Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Обогащение мРНК и бисульфит-мРНК Подготовка библиотек для секвенирования нового поколения

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65352
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

Summary

Этот протокол обеспечивает простой рабочий процесс для проведения очистки поли(А)-РНК, бисульфитной конверсии и подготовки библиотеки с использованием стандартизированного оборудования для получения интересующего биологического образца.

Abstract

Посттранскрипционные модификации РНК в различных типах транскриптов РНК связаны с разнообразной регуляцией РНК в эукариотических клетках. Было показано, что аберрантные модификации РНК-5-метилцитозина и нерегулируемая экспрессия РНК-метилтрансфераз связаны с различными заболеваниями, включая рак. Для характеристики положения и количественных уровней метилирования цитозина в бисульфит-превращенной РНК при разрешении пары оснований было разработано полнотранскриптомное бисульфитное секвенирование. В настоящем протоколе подробно описаны процедуры двух раундов очистки поли(А) РНК, трех циклов бисульфитной реакции и подготовки библиотеки, позволяющие проводить транскриптомное картирование сайтов модификации мРНК 5-метилцитозина. Оценка количества и качества РНК после основной реакции имеет важное значение для контроля целостности РНК и является критически важным шагом для обеспечения высококачественных библиотек секвенирования. В идеале процедуры можно завершить в течение трех дней. С помощью этого протокола, используя высококачественную общую РНК в качестве входных данных, можно практически создать надежные библиотеки бисульфит-мРНК для секвенирования следующего поколения из интересующего образца.

Introduction

Среди более чем 150 типов посттранскрипционных модификаций1 модификация 5-метилцитозина (м5С) была идентифицирована в различных типах РНК, включая рибосомную РНК, транспортную РНК, матричную РНК, микроРНК, длинную некодирующую РНК, опорную РНК, энхансерную РНК и малые кажальные тельцеспецифичные РНК2. РНК m 5 C связана с различными биологическими и патологическими механизмами, такими как регуляция развития корней растений3, экспрессия вирусных генов4 и прогрессирование рака5. Целью данного протокола является предоставление оптимизированных конвейеров для характеристики профиля модификации мРНК m5Cна уровне транскриптома биологических образцов на разных стадиях развития или в условиях заболевания. Для характеристики положения и количественных уровней метилирования цитозина в бисульфит-превращенной РНК при разрешении пар оснований 6,7,8,9 было разработано полнотранскриптомное бисульфитное секвенирование. Это особенно полезно при изучении связи m5C с экспрессией генов и судьбой РНК, участвующей в биологических регуляторных механизмах в клетках. В клетке млекопитающих известно два считывателя m 5 C: ALYREF может распознавать m 5 C в ядре и служит транспортером мРНК от ядра к цитозоль10, в то время как YBX1 может распознавать m5C в цитоплазме иувеличивать стабилизацию мРНК11. Аберрантные мРНК m5C, связанные с иммунными путями, были зарегистрированы в CD4+ Т-клетках системной красной волчанки12. Исследования выявили связь между модификацией мРНК m5C и модуляцией ракового иммунитета и прогрессированием рака13,14. Таким образом, картирование профиля модификации m5Cна мРНК может предоставить важную информацию для выяснения потенциального регуляторного механизма.

Для исследования функциональной роли модификации РНК m 5 Cв определенных биологических условиях подходы, основанные на бисульфитной конверсии (bsRNA-seq) и обогащении на основе сродства антител, такие как m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq и 5-Aza-seq, могут быть объединены с высокопроизводительной платформой секвенирования для обеспечения эффективного обнаружения целевых областей и последовательностей с модификациями m5Cпо транскриптомной шкале15. 16. См. Преимущество этого протокола заключается в том, что РНК m5C имеет полное разрешение с одним основанием, поскольку подход, основанный на обогащении сродством антител, опирается на наличие высококачественных антител и может достигать однофрагментного разрешенияm5Cметилированияландшафта 17.

Все образцы РНК будут обработаны двумя раундами обогащения мРНК с использованием гранул олиго(dT), тремя циклами бисульфитной реакции и подготовкой библиотеки секвенирования. Для контроля качества РНК каждый образец РНК будет исследован методом электрофореза в капиллярном геле до и после процедур очистки мРНК и бисульфитной реакции для оценки распределения фрагментов. Очищенные библиотеки будут исследованы по качеству ампликонов ПЦР, распределению фрагментов ДНК по размерам с помощью электрофореза в капиллярном геле, а их общее количество будет исследовано количественными методами на основе флуоресцентных красителей перед секвенированием. Система также может быть использована для анализа широкого спектра биологических образцов, таких как сельскохозяйственная продукция, изолированные вирионы, клеточные линии, модельные организмы и патологические образцы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Очистка поли(А) РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте общую РНК, обработанную ДНКазой I, и проверьте качество и целостность общей РНК путем оценки капиллярного или обычного гель-электрофореза, прежде чем приступать к очистке поли(А) РНК. Исследователи должны быть в состоянии идентифицировать 28S и 18S рРНК рибосомные полосы в высокомолекулярном поле и 5,8S рРНК в низкомолекулярном поле без каких-либо значимых полос мазка на электроферограмме. Этапы очистки в основном соответствуют инструкциям производителя с незначительными изменениями, указанными на конкретных этапах. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами и инструментами, используемыми в этом протоколе.

  1. Подготовка
    1. Нагрейте реагент, промывочный буфер, гранулы олиго(dT) и буфер лизиса при комнатной температуре в течение 30 мин перед проведением следующих процедур.
    2. Для выделения поли(А)-обогащенной РНК в качестве исходного материала готовят 10-20 мкг аликвоты высококачественной общей РНК путем переноса достаточного количества РНК в безнуклеазную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Инкубируйте в тепловом блоке при температуре 70 °C в течение 5 минут, затем держите на льду в течение 2 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество общей РНК в качестве исходного материала должно быть соответствующим образом скорректировано в зависимости от желаемого количества мРНК и природы используемых клеток. Эмпирически поли(А)-обогащенная РНК может составлять 1-5% в общей РНК. Аликвота 10 мкг высококачественной общей РНК должна обеспечить получение высококачественной поли(А)-обогащенной РНК в диапазоне 100-500 нг для последующей бисульфитной конверсии.
    3. Между тем, полностью ресуспендируйте гранулы олиго(dT). Переложите необходимое количество суспензии шариков в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, затем поместите на магнит на 3 минуты, пока магнитные шарики не сформируют гранулу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 50 мкл гранул олиго(дТ) для 10 мкг общего ввода РНК. Объем шариков на этом этапе может быть дополнительно оптимизирован в зависимости от используемых ячеек.
    4. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы олиго(dT) с равными количествами (объем суспензии шариков, использованный на этапе 1.1.3.) буфера для лизиса и поместите на магнит на 3 мин перед удалением надосадочной жидкости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не пересушивайте бусины; Пользователь должен быстро перейти к шагу 1.2.1.
  2. Первый раунд очищения
    1. Добавьте лизисный буфер в пробирку с образцом РНК (объемное соотношение 4:1) и тщательно перемешайте перед переносом в гранулы олиго(dT).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если объем образца РНК составляет 20 мкл, добавьте 80 мкл лизисного буфера.
    2. Ресуспендируйте РНК: буферную смесь лизиса и гранулы олиго(dT) в полном объеме, пипетируя не менее 10 раз.
    3. Дайте образцам инкубироваться при непрерывном вращении в течение 15 мин при комнатной температуре.
    4. Поместите образец на магнит на 5 минут или до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной; Выбросьте надосадочную жидкость.
    5. Добавьте 600 мкл промывочного буфера 1 к гранулам и тщательно перемешайте, чтобы снова взвесить гранулы.
    6. Поместите пробирку на магнит на 5 минут или до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной, выбросьте надосадочную жидкость и повторите шаг стирки 1.2.5 один раз.
    7. Вымойте шарики, добавив 300 мкл буфера для промывки 2, и аккуратно суспендируйте шарики.
    8. Поместите пробирку на магнит на 5 минут или до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной, выбросьте надосадочную жидкость и повторите шаг промывки 1.2.7 один раз.
    9. Добавьте 30 мкл холодного 10 мМ Tris-HCl (элюирующего буфера) в пробирку с образцом и инкубируйте при 70 °C в течение 5 минут.
    10. Быстро перенесите пробирку на магнит и, когда суспензия станет прозрачной, через 20 с или более перенесите надосадочную жидкость, содержащую элюированную поли(А) обогащенную РНК, в новую пробирку микроцентрифуги объемом 1,5 мл.
  3. Второй раунд очищения
    1. Добавьте 120 мкл (в 4 раза больше объема элюированного образца) лизисного буфера к образцу элюированной РНК и тщательно перемешайте.
    2. Промойте шарики, используемые в первом раунде очистки, равным количеством лизисного буфера, как на шаге 1.1.4, пропипетируйте 10 раз, чтобы снова взвесить гранулы, а затем поместите их на магнит на 5 минут, прежде чем выбросить надосадочную жидкость.
    3. Перенесите РНК: лизисную буферную смесь на промытые шарики и тщательно перемешайте, пипетируя не менее 10 раз.
    4. Инкубируют образец при непрерывном вращении в течение 15 мин при комнатной температуре.
    5. Повторите шаги с 1.2.4 по 1.2.8, чтобы удалить соль и другие подтипы РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем промывочного буфера может быть уменьшен до 300 мкл промывочного буфера 1 и 150 мкл промывочного буфера 2.
    6. Добавьте 25 мкл (желаемый объем) холодного 10 мМ Tris-HCl (элюирующего буфера) в пробирку с образцом и инкубируйте при 70 °C в течение 5 минут.
    7. Быстро перенесите пробирку на магнит и, когда суспензия станет прозрачной, через 20 с или более перенесите надосадочную жидкость, содержащую элюированную поли(А) обогащенную РНК, в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    8. Перенесите 2,2 мкл в 8-полосковые пробирки для оценки количества и качества РНК с помощью высокочувствительного анализа РНК.
    9. Храните образец при температуре -20 °C в течение короткого периода времени и -70 °C в течение более длительного периода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть точкой паузы в протоколе.

2. Бисульфитная конверсия

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы центрифугирования выполнялись при комнатной температуре. Процедуры, по сути, выполняются в соответствии с инструкциями производителя, но с дополнительным этапом 2.2 для добавления контрольной последовательности мРНК перед этапом 2.3 бисульфитной реакции.

  1. Перенесите 19 мкл очищенного образца РНК, обогащенного поли(А), в пробирку с 8 полосками объемом 0,2 мл.
  2. Добавьте 1,0 мкл спайк-ин-контроля, свободного от каких-либо модификаций при заданном количественном соотношении 1:10 000 (т.е. 0,1 нг мРНК люциферазы: 1 мкг очищенной поли(А) обогащенной РНК) в образец РНК на стадии 2.1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольной последовательностью спайка может быть РНК люциферазы Firefly, люциферазы Renilla или транскрибируемая последовательность РНК in vitro без метилированных цитозинов.
  3. Добавьте в пробирку 130 мкл конверсионного регента и осторожно переверните несколько раз для тщательного перемешивания.
  4. Поместите пробирку в ПЦР-машину и выполните три цикла нагрева при 70 °C в течение 10 минут, затем инкубацию при 64 °C в течение 45 минут каждый, а затем заключительный этап для охлаждения до 4 °C.
  5. Поместите колонку на сборную пробирку и перенесите 250 мкл РНК-связывающего буфера в колонку.
  6. Перенесите пробу с шага 2.4 в колонку с шага 2.5 и тщательно пропитовывайте.
  7. Добавьте в колонку 400 мкл 95-100% этанола, быстро закройте крышку и несколько раз переверните.
  8. Центрифугу при 10 000 × г в течение 30 с при 25 °C и выбросьте.
  9. Добавьте в колонку 200 мкл промывочного буфера РНК.
  10. Центрифугу при 10 000 × г в течение 30 с при 25 °C и выбросьте проточную часть.
  11. Добавьте 200 мкл буфера десульфирования и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.
  12. Центрифугу при 10 000 × г в течение 30 с при 25 °C и выбросьте.
  13. Добавьте 400 мкл буфера для промывки РНК и центрифугу при 10 000 × г в течение 30 с при 25 °C и выбросьте проточный поток. Повторите этот шаг один раз.
  14. Снова центрифугу при 10 000 × г в течение 2 мин при 25 °C, чтобы полностью удалить остаточный буфер для промывки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другой этап центрифугирования 2.14 в течение 2 минут перед элюированием заключается в полном удалении промывочного буфера. Этап промывки выполняется дважды, чтобы вымыть высокосолевой компонент из бисульфитного реагента и буфера десульфирования на колонне.
  15. Переложите колонку в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  16. Добавьте в колонку 20-30 мкл безнуклеазногоH2Oи выдержите при комнатной температуре 1 мин.
  17. Центрифуга при 10 000 × г в течение 30 с при 25 °C.
  18. Перенесите 2,2 мкл в 8-полосковые пробирки для оценки количества и качества РНК.
  19. Образец РНК, обработанный бисульфитом, хранят при температуре -20 °C в течение короткого периода времени и -70 °C в течение более длительного периода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть точкой паузы в протоколе.

3. Подготовка бисульфитной библиотеки мРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям по подготовке библиотеки, раздел 4, для использования с очищенной мРНК или РНК, обедненной рРНК. Первый этап прайминга должен проводиться в соответствии с протоколом FFPE RNA, поскольку обработка бисульфитом фрагментирует РНК. Выполните каждый шаг в ламинарном колпаке и добавьте реакционную смесь на охлажденную льдом решетку.

  1. Прайминг входной РНК
    1. Перенесите желаемое количество образца мРНК, обработанного бисульфитом, в общей сложности максимум 5 мкл или добавьте безнуклеазный H2O, чтобы получить в общей сложности 5 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого типа подготовки библиотеки РНК и для получения окончательной молярности библиотечного продукта 4 нМ рекомендуется использовать не менее 10 нг обработанной бисульфитом мРНК в качестве входных данных.
    2. Добавьте в образец 1 мкл праймера Random (сиреневого) и перемешайте пипеткой.
    3. Поместите пробирку с образцом в ПЦР-машину, предварительно настроенную на 65 °C, накройте крышкой при 105 °C на 5 минут и держите при 4 °C.
  2. Синтез кДНК первой цепи
    1. Добавьте к образцу 4 мкл буфера для реакции синтеза (сиреневый), 8 мкл реагента для определения специфичности цепи (коричневый) и 2 мкл смеси ферментов синтеза (коричневый), что составит общий объем 20 мкл. Тщательно перемешайте, пипетируя не менее 10 раз, и быстро открутите.
    2. Поместите пробирку с образцом в предварительно настроенную ПЦР-машину при температуре 25 °C в течение 10 минут, 42 °C в течение 50 минут, 70 °C в течение 15 минут и держите при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для вкладышей с более чем 200 основаниями рекомендуется инкубационный период 42 °C в течение 50 минут; Для пластин размером менее 200 оснований рекомендуется инкубационный период при температуре 42 °C в течение 15 минут.
  3. Синтез кДНК второй цепи
    1. Добавьте 8 мкл реакционного буфера синтеза со смесью dUTP (оранжевый), 4 мкл смеси ферментов синтеза (оранжевый) и 48 мкл безнуклеазного H2O. Тщательно перемешайте, пипетируя не менее 10 раз, и быстро отжимите.
    2. Поместите пробирку с образцом в предварительно настроенную ПЦР-машину при температуре 16 °C на 1 ч при закрытой крышке или ≤40 °C.
  4. Очистка двухцепочечной кДНК с помощью гранул для очистки ДНК
    1. Предварительно разогрейте шарики для очистки ДНК за 30 минут до проведения очистки и вихрьте, чтобы снова взвесить бусины.
    2. Добавьте 144 мкл ресуспендированных гранул очистки ДНК к образцу кДНК из шага 3.3.2 и тщательно перемешайте, пипетируя не менее 10 раз.
    3. Инкубировать при комнатной температуре 5 мин.
    4. Поместите пробирку с образцом на магнитную стойку на 5 минут, пока раствор не станет прозрачным, а затем удалите надосадочную жидкость и сохраните шарики, содержащие ДНК.
    5. Добавьте 200 мкл свежеприготовленного 80%-ного этанола в пробирку с шариками, держа образец на магнитной стойке, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 с.
    6. Удалите надосадочную жидкость и повторите шаг 3.4.5 один раз, но на этот раз осторожно удалите всю оставшуюся надосадочную жидкость.
    7. Высушите шарики на воздухе в течение 1-5 минут, удерживая образец на магните.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не пересушивайте бусины; Цвет должен быть темно-коричневым.
    8. Извлеките образец из магнитного штатива и элюируйте ДНК, добавив к шарикам 53 мкл буфера 0,1x TE (10 мМ Tris-HCl и 1 мМ ЭДТА, pH 8,0). Тщательно перемешайте пипеткой не менее 10 раз и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 минут.
    9. Поместите пробирку на магнитную стойку на 5 минут или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
    10. Перенесите 50 мкл надосадочной жидкости, содержащей двухцепочечную кДНК, в новую 8-полосковую пробирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть остановлен на этом этапе, и образец можно хранить при температуре -30 °C.
  5. Окончание подготовки библиотеки кДНК
    1. Добавьте 7 мкл реакционного буфера для торцевой полировки (зеленый) и 3 мкл ферментной смеси для конечной полировки (зеленый) к элюированному образцу двухцепочечной кДНК.
    2. Смешайте смесь пипеткой 10 раз с настройкой объема 50 мкл без образования пузырьков, затем быстро прокрутите образец.
    3. Поместить образец в ПЦР-машину и инкубировать при 20 °C в течение 30 мин, 65 °C в течение 30 мин и держать при 4 °C.
  6. Перевязка адаптора
    1. Разведите адаптер (красный) в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Добавьте в образец 2,5 мкл разбавленного адаптера, 1 мкл усилителя лигирования (красный) и 30 мкл Ligation Master Mix (красный).
    3. Перемешайте смесь путем пипетирования 10 раз с настройкой объема 80 мкл без образования пузырьков, затем быстро прокрутите образец.
    4. Поместите образец в ПЦР-машину и инкубируйте при 20 °C в течение 15 минут.
    5. Добавьте к образцу 3 мкл смеси урацил-ДНК-гликозилазы и ДНК-гликозилазы-лиазной эндонуклеазы VIII (синий) и тщательно пипетируйте.
    6. Поместите образец обратно в ПЦР-машину и инкубируйте при 37 °C в течение 15 минут при крышке 75 °C.
  7. Очистка кДНК, обработанных реакцией лигирования,
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой цели можно использовать выбор размера с помощью бусин SPRIselect или опционально с бусинами AMpure XP18.
    1. Разогрейте бусины за 30 минут до проведения очищения и встряхните, чтобы снова взвесить их.
    2. Перенесите 25 мкл ресуспендированных гранул в образец кДНК из шага 3.6.6 и тщательно перемешайте, пипетируя не менее 10 раз.
    3. Инкубировать при комнатной температуре 5 мин.
    4. Поместите пробирку с образцом на магнитный штатив на 5 мин, пока раствор не станет прозрачным, а затем перенесите надосадочную жидкость в новую 8-полосковую пробирку и выбросьте шарики.
    5. Добавьте 10 мкл ресуспендированных гранул в надосадочную жидкость и тщательно перемешайте, пипетируя не менее 10 раз.
    6. Поместите пробирку с образцом на магнитную стойку на 5 минут, пока раствор не станет прозрачным, а затем выбросьте надосадочную жидкость и не тревожите шарики.
    7. Добавьте 200 мкл свежеприготовленного 80%-ного этанола в пробирку с шариками, держа образец на магнитной стойке, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 с.
    8. Удалите надосадочную жидкость и повторите шаг 3.7.7 один раз, но на этот раз осторожно удалите всю оставшуюся надосадочную жидкость.
    9. Высушите шарики на воздухе в течение 1-5 минут, удерживая образец на магните.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не пересушивайте бусины; Цвет должен быть темно-коричневым.
    10. Извлеките образец из магнитной стойки и элюируйте ДНК, добавив к шарикам 17 мкл буфера 0,1x TE. Тщательно перемешайте пипеткой не менее 10 раз и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 минут.
    11. Поместите пробирку на магнитную стойку на 5 минут, пока раствор не станет прозрачным.
    12. Перенесите 15 мкл надосадочной жидкости, содержащей целевую дцДНК, в новую 8-полосковую пробирку.
  8. ПЦР-обогащение адаптор-лигированной ДНК
    1. Добавьте 25 мкл мастер-смеси (синий), 5 мкл 5'-апперторного праймера и 5 мкл 3'-адаптерного праймера к образцу ДНК с адапторной лигацией. Тщательно перемешайте, пипетируя не менее 10 раз.
    2. Поместите образец в ПЦР-машину и выполните амплификацию ПЦР, выполнив следующие действия: (1) 98 °C в течение 30 с, (2) 98 °C в течение 10 с, (3) 65 °C в течение 75 с, (4) 65 °C в течение 5 мин и (5) выдержка при 4 °C; в котором шаги (2) и (3) должны повторяться для номера цикла N+2, где N равно входному количеству РНК в инструкции по эксплуатации. Это означает, что необходимо 2 дополнительных цикла из-за двустороннего выбора размера образцов, выполненного на шаге 3.7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, 8 нг очищенной мРНК будет рекомендовано при 9-10 циклах ПЦР; но с двусторонней, подобранной по размеру, лигированной кДНК на этапе 3.7 рекомендуемый цикл ПЦР будет составлять 11-12 циклов.
  9. Очистка библиотек с ПЦР-амплификацией
    1. Предварительно разогрейте шарики для очистки ДНК в течение 30 минут перед проведением очистки и вихрьте, чтобы снова взвесить бусины.
    2. Перенесите 45 мкл (0,9x) ресуспендированных гранул в продукт ПЦР из шага 3.8.2 и тщательно перемешайте, пипетируя не менее 10x.
    3. Инкубировать при комнатной температуре 5 мин.
    4. Поместите пробирку с образцом на магнитную стойку на 5 минут, пока раствор не станет прозрачным, а затем удалите надосадочную жидкость и сохраните шарики, содержащие ДНК.
    5. Добавьте в пробирку с шариками 200 мкл свежеприготовленного 80% этанола, оставьте образец на магнитной стойке и дайте ему постоять при комнатной температуре в течение 30 секунд.
    6. Удалите надосадочную жидкость и повторите шаг 3.9.5 один раз, но на этот раз осторожно удалите всю оставшуюся надосадочную жидкость.
    7. Высушите шарики на воздухе в течение 1-5 минут, удерживая образец на магните.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не пересушивайте бусины; Цвет должен быть темно-коричневым.
    8. Снимите образец с магнитной стойки и добавьте 22 мкл 0,1-кратного TE буфера к шарикам, чтобы элюировать ДНК. Тщательно перемешайте пипеткой не менее 10 раз и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 минут.
    9. Поместите пробирку на магнитную стойку и дайте ей постоять 5 минут или пока раствор не станет прозрачным при комнатной температуре.
    10. Перелейте 20 мкл надосадочной жидкости в новую 8-полосковую пробирку.
    11. Перенесите 2,2 мкл в 8-полосные пробирки для оценки количества и качества библиотеки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество библиотеки также может быть определено с помощью кПЦР (см. Таблицу материалов).
    12. Храните образец библиотеки bsRNA-seq при температуре -20 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Серия библиотек bsRNA-seq из клеточных линий19 была сгенерирована с помощью процедур, описанных в этом отчете (рис. 1). После полной очистки РНК, сопровождаемой обработкой ДНКазой образцов клеточной линии, и проверкой качества с помощью гель-электрофореза и УФ-видимой спектрофотометрии (A260/A280), образец РНК может перейти к обогащению поли(А)-РНК. Чтобы определить, может ли двойная очистка удалить большую часть рибосомной РНК, эффективность очистки поли(А) РНК оценивали с помощью капиллярного электрофореза анализа общей РНК, который может автоматически рассчитать процент загрязнения рРНК (рис. 2). Исходя из пиковой картины фрагментов РНК и процента загрязнения рРНК, образцы РНК с двойной очисткой действительно показали снижение контаминации рибосомной РНК с 6,5% до 2,2% и с 2,6% до 1,1% в AsPC-1 и BxPC-3 соответственно. В случае с клеточными линиями рака поджелудочной железы человека два раунда очистки гранул могут достигать в среднем 2,8 ± 1% содержания поли(А)-обогащенной РНК от общего количества образцов РНК. Таким образом, обогащение поли(А)-РНК гранулами олиго(dT) с двойными стадиями очистки минимизировало рибосомную РНК и представляет собой возможное обогащение образца мРНК для последующих экспериментов.

Протоколы бисульфитной конверсии были описаны в нескольких исследованиях модификации РНК-5-метилцитозина (табл. 1). Реакция бисульфита может быть проведена с восстановленной пользователем реакционной смесью, состоящей из 40% бисульфита натрия и 600 мМ гидрохинона в водном растворе (рН 5,1) при 75 °C в течение 4 часов10,20,21. В качестве альтернативы можно также выполнить более строгую бисульфитную обработку образца РНК с помощью коммерческого набора; которые в ряде исследований других и наших 6,22,23,24 увеличили время бисульфитной реакции до трех инкубационных циклов. Поскольку трехтактный этап инкубации эффективно преобразует неметилированный цитозин в транскрибируемый in vitro и структурно более свернутый сегмент16S рРНК Escherichia coli, в этом протоколе также применялся трехтактный этап инкубации.

При двукратном обогащении поли(А) и трехтактной бисульфитной конверсии качество РНК до и после реакции оценивали методом капиллярного электрофореза. Распределение РНК по размерам после обработки бисульфитом показало пик ~200-500 нуклеотидов из-за фрагментации, вызванной бисульфитной реакцией (рис. 3). Кроме того, фрагментированная бцРНК идеально подходит для подготовки библиотеки без необходимости проведения еще одного этапа фрагментации. В общей сложности 8-10 нг бцРНК в качестве входных данных использовали для построения библиотеки в соответствии с этим протоколом с использованием от 9 до 11 циклов в конечной ПЦР-амплификации ДНК, лигированной адаптером. Капиллярный электрофорез ампликона показал достаточно успешную библиотечную подготовку, при этом осталась лишь небольшая часть праймера и не было пика гиперамплификации (рис. 4). Чтобы проверить эффективность конверсии в каждой библиотеке образцов, неметилированная люциферазная РНК светлячка в качестве контрольной последовательности спайка была добавлена в образец перед проведением обработки бисульфитом. После того, как считывание секвенирования было выровнено по эталонной последовательности с помощью наборов инструментов meRanTK25, среднее значение 2 440 (0,006%) от общего числа считываний было сопоставлено с последовательностью спайка, а общий коэффициент конверсии анализируемых C-to-T достиг в среднем 99,81%; Статус можно посмотреть в Integrated Genomics Viewer (рисунок 5).

Figure 1
Рисунок 1: Диаграмма рабочего процесса секвенирования бисульфитной мРНК. Пайплайн состоит из трех основных протоколов, включая обогащение мРНК, бисульфитную конверсию и подготовку библиотеки. Аббревиатура: бцРНК = бисульфитная мРНК; Контроль качества. = контроль качества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Результаты контроля качества образцов поли(А)-обогащенной РНК методом капиллярного электрофореза. (A) Репрезентативный профиль капиллярного электрофореза общей РНК из клеток BxPC-3. (B ) Репрезентативные профили капиллярного электрофореза образцов, обработанных очисткой олиго(dT) из ячеек AsPC-1 и BxPC-3. мРНК Е1, элюирование мРНК из однократной очистки; мРНК Е2, элюирование мРНК от двукратной очистки. Оценки загрязнения рРНК рассчитывались с помощью операционной системы электрофореза, контролирующей анализ общей РНК. (C) Профиль капиллярного электрофореза маркеров лестницы был получен в том же прогоне, что и образцы, представленные на панели B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Оценка качества образцов РНК методом капиллярного электрофореза. Репрезентативные профили капиллярного электрофореза (А) общей РНК, (В) мРНК, обогащенной поли(А) после двукратной очистки, и (В) обработанной бисульфитом мРНК из клеток BxPC-3. Сокращения: B_empty = ячейки BxPC-3, преобразованные с пустым вектором; B_shScr = ячейки BxPC-3, трансдуцированные с помощью скрембл-последовательностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Оценка качества библиотек bsRNA-seq. (А-С) Три набора репрезентативных профилей капиллярного электрофореза сконструированных библиотек bsRNA-seq, амплифицированных методом ПЦР при различных номерах циклов ПЦР 9 и 11 циклов с использованием bsRNA из набора клеток BxPC-3. Расчетное входное количество обработанной бисульфитом РНК определяли с помощью высокочувствительного количественного анализа РНК. В общей сложности 8, 8,4 и 9,6 нг бцРНК были использованы в образцах (A) макета BxPC-3, (B) пустого BxPC-3 и (C) BxPC-3 shN2UN2 соответственно. Лестничный маркер достигает пика при 35.о., а 10 380.о. представляют собой внутренние эталоны нижней и верхней границ профиля электрофореза каждого образца. Заметный пик около 100.н. и неясный пик около 127.о., соответственно, указывают на праймеры ПЦР (<100.н.) и адаптор-димер (~127.о.), которые остались в элюате после очистки ПЦР. Сокращения: BxPC-3 mock = нетрансдуцированные ячейки BxPC-3; BxPC-3 пустые = BxPC-3 ячейки, трансдуцированные с пустым векторным управлением; BxPC-3 shN2UN2 = ячейки BxPC-3, трансдуцированные конструкциями shNSUN2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Профили выравнивания последовательностей каждой библиотеки bsRNA-seq, сопоставленные с контрольной последовательностью спайка. Репрезентативные профили выравнивания библиотек bsRNA-seq BxPC-3 mock, empty, scramble и shNSUN2 с контрольной контрольной последовательностью люциферазы светлячка (обозначена как ген «Z»); Были показаны 2 репрезентативных региона. Серыми полосами обозначены все считывания, которые представляют совпадающие консенсусные нуклеотиды в указанном базовом положении относительно эталонной последовательности. Красные полосы выделяют идентичность тимидина (Т) в исходном положении показаний; Синие полосы обозначают те показания, которые имеют идентичность цитозина (С) в этой позиции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Сравнение протоколов бисульфитных реакций и коэффициента конверсии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом протоколе детальный конвейер обогащения поли(А), бисульфитной конверсии и подготовки библиотеки был достигнут за счет использования стандартизированных компонентов. Дальнейший секвенированный анализ позволил идентифицировать мРНК-5-метилцитозин в интересующих образцах.

Критическим этапом является качество исходного материала — общей РНК, поскольку деградация РНК повлияет на скорость восстановления поли(А) РНК. С образцом следует обращаться осторожно и избегать загрязнения РНКазой перед проведением этапа очистки поли(А) РНК. Еще одной важной частью процедуры является количество циклов ПЦР при подготовке библиотеки. Решение о номере цикла зависит от количества обработанной бисульфитом мРНК, используемой для библиотечной подготовки, а также от того, используется ли выбор одного или двойного размера на этапе перед ПЦР. Таким образом, для определения подходящих номеров циклов для интересующего образца потребуется пробный запуск и оценка распределения продукта ПЦР по размерам с помощью капиллярного электрофореза для определения оптимального числа циклов для одной и той же клеточной линии или ткани.

В этом протоколе для обогащения и очистки поли(А)-РНК были использованы два раунда очистки гранул олиго(dT) и элиминация большинства рибосомных РНК и других РНК. Существуют и другие методы удаления рибосомной РНК и сохранения других типов РНК в образце, такие как олигоистическое истощение рРНК26. Затем модификация 5-метилцитозина, присутствующая в других типах РНК, также может быть принята в анализ и расширить понимание особенностей 5-метилцитозина в мРНК и других РНК.

Известно, что бисульфитная реакция не способна отличить m 5C от других модификаций, включая 5-гидроксиметилцитозин (hm5C), 3-метилцитидин (m3C) и N4-метилцитидин (m4C)27. Тем не менее, экспериментальный дизайн, включающий нокдаун или нокаут m 5 C РНК метилтрансферазы, должен предоставить информативные доказательства высокодостоверных регулируемых сайтов m5C. Кроме того, валидация с использованием различных методов, таких как обогащение на основе антител с последующим секвенированием или методы на основе ПЦР или ЖХ-МС/МС, может по существу аутентифицировать сайты-кандидаты m5C16. Новый метод прямого секвенирования нанопористой РНК также обеспечивает потенциальную идентификацию модификации РНК с помощью вычислительного анализа текущего сигнала или так называемой «ошибки»28,29,30.

Недавнее исследование, проведенное Johnson et al., показало, что добавление этапа фрагментации в образцы митохондриальной РНК после трех раундов бисульфитной конверсии действительно показало более высокую скорость конверсии и увеличило выход библиотечного продукта кДНК31. В этой статье специально проанализирована скорость конверсии и качество считывания, сопоставленное с геномом митохондрий, а не с транскриптомом мРНК. Таким образом, в таблице 1 было обновлено использование этапа фрагментации, чтобы подчеркнуть, включали ли опубликованные отчеты этап фрагментации РНК, чтобы зрители могли легко воспроизвести протокол. Другое исследование, проведенное Zhang et al., продемонстрировало, что использование транскрибируемой библиотеки РНК без модификации in vitro в качестве отрицательного контроля эффективно для устранения ложноположительного сигнала при лечении бисульфитом32. В недавних исследованиях сравнивались различные протоколы, используемые для создания библиотек33. Кроме того, пользователь может выбрать проведение конвейера bsRNA-seq с дополнительным этапом фрагментации или без него, а также транскрибируемую in vitro библиотеку РНК без модификации для настройки подходящего рабочего процесса.

Транскриптомная идентификация m5C по различным принципам может усилить результаты ландшафтов модификаций и обеспечить более глубокое понимание регуляторных механизмов модификаций РНК в здоровых моделях или моделях заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным советом по науке и технологиям Тайваня. [НСТК 111-2314-Б-006-003]

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System Agilent, Santa Clara, CA RNA quality detection
AMpure XP beads Beckman Coulter A63881 purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-4626 DNA quality detection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-1513 RNA quality detection
DiaMag02 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000001 assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000003 assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 61011 poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol J.T.Baker 64-17-5
EZ RNA methylation kit Zymo, Irvine, CA R5002 bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA Promega, Madison, WI, USA L4561 spike in control seqeunce 
KAPA Library Quantification Kits Roche, Switzerland KK4824 library quantification
Nanodrop spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) New England Biolabs, Ipswich, MA E7335S library preparation
NEBNext Ultra Equation 1 Directional RNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs, Ipswich, MA E7760S library preparation
Nuclease-free Water Thermo Fisher Scientific AM9932
P2 pipetman Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 4641010
Qubit 2.0 fluorometer  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32854 DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32852 RNA quantity detection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
  2. Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102 (2019).
  3. Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959 (2023).
  4. Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
  5. Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
  6. Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
  7. Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
  8. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).
  9. Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40 (2020).
  10. Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606 (2017).
  11. Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
  12. Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430 (2020).
  13. Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15 (2022).
  14. Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43 (2020).
  15. Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
  16. Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
  17. Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231 (2020).
  18. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 18, Unit 18.12 (2009).
  19. Chen, S. -Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
  20. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  21. Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
  22. Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
  23. Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
  24. Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
  25. Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
  26. Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281 (2019).
  27. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602 (2013).
  28. Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
  29. Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198 (2021).
  30. Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
  31. Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045 (2022).
  32. Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
  33. Chao, H. -P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).

Tags

Обогащение мРНК Бисульфит-мРНК Бисульфит-мРНК Секвенирование нового поколения Посттранскрипционные модификации РНК Регуляция РНК Эукариотические клетки Модификации РНК-5-метилцитозина РНК-метилтрансферазы Заболевания Рак Полнотранскриптомное бисульфитное секвенирование Уровни метилирования цитозина Очистка поли(А) РНК Бисульфитная реакция Библиотечная подготовка Сайты модификации мРНК-5-метилцитозина Оценка количества и качества РНК Мониторинг целостности РНК Высокое качество Библиотеки секвенирования
Обогащение мРНК и бисульфит-мРНК Подготовка библиотек для секвенирования нового поколения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S. Y., Huang, P. H. Enrichment … More

Chen, S. Y., Huang, P. H. Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (197), e65352, doi:10.3791/65352 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter