14. Derfor kan kartlegging av m5C modifikasjonsprofilen på mRNA gi viktig informasjon for å belyse det potensielle regulatoriske maskineriet.

For å undersøke de funksjonelle rollene til RNA m 5 C modifikasjon under visse biologiske forhold, kan bisulfittkonverteringsbaserte (bsRNA-seq) og antistoffaffinitetsberikelsesbaserte tilnærminger somm 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq og 5-Aza-seq kombineres med høykapasitetssekvenseringsplattformen for å gi effektiv deteksjon av målrettede regioner og sekvenser med m5C-modifikasjonene på en transkriptom-bred skala15, 16. Fordelen med denne protokollen gir det omfattende RNA m 5C landskapet ved en enkeltbaseoppløsning siden antistoffaffinitetsberikelsesbasert tilnærming er avhengig av tilgjengeligheten av antistoffer av høy kvalitet og kan oppnå enkeltfragmentoppløsningen av m5C metyleringslandskap17.

Alle RNA-prøver vil bli behandlet med to runder mRNA-anrikning ved bruk av oligo (dT) perler, tre sykluser med bisulfittreaksjon og sekvenseringsbibliotekets forberedelse. For å overvåke RNA-kvaliteten vil hver RNA-prøve bli undersøkt ved kapillær gelelektroforese før og etter prosedyrene for mRNA-rensing og bisulfittreaksjon for å vurdere fragmentfordeling. De rensede bibliotekene vil bli undersøkt av deres PCR-ampliconkvaliteter, DNA-størrelsesfordelingsfragmenter ved kapillær gelelektroforese, og deres samlede mengder undersøkt ved fluorescensfargestoffbaserte kvantitative analyser før sekvensering. Systemet kan også brukes til å analysere et bredt spekter av biologiske prøver som landbruksprodukter, isolerte virioner, cellelinjer, modellorganismer og patologiske prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Poly (A) RNA-rensing

MERK: Bruk det totale RNA behandlet med DNase I og undersøk total RNA-kvalitet og integritet ved kapillær eller konvensjonell gelelektroforesevurdering før du går videre til poly (A) RNA-rensing. Etterforskere skal kunne identifisere 28S og 18S rRNA ribosomale bånd i høymolekylvektfeltet og 5.8S rRNA-båndet i lavmolekylvektfeltet uten signifikante smørebånd i elektrofherogrammet. Rensetrinnene følger i hovedsak produsentens instruksjoner med mindre modifikasjoner angitt i de spesifikke trinnene. Se materialfortegnelsen for detaljer knyttet til alle materialer og instrumenter som brukes i denne protokollen.

  1. Forberedelse
    1. Varm opp reagenset, vaskebufferen, oligo(dT)-perlene og lysisbufferen ved romtemperatur i 30 minutter før du utfører følgende prosedyrer.
    2. For isolering av poly (A) -beriket RNA, lag 10-20 μg av en alikot av total RNA av høy kvalitet som utgangsmateriale ved å overføre en tilstrekkelig mengde RNA til et nukleasefritt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Rug i varmeblokken ved 70 °C i 5 min, og la den deretter ligge på is i 2 min.
      MERK: Mengdene av totalt RNA som utgangsmateriale bør justeres hensiktsmessig avhengig av ønsket mengde mRNA og arten av cellene som brukes. Empirisk kan poly (A) -beriket RNA utgjøre 1-5% overflod i det totale RNA. En alikot på 10 μg totalt RNA av høy kvalitet, skal gi poly (A) -beriket RNA av høy kvalitet i 100-500 ng-området for nedstrøms bisulfittkonvertering.
    3. I mellomtiden må du resuspendere oligo (dT) perlene helt. Overfør de nødvendige mengdene perleoppheng til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør, og legg deretter på magneten i 3 minutter til magnetkulene danner en pellet.
      MERK: Bruk 50 μL oligo (dT) perler for 10 μg total RNA-inngang. Volumet av perler i dette trinnet kan optimaliseres ytterligere avhengig av cellene som brukes.
    4. Fjern supernatanten og resuspender oligo(dT)-kulene med like store mengder (volumet av perlesuspensjonen brukt i trinn 1.1.3.) lysisbuffer og sett på magneten i 3 minutter før supernatanten fjernes.
      NOTAT: Ikke tørk for mye perlene; Brukeren bør raskt gå videre til trinn 1.2.1.
  2. Den første renselsesrunden
    1. Legg lysisbuffer til RNA-prøverøret (volumforhold 4: 1) og bland grundig før overføring til oligo (dT) perler.
      MERK: Hvis RNA-prøvevolumet er 20 μL, tilsett deretter 80 μL lysisbuffer.
    2. Resuspender RNA: lysisbufferblanding og oligo (dT) perler helt ved pipettering minst 10x.
    3. La prøvene ruge med kontinuerlig rotasjon i 15 minutter ved romtemperatur.
    4. Plasser prøven på magneten i 5 minutter eller til supernatanten er klar. Kast supernatanten.
    5. Tilsett 600 μL vaskebuffer 1 til perlene og bland forsiktig for å resuspendere perlene.
    6. Plasser slangen på magneten i 5 min eller til supernatanten er klar, kast supernatanten og gjenta vask trinn 1.2.5 én gang.
    7. Vask perlene ved å tilsette 300 μL vaskebuffer 2, og heng forsiktig opp perlene igjen.
    8. Plasser slangen på magneten i 5 minutter eller til supernatanten er klar, kast supernatanten og gjenta vask trinn 1.2.7 én gang.
    9. Tilsett 30 μL kald 10 mM Tris-HCl (elueringsbuffer) i prøverøret og inkuber ved 70 °C i 5 minutter.
    10. Overfør røret raskt til magneten, og når suspensjonen er klar etter 20 s eller mer, overfør supernatanten som inneholder eluert poly (A) beriket RNA til det nye 1,5 ml mikrosentrifugerøret.
  3. Den andre renselsesrunden
    1. Tilsett 120 μL (4x volumet av eluert prøve) lysisbuffer til den eluerte RNA-prøven og bland godt.
    2. Vask perlene som ble brukt i den første renserunden med like mye lysisbuffer som trinn 1.1.4, pipet 10x for å resuspendere perlene, og legg dem deretter på magneten i 5 minutter før du kaster supernatanten.
    3. Overfør RNA: lysisbufferblanding til de vaskede perlene og bland grundig ved å pipettere minst 10x.
    4. Inkuber prøven med kontinuerlig rotasjon i 15 minutter ved romtemperatur.
    5. Gjenta trinn 1.2.4 til 1.2.8 for å fjerne salt og andre RNA-undertyper.
      NOTAT: Vaskebuffervolumet kan reduseres til 300 μL vaskebuffer 1 og 150 μL vaskebuffer 2.
    6. Tilsett 25 μL (ønsket volum) kald 10 mM Tris-HCl (elueringsbuffer) i prøverøret og inkuber ved 70 °C i 5 minutter.
    7. Overfør røret raskt til magneten, og når suspensjonen er klar etter 20 s eller mer, overfør supernatanten som inneholder eluert poly (A) beriket RNA til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    8. Overfør 2,2 μL til 8-stavsrør for kvalitetsvurdering av RNA-mengde og -kvalitet ved bruk av RNA-høysensitivitetsanalyser.
    9. Oppbevar prøven ved -20 °C i korte perioder og -70 °C i en lengre periode.
      MERK: Dette kan være et pausepunkt i protokollen.

2. Konvertering av bisulfitt

MERK: Sentrifugeringstrinnene ble alle utført ved romtemperatur. Prosedyrene utføres i hovedsak i henhold til produsentens instruksjoner, men med et ekstra trinn 2.2 for å legge til piggkontroll-mRNA-sekvensen(e) før bisulfittreaksjonstrinn 2.3.

  1. Overfør 19 μL renset poly (A) beriket RNA-prøve til et 0,2 ml 8-strips rør.
  2. Legg til 1,0 μL pigg-inn-kontroll, som er fri for eventuelle modifikasjoner ved det forhåndsbestemte 1:10,000-mengdeforholdet (dvs. 0,1 ng luciferase mRNA: 1 μg renset poly (A) beriket RNA) i RNA-prøven i trinn 2.1.
    MERK: Spike-in-kontrollsekvensen kan være Firefly luciferase RNA, Renilla luciferase eller in vitro transkribert RNA-sekvens uten metylerte cytosiner.
  3. Tilsett 130 μL konverteringsregent til røret og snu forsiktig flere ganger for grundig blanding.
  4. Plasser røret i PCR-maskinen og utfør tre sykluser med oppvarming ved 70 °C i 10 minutter etterfulgt av inkubering ved 64 °C i 45 minutter hver og deretter et siste trinn for å kjøle seg ned til 4 °C.
  5. Plasser kolonnen på oppsamlingsrøret og overfør 250 μL RNA-bindingsbuffer til kolonnen.
  6. Overfør prøven fra trinn 2.4 til kolonnen fra trinn 2.5 og pipe grundig.
  7. Tilsett 400 μL 95-100% etanol til kolonnen, lukk lokket raskt og vend opp flere ganger.
  8. Sentrifuge ved 10 000 × g i 30 s ved 25 °C og kast gjennomstrømningen.
  9. Tilsett 200 μL RNA-vaskebuffer i kolonnen.
  10. Sentrifuge ved 10 000 × g i 30 s ved 25 °C og kast gjennomstrømningen.
  11. Tilsett 200 μL avsulfoneringsbuffer og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
  12. Sentrifuge ved 10 000 × g i 30 s ved 25 °C og kast gjennomstrømningen.
  13. Tilsett 400 μL RNA-vaskebuffer og sentrifuge ved 10 000 × g i 30 s ved 25 °C og kast gjennomstrømningen. Gjenta dette trinnet én gang.
  14. Sentrifuge igjen ved 10 000 × g i 2 minutter ved 25 °C for å fjerne den gjenværende vaskebufferen helt.
    MERK: Det andre sentrifugeringstrinnet 2,14 i 2 minutter før eluering er å fjerne vaskebufferen helt. Vasketrinnet utføres to ganger for å vaske ut saltkomponenten fra bisulfittreagenset og desulfoneringsbufferen på kolonnen.
  15. Overfør kolonnen til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  16. Tilsett 20-30 μL nukleasefri H2O til kolonnen og stå ved romtemperatur i 1 min.
  17. Sentrifuge ved 10 000 × g i 30 s ved 25 °C.
  18. Overfør 2,2 μL til 8-stavsrør for vurdering av RNA-mengde og kvalitet.
  19. Oppbevar den bisulfittbehandlede RNA-prøven ved -20 °C i korte perioder og -70 °C i en lengre periode.
    MERK: Dette kan være et pausepunkt i protokollen.

3. Klargjøring av bisulfittbehandlet mRNA-bibliotek

MERK: Følg bibliotekforberedelsesprotokollen seksjon 4 for bruk med renset mRNA eller rRNA-utarmet RNA. Det første grunningstrinnet bør følge FFPE RNA-protokollen siden bisulfittbehandlingen fragmenterer RNA. Utfør hvert trinn i den laminære strømningshetten og tilsett reaksjonsblandingen på et iskjølt kjølestativ.

  1. Priming av inngangs-RNA
    1. Overfør ønsket mengde bisulfittbehandlet mRNA-prøve i totalt maksimalt 5 μL eller tilsett nukleasefri H2O for å lage totalt 5 μL.
      MERK: Minst 10 ng bisulfittbehandlet mRNA som input anbefales for denne typen RNA-bibliotekforberedelse og for å generere den endelige molariteten til 4nM-bibliotekproduktet.
    2. Tilsett 1 μL tilfeldig primer (lilla) i prøven og bland ved pipettering.
    3. Plasser prøverøret i PCR-maskinen forhåndsinnstilt ved 65 °C og lokk ved 105 °C i 5 minutter og hold ved 4 °C.
  2. Førstestrengs cDNA-syntese
    1. Tilsett 4 μL syntesereaksjonsbuffer (lilla), 8 μL strengspesifisitetsreagens (brun) og 2 μL synteseenzymblanding (brun) til prøven, noe som gir et totalt volum på 20 μL. Bland grundig ved å pipettere minst 10x og spinn raskt ned.
    2. Plasser prøverøret i PCR-maskinen forhåndsinnstilt ved 25 °C i 10 minutter, 42 °C i 50 minutter, 70 °C i 15 minutter, og hold ved 4 °C.
      MERK: For innsatser over 200 baser foreslås en inkubasjonsperiode på 42 °C på 50 minutter; For innsatsstørrelse under 200 baser foreslås en inkubasjonsperiode på 42 °C på 15 minutter.
  3. Andrestrengs cDNA-syntese
    1. Tilsett 8 μL syntesereaksjonsbuffer med dUTP-blanding (oransje), 4 μL synteseenzymblanding (oransje) og 48 μL nukleasefriH2O. Bland grundig ved å pipettere minst 10x og spinn raskt ned.
    2. Plasser prøverøret i PCR-maskinen som er forhåndsinnstilt ved 16 °C i 1 time med lokket satt av eller ≤40 °C.
  4. Rensing av dobbeltstrenget cDNA med DNA-renseperler
    1. Forvarm DNA-rensekulene 30 minutter før du utfører rensingen og virvelen for å resuspendere perlene.
    2. Tilsett 144 μL resuspenderte DNA-renseperler til cDNA-prøven fra trinn 3.3.2 og bland grundig ved å pipettere minst 10x.
    3. Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
    4. Plasser prøverøret på et magnetstativ i 5 minutter til oppløsningen er klar, og fjern deretter supernatanten og behold kulene som inneholder DNA.
    5. Tilsett 200 μL nylaget 80% etanol til røret med perlene mens du holder prøven på magnetstativet og inkuber ved romtemperatur i 30 s.
    6. Fjern supernatanten og gjenta trinn 3.4.5 én gang, men denne gangen fjerner du forsiktig all gjenværende supernatant.
    7. Lufttørk perlene i 1-5 min mens prøven holdes på magneten.
      NOTAT: Ikke tørk for mye perlene; Fargen skal være mørk brun.
    8. Fjern prøven fra magnetstativet og eluer DNA ved å legge til 53 μL 0,1x TE (10 mM Tris-HCl og 1 mM EDTA, pH 8,0) buffer til perlene. Bland godt ved å pipettere minst 10x og inkuber ved romtemperatur i 2 minutter.
    9. Plasser røret på magnetstativet i 5 minutter eller til oppløsningen er klar.
    10. Overfør 50 mikrol supernatant inneholdende dobbeltstrenget cDNA til et nytt 8-strips rør.
      MERK: Protokollen kan stoppes på dette tidspunktet, og prøven kan lagres ved -30 °C.
  5. Slutt på klargjøring av cDNA-bibliotek
    1. Tilsett 7 μL endepolerende reaksjonsbuffer (grønn) og 3 μL av den endepolerende enzymblandingen (grønn) til den eluerte dobbeltstrengede cDNA-prøven.
    2. Bland blandingen ved å pipettere 10x med en voluminnstilling på 50 μL uten å skape bobler, og spinn deretter prøven raskt.
    3. Legg prøven i en PCR-maskin og inkuber ved 20 °C i 30 minutter, 65 °C i 30 minutter, og hold ved 4 °C.
  6. Adapter ligering
    1. Fortynn adapteren (rød) i henhold til produsentens instruksjoner.
    2. Tilsett 2,5 μL av den fortynnede adapteren, 1 μL ligeringsforsterker (rød) og 30 μL Ligation Master Mix (rød) til prøven.
    3. Bland blandingen ved å pipetere 10x med en voluminnstilling på 80 μL uten å skape bobler, og spinn deretter prøven raskt.
    4. Legg prøven i en PCR-maskin og inkuber ved 20 °C i 15 minutter.
    5. Tilsett 3 μL av blandingen av uracil DNA-glykosylase og DNA-glykosylase-endonuklease VIII (blå) til prøven og pipet grundig.
    6. Legg prøven tilbake i PCR-maskinen og inkuber ved 37 °C i 15 minutter med lokket satt til 75 °C.
  7. Rensing av ligeringsreaksjonsbehandlede cDNA
    MERK: Størrelsesvalget med SPRIselect-perler, eller eventuelt med AMpure XP-perler, kan begge brukes til dette formålet18.
    1. Forvarm perlene 30 min før du utfører rensingen og virvelen for å resuspendere dem.
    2. Overfør 25 μL resuspenderte perler til cDNA-prøven fra trinn 3.6.6 og bland grundig ved å pipettere minst 10x.
    3. Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
    4. Plasser prøverøret på et magnetstativ i 5 minutter til oppløsningen er klar, og overfør deretter supernatanten til et nytt 8-stavsrør og kast kulene.
    5. Tilsett 10 μL resuspenderte perler til supernatanten og bland godt ved å pipettere minst 10x.
    6. Plasser prøverøret på et magnetstativ i 5 minutter til oppløsningen er klar, og kast deretter supernatanten og ikke forstyrr kulene.
    7. Tilsett 200 μL nylaget 80% etanol til røret med perlene mens du holder prøven på magnetstativet og inkuber ved romtemperatur i 30 s.
    8. Fjern supernatanten og gjenta trinn 3.7.7 én gang, men denne gangen fjerner du forsiktig all gjenværende supernatant.
    9. Lufttørk kulene i 1-5 min mens prøven holdes på magneten.
      NOTAT: Ikke tørk for mye perlene; Fargen skal være mørk brun.
    10. Fjern prøven fra magnetstativet og eluer DNA ved å legge til 17 μL 0,1x TE-buffer til perlene. Bland godt ved å pipettere minst 10x og inkuber ved romtemperatur i 2 minutter.
    11. Plasser røret på magnetstativet i 5 minutter til oppløsningen er klar.
    12. Overfør 15 μL supernatant, som inneholder målforberedt dsDNA til et nytt 8-strips rør.
  8. PCR-anrikning av adapterligert DNA
    1. Tilsett 25 μL masterblanding (blå), 5 μL 5' adapterprimer og 5 μL av 3'-adapterprimeren til den adapterligerte DNA-prøven. Bland godt ved å pipettere minst 10x.
    2. Plasser prøven i PCR-maskinen og utfør PCR-amplifisering ved å bruke følgende trinn: (1) 98 °C i 30 s, (2) 98 °C i 10 s, (3) 65 °C i 75 s, (4) 65 °C i 5 minutter og (5) hold ved 4 °C; der trinnene (2) og (3) skal gjentas for et N + 2-syklusnummer der N er lik RNA-inngangsmengden i bruksanvisningen. Dette betyr at 2 ekstra sykluser er nødvendig på grunn av det dobbeltsidige størrelsesutvalget av prøver utført i trinn 3.7.
      MERK: For eksempel vil 8 ng av den rensede mRNA-inngangen anbefales med 9-10 sykluser av PCR; men med dobbeltsidig, størrelsesvalgt, ligert cDNA i trinn 3.7, vil den anbefalte PCR-syklusen være 11-12 sykluser.
  9. Rensing av PCR-forsterkede biblioteker
    1. Forvarm DNA-rensekulene i 30 minutter før du utfører rensingen og virvelen for å resuspendere perlene.
    2. Overfør 45 mikrol (0,9x) resuspenderte perler til PCR-produktet fra trinn 3.8.2 og bland grundig ved å pipettere minst 10x.
    3. Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
    4. Plasser prøverøret på et magnetstativ i 5 minutter til oppløsningen er klar, og fjern deretter supernatanten og behold kulene som inneholder DNA.
    5. Tilsett 200 μL nylaget 80% etanol til røret med perlene, la prøven stå på magnetstativet og la den stå ved romtemperatur i 30 s.
    6. Fjern supernatanten og gjenta trinn 3.9.5 én gang, men denne gangen fjerner du forsiktig all gjenværende supernatant.
    7. Lufttørk kulene i 1-5 min mens prøven holdes på magneten.
      NOTAT: Ikke tørk for mye perlene; Fargen skal være mørk brun.
    8. Ta prøven av magnetstativet og tilsett 22 μL 0,1x TE-buffer til kulene for å eluere DNA. Bland godt ved å pipettere minst 10x og inkuber ved romtemperatur i 2 minutter.
    9. Plasser røret på magnetstativet og la det stå i 5 minutter eller til oppløsningen er klar ved romtemperatur.
    10. Overfør 20 mikrol supernatant til et nytt 8-stavs rør.
    11. Overfør 2,2 μL til 8-stavsrør for kvalitetsvurdering av bibliotekets mengde og kvalitet.
      MERK: Mengden av biblioteket kan også oppdages av qPCR (se materialfortegnelsen).
    12. Lagre bsRNA-seq-bibliotekprøven ved -20 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En rekke bsRNA-seq-biblioteker fra cellelinje19 ble generert ved å følge prosedyrene i denne rapporten (figur 1). Etter total RNA-rensing ledsaget av DNase-behandling utført på cellelinjeprøver og kvalitetskontrollert ved gelelektroforese og UV-Vis-spektrofotometri (A260/A280), kan RNA-prøven gå videre til poly(A) RNA-anrikning. For å avgjøre om den doble rensingen kunne fjerne flertallet av ribosomalt RNA, ble renseeffektiviteten av poly (A) RNA vurdert ved kapillær elektroforese total RNA-analyse som automatisk kan beregne rRNA-forurensningsprosenten (figur 2). Fra RNA-fragmentets toppmønster og rRNA-forurensningsprosent viste RNA-prøver med to ganger rensing faktisk redusert forurensning av ribosomalt RNA fra 6,5% til 2,2% og 2,6% til 1,1% i henholdsvis AsPC-1 og BxPC-3. Med humane kreftcellelinjer i bukspyttkjertelen kan to runder med perlerensing nå et gjennomsnitt på 2,8 ± 1% poly (A) -berikede RNA-overflod fra de totale RNA-prøvene. Derfor minimerte poly (A) RNA-anrikningen av oligo (dT) perler med doble rensingstrinn ribosomalt RNA og representerer en mulig mRNA-prøveanrikning for nedstrøms eksperimenter.

Bisulfittkonverteringsprotokollene var rapportert i flere studier på RNA 5-metylcytosinmodifisering (tabell 1). Bisulfittreaksjonen kunne utføres med en rekonstituert reaksjonsblanding bestående av 40 % natriumbisulfitt og 600 mM hydrokinon i vandig oppløsning (pH 5,1) ved 75 °C i 4 timer10,20,21. Alternativt kan en strengere bisulfittbehandling av RNA-prøve også utføres med et kommersielt sett; som i en rekke studier fra andre og vår 6,22,23,24 utvidet bisulfittreaksjonstiden til tre inkubasjonssykluser. Siden det tre-syklus inkubasjonstrinnet effektivt omdanner ikke-metylert cytosin i in vitro transkribert og strukturelt mer foldet Escherichia coli 16S rRNA segment8, ble tre-syklus inkubasjonstrinnet også anvendt i denne protokollen.

Med to ganger poly (A) anrikning og tre-syklus bisulfitt konvertering, ble RNA-kvalitet før og etter reaksjonen vurdert ved kapillær elektroforese. RNA-størrelsesfordelingen etter bisulfittbehandlingen viste en topp på ~200-500 nukleotider på grunn av fragmentering forårsaket av bisulfittreaksjonen (figur 3). I tillegg er det fragmenterte bsRNA ideelt for bibliotekforberedelse uten behov for å gjennomføre et nytt fragmenteringstrinn. Totalt 8-10 ng bsRNA som input ble brukt til å konstruere biblioteket i henhold til denne protokollen ved å bruke 9 til 11 sykluser i den endelige PCR-amplifiseringen av adapterligert DNA. Amplikonets kapillære elektroforese viste ganske vellykket bibliotekpreparering, med bare en liten del primer igjen og ingen overforsterkningstopp (figur 4). For å kontrollere konverteringseffektiviteten i hvert prøvebibliotek ble det ikke-metylerte firefly luciferase RNA som en spike-in kontrollsekvens lagt til prøven før bisulfittbehandlingen ble utført. Etter sekvenseringsavlesningene justert til referansesekvensen ved hjelp av meRanTK-verktøysett25, ble gjennomsnittet på 2 440 (0,006 %) av totale avlesninger kartlagt til piggsekvensen, og den totale analyserte C-til-T-konverteringsfrekvensen nådde et gjennomsnitt på 99,81 %; statusen kan ses i Integrated Genomics Viewer (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflytdiagram for bisulfitt mRNA-sekvensering. Rørledningen består av tre hovedprotokoller, inkludert mRNA-anrikning, bisulfittkonvertering og bibliotekforberedelse. Forkortelse: bsRNA = bisulfitt mRNA; QC. = kvalitetskontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kvalitetskontrollresultater av poly(A)-berikede RNA-prøver med kapillær elektroforese. (A) Den representative kapillære elektroforeseprofilen til det totale RNA fra BxPC-3-celler. (B ) De representative kapillære elektroforeseprofilene for prøver behandlet med oligo (dT) rensing fra AsPC-1 og BxPC-3 celler. mRNA E1, mRNA-eluering fra engangsrensing; mRNA E2, mRNA-eluering fra to ganger rensing. Estimatene for rRNA-forurensning ble beregnet av elektroforeseoperasjonssystemet som styrer den totale RNA-analyseanalysen. (C) Kapillærelektroforeseprofilen til stigemarkørene ble oppnådd i samme løp med prøver presentert i panel B. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kvalitetsvurdering av RNA-prøver ved kapillær elektroforese. De representative kapillære elektroforeseprofilene til (A) det totale RNA, (B) det poly(A)-berikede mRNA fra to ganger rensing, og (C) det bisulfittbehandlede mRNA fra BxPC-3-cellene. Forkortelser: B_empty = BxPC-3 celler transdusert med tom vektor; B_shScr = BxPC-3-celler transdusert med scramble-sekvensene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Kvalitetsvurdering av bsRNA-seq-biblioteker. (AC) Tre sett med representative kapillære elektroforeseprofiler av konstruerte bsRNA-seq-biblioteker forsterket av PCR ved forskjellige PCR-syklusnummer på 9 og 11 sykluser ved bruk av bsRNA fra et sett med BxPC-3-celler. Den estimerte inngangsmengden av det bisulfittbehandlede RNA ble bestemt av en høysensitiv RNA-kvantifiseringsanalyse. Totalt 8, 8,4 og 9,6 ng bsRNA ble brukt i henholdsvis (A) BxPC-3-mocken, (B) BxPC-3 tomme og (C) BxPC-3 shN2UN2-prøvene. Stigemarkørtoppene ved 35 bp og 10 380 bp representerer de interne standardene for nedre og øvre grense i elektroforeseprofilen til hver prøve. En fremtredende topp på henholdsvis rundt 100 bp og en obskur topp på rundt 127 bp indikerer PCR-primere (<100 bp) og adapterdimeren (~127 bp), som forble i eluatet etter PCR-opprydding. Forkortelser: BxPC-3 mock = utransducerte BxPC-3-celler; BxPC-3 tom = BxPC-3 celler transdusert med den tomme vektorkontrollen; BxPC-3 shN2UN2 = BxPC-3 celler transdusert med shNSUN2 konstruksjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Sekvensjusteringsprofilene for hvert bsRNA-seq-bibliotek tilordnet til spike-in-control-referansesekvensen. De representative justeringsprofilene til BxPC-3-mock-, empty-, scramble- og shNSUN2 bsRNA-seq-bibliotekene til firefly luciferase spike-in-kontrollreferansesekvensen (indikert som "Z"-genet); 2 representative regioner ble vist. Grå søyler indikerer alle avlesninger som presenterer matchede konsensusnukleotider ved den angitte baseposisjonen til referansesekvensen. Røde søyler markerer tymidin (T) identiteten ved utgangsposisjonen til lesningene; blå søyler indikerer de lesningene som har cytosin (C) identitet på posisjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Sammenligning av bisulfittreaksjonsprotokoller og konverteringsrate. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen ble en detaljert rørledning av poly (A) anrikning, bisulfittkonvertering og bibliotekforberedelse oppnådd ved å benytte standardiserte komponenter. Videre sekvenseringsanalyse ga identifisering av mRNA 5-metylcytosin i prøver av interesse.

Det kritiske trinnet er kvaliteten på startmaterialet - totalt RNA - siden nedbrytningen av RNA vil påvirke utvinningsgraden av poly (A) RNA-rensing. Prøven bør håndteres nøye og RNase-forurensning unngås før poly (A) RNA-rensingstrinnet utføres. En annen viktig del av prosedyren er antall PCR-sykluser i bibliotekforberedelse. Beslutningen av syklusnummer avhenger av mengden bisulfittbehandlet mRNA som brukes til bibliotekforberedelse og om bruken av en størrelsesvalg eller dobbeltstørrelsesvalg i trinnet før PCR. De egnede syklusnumrene for utvalget av interesse vil derfor kreve en prøvekjøring og vurdere PCR-produktstørrelsesfordelingen ved kapillær elektroforese for å bestemme det optimale syklusnummeret for samme cellelinje eller vev.

I denne protokollen ble to runder med oligo (dT) perler rensing brukt til å berike og rense poly (A) RNA og eliminert et flertall av ribosomale RNA og andre RNAer. Det finnes andre metoder for å fjerne ribosomalt RNA og beholde andre RNA-typer i prøven, for eksempel oligobasert uttømming av rRNA26. Deretter kan 5-metylcytosinmodifikasjonen som er tilstede i andre RNA-typer også tas i analyse og utvide forståelsen av 5-metylcytosinegenskaper i mRNA og andre RNAer.

Bisulfittreaksjon er kjent for ikke å kunne skille m 5 Cfra andre modifikasjoner, inkludert 5-hydroksymetylcytosin (hm5C), 3-metylcytidin (m3C) og N4-metylcytidin (m4C) 27. Imidlertid bør den eksperimentelle designen, inkludert m 5 C RNA metyltransferase knockdown eller knockout, gi informativt bevis på høy tillit regulertm5C steder. I tillegg kan validering ved hjelp av forskjellige metoder som antistoffbasert berikelse etterfulgt av sekvensering eller PCR eller LC-MS / MS-baserte metoder i hovedsak autentisere kandidaten m5C nettsteder16. Den nye teknikken for direkte nanopore RNA-sekvensering gir også potensiell identifisering av RNA-modifikasjon via beregningsanalyse av gjeldende signal eller base-kalt 'feil' funksjoner28,29,30.

En nylig studie av Johnson et al. viste at tilsetning av fragmenteringstrinnet i mitokondrier RNA-prøver etter tre runder med bisulfittkonvertering faktisk viste en høyere konverteringsfrekvens og økte utbyttet av cDNA-bibliotekprodukt31. Denne artikkelen analyserte spesifikt konverteringsfrekvensen og leser kvalitet kartlagt til mitokondriegenomet, ikke mRNA-transkriptomet. Derfor er bruken av fragmenteringstrinnet oppdatert i tabell 1 for å markere om de publiserte rapportene inkluderte et RNA-fragmenteringstrinn, slik at seerne enkelt kan replikere protokollen. En annen studie av Zhang et al. viste at bruk av in vitro transkribert modifikasjonsfritt RNA-bibliotek som en negativ kontroll er effektiv for å eliminere det falske positive signalet fra bisulfittbehandling32. Nylige studier har sammenlignet ulike protokoller som brukes til bibliotekkonstruksjon33. Brukeren kan videre velge å gjennomføre bsRNA-seq pipeline med eller uten et ekstra fragmenteringstrinn og in vitro transkribert modifikasjonsfritt RNA-bibliotek for å tilpasse passende arbeidsflyt.

Den transkriptombrede identifiseringen av m5C ved forskjellige prinsipper kan styrke funnene fra modifikasjonslandskapene og gi mer forståelse av reguleringsmekanismene for RNA-modifikasjoner i friske eller sykdomsmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Science and Technology Council of Taiwan. [NSTC 111-2314-B-006-003]

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System Agilent, Santa Clara, CA RNA quality detection
AMpure XP beads Beckman Coulter A63881 purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-4626 DNA quality detection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-1513 RNA quality detection
DiaMag02 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000001 assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000003 assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 61011 poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol J.T.Baker 64-17-5
EZ RNA methylation kit Zymo, Irvine, CA R5002 bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA Promega, Madison, WI, USA L4561 spike in control seqeunce 
KAPA Library Quantification Kits Roche, Switzerland KK4824 library quantification
Nanodrop spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) New England Biolabs, Ipswich, MA E7335S library preparation
NEBNext Ultra Equation 1 Directional RNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs, Ipswich, MA E7760S library preparation
Nuclease-free Water Thermo Fisher Scientific AM9932
P2 pipetman Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 4641010
Qubit 2.0 fluorometer  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32854 DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32852 RNA quantity detection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
  2. Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102 (2019).
  3. Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959 (2023).
  4. Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
  5. Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
  6. Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
  7. Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
  8. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).
  9. Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40 (2020).
  10. Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606 (2017).
  11. Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
  12. Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430 (2020).
  13. Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15 (2022).
  14. Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43 (2020).
  15. Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
  16. Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
  17. Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231 (2020).
  18. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 18, Unit 18.12 (2009).
  19. Chen, S. -Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
  20. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  21. Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
  22. Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
  23. Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
  24. Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
  25. Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
  26. Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281 (2019).
  27. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602 (2013).
  28. Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
  29. Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198 (2021).
  30. Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
  31. Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045 (2022).
  32. Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
  33. Chao, H. -P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).

Tags

MRNA-anrikning klargjøring av bisulfitt-mRNA-bibliotek neste generasjons sekvensering RNA posttranskripsjonelle modifikasjoner RNA-regulering eukaryote celler RNA 5-metylcytosinmodifikasjoner RNA-metyltransferaser sykdommer kreft transkriptombrede bisulfittsekvensering cytosinmetyleringsnivåer poly (A) RNA-rensing bisulfittreaksjon bibliotekforberedelse MRNA 5-metylcytosinmodifikasjonssteder RNA-kvantitet og kvalitetsvurdering RNA-integritetsovervåking høy kvalitet Sekvens av biblioteker
Anrikning av mRNA og bisulfitt-mRNA-bibliotekforberedelse for neste generasjons sekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S. Y., Huang, P. H. Enrichment … More

Chen, S. Y., Huang, P. H. Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (197), e65352, doi:10.3791/65352 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter