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Biology

Anreicherung von mRNA- und Bisulfit-mRNA-Bibliotheksvorbereitung für Next-Generation-Sequencing

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65352
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

Summary

Dieses Protokoll bietet einen einfach zu befolgenden Arbeitsablauf für die Durchführung von Poly(A)-RNA-Aufreinigung, Bisulfitumwandlung und Bibliotheksvorbereitung mit standardisierten Geräten für eine biologische Probe von Interesse.

Abstract

RNA-posttranskriptionelle Modifikationen in verschiedenen Arten von RNA-Transkripten sind mit einer vielfältigen RNA-Regulation in eukaryotischen Zellen verbunden. Es wurde gezeigt, dass aberrante RNA-5-Methylcytosin-Modifikationen und die dysregulierte Expression von RNA-Methyltransferasen mit verschiedenen Krankheiten, einschließlich Krebs, in Verbindung gebracht werden. Die Transkriptom-weite Bisulfit-Sequenzierung wurde entwickelt, um die Positionen und die quantitativen Cytosin-Methylierungsniveaus in der Bisulfit-konvertierten RNA mit Basenpaarauflösung zu charakterisieren. In diesem Protokoll werden die Verfahren von zwei Runden der Poly(A)-RNA-Reinigung, drei Zyklen der Bisulfitreaktion und der Bibliotheksvorbereitung im Detail vorgestellt, um die transkriptomweite Kartierung von mRNA-5-Methylcytosin-Modifikationsstellen zu ermöglichen. Die Bewertung der RNA-Quantität und -Qualität nach der Hauptreaktion ist für die Überwachung der RNA-Integrität unerlässlich und ein entscheidender Schritt zur Gewährleistung qualitativ hochwertiger Sequenzierungsbibliotheken. Im Idealfall können die Eingriffe innerhalb von drei Tagen abgeschlossen werden. Mit diesem Protokoll können durch die Verwendung hochwertiger Gesamt-RNA als Input praktisch robuste Bisulfit-mRNA-Bibliotheken für die Sequenzierung der nächsten Generation aus der interessierenden Probe aufgebaut werden.

Introduction

Unter über 150 Arten von posttranskriptionellen Modifikationen1 wurde eine Modifikation von 5-Methylcytosin (m5C) in verschiedenen Arten von RNAs identifiziert, darunter ribosomale RNA, Transfer-RNA, Boten-RNA, Mikro-RNA, lange nicht-kodierende RNA, Vault-RNA, Enhancer-RNA und kleine Cajal-Körper-spezifische RNAs2. Die RNA m5Cist mit verschiedenen biologischen und pathologischen Mechanismen assoziiert, wie z. B. der Regulierung der Pflanzenwurzelentwicklung3, der viralen Genexpression4 und der Krebsprogression5. Das Ziel dieses Protokolls ist es, optimierte Pipelines zur Charakterisierung des transkriptomweiten mRNA-m5C-Modifikationsprofils biologischer Proben in verschiedenen Entwicklungsstadien oder im Krankheitsstadium bereitzustellen. Die Transkriptom-weite Bisulfit-Sequenzierung wurde entwickelt, um die Positionen und die quantitativen Cytosin-Methylierungsniveaus in der Bisulfit-umgewandelten RNA mit einer Basenpaar-Auflösungvon 6,7,8,9 zu charakterisieren. Dies ist besonders nützlich, wenn es darum geht, die Assoziation von m5C mit der Genexpression und dem RNA-Schicksal zu untersuchen, die an den biologischen Regulationsmechanismen in Zellen beteiligt sind. In der Säugetierzelle gibt es zwei bekanntem5C-Reader: ALYREF kann m 5C am Zellkern erkennen und dient als mRNA-Nucleus-to-Cytosol-Transporter10, während YBX1 m5Cim Zytoplasma erkennen unddie mRNA-Stabilisierung11 erhöhen kann. Aberrante m5-C-mRNAs, die mit Immunsignalwegen in Verbindung stehen, wurden in systemischen Lupus erythematodes CD4+ T-Zellen berichtet12. Studien haben einen Zusammenhang zwischen der mRNA-m5C-Modifikation und der Modulation der Krebsimmunität und dem Fortschreiten der Krebserkrankung gezeigt13,14. Daher kann die Kartierung desm5C-Modifikationsprofils auf der mRNA entscheidende Informationen zur Aufklärung der potenziellen regulatorischen Maschinerie liefern.

Um die funktionelle Rolle der RNA-m5C-Modifikation unter bestimmten biologischen Bedingungen zu untersuchen, können die auf Bisulfitumwandlung (bsRNA-seq) und Antikörperaffinitätsanreicherung basierenden Ansätze wie m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq und 5-Aza-seq mit der Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattform kombiniert werden, um eine effiziente Detektion von Zielregionen und -sequenzen mit den m5C-Modifikationen auf einer transkriptomweiten Skala zu ermöglichen15, 16. Anmelden Der Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass die umfassende RNA-m5C-Landschaft mit einer Einzelbasenauflösung versehen ist, da der auf Antikörperaffinität basierende Ansatz auf der Verfügbarkeit hochwertiger Antikörper beruht und die Einzelfragmentauflösung derm5C-Methylierungslandschaft17 erreichen könnte.

Alle RNA-Proben werden mit zwei Runden der mRNA-Anreicherung mit Oligo(dT)-Kügelchen, drei Zyklen der Bisulfitreaktion und der Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek verarbeitet. Um die RNA-Qualität zu überwachen, wird jede RNA-Probe vor und nach den Verfahren der mRNA-Reinigung und der Bisulfitreaktion mittels Kapillargelelektrophorese untersucht, um die Fragmentverteilung zu beurteilen. Die gereinigten Bibliotheken werden vor der Sequenzierung auf ihre PCR-Amplikonqualitäten, DNA-Größenverteilungsfragmente durch Kapillargelelektrophorese und ihre Gesamtmengen durch Fluoreszenzfarbstoff-basierte quantitative Assays untersucht. Das System kann auch zur Analyse eines breiten Spektrums biologischer Proben wie landwirtschaftlichen Erzeugnissen, isolierten Virionen, Zelllinien, Modellorganismen und pathologischen Proben verwendet werden.

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Protocol

1. Poly(A)-RNA-Aufreinigung

HINWEIS: Verwenden Sie die mit DNase I behandelte Gesamt-RNA und untersuchen Sie die Gesamt-RNA-Qualität und -Integrität durch Kapillar- oder konventionelle Gelelektrophorese, bevor Sie mit der Poly(A)-RNA-Aufreinigung fortfahren. Die Forscher sollten in der Lage sein, die ribosomalen 28S- und 18S-rRNA-Banden im hochmolekularen Feld und die 5,8S-rRNA-Bande im niedermolekularen Feld ohne signifikante Schmierbanden im Elektropherogramm zu identifizieren. Die Reinigungsschritte folgen im Wesentlichen den Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Änderungen, die in den spezifischen Schritten angegeben sind. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

  1. Präparat
    1. Erwärmen Sie das Reagenz, den Waschpuffer, die Oligo(dT)-Kügelchen und den Lysepuffer 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie die folgenden Verfahren durchführen.
    2. Für die Isolierung von Poly(A)-angereicherter RNA werden 10-20 μg eines Aliquots hochwertiger Gesamt-RNA als Ausgangsmaterial hergestellt, indem eine ausreichende Menge RNA in ein nukleasefreies 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt wird. Im Wärmeblock bei 70 °C 5 min inkubieren, dann 2 min auf Eis lassen.
      HINWEIS: Die Mengen der Gesamt-RNA als Ausgangsmaterial sollten in Abhängigkeit von der gewünschten Menge an mRNA und der Art der verwendeten Zellen entsprechend angepasst werden. Empirisch kann die mit Poly(A) angereicherte RNA für 1-5% Häufigkeiten in der Gesamt-RNA verantwortlich sein. Ein Aliquot von 10 μg hochwertiger Gesamt-RNA sollte hochwertige Poly(A)-angereicherte RNA im Bereich von 100-500 ng für die nachgeschaltete Bisulfit-Umwandlung liefern.
    3. In der Zwischenzeit werden die Oligo(dT)-Kügelchen vollständig resuspendiert. Geben Sie die erforderlichen Mengen an Kügelchensuspension in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie es dann 3 Minuten lang auf den Magneten, bis die Magnetkügelchen ein Pellet bilden.
      HINWEIS: Verwenden Sie 50 μl Oligo(dT)-Kügelchen für 10 μg Gesamt-RNA-Input. Das Volumen der Kügelchen in diesem Schritt könnte je nach den verwendeten Zellen weiter optimiert werden.
    4. Der Überstand wird entfernt und die Oligo(dT)-Kügelchen mit der gleichen Menge (dem Volumen der in Schritt 1.1.3 verwendeten Kügelchensuspension) des Lysepuffers resuspendiert und 3 Minuten lang auf den Magneten gelegt, bevor der Überstand entfernt wird.
      HINWEIS: Trocknen Sie die Perlen nicht zu sehr aus. Der Benutzer sollte schnell mit Schritt 1.2.1 fortfahren.
  2. Die erste Runde der Reinigung
    1. Geben Sie Lysepuffer in das RNA-Probenröhrchen (Volumenverhältnis 4:1) und mischen Sie es gründlich, bevor Sie es auf die Oligo(dT)-Kügelchen übertragen.
      HINWEIS: Wenn das RNA-Probenvolumen 20 μl beträgt, fügen Sie 80 μl Lysepuffer hinzu.
    2. Resuspendieren Sie die RNA: Lysepuffermischung und Oligo(dT)-Kügelchen vollständig, indem Sie mindestens 10x pipettieren.
    3. Lassen Sie die Proben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in kontinuierlicher Rotation inkubieren.
    4. Legen Sie die Probe 5 Minuten lang auf den Magneten oder bis der Überstand klar ist. Verwerfen Sie den Überstand.
    5. Geben Sie 600 μl Waschpuffer 1 zu den Kügelchen und mischen Sie sie vorsichtig, um die Kügelchen wieder zu suspendieren.
    6. Legen Sie das Röhrchen für 5 Minuten auf den Magneten oder bis der Überstand frei ist, entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschschritt 1.2.5 einmal.
    7. Waschen Sie die Perlen durch Zugabe von 300 μl Waschpuffer 2 und suspendieren Sie die Perlen vorsichtig wieder.
    8. Legen Sie das Röhrchen für 5 Minuten auf den Magneten oder bis der Überstand frei ist, entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschschritt 1.2.7 einmal.
    9. 30 μl kaltes 10 mM Tris-HCl (Elutionspuffer) in das Probenröhrchen geben und bei 70 °C 5 min inkubieren.
    10. Übertragen Sie das Röhrchen schnell auf den Magneten, und wenn die Suspension nach 20 s oder mehr klar ist, überführen Sie den Überstand mit eluierter Poly(A)-angereicherter RNA in das neue 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  3. Die zweite Runde der Reinigung
    1. 120 μl (4x das Volumen der eluierten Probe) Lysepuffer zur eluierten RNA-Probe geben und gründlich mischen.
    2. Die in der ersten Reinigungsrunde verwendeten Kügelchen werden mit der gleichen Menge Lysepuffer wie in Schritt 1.1.4 gewaschen, 10x pipetiert, um die Kügelchen zu resuspendieren, und dann 5 Minuten lang auf den Magneten gelegt, bevor der Überstand verworfen wird.
    3. Übertragen Sie die RNA: Lysepuffermischung auf die gewaschenen Kügelchen und mischen Sie sie gründlich, indem Sie mindestens 10x pipettieren.
    4. Inkubieren Sie die Probe mit kontinuierlicher Rotation für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.4 bis 1.2.8, um Salz und andere RNA-Subtypen zu entfernen.
      HINWEIS: Das Volumen des Waschpuffers kann auf 300 μl Waschpuffer 1 und 150 μl Waschpuffer 2 reduziert werden.
    6. 25 μl (gewünschtes Volumen) kaltes 10 mM Tris-HCl (Elutionspuffer) in das Probenröhrchen geben und bei 70 °C 5 min inkubieren.
    7. Übertragen Sie das Röhrchen schnell auf den Magneten, und wenn die Suspension nach 20 s oder mehr klar ist, überführen Sie den Überstand, der eluierte, mit Poly(A) angereicherte RNA enthält, in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    8. Transfer von 2,2 μl in 8-Streifen-Röhrchen zur Qualitätsbewertung der RNA-Quantität und -Qualität mit hochempfindlichen RNA-Assays.
    9. Lagern Sie die Probe kurzzeitig bei -20 °C und über einen längeren Zeitraum bei -70 °C.
      HINWEIS: Dies kann ein Pausenpunkt im Protokoll sein.

2. Bisulfit-Umwandlung

HINWEIS: Die Zentrifugationsschritte wurden alle bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Verfahren werden im Wesentlichen gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, jedoch mit einem zusätzlichen Schritt 2.2 zur Zugabe der Spike-in-Kontroll-mRNA-Sequenz(en) vor dem Bisulfit-Reaktionsschritt 2.3.

  1. 19 μl der gereinigten, mit Poly(A) angereicherten RNA-Probe in ein 0,2-ml-8-Streifen-Röhrchen überführen.
  2. In die RNA-Probe von Schritt 2.1 werden 1,0 μl Spike-in-Kontrolle, die bei dem vorgegebenen Mengenverhältnis von 1:10.000 frei von Modifikationen ist (d. h. 0,1 ng Luciferase-mRNA: 1 μg gereinigte Poly(A)-angereicherte RNA) zugegeben.
    HINWEIS: Bei der Spike-in-Kontrollsequenz kann es sich um Firefly-Luciferase-RNA, Renilla-Luciferase oder eine in vitro transkribierte RNA-Sequenz ohne methylierte Cytosine handeln.
  3. Geben Sie 130 μl Umwandlungsregent in das Röhrchen und wenden Sie es mehrmals vorsichtig um, um es gründlich zu mischen.
  4. Legen Sie das Röhrchen in das PCR-Gerät und führen Sie drei Zyklen des Erhitzens bei 70 °C für 10 Minuten durch, gefolgt von einer Inkubation bei 64 °C für jeweils 45 Minuten und einem letzten Schritt zum Abkühlen auf 4 °C.
  5. Setzen Sie die Säule auf das Sammelröhrchen und geben Sie 250 μl RNA-Bindungspuffer auf die Säule.
  6. Die Probe aus Schritt 2.4 in die Säule aus Schritt 2.5 überführen und gründlich pipettieren.
  7. Geben Sie 400 μl 95-100% Ethanol in die Säule, schließen Sie die Kappe schnell und drehen Sie sie mehrmals um.
  8. Bei 10.000 × g 30 s bei 25 °C zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen.
  9. Geben Sie 200 μl RNA-Waschpuffer in die Säule.
  10. Bei 10.000 × g 30 s bei 25 °C zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen.
  11. 200 μl Desulfonierungspuffer zugeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  12. Bei 10.000 × g 30 s bei 25 °C zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen.
  13. 400 μl RNA-Waschpuffer zugeben und bei 10.000 × g 30 s bei 25 °C zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
  14. Bei 10.000 × g erneut 2 min bei 25 °C zentrifugieren, um den restlichen Waschpuffer vollständig zu entfernen.
    HINWEIS: Der andere Zentrifugationsschritt 2.14 für 2 Minuten vor der Elution besteht darin, den Waschpuffer vollständig zu entfernen. Der Waschschritt wird zweimal durchgeführt, um die salzreiche Komponente aus dem Bisulfit-Reagenz und dem Desulfonierungspuffer auf der Säule auszuwaschen.
  15. Übertragen Sie die Säule in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  16. 20-30 μl nukleasefreies H2O in dieSäule geben und 1 Minute bei Raumtemperatur stehen lassen.
  17. Bei 10.000 × g 30 s bei 25 °C zentrifugieren.
  18. Übertragen Sie 2,2 μl in 8-Streifen-Röhrchen zur Beurteilung der RNA-Quantität und -Qualität.
  19. Lagern Sie die mit Bisulfit behandelte RNA-Probe kurzzeitig bei -20 °C und über einen längeren Zeitraum bei -70 °C.
    HINWEIS: Dies kann ein Pausenpunkt im Protokoll sein.

3. Bisulfit-behandelte mRNA-Bibliotheksvorbereitung

HINWEIS: Befolgen Sie Abschnitt 4 des Bibliotheksvorbereitungsanweisungsprotokolls für die Verwendung mit gereinigter mRNA oder rRNA-abgereicherter RNA. Der erste Priming-Schritt sollte dem FFPE-RNA-Protokoll folgen, da die Bisulfit-Behandlung die RNA fragmentiert. Führen Sie jeden Schritt in der Laminar-Flow-Haube durch und geben Sie das Reaktionsgemisch auf ein eisgekühltes Kühlgitter.

  1. Priming der Eingangs-RNA
    1. Übertragen Sie die gewünschte Menge der mit Bisulfit behandelten mRNA-Probe in insgesamt maximal 5 μl oder fügen Sie nukleasefreiesH2Ohinzu, um insgesamt 5 μl zu erhalten.
      HINWEIS: Für diese Art der RNA-Bibliotheksvorbereitung und zur Erzeugung der endgültigen Molarität des 4-nM-Bibliotheksprodukts wird ein Minimum von 10 ng Bisulfit-behandelter mRNA als Input empfohlen.
    2. Geben Sie 1 μl Random-Primer (Flieder) in die Probe und mischen Sie sie durch Pipettieren.
    3. Das Probenröhrchen wird bei 65 °C und Deckel bei 105 °C für 5 min in das PCR-Gerät gestellt und bei 4 °C gehalten.
  2. Erststrang-cDNA-Synthese
    1. Geben Sie 4 μl Synthesereaktionspuffer (Flieder), 8 μl Strangspezifitätsreagenz (braun) und 2 μl Syntheseenzymmischung (braun) zur Probe, was ein Gesamtvolumen von 20 μl ergibt. Mischen Sie gründlich, indem Sie mindestens 10x pipettieren und schleudern Sie es schnell herunter.
    2. Das Probenröhrchen wird 10 Minuten lang bei 25 °C, 50 Minuten bei 42 °C und 15 Minuten bei 70 °C in das PCR-Gerät eingelegt und bei 4 °C gehalten.
      HINWEIS: Für Einsätze mit mehr als 200 Basen wird eine Inkubationszeit von 50 Minuten bei 42 °C empfohlen. Für Einsatzgrößen unter 200 Basen wird eine Inkubationszeit von 15 min bei 42 °C empfohlen.
  3. Second-Strang-cDNA-Synthese
    1. 8 μl Synthesereaktionspuffer mit dUTP-Mischung (orange), 4 μl Syntheseenzymmischung (orange) und 48 μl nukleasefreiesH2O hinzufügen.
    2. Legen Sie das Probenröhrchen bei 16 °C für 1 Stunde mit abgesetztem Deckel oder ≤40 °C in das PCR-Gerät.
  4. Aufreinigung von doppelsträngiger cDNA mit DNA-Aufreinigungskügelchen
    1. Erwärmen Sie die DNA-Reinigungskügelchen 30 Minuten vor der Aufreinigung und wirbeln Sie die Kügelchen auf, um sie zu resuspendieren.
    2. 144 μl resuspendierte DNA-Aufreinigungskügelchen in die cDNA-Probe aus Schritt 3.3.2 geben und gründlich mischen, indem mindestens 10x pipettiert wird.
    3. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Legen Sie das Probenröhrchen 5 Minuten lang auf ein magnetisches Gestell, bis die Lösung klar ist, entfernen Sie dann den Überstand und bewahren Sie die DNA-haltigen Kügelchen auf.
    5. Geben Sie 200 μl frisch hergestelltes 80%iges Ethanol in das Röhrchen mit den Kügelchen, während Sie die Probe auf dem magnetischen Gestell aufbewahren und 30 s lang bei Raumtemperatur inkubieren.
    6. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie Schritt 3.4.5 einmal, aber dieses Mal entfernen Sie vorsichtig den gesamten Restüberstand.
    7. Trocknen Sie die Perlen 1-5 Minuten lang an der Luft, während Sie die Probe auf dem Magneten halten.
      HINWEIS: Trocknen Sie die Perlen nicht zu sehr aus. Die Farbe sollte dunkelbraun sein.
    8. Nehmen Sie die Probe aus dem magnetischen Gestell und eluieren Sie die DNA, indem Sie 53 μl 0,1x TE-Puffer (10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA, pH 8,0) zu den Kügelchen hinzufügen. Mindestens 10x pipettieren und 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    9. Legen Sie das Röhrchen für 5 Minuten auf das magnetische Gestell oder bis die Lösung klar ist.
    10. 50 μl Überstand, der doppelsträngige cDNA enthält, in ein neues 8-Streifen-Röhrchen überführen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle gestoppt und die Probe bei -30 °C gelagert werden.
  5. Endvorbereitung der cDNA-Bibliothek
    1. 7 μl Endpolier-Reaktionspuffer (grün) und 3 μl Endpolier-Enzymmischung (grün) in die eluierte doppelsträngige cDNA-Probe geben.
    2. Mischen Sie die Mischung, indem Sie 10x mit einer Volumeneinstellung von 50 μl pipettieren, ohne Blasen zu erzeugen, und schleudern Sie die Probe dann schnell herunter.
    3. Geben Sie die Probe in ein PCR-Gerät und inkubieren Sie sie bei 20 °C für 30 Minuten, 65 °C für 30 Minuten und halten Sie sie bei 4 °C.
  6. Adapter-Ligatur
    1. Verdünnen Sie den Adapter (rot) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    2. Geben Sie 2,5 μl des verdünnten Adapters, 1 μl Ligationsverstärker (rot) und 30 μl Ligations-Mastermix (rot) in die Probe.
    3. Mischen Sie die Mischung, indem Sie 10x mit einer Volumeneinstellung von 80 μl pipettieren, ohne Blasen zu bilden, und schleudern Sie die Probe dann schnell herunter.
    4. Die Probe wird in ein PCR-Gerät gegeben und 15 Minuten lang bei 20 °C inkubiert.
    5. 3 μl der Mischung aus Uracil-DNA-Glykosylase und DNA-Glykosylase-Lyase-Endonuklease VIII (blau) in die Probe geben und gründlich pipettieren.
    6. Geben Sie die Probe zurück in das PCR-Gerät und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 °C bei 75 °C Deckel.
  7. Aufreinigung von mit Ligationsreaktionen behandelten cDNAs
    HINWEIS: Zu diesem Zweck kann sowohl die Größenauswahl mit SPRIselect Beads als auch optional mit AMpure XP Perlen verwendet werden18.
    1. Erwärmen Sie die Perlen 30 Minuten vor der Reinigung und Wirbel, um sie wieder zu suspendieren.
    2. 25 μl resuspendierte Kügelchen aus Schritt 3.6.6 in die cDNA-Probe überführen und durch mindestens 10-faches Pipettieren gründlich mischen.
    3. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Legen Sie das Probenröhrchen 5 Minuten lang auf ein magnetisches Gestell, bis die Lösung klar ist, und überführen Sie dann den Überstand in ein neues 8-Streifen-Röhrchen und entsorgen Sie die Kügelchen.
    5. Geben Sie 10 μl resuspendierte Kügelchen in den Überstand und mischen Sie sie gründlich, indem Sie mindestens 10x pipettieren.
    6. Legen Sie das Probenröhrchen 5 Minuten lang auf ein magnetisches Gestell, bis die Lösung klar ist, und entsorgen Sie dann den Überstand und stören Sie die Kügelchen nicht.
    7. Geben Sie 200 μl frisch hergestelltes 80%iges Ethanol in das Röhrchen mit den Kügelchen, während Sie die Probe auf dem magnetischen Gestell aufbewahren und 30 s lang bei Raumtemperatur inkubieren.
    8. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie Schritt 3.7.7 einmal, aber dieses Mal entfernen Sie vorsichtig den gesamten Restüberstand.
    9. Trocknen Sie die Kügelchen 1-5 Minuten lang an der Luft, während Sie die Probe auf dem Magneten lassen.
      HINWEIS: Trocknen Sie die Perlen nicht zu sehr aus. Die Farbe sollte dunkelbraun sein.
    10. Nehmen Sie die Probe aus dem magnetischen Gestell und eluieren Sie die DNA, indem Sie 17 μl 0,1x TE-Puffer zu den Kügelchen hinzufügen. Mindestens 10x pipettieren und 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    11. Legen Sie das Röhrchen 5 Minuten lang auf das magnetische Gestell, bis die Lösung klar ist.
    12. 15 μl Überstand, der die am Zielende vorbereitete dsDNA enthält, in ein neues 8-Streifen-Röhrchen überführen.
  8. PCR-Anreicherung von adaptor-ligierter DNA
    1. 25 μl Mastermix (blau), 5 μl 5'-Adapterprimer und 5 μl 3'-Adapterprimer zur adapterligierten DNA-Probe geben. Gründlich mischen, indem Sie mindestens 10x pipettieren.
    2. Geben Sie die Probe in das PCR-Gerät und führen Sie die PCR-Amplifikation mit den folgenden Schritten durch: (1) 98 °C für 30 s, (2) 98 °C für 10 s, (3) 65 °C für 75 s, (4) 65 °C für 5 Minuten und (5) Halten bei 4 °C; in dem die Schritte (2) und (3) für eine N+2-Zykluszahl wiederholt werden sollten, wobei N gleich der RNA-Eingabemenge in der Bedienungsanleitung ist. Dies bedeutet, dass aufgrund der in Schritt 3.7 durchgeführten doppelseitigen Größenauswahl der Proben 2 zusätzliche Zyklen erforderlich sind.
      HINWEIS: Zum Beispiel würden 8 ng des gereinigten mRNA-Inputs bei 9-10 PCR-Zyklen empfohlen; Bei doppelseitiger, größenselektierter, ligierter cDNA in Schritt 3.7 beträgt der empfohlene PCR-Zyklus jedoch 11-12 Zyklen.
  9. Aufreinigung von PCR-amplifizierten Bibliotheken
    1. Erwärmen Sie die DNA-Aufreinigungskügelchen 30 Minuten lang, bevor Sie die Aufreinigung durchführen und Wirbel verwenden, um die Kügelchen zu resuspendieren.
    2. 45 μl (0,9x) resuspendierte Beads werden in das PCR-Produkt aus Schritt 3.8.2 überführt und durch Pipettieren von mindestens 10x gründlich vermischt.
    3. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Legen Sie das Probenröhrchen 5 Minuten lang auf ein magnetisches Gestell, bis die Lösung klar ist, entfernen Sie dann den Überstand und bewahren Sie die DNA-haltigen Kügelchen auf.
    5. Geben Sie 200 μl frisch hergestelltes 80%iges Ethanol in das Röhrchen mit den Kügelchen, lassen Sie die Probe auf dem Magnetgestell und lassen Sie sie 30 s lang bei Raumtemperatur stehen.
    6. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie Schritt 3.9.5 einmal, aber entfernen Sie dieses Mal vorsichtig den gesamten Restüberstand.
    7. Trocknen Sie die Kügelchen 1-5 Minuten lang an der Luft, während Sie die Probe auf dem Magneten lassen.
      HINWEIS: Trocknen Sie die Perlen nicht zu sehr aus. Die Farbe sollte dunkelbraun sein.
    8. Nehmen Sie die Probe vom magnetischen Gestell und geben Sie 22 μl 0,1x TE-Puffer zu den Kügelchen, um die DNA zu eluieren. Mindestens 10x pipettieren und 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    9. Legen Sie das Röhrchen auf das magnetische Gestell und lassen Sie es 5 Minuten lang stehen oder bis die Lösung bei Raumtemperatur klar ist.
    10. 20 μl Überstand in ein neues 8-Streifen-Röhrchen überführen.
    11. Übertragen Sie 2,2 μl in 8-Streifen-Röhrchen zur Qualitätsbewertung der Bibliotheksquantität und -qualität.
      HINWEIS: Die Menge der Bibliothek kann auch mittels qPCR nachgewiesen werden (siehe Materialtabelle).
    12. Lagern Sie die Probe der bsRNA-seq-Bibliothek bei -20 °C.

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Representative Results

Eine Reihe von bsRNA-seq-Bibliotheken aus Zelllinien19 wurde erzeugt, indem die Verfahren in diesem Bericht befolgt wurden (Abbildung 1). Nach der vollständigen RNA-Aufreinigung mit einer DNase-Behandlung, die an Zelllinienproben durchgeführt wird, und der Qualitätskontrolle durch Gelelektrophorese und UV-Vis-Spektrophotometrie (A260/A280) kann die RNA-Probe zur Poly(A)-RNA-Anreicherung übergehen. Um festzustellen, ob durch die doppelte Aufreinigung der Großteil der ribosomalen RNA entfernt werden konnte, wurde die Aufreinigungseffizienz von Poly(A)-RNA durch einen Kapillarelektrophorese-Gesamt-RNA-Assay bewertet, der den Prozentsatz der rRNA-Kontamination automatisch berechnen kann (Abbildung 2). Aus dem RNA-Fragment-Peak-Muster und dem rRNA-Kontaminationsprozentsatz zeigten RNA-Proben mit zweimaliger Aufreinigung tatsächlich eine verringerte Kontamination der ribosomalen RNA von 6,5 % auf 2,2 % bzw. 2,6 % auf 1,1 % in AsPC-1 bzw. BxPC-3. Mit humanen Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinien konnten zwei Runden der Beads-Aufreinigung durchschnittlich 2,8 ± 1% Poly(A)-angereicherte RNA-Häufigkeiten aus den Gesamt-RNA-Proben erreichen. Daher minimierte die poly(A)-RNA-Anreicherung durch Oligo(dT)-Beads mit doppelten Reinigungsschritten die ribosomale RNA und stellt eine praktikable mRNA-Probenanreicherung für die nachgeschalteten Experimente dar.

Die Bisulfit-Umwandlungsprotokolle wurden in mehreren Studien zur RNA-5-Methylcytosin-Modifikation berichtet (Tabelle 1). Die Bisulfitreaktion konnte mit einem vom Anwender rekonstituierten Reaktionsgemisch bestehend aus 40% Natriumbisulfit und 600 mM Hydrochinon in der wässrigen Lösung (pH 5,1) bei 75 °C für 4 Stunden durchgeführt werden10,20,21. Alternativ kann eine strengere Bisulfitbehandlung der RNA-Probe auch mit einem kommerziellen Kit durchgeführt werden; was in einer Reihe von Studien von anderen und unseren 6,22,23,24 die Bisulfit-Reaktionszeit auf drei Inkubationszyklen verlängerte. Da der dreistufige Inkubationsschritt unmethyliertes Cytosin effizient in das in vitro transkribierte und strukturell stärker gefaltete Escherichia coli 16S rRNA-Segment8 umwandelt, wurde der dreizyklische Inkubationsschritt auch in diesem Protokoll angewendet.

Mit zweifacher Poly(A)-Anreicherung und der dreizykligen Bisulfit-Umwandlung wurde die RNA-Qualität vor und nach der Reaktion durch Kapillarelektrophorese bestimmt. Die RNA-Größenverteilung nach der Bisulfit-Behandlung zeigte einen Peak von ~200-500 Nukleotiden aufgrund der durch die Bisulfit-Reaktion verursachten Fragmentierung (Abbildung 3). Darüber hinaus ist die fragmentierte bsRNA ideal für die Bibliotheksvorbereitung, ohne dass ein weiterer Fragmentierungsschritt durchgeführt werden muss. Insgesamt wurden 8-10 ng bsRNA als Input verwendet, um die Bibliothek gemäß diesem Protokoll zu konstruieren, indem 9 bis 11 Zyklen in der abschließenden PCR-Amplifikation der adapterligierten DNA verwendet wurden. Die Kapillarelektrophorese des Amplikons zeigte eine recht erfolgreiche Bibliothekspräparation, bei der nur ein kleiner Teil des Primers übrig blieb und kein Peak der Überamplifikation auftrat (Abbildung 4). Um die Umwandlungseffizienz in jeder Probenbibliothek zu überprüfen, wurde die unmethylierte Glühwürmchen-Luciferase-RNA als Spike-in-Kontrollsequenz in die Probe gegeben, bevor die Bisulfit-Behandlung durchgeführt wurde. Nachdem die Sequenzierungs-Reads mit Hilfe von meRanTK-Toolkits25 auf die Referenzsequenz ausgerichtet waren, wurden der Durchschnitt von 2.440 (0,006 %) der gesamten Reads auf die Spike-in-Sequenz abgebildet, und die gesamte analysierte C-zu-T-Umwandlungsrate erreichte einen Durchschnitt von 99,81 %; Der Status kann im Integrated Genomics Viewer angezeigt werden (Abbildung 5).

Figure 1
Abbildung 1: Workflow-Diagramm der Bisulfit-mRNA-Sequenzierung. Die Pipeline besteht aus drei Hauptprotokollen, darunter mRNA-Anreicherung, Bisulfitumwandlung und Bibliotheksvorbereitung. Abkürzung: bsRNA = Bisulfit-mRNA; QC. = Qualitätskontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Ergebnisse der Qualitätskontrolle von Poly(A)-angereicherten RNA-Proben mit Kapillarelektrophorese. (A) Das repräsentative Kapillarelektrophorese-Profil der Gesamt-RNA von BxPC-3-Zellen. (B) Die repräsentativen Kapillarelektrophorese-Profile von Proben, die mit Oligo(dT)-Aufreinigung aus AsPC-1- und BxPC-3-Zellen verarbeitet wurden. mRNA E1, mRNA-Elution aus einmaliger Reinigung; mRNA E2, mRNA-Elution aus zweifacher Aufreinigung. Die Schätzungen der rRNA-Kontamination wurden mit dem Elektrophorese-Betriebssystem berechnet, das den Gesamt-RNA-Analyse-Assay steuert. (C) Das Kapillarelektrophorese-Profil der Ladder-Marker wurde im selben Lauf mit den in Tafel B dargestellten Proben erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Qualitätsbewertung von RNA-Proben mittels Kapillarelektrophorese. Die repräsentativen Kapillarelektrophoreseprofile zeigen (A) die Gesamt-RNA, (B) die poly(A)-angereicherte mRNA aus zweifacher Aufreinigung und (C) die mit Bisulfit behandelte mRNA aus den BxPC-3-Zellen. Abkürzungen: B_empty = BxPC-3-Zellen, die mit leerem Vektor transduziert werden; B_shScr = BxPC-3-Zellen, die mit den Scramble-Sequenzen transduziert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Qualitätsbewertung von bsRNA-seq-Bibliotheken. (A-C) Drei Sätze repräsentativer Kapillarelektrophorese-Profile von konstruierten bsRNA-seq-Bibliotheken, die mittels PCR mit unterschiedlichen PCR-Zykluszahlen von 9 und 11 Zyklen unter Verwendung von bsRNA aus einem Satz von BxPC-3-Zellen amplifiziert wurden. Die geschätzte Eingangsmenge der mit Bisulfit behandelten RNA wurde durch einen hochempfindlichen RNA-Quantifizierungsassay bestimmt. Insgesamt wurden 8, 8,4 und 9,6 ng bsRNA in den Proben (A) BxPC-3, (BxPC-3) leer und (C) BxPC-3 shN2UN2 verwendet. Der Leitermarker erreicht seinen Höhepunkt bei 35 bp und die 10.380 bp stellen die internen Standards der unteren und oberen Grenze im Elektrophoreseprofil jeder Probe dar. Ein markanter Peak von etwa 100 bp bzw. ein obskurer Peak von etwa 127 bp deuten auf die PCR-Primer (<100 bp) und das Adapter-Dimer (~127 bp) hin, die nach der PCR-Aufreinigung im Eluat verblieben sind. Abkürzungen: BxPC-3 mock = untransduzierte BxPC-3-Zellen; BxPC-3 leer = BxPC-3 Zellen, die mit der leeren Vektorsteuerung transduziert werden; BxPC-3 shN2UN2 = BxPC-3-Zellen, die mit den shNSUN2-Konstrukten transduziert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Die Sequenz-Alignment-Profile jeder bsRNA-seq-Bibliothek, die der Spike-in-Control-Referenzsequenz zugeordnet sind. Die repräsentativen Ausrichtungsprofile der BxPC-3-Pseudo-, Leer-, Scramble- und shNSUN2-bsRNA-seq-Bibliotheken zur Glühwürmchen-Luciferase-Spike-in-Kontrollreferenzsequenz (angegeben als "Z"-Gen); Es wurden 2 repräsentative Regionen gezeigt. Graue Balken zeigen alle Reads an, die übereinstimmende Konsensus-Nukleotide an der angegebenen Basisposition zur Referenzsequenz aufweisen. Rote Balken markieren die Identität von Thymidin (T) an der Basisposition der Messwerte; Blaue Balken zeigen die Messwerte an, die an der Position die Cytosin (C)-Identität aufweisen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Vergleich der Bisulfit-Reaktionsprotokolle und der Umwandlungsrate. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

In diesem Protokoll wurde eine detaillierte Pipeline von Poly(A)-Anreicherung, Bisulfitumwandlung und Bibliotheksvorbereitung durch die Verwendung standardisierter Komponenten erreicht. Weitere Sequenzierungsanalysen ermöglichten die Identifizierung von mRNA 5-Methylcytosin in Proben von Interesse.

Der entscheidende Schritt ist die Qualität des Ausgangsmaterials - der Gesamt-RNA -, da der Abbau von RNA die Wiederfindungsrate der Poly(A)-RNA-Reinigung beeinträchtigen würde. Die Probe sollte vorsichtig behandelt und eine RNase-Kontamination vermieden werden, bevor der Poly(A)-RNA-Reinigungsschritt durchgeführt wird. Ein weiterer wichtiger Teil des Verfahrens ist die Anzahl der PCR-Zyklen bei der Bibliotheksvorbereitung. Die Entscheidung über die Zyklusnummer hängt von der Menge der mit Bisulfit behandelten mRNA ab, die für die Bibliotheksvorbereitung verwendet wird, und davon, ob im Schritt vor der PCR eine oder eine doppelte Größenauswahl verwendet wird. Die geeigneten Zykluszahlen für die interessierende Probe würden daher einen Probelauf erfordern und die Größenverteilung des PCR-Produkts durch Kapillarelektrophorese bewerten, um die optimale Zykluszahl für dieselbe Zelllinie oder dasselbe Gewebe zu bestimmen.

In diesem Protokoll wurden zwei Runden der Aufreinigung von Oligo(dT)-Kügelchen verwendet, um Poly(A)-RNA anzureichern und zu reinigen und einen Großteil der ribosomalen RNAs und anderer RNAs zu eliminieren. Es gibt andere Methoden, um ribosomale RNA zu entfernen und andere RNA-Typen in der Probe zu halten, wie z. B. die oligobasierte Depletion von rRNA26. Dann kann auch die in anderen RNA-Typen vorhandene 5-Methylcytosin-Modifikation in die Analyse einbezogen werden und das Verständnis der 5-Methylcytosin-Eigenschaften in mRNA und anderen RNAs erweitern.

Die Bisulfitreaktion ist dafür bekannt, dass sie nicht in der Lage ist,m5Cvon anderen Modifikationen zu unterscheiden, einschließlich 5-Hydroxymethylcytosin (hm5C), 3-Methylcytidin (m3C) und N4-Methylcytidin (m4C)27. Das Versuchsdesign, das den m5C-RNA-Methyltransferase-Knockdown oder -Knockout beinhaltet, sollte jedoch einen informativen Nachweis für reguliertem5C-Stellenmit hoher Zuverlässigkeit liefern. Darüber hinaus könnte die Validierung unter Verwendung verschiedener Methoden, wie z. B. einer Antikörper-basierten Anreicherung mit anschließender Sequenzierung oder PCR oder LC-MS/MS-basierten Methoden, die Kandidaten-m5C-Stellen16 im Wesentlichen authentifizieren. Die aufkommende Technik der direkten Nanoporen-RNA-Sequenzierung bietet auch eine potenzielle Identifizierung von RNA-Modifikationen durch die computergestützte Analyse des aktuellen Signals oder der Base, die als "Fehler" bezeichnet werden28,29,30.

Eine kürzlich von Johnson et al. durchgeführte Studie zeigte, dass die Zugabe des Fragmentierungsschritts in Mitochondrien-RNA-Proben nach drei Runden der Bisulfit-Umwandlung tatsächlich eine höhere Umwandlungsrate zeigte und die Ausbeute des cDNA-Bibliotheksprodukts31 erhöhte. In dieser Arbeit wurde speziell die Umwandlungsrate und die Qualität der Messwerte analysiert, die dem Genom der Mitochondrien und nicht dem mRNA-Transkriptom zugeordnet sind. Daher wurde die Verwendung des Fragmentierungsschritts in Tabelle 1 aktualisiert, um hervorzuheben, ob die veröffentlichten Berichte einen RNA-Fragmentierungsschritt enthielten, damit die Betrachter das Protokoll leicht replizieren können. Eine weitere Studie von Zhang et al. zeigte, dass die Verwendung einer in vitro transkribierten modifikationsfreien RNA-Bibliothek als Negativkontrolle effizient ist, um das falsch-positive Signal der Bisulfit-Behandlung zu eliminieren32. Neuere Studien haben verschiedene Protokolle für den Bibliotheksaufbau verglichen33. Der Benutzer kann außerdem wählen, ob er eine bsRNA-seq-Pipeline mit oder ohne zusätzlichen Fragmentierungsschritt und eine in vitro transkribierte, modifikationsfreie RNA-Bibliothek durchführen möchte, um einen geeigneten Arbeitsablauf anzupassen.

Die transkriptomweite Identifizierung von m5Cdurch verschiedene Prinzipien könnte die Ergebnisse der Modifikationslandschaften stärken und ein besseres Verständnis der regulatorischen Mechanismen von RNA-Modifikationen in gesunden oder kranken Modellen liefern.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom National Science and Technology Council of Taiwan unterstützt. [NSTC 111-2314-B-006-003]

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System Agilent, Santa Clara, CA RNA quality detection
AMpure XP beads Beckman Coulter A63881 purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-4626 DNA quality detection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-1513 RNA quality detection
DiaMag02 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000001 assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000003 assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 61011 poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol J.T.Baker 64-17-5
EZ RNA methylation kit Zymo, Irvine, CA R5002 bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA Promega, Madison, WI, USA L4561 spike in control seqeunce 
KAPA Library Quantification Kits Roche, Switzerland KK4824 library quantification
Nanodrop spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) New England Biolabs, Ipswich, MA E7335S library preparation
NEBNext Ultra Equation 1 Directional RNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs, Ipswich, MA E7760S library preparation
Nuclease-free Water Thermo Fisher Scientific AM9932
P2 pipetman Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 4641010
Qubit 2.0 fluorometer  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32854 DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32852 RNA quantity detection

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Chen, S. Y., Huang, P. H. Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (197), e65352, doi:10.3791/65352 (2023).

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