Summary
Este protocolo fornece um fluxo de trabalho fácil de seguir para conduzir a purificação de RNA poli(A), conversão de bissulfito e preparação de biblioteca usando equipamentos padronizados para uma amostra biológica de interesse.
Abstract
Modificações pós-transcricionais de RNA em vários tipos de transcritos de RNA estão associadas à regulação de diversos RNA em células eucarióticas. Modificações aberrantes do RNA 5-metilcitosina e a expressão desregulada de RNA metiltransferases têm se mostrado associadas a várias doenças, incluindo cânceres. O sequenciamento de bissulfito transdescritor largo foi desenvolvido para caracterizar as posições e os níveis quantitativos de metilação da citosina no RNA convertido em bissulfito na resolução do par de bases. Este protocolo apresenta os procedimentos de duas rodadas de purificação de RNA poli(A), três ciclos de reação de bissulfito e preparação de biblioteca em detalhes para permitir o mapeamento em todo o transcriptoma dos sítios de modificação do RNAm 5-metilcitosina. A avaliação da quantidade e qualidade do RNA após a reação principal é essencial para monitorar a integridade do RNA e é um passo crítico para garantir bibliotecas de sequenciamento de alta qualidade. O ideal é que os procedimentos possam ser concluídos em até três dias. Com este protocolo, o uso de RNA total de alta qualidade como entrada pode praticamente construir bibliotecas robustas de bissulfito-mRNA para sequenciamento de próxima geração a partir da amostra de interesse.
Introduction
Entre mais de 150 tipos de modificações pós-transcricionais1, a modificação da 5-metilcitosina (m5C) foi identificada em vários tipos de RNAs, incluindo RNA ribossomal, RNA de transferência, RNA mensageiro, micro RNA, RNA longo não codificante, RNA de abóbada, RNA intensificador e RNAs específicos do corpo cajalpequeno 2. O RNA m 5 C está associado a diversos mecanismos biológicos e patológicos, tais como regulação do desenvolvimento radicular de plantas3, expressão gênica viral4 e progressão do câncer5. O objetivo deste protocolo é fornecer pipelines simplificados para caracterizar o perfil de modificação do mRNA m5C do transcriptoma de amostras biológicas em diferentes estágios de desenvolvimento ou no cenário da doença. O sequenciamento transcriptoma-amplo de bissulfito foi desenvolvido para caracterizar as posições e os níveis quantitativos de metilação da citosina no RNA convertido em bissulfito na resolução do par de bases 6,7,8,9. Isto é particularmente útil quando se estuda a associação de m5C com a expressão gênica e o destino do RNA que está envolvido nos mecanismos biológicos regulatórios em células. Na célula de mamíferos, existem dois leitores m 5 C conhecidos: ALYREF pode reconhecer m 5 C no núcleo e serve como um transportador de núcleo de RNAm para citosol10, enquanto YBX1 pode reconhecer m5C no citoplasma e aumentar a estabilização de RNAm11. Foram relatados mRNAs5 Caberrantes relacionados a vias imunes em células T CD4+ do lúpus eritematoso sistêmico12. Estudos têm revelado associação entre modificação do RNAmm 5C e modulação da imunidade do câncer e progressão do câncer13,14. Assim, o mapeamento do perfil demodificação dom5 C no RNAm pode fornecer informações cruciais para elucidar o potencial maquinário regulatório.
Para investigar os papéis funcionais da modificação do RNAm 5 C sob certas condições biológicas, as abordagens baseadas na conversão de bissulfito (bsRNA-seq) e no enriquecimento por afinidade de anticorpos, como m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq e 5-Aza-seq, podem ser combinadas com a plataforma de sequenciamento de alto rendimento para fornecer detecção eficiente de regiões e sequências alvo com as modificações de m5C em uma escala de transcriptoma15, 16º. A vantagem deste protocolo fornece a paisagem abrangente do RNA m 5 C em uma resolução de base única, uma vez que a abordagem baseada no enriquecimento por afinidade de anticorpos depende da disponibilidade de anticorpos de alta qualidade e poderia alcançar a resolução de fragmentoúnico da paisagem de metilação de m5C17.
Todas as amostras de RNA serão processadas com duas rodadas de enriquecimento de RNAm usando esferas de oligo(dT), três ciclos de reação de bissulfito e a preparação da biblioteca de sequenciamento. Para monitorar a qualidade do RNA, cada amostra de RNA será examinada por eletroforese em gel capilar antes e após os procedimentos de purificação do RNAm e reação de bissulfito para avaliar a distribuição dos fragmentos. As bibliotecas purificadas serão examinadas por suas qualidades de amplificação de PCR, fragmentos de distribuição de tamanho de DNA por eletroforese em gel capilar e suas quantidades totais examinadas por ensaios quantitativos baseados em corantes de fluorescência antes do sequenciamento. O sistema também pode ser usado para analisar um amplo espectro de amostras biológicas, como produtos agrícolas, vírions isolados, linhagens celulares, organismos modelo e espécimes patológicos.
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Protocol
1. Purificação do RNA poli(A)
NOTA: Use o RNA total tratado com DNase I e examine a qualidade e integridade do RNA total por eletroforese capilar ou gel convencional antes de proceder à purificação do RNA poli(A). Os investigadores devem ser capazes de identificar as bandas ribossomais 28S e 18S rRNA no campo de alto peso molecular e a banda 5.8S rRNA no campo de baixo peso molecular sem bandas de esfregaço significativas no eletroferograma. As etapas de purificação seguem essencialmente as instruções do fabricante, com pequenas modificações indicadas nas etapas específicas. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais e instrumentos utilizados neste protocolo.
- Preparação
- Aquecer o reagente, tampão de lavagem, esferas de oligo(dT) e tampão de lise à temperatura ambiente por 30 minutos antes de realizar os procedimentos a seguir.
- Para o isolamento de RNA enriquecido com poli(A), prepare 10-20 μg de uma alíquota de RNA total de alta qualidade como material de partida, transferindo uma quantidade adequada de RNA para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL livre de nuclease. Incubar no bloco de calor a 70 °C durante 5 minutos e, em seguida, manter no gelo durante 2 minutos.
NOTA: As quantidades de ARN total como material de partida devem ser ajustadas adequadamente em função da quantidade desejada de ARNm e da natureza das células utilizadas. Empiricamente, o RNA enriquecido com poli(A) pode ser responsável por 1-5% de abundância no RNA total. Uma alíquota de 10 μg de RNA total de alta qualidade deve fornecer RNA enriquecido com poli(A) de alta qualidade na faixa de 100-500 ng para a conversão de bissulfito a jusante. - Enquanto isso, ressuspenda totalmente as contas oligo(dT). Transfira as quantidades necessárias de suspensão de contas para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e, em seguida, coloque no ímã por 3 minutos até que as esferas magnéticas formem um grânulo.
NOTA: Use 50 μL de esferas oligo(dT) para 10 μg de entrada total de RNA. O volume de contas nesta etapa pode ser ainda mais otimizado dependendo das células usadas. - Retire o sobrenadante e ressuspenda as esferas oligo(dT) com quantidades iguais (o volume da suspensão de esferas utilizada na etapa 1.1.3.) do tampão de lise e coloque no íman durante 3 minutos antes de remover o sobrenadante.
OBS: Não seque demais as contas; O usuário deve avançar rapidamente para a etapa 1.2.1.
- A primeira rodada de purificação
- Adicione tampão de lise ao tubo de amostra de RNA (relação de volume 4:1) e misture completamente antes de transferir para as esferas de oligo(dT).
NOTA: Se o volume da amostra de ARN for de 20 μL, adicione 80 μL de tampão de lise. - Ressuspenda totalmente a mistura de RNA: tampão de lise e esferas de oligo(dT) pipetando pelo menos 10x.
- Deixar incubar as amostras com rotação contínua durante 15 min à temperatura ambiente.
- Colocar a amostra no íman durante 5 min ou até que o sobrenadante esteja límpido; Descarte o sobrenadante.
- Adicione 600 μL de Wash Buffer 1 às contas e misture cuidadosamente para ressuspender as contas.
- Colocar o tubo sobre o íman durante 5 minutos ou até que o sobrenadante esteja límpido, elimine o sobrenadante e repita o passo de lavagem 1.2.5 uma vez.
- Lave as contas adicionando 300 μL de Wash Buffer 2 e ressuspenda suavemente as contas.
- Colocar o tubo no iman durante 5 minutos ou até que o sobrenadante esteja límpido, eliminar o sobrenadante e repetir o passo de lavagem 1.2.7 uma vez.
- Adicionar 30 μL de Tris-HCl (tampão de eluição) a frio de 10 mM ao tubo de amostra e incubar a 70 °C durante 5 minutos.
- Transfira rapidamente o tubo para o ímã e, quando a suspensão estiver límpida após 20 s ou mais, transfira o sobrenadante contendo RNA enriquecido com poli(A) eluído para o novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Adicione tampão de lise ao tubo de amostra de RNA (relação de volume 4:1) e misture completamente antes de transferir para as esferas de oligo(dT).
- A segunda rodada de purificação
- Adicionar 120 μL (4x o volume da amostra eluída) tampão de lise à amostra de RNA eluída e misturar completamente.
- Lave as contas usadas na primeira rodada de purificação com uma quantidade igual de tampão de lise como etapa 1.1.4, pipetar 10x para ressuspender as contas e, em seguida, colocá-las no ímã por 5 min antes de descartar o sobrenadante.
- Transfira a mistura de RNA: tampão de lise para as esferas lavadas e misture completamente pipetando pelo menos 10x.
- Incubar a amostra com rotação contínua durante 15 min à temperatura ambiente.
- Repita as etapas 1.2.4 a 1.2.8 para remover o sal e outros subtipos de RNA.
NOTA: O volume do tampão de lavagem pode ser reduzido para 300 μL de tampão de lavagem 1 e 150 μL de tampão de lavagem 2. - Adicionar 25 μL (volume desejado) de Tris-HCl (tampão de eluição) a frio de 10 mM ao tubo de amostra e incubar a 70 °C durante 5 minutos.
- Transfira rapidamente o tubo para o ímã e, quando a suspensão estiver límpida após 20 s ou mais, transfira o sobrenadante contendo RNA enriquecido com poli(A) eluído para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Transferir tubos de 2,2 μL para 8 tiras para avaliação da qualidade da quantidade e qualidade do RNA usando ensaios de alta sensibilidade de RNA.
- Conservar a amostra a -20 °C por curtos períodos e -70 °C por um período mais longo.
Observação : isso pode ser um ponto de pausa no protocolo.
2. Conversão de bissulfito
OBS: As etapas de centrifugação foram todas realizadas à temperatura ambiente. Os procedimentos são essencialmente realizados de acordo com as instruções do fabricante, mas com uma etapa adicional 2.2 para adicionar a(s) sequência(s) de mRNA de controle spike-in antes da etapa 2.3 da reação de bissulfito.
- Transfira 19 μL de amostra purificada de RNA enriquecido com poli(A) para um tubo de 8 tiras de 0,2 mL.
- Adicionar 1,0 μL de controle spike-in, que está livre de quaisquer modificações na razão de quantidade predeterminada de 1:10.000 (ou seja, 0,1 ng de mRNA de luciferase: 1 μg de RNA purificado enriquecido com poli(A) na amostra de RNA da etapa 2.1.
NOTA: A sequência de controle de spike-in pode ser Firefly luciferase RNA, Renilla luciferase, ou sequência de RNA transcrito in vitro sem citosinas metiladas. - Adicione 130 μL de regente de conversão ao tubo e inverta suavemente várias vezes para uma mistura completa.
- Coloque o tubo na máquina de PCR e execute três ciclos de aquecimento a 70 °C por 10 min, seguido de incubação a 64 °C por 45 min cada e, em seguida, uma etapa final para resfriar até 4 °C.
- Coloque a coluna no tubo de coleta e transfira 250 μL de tampão de ligação de RNA para a coluna.
- Transferir a amostra do passo 2.4 para a coluna do passo 2.5 e pipetar completamente.
- Adicione 400 μL de 95-100% de etanol à coluna, feche rapidamente a tampa e inverta várias vezes.
- Centrifugar a 10.000 × g por 30 s a 25 °C e descartar o fluxo.
- Adicionar 200 μL de tampão de lavagem de RNA à coluna.
- Centrifugar a 10.000 × g por 30 s a 25 °C e descartar o fluxo.
- Adicionar 200 μL de tampão de dessulfonação e incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Centrifugar a 10.000 × g por 30 s a 25 °C e descartar o fluxo.
- Adicionar 400 μL de tampão de lavagem de ARN e centrifugar a 10.000 × g durante 30 s a 25 °C e eliminar o fluxo. Repita esta etapa uma vez.
- Centrifugar novamente a 10.000 × g durante 2 min a 25 °C para remover completamente o tampão de lavagem residual.
NOTA: O outro passo de centrifugação 2.14 durante 2 minutos antes da eluição é remover completamente o tampão de lavagem. A etapa de lavagem é realizada duas vezes para lavar o componente com alto teor de sal do reagente de bissulfito e o tampão de dessulfonação na coluna. - Transfira a coluna para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Adicionar 20-30 μL de H2O sem nuclease à coluna e repousar à temperatura ambiente durante 1 min.
- Centrifugar a 10.000 × g por 30 s a 25 °C.
- Transferir 2,2 μL para tubos de 8 tiras para a avaliação da quantidade e qualidade do RNA.
- Conservar a amostra de ARN tratada com bissulfito a -20 °C por curtos períodos e -70 °C por um período mais longo.
Observação : isso pode ser um ponto de pausa no protocolo.
3. Preparação da biblioteca de mRNA tratada com bissulfito
NOTA: Siga a seção 4 do protocolo de instrução de preparação da biblioteca para uso com mRNA purificado ou RNA depletado. O primeiro priming deve seguir o protocolo de RNA FFPE, uma vez que o tratamento com bissulfito fragmenta o RNA. Execute cada etapa na capela de fluxo laminar e adicione a mistura de reação em um rack de resfriamento refrigerado por gelo.
- Priming do RNA de entrada
- Transfira a quantidade desejada de amostra de mRNA tratada com bissulfito em um máximo total de 5 μL ou adicione H2O livre de nuclease para fazer um total de 5 μL.
NOTA: Um mínimo de 10 ng de mRNA tratado com bissulfito como entrada é recomendado para este tipo de preparação de biblioteca de RNA e para gerar a molaridade final do produto de biblioteca de 4nM. - Adicionar 1 μL de primer aleatório (lilás) à amostra e misturar por pipetagem.
- Colocar o tubo de amostra na máquina de PCR preajustada a 65 °C e tampar a 105 °C durante 5 min e segurar a 4 °C.
- Transfira a quantidade desejada de amostra de mRNA tratada com bissulfito em um máximo total de 5 μL ou adicione H2O livre de nuclease para fazer um total de 5 μL.
- Síntese de cDNA de primeira fita
- Adicionar 4 μL de tampão de reação de síntese (lilás), 8 μL de reagente de especificidade de fita (marrom) e 2 μL de mistura enzimática de síntese (marrom) à amostra, o que perfaz um volume total de 20 μL. Misture bem pipetando pelo menos 10x e gire rapidamente para baixo.
- Colocar o tubo de amostra na máquina de PCR predefinida a 25 °C durante 10 min, 42 °C durante 50 min, 70 °C durante 15 min e segurar a 4 °C.
NOTA: Para pastilhas acima de 200 bases, sugere-se um período de incubação de 42 °C de 50 min; para o tamanho da pastilha inferior a 200 bases, sugere-se um período de incubação de 42 °C de 15 min.
- Síntese de cDNA de segunda fita
- Adicionar 8 μL de tampão de reação de síntese com mistura de dUTP (laranja), 4 μL de mistura de enzimas de síntese (laranja) e 48 μL de H2O livre de nuclease. Misture completamente pipetando pelo menos 10x e gire rapidamente para baixo.
- Colocar o tubo de amostra na máquina de PCR preajustada a 16 °C durante 1 h com a tampa afastada ou ≤40 °C.
- Purificação de cDNA de fita dupla com esferas de purificação de DNA
- Pré-aqueça as contas de purificação de DNA 30 minutos antes de realizar a purificação e vórtice para ressuspender as contas.
- Adicionar 144 μL de contas de purificação de ADN ressuspensas à amostra de cADN do passo 3.3.2 e misturar cuidadosamente pipetando pelo menos 10x.
- Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Coloque o tubo de amostra em um rack magnético por 5 min até que a solução esteja límpida e, em seguida, remova o sobrenadante e mantenha as esferas que contêm DNA.
- Adicionar 200 μL de etanol 80% recém-feito ao tubo com as contas, mantendo a amostra no rack magnético e incubar à temperatura ambiente por 30 s.
- Retire o sobrenadante e repita o passo 3.4.5 uma vez, mas desta vez remova cuidadosamente todo o sobrenadante residual.
- Seque as contas ao ar por 1-5 min, mantendo a amostra no ímã.
OBS: Não seque demais as contas; A cor deve ser marrom escuro. - Remova a amostra do rack magnético e elute o DNA adicionando 53 μL de tampão 0,1x TE (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA, pH 8,0) às contas. Misture bem pipetando pelo menos 10x e incube à temperatura ambiente durante 2 min.
- Coloque o tubo no rack magnético por 5 min ou até que a solução esteja límpida.
- Transferir 50 μL de sobrenadante contendo cDNA de fita dupla para um novo tubo de 8 tiras.
NOTA: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e a amostra pode ser armazenada a -30 °C.
- Preparação final da biblioteca de cDNA
- Adicionar 7 μL de tampão de reação de polimento final (verde) e 3 μL de mistura enzimática de polimento final (verde) à amostra de cDNA de fita dupla eluída.
- Misture a mistura pipetando 10x com uma configuração de volume de 50 μL sem criar bolhas e, em seguida, gire rapidamente a amostra.
- Colocar a amostra numa máquina de PCR e incubar a 20 °C durante 30 min, 65 °C durante 30 minutos e segurar a 4 °C.
- Ligadura do adaptador
- Diluir o adaptador (vermelho) de acordo com as instruções do fabricante.
- Adicionar 2,5 μL do adaptador diluído, 1 μL de intensificador de ligadura (vermelho) e 30 μL de Ligation Master Mix (vermelho) à amostra.
- Misture a mistura pipetando 10x com uma configuração de volume de 80 μL sem criar bolhas e, em seguida, gire rapidamente a amostra.
- Colocar a amostra numa máquina de PCR e incubar a 20 °C durante 15 minutos.
- Adicionar 3 μL da mistura de uracila DNA glicosilase e DNA glicosilase-liase endonuclease VIII (azul) à amostra e pipetar completamente.
- Recolocar a amostra na máquina de PCR e incubar a 37 °C durante 15 min com a tampa regulada para 75 °C.
- Purificação de cDNAs tratados com reação de ligadura
NOTA: A seleção de tamanho com contas SPRIselect ou, opcionalmente, com contas AMpure XP pode ser usada para essa finalidade18.- Pré-aqueça as contas 30 min antes de realizar a purificação e vórtice para ressuspendê-las.
- Transferir 25 μL de contas ressuspensas para a amostra de cDNA a partir do passo 3.6.6 e misturar cuidadosamente pipetando pelo menos 10x.
- Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Coloque o tubo de amostra em um rack magnético por 5 min até que a solução esteja límpida e, em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de 8 tiras e descarte as contas.
- Adicionar 10 μL de contas ressuspensas ao sobrenadante e misturar cuidadosamente pipetando pelo menos 10x.
- Coloque o tubo de amostra num rack magnético durante 5 minutos até que a solução esteja límpida e, em seguida, elimine o sobrenadante e não perturbe as contas.
- Adicionar 200 μL de etanol 80% recém-feito ao tubo com as contas, mantendo a amostra no rack magnético e incubar à temperatura ambiente por 30 s.
- Remova o sobrenadante e repita o passo 3.7.7 uma vez, mas desta vez remova cuidadosamente todo o sobrenadante residual.
- Seque as contas ao ar por 1-5 min, mantendo a amostra no ímã.
OBS: Não seque demais as contas; A cor deve ser marrom escuro. - Remova a amostra do rack magnético e elimine o DNA adicionando 17 μL de tampão 0,1x TE às contas. Misture bem pipetando pelo menos 10x e incube à temperatura ambiente durante 2 min.
- Coloque o tubo no rack magnético por 5 min até que a solução esteja límpida.
- Transferir 15 μL de sobrenadante, que contém dsDNA preparado para o alvo para um novo tubo de 8 tiras.
- Enriquecimento por PCR de DNA ligado a adaptadores
- Adicionar 25 μL da mistura principal (azul), 5 μL do primer adaptador de 5' e 5 μL do primer do adaptador de 3' à amostra de ADN ligada ao adaptador. Misture bem pipetando pelo menos 10x.
- Colocar a amostra na máquina de PCR e realizar a amplificação da PCR seguindo os seguintes passos: (1) 98 °C por 30 s, (2) 98 °C por 10 s, (3) 65 °C por 75 s, (4) 65 °C por 5 min e (5) segurar a 4 °C; em que os passos (2) e (3) devem repetir-se para um número de ciclo N+2 em que N é igual à quantidade de RNA de entrada no manual de instruções. Isso significa que 2 ciclos adicionais são necessários devido à seleção de tamanho de dupla face das amostras realizada na etapa 3.7.
NOTA: Por exemplo, 8 ng da entrada de mRNA purificada seriam recomendados com 9-10 ciclos de PCR; mas com cDNA ligado, selecionado em tamanho duplo, na etapa 3.7, o ciclo de PCR recomendado seria de 11-12 ciclos.
- Purificação de bibliotecas amplificadas por PCR
- Pré-aqueça as contas de purificação de DNA por 30 minutos antes de realizar a purificação e o vórtice para ressuspender as contas.
- Transferir 45 μL (0,9x) de contas ressuspensas para o produto de PCR a partir da etapa 3.8.2 e misturar completamente pipetando pelo menos 10x.
- Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Coloque o tubo de amostra em um rack magnético por 5 min até que a solução esteja límpida e, em seguida, remova o sobrenadante e mantenha as contas que contêm DNA.
- Adicione 200 μL de etanol 80% recém-feito ao tubo com as contas, deixe a amostra no rack magnético e deixe repousar à temperatura ambiente por 30 s.
- Retire o sobrenadante e repita o passo 3.9.5 uma vez, mas desta vez remova cuidadosamente todo o sobrenadante residual.
- Seque as contas ao ar por 1-5 min, mantendo a amostra no ímã.
OBS: Não seque demais as contas; A cor deve ser marrom escuro. - Retire a amostra do rack magnético e adicione 22 μL de tampão 0,1x TE às esferas para eluir o DNA. Misture bem pipetando pelo menos 10x e incube à temperatura ambiente durante 2 min.
- Coloque o tubo no rack magnético e deixe-o repousar por 5 min ou até que a solução esteja límpida à temperatura ambiente.
- Transfira 20 μL de sobrenadante para um novo tubo de 8 tiras.
- Transferir tubos de 2,2 μL para 8 tiras para avaliação da qualidade da quantidade e qualidade da biblioteca.
NOTA: A quantidade da biblioteca também pode ser detectada por qPCR (consulte a Tabela de Materiais). - Conservar a amostra da biblioteca bsRNA-seq a -20 °C.
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Representative Results
Uma série de bibliotecas bsRNA-seq de linhagens celulares19 foi gerada seguindo os procedimentos deste relatório (Figura 1). Após purificação total do RNA acompanhada do tratamento com DNase realizado em amostras de linhagem celular e a qualidade verificada por eletroforese em gel e espectrofotometria UV-Vis (A260/A280), a amostra de RNA pode prosseguir para o enriquecimento de RNA poli(A). Para determinar se a purificação dupla poderia remover a maioria do RNA ribossomal, a eficiência de purificação do RNA poli(A) foi avaliada por eletroforese capilar por ensaio de RNA total que pode calcular automaticamente a porcentagem de contaminação por RNAr (Figura 2). A partir do padrão de pico do fragmento de RNA e da porcentagem de contaminação por RNAr, amostras de RNA com purificação dupla mostraram diminuição da contaminação de RNA ribossomal de 6,5% para 2,2% e 2,6% para 1,1% em AsPC-1 e BxPC-3, respectivamente. Com linhagens de células de câncer de pâncreas humano, duas rodadas de purificação de esferas poderiam atingir uma média de 2,8 ± 1% de abundâncias de RNA enriquecido com poli(A) a partir do total de amostras de RNA. Portanto, o enriquecimento de RNA poli(A) por esferas de oligo(dT) com dupla purificação minimizou o RNA ribossomal e representa um enriquecimento viável de amostras de RNAm para os experimentos a jusante.
Os protocolos de conversão de bissulfito foram relatados em vários estudos sobre a modificação do RNA 5-metilcitosina (Tabela 1). A reação de bissulfito pode ser realizada com uma mistura reconstituída pelo usuário consistindo de bissulfito de sódio a 40% e hidroquinona 600 mM na solução aquosa (pH 5,1) a 75 °C por 4 horas10,20,21. Alternativamente, um tratamento mais rigoroso com bissulfito da amostra de RNA também pode ser realizado com um kit comercial; que em vários estudos de outros e do nosso 6,22,23,24 estendeu o tempo de reação ao bissulfito para três ciclos de incubação. Uma vez que a etapa de incubação de três ciclos converte eficientemente citosina não metilada no segmento8 de Escherichia coli 16S rRNA transcrita in vitro e estruturalmente mais dobrada, a etapa de incubação de três ciclos também foi aplicada neste protocolo.
Com o enriquecimento duplo de poli(A) e a conversão de bissulfito em três ciclos, a qualidade do RNA antes e após a reação foi avaliada por eletroforese capilar. A distribuição do tamanho do RNA após o tratamento com bissulfito mostrou um pico de ~200-500 nucleotídeos devido à fragmentação causada pela reação de bissulfito (Figura 3). Além disso, o bsRNA fragmentado é ideal para a preparação de bibliotecas sem a necessidade de realizar outra etapa de fragmentação. Um total de 8-10 ng de bsRNA como entrada foi usado para construir a biblioteca de acordo com este protocolo usando 9 a 11 ciclos na amplificação final por PCR do DNA ligado ao adaptador. A eletroforese capilar do amplicon mostrou um preparo da biblioteca bastante bem sucedido, restando apenas uma pequena porção do primer e nenhum pico de sobreamplificação (Figura 4). Para verificar a eficiência de conversão em cada biblioteca de amostras, o RNA da luciferase do vagalume não metilado como uma sequência de controle spike-in foi adicionado à amostra antes de realizar o tratamento com bissulfito. Após as leituras de sequenciamento alinhadas à sequência de referência utilizando o kit de ferramentas meRanTK25, a média de 2.440 (0,006%) leituras totais foram mapeadas para a sequência spike-in, e a taxa de conversão total de C-to-T analisada atingiu uma média de 99,81%; o status pode ser visualizado no Integrated Genomics Viewer (Figura 5).
Figura 1: Diagrama de fluxo de trabalho do sequenciamento de mRNA de bissulfito. O pipeline consiste em três protocolos principais, incluindo enriquecimento de mRNA, conversão de bissulfito e preparação de bibliotecas. Abreviação: bsRNA = mRNA bissulfito; QC. = controle de qualidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados do controle de qualidade de amostras de RNA enriquecidas com poli(A) com eletroforese capilar. (A) Perfil representativo da eletroforese capilar do RNA total das células BxPC-3. (B ) Os perfis representativos de eletroforese capilar de amostras processadas com purificação de oligo(dT) de células AsPC-1 e BxPC-3. mRNA E1, eluição de mRNA a partir de purificação única; mRNA E2, eluição de mRNA a partir de purificação em duas vezes. As estimativas de contaminação por RNAr foram calculadas pelo sistema de operação por eletroforese que controla o ensaio de análise de RNA total. (C) O perfil eletroforético capilar dos marcadores Ladder foi obtido no mesmo percurso com as amostras apresentadas no painel B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação da qualidade das amostras de RNA por eletroforese capilar. Os perfis representativos de eletroforese capilar de (A) o RNA total, (B) o mRNA poli(A) enriquecido a partir de duas vezes a purificação e (C) o mRNA tratado com bissulfito das células BxPC-3. Abreviações: B_empty = células BxPC-3 transduzidas com vetor vazio; B_shScr = células BxPC-3 transduzidas com as sequências scramble. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Avaliação da qualidade das bibliotecas bsRNA-seq. (A-C) Três conjuntos de perfis representativos de eletroforese capilar de bibliotecas bsRNA-seq construídas amplificadas por PCR em diferentes números de ciclos de PCR de 9 e 11 ciclos usando bsRNA de um conjunto de células BxPC-3. A quantidade estimada de entrada do RNA tratado com bissulfito foi determinada por um ensaio de quantificação de RNA de alta sensibilidade. Um total de 8, 8,4 e 9,6 ng de bsRNA foram usados nas amostras (A) BxPC-3 mock, (B) BxPC-3 vazia e (C) BxPC-3 shN2UN2, respectivamente. Os picos do marcador escada em 35 pb e os 10.380 pb representam os padrões internos dos limites inferior e superior no perfil eletroforético de cada amostra. Um pico proeminente de cerca de 100 pb e um pico obscuro de cerca de 127 pb, respectivamente, indicam os primers de PCR (<100 pb) e o dímero adaptador (~127 pb), que permaneceram no eluato após a limpeza da PCR. Abreviações: BxPC-3 mock = células BxPC-3 não transduzidas; BxPC-3 vazio = células BxPC-3 transduzidas com o controle vetorial vazio; BxPC-3 shN2UN2 = células BxPC-3 transduzidas com as construções shNSUN2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Os perfis de alinhamento de sequência de cada biblioteca bsRNA-seq mapeados para a sequência de referência spike-in-control. Os perfis de alinhamento representativos das bibliotecas BxPC-3 mock, empty, scramble e shNSUN2 bsRNA-seq para a sequência de referência de controle spike-in da luciferase do vagalume (indicada como o gene "Z"); Foram apresentadas 2 regiões representativas. As barras cinzas indicam todas as leituras que apresentam nucleotídeos de consenso correspondentes na posição base indicada para a sequência de referência. Barras vermelhas destacam a identidade timidina (T) na posição de base das leituras; barras azuis indicam aquelas leituras com a identidade citosina (C) na posição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Comparação dos protocolos de reação de bissulfito e a taxa de conversão. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Neste protocolo, um pipeline detalhado de enriquecimento de poli(A), conversão de bissulfito e preparação de bibliotecas foi obtido utilizando componentes padronizados. Análises posteriores de sequenciamento forneceram a identificação do RNAm 5-metilcitosina nas amostras de interesse.
A etapa crítica é a qualidade do material de partida - RNA total - uma vez que a degradação do RNA impactaria a taxa de recuperação da purificação do RNA poli(A). A amostra deve ser cuidadosamente manuseada e a contaminação por RNase deve ser evitada antes de realizar a etapa de purificação do poli(A) RNA. Outra parte crucial do procedimento é o número de ciclos de PCR na preparação da biblioteca. A decisão do número do ciclo depende da quantidade de mRNA tratado com bissulfito usado para a preparação da biblioteca e se o uso de seleção de tamanho único ou seleção de tamanho duplo na etapa anterior à PCR. Os números de ciclo adequados para a amostra de interesse exigiriam, portanto, uma realização experimental e avaliar a distribuição do tamanho do produto de PCR por eletroforese capilar para determinar o número ideal de ciclos para a mesma linhagem celular ou tecido.
Neste protocolo, duas rodadas de purificação de esferas de oligo(dT) foram usadas para enriquecer e purificar o poli(A) RNA e eliminaram a maioria dos RNAs ribossomais e outros RNAs. Existem outros métodos para remover o RNA ribossomal e manter outros tipos de RNA na amostra, como a depleção oligo-baseada de rRNA26. Então, a modificação da 5-metilcitosina presente em outros tipos de RNA também pode ser levada à análise e estender a compreensão das características da 5-metilcitosina no mRNA e em outros RNAs.
A reação de bissulfito é conhecida por não ser capaz dedistinguir m 5 C de outras modificações, incluindo a 5-hidroximetilcitosina (hm5C), 3-metilcitidina (m3C) e N4-metilcitidina (m4C)27. No entanto, o planejamento experimental incluindo knockdown ou knockout dam5C RNA metiltransferase deve fornecer evidências informativas de sítios m5C regulados de alta confiança. Além disso, a validação usando diferentes métodos, como enriquecimento baseado em anticorpos seguido de sequenciamento ou PCR ou métodos baseados em LC-MS/MS, poderia essencialmente autenticar os sítios candidatos m5C16. A técnica emergente de sequenciamento direto do RNA de Nanoporos também fornece potencial de identificação de modificação do RNA através da análise computacional do sinal de corrente ou características de base chamadas de "erro"28,29,30.
Um estudo recente de Johnson e col. mostrou que a adição da etapa de fragmentação em amostras de RNA mitocondrial após três rodadas de conversão de bissulfito de fato mostrou uma taxa de conversão maior e aumentou o rendimento do produto da biblioteca de cDNA31. Este artigo analisou especificamente a taxa de conversão e a qualidade da leitura mapeada para o genoma mitocondrial, não para o transcriptoma do RNAm. Assim, o uso da etapa de fragmentação foi atualizado na Tabela 1 para destacar se os relatos publicados incluíam uma etapa de fragmentação de RNA para que os espectadores pudessem replicar facilmente o protocolo. Outro estudo realizado por Zhang e col. demonstrou que a utilização de biblioteca de RNA livre de modificação transcrita in vitro como controle negativo é eficiente para eliminar o sinal falso-positivo do tratamento com bissulfito32. Estudos recentes compararam diferentes protocolos utilizados para a construção de bibliotecas33. O usuário pode ainda optar por conduzir o pipeline bsRNA-seq com ou sem uma etapa adicional de fragmentação e biblioteca de RNA livre de modificação transcrita in vitro para personalizar o fluxo de trabalho adequado.
A identificação de m5C em todo o transcriptoma por diferentes princípios poderia fortalecer os achados das paisagens de modificação e fornecer maior compreensão dos mecanismos regulatórios das modificações de RNA em modelos saudáveis ou de doenças.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia de Taiwan. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
| AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
| Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality detection |
| Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality detection |
| DiaMag02 - magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
| DiaMag1.5 - magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
| Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
| Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
| EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
| Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
| NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra  Directional RNA Library Prep Kit for Illumina |
New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
| Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |
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