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Biology

차세대 염기서열분석을 위한 mRNA 및 Bisulfite-mRNA 라이브러리 준비 농축

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65352
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

Summary

이 프로토콜은 관심 생물학적 샘플에 대해 표준화된 장비를 사용하여 poly(A) RNA 정제, 중아황산염 변환 및 라이브러리 준비를 수행하기 위한 따라하기 쉬운 워크플로우를 제공합니다.

Abstract

다양한 유형의 RNA 전사체에서 RNA 전사 후 변형은 진핵 세포의 다양한 RNA 조절과 관련이 있습니다. 비정상적인 RNA 5-메틸시토신 변형과 RNA 메틸전이효소의 조절 장애 발현은 암을 포함한 다양한 질병과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 전사체 전체 중아황산염 염기서열분석은 염기쌍 분해능에서 중아황산염 변환 RNA의 위치와 정량적 사이토신 메틸화 수준을 특성화하기 위해 개발되었습니다. 여기에서 이 프로토콜은 mRNA 5-메틸시토신 변형 부위의 전사체 전체 매핑을 허용하기 위해 2라운드의 폴리(A) RNA 정제, 3주기의 중아황산염 반응 및 라이브러리 준비 절차를 자세히 제시합니다. 주요 반응 후 RNA의 양과 질을 평가하는 것은 RNA 무결성을 모니터링하는 데 필수적이며 고품질 염기서열분석 라이브러리를 보장하기 위한 중요한 단계입니다. 이상적으로는 3일 이내에 절차를 완료할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 고품질 total RNA를 입력으로 사용하면 관심 샘플에서 차세대 염기서열분석을 위한 강력한 bisulfite-mRNA 라이브러리를 실질적으로 구축할 수 있습니다.

Introduction

150가지 이상의 전사 후 변형(post-transcriptional modifications)1 중 5-메틸시토신(m5C) 변형은 리보솜 RNA, 전달 RNA, 메신저 RNA, 마이크로 RNA, 긴 비코딩 RNA, 금고 RNA, 인핸서 RNA, 작은 카잘체 특이적 RNA를 포함한 다양한 유형의 RNA에서 확인되었습니다2. RNA m 5 C는 식물 뿌리 발달 조절3, 바이러스 유전자 발현4 및 암 진행5과 같은 다양한 생물학적 및 병리학적 메커니즘과 관련이 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 다양한 발달 단계 또는 질병 환경에서 생물학적 샘플의 전사체 전체 mRNA m5C변형 프로파일을 특성화하기 위한 간소화된 파이프라인을 제공하는 것입니다. 전사체 전체 중아황산염 염기서열분석은 염기쌍 분해능 6,7,8,9에서 중아황산염 변환 RNA의 위치 및 정량적 시토신 메틸화 수준을 특성화하기 위해 개발되었습니다. 이것은 세포의 생물학적 조절 메커니즘에 관여하는 유전자 발현 및 RNA 운명과 m5C의 연관성을 연구할 때 특히 유용합니다. 포유류 세포에는 두 개의 알려진 m5C 판독기가 있다: ALYREF는 핵에서 m5C를 인식할 수 있고 mRNA 핵-세포질 수송체(10) 역할을 하는 반면, YBX1은 세포질에서m5C를 인식하고 mRNA 안정화를 증가시킬 수 있다(11). 면역 경로와 관련된 비정상적인 m5CmRNA는 전신성 홍반성 루푸스 CD4+ T 세포에서 보고되었다12. 연구에 따르면 mRNA m5C 변형과 암 면역 및 암 진행 조절 사이의 연관성이 밝혀졌습니다13,14. 따라서 mRNA에서 m5C변형 프로파일을 매핑하면 잠재적인 조절 메커니즘을 설명하는 데 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.

특정 생물학적 조건 하에서 RNA m5C 변형의 기능적 역할을 조사하기 위해, m5 C-RIP-seq, miCLIP-seq 및 5-Aza-seq와 같은 중아황산염 전환 기반(bsRNA-seq) 및 항체 친화성 농축 기반 접근법을 고처리량 염기서열분석 플랫폼과 결합하여 전사체 전체 규모에서m5C변형으로 표적 영역 및 염기서열을 효율적으로 검출할 수 있습니다15, 16. 이 프로토콜의 장점은 항체 친화성 농축 기반 접근법이 고품질 항체의 가용성에 의존하고 m5C메틸화 환경17의 단일 단편 분리능을 달성할 수 있기 때문에 단일 염기 분해능에서 포괄적인 RNA m5C 환경을 제공합니다.

모든 RNA 샘플은 올리고(dT) 비드를 사용한 2라운드의 mRNA 농축, 3주기의 중아황산염 반응 및 염기서열분석 라이브러리 준비로 처리됩니다. RNA 품질을 모니터링하기 위해 각 RNA 샘플은 mRNA 정제 및 중아황산염 반응 절차 전후에 모세관 겔 전기영동으로 검사하여 단편 분포를 평가합니다. 정제된 라이브러리는 PCR 앰플리콘 품질, 모세관 겔 전기영동에 의한 DNA 크기 분포 단편, 염기서열분석 전에 형광 염료 기반 정량 분석으로 검사한 전체 수량으로 검사됩니다. 이 시스템은 농산물, 분리된 바이러스, 세포주, 모델 유기체 및 병리학적 표본과 같은 광범위한 생물학적 샘플을 분석하는 데에도 사용할 수 있습니다.

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Protocol

1. Poly(A) RNA 정제

참고: 폴리(A) RNA 정제를 진행하기 전에 DNase I으로 처리된 total RNA를 사용하고 모세관 또는 기존 겔 전기영동 평가를 통해 전체 RNA 품질 및 무결성을 검사합니다. 조사관은 고분자량 분야에서 28S 및 18S rRNA 리보솜 밴드를 식별하고 저분자량 필드에서 5.8S rRNA 밴드를 식별하여 전기 페로그램에서 중요한 도말 밴드를 식별할 수 있어야 합니다. 정제 단계는 기본적으로 특정 단계에 표시된 약간의 수정과 함께 제조업체의 지침을 따릅니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 도구와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

  1. 준비
    1. 시약, 세척 완충액, 올리고(dT) 비드 및 용해 완충액을 실온에서 30분 동안 예열한 후 다음 절차를 수행합니다.
    2. 폴리(A)-농축 RNA의 분리를 위해 적절한 양의 RNA를 뉴클레아제가 없는 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮겨 10-20μg의 고품질 total RNA 분취액을 출발 물질로 준비합니다. 70°C 의 열 블록에서 5분 동안 배양한 다음 얼음 위에서 2 분 동안 유지합니다.
      참고: 출발 물질로서의 총 RNA의 양은 원하는 mRNA의 양과 사용되는 세포의 특성에 따라 적절하게 조정되어야 합니다. 경험적으로, 폴리(A)-농축 RNA는 전체 RNA에서 1-5%의 존재비를 설명할 수 있다. 고품질 총 RNA 10μg의 분취액은 다운스트림 중아황산염 전환을 위해 100-500ng 범위의 고품질 폴리(A) 농축 RNA를 제공해야 합니다.
    3. 한편, 올리고(dT) 비드를 완전히 재현탁합니다. 필요한 양의 비드 현탁액을 새 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 옮긴 다음 마그네틱 비드가 펠릿을 형성할 때까지 3분 동안 자석에 놓습니다.
      참고: 총 RNA 입력 10μg에 대해 50μL 올리고(dT) 비드를 사용합니다. 이 단계에서 비드의 부피는 사용된 셀에 따라 더욱 최적화될 수 있습니다.
    4. 상층액을 제거하고 oligo(dT) 비드를 용해 완충액의 동일한 양(1.1.3단계에서 사용된 비드 현탁액의 부피)으로 재현탁시키고 상층액을 제거하기 전에 3분 동안 자석에 놓습니다.
      알림: 비드를 과도하게 건조시키지 마십시오. 사용자는 1.2.1단계로 빠르게 진행해야 합니다.
  2. 정화의 첫 번째 라운드
    1. RNA 샘플 튜브(부피 비율 4:1)에 용해 완충액을 추가하고 올리고(dT) 비드로 옮기기 전에 완전히 혼합합니다.
      참고: RNA 샘플 부피가 20μL인 경우 80μL의 용해 완충액을 추가합니다.
    2. RNA 재현탁: 용해 완충액 혼합물 및 올리고(dT) 비드를 최소 10회 이상 피펫팅하여 완전히 재현탁합니다.
    3. 샘플을 실온에서 15분 동안 연속 회전하여 배양합니다.
    4. 샘플을 자석에 5분 동안 또는 상층액이 깨끗해질 때까지 놓습니다. 상층액을 버리십시오.
    5. 600 μL의 세척 완충액 1을 비드에 넣고 조심스럽게 섞어 비드를 재현탁시킵니다.
    6. 튜브를 자석에 5분 동안 또는 상층액이 깨끗해질 때까지 놓고 상층액을 버리고 세척 단계 1.2.5를 한 번 반복합니다.
    7. 300μL의 Wash Buffer 2를 추가하여 비드를 세척하고 비드를 부드럽게 재현탁합니다.
    8. 튜브를 자석에 5분 동안 또는 상층액이 깨끗해질 때까지 놓고 상층액을 버리고 세척 단계 1.2.7을 한 번 반복합니다.
    9. 30 μL의 차가운 10 mM Tris-HCl (용출 완충액)을 샘플 튜브에 넣고 70 ° C 에서 5 분 동안 배양합니다.
    10. 튜브를 자석에 빠르게 옮기고 20초 이상 후에 현탁액이 깨끗해지면 용리된 폴리(A) 농축 RNA가 포함된 상층액을 새 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
  3. 두 번째 정화
    1. 용출된 RNA 시료에 120μL(용출된 시료 부피의 4배) 용해 완충액을 추가하고 완전히 혼합합니다.
    2. 1.1.4단계와 동일한 양의 용해 완충액으로 첫 번째 정제에 사용된 비드를 세척하고 피펫 10배로 피펫하여 비드를 재현탁한 다음 상층액을 버리기 전에 5분 동안 자석에 놓습니다.
    3. RNA: 용해 완충액 혼합물을 세척된 비드로 옮기고 최소 10회 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
    4. 샘플을 실온에서 15분 동안 연속 회전하여 배양합니다.
    5. 1.2.4 - 1.2.8단계를 반복하여 염 및 기타 RNA 아형을 제거합니다.
      알림: 세척 버퍼의 부피는 세척 버퍼 300μL의 1 및 세척 버퍼 150의 2μL로 줄일 수 있습니다.
    6. 25 μL (원하는 부피)의 차가운 10 mM Tris-HCl (용출 완충액)을 샘플 튜브에 추가하고 70 ° C 에서 5 분 동안 배양합니다.
    7. 튜브를 자석에 빠르게 옮기고 20초 이상 후에 현탁액이 깨끗해지면 용리된 폴리(A) 농축 RNA가 포함된 상층액을 새 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
    8. RNA 고감도 분석을 사용하여 RNA 수량 및 품질의 품질 평가를 위해 2.2μL를 8-스트립 튜브로 옮깁니다.
    9. 샘플을 보관하십시오.amp짧은 기간 동안 -20 °C, 장기간 동안 -70 °C.
      참고: 프로토콜의 일시 중지 지점이 될 수 있습니다.

2. 중아황산염 변환

알림: 원심분리 단계는 모두 실온에서 수행되었습니다. 절차는 기본적으로 제조업체의 지침에 따라 수행되지만 중아황산염 반응 단계 2.3 전에 스파이크인 제어 mRNA 서열을 추가하기 위한 추가 단계 2.2가 있습니다.

  1. 19μL의 정제된 폴리(A) 농축 RNA 샘플을 0.2mL 8스트립 튜브로 옮깁니다.
  2. 미리 결정된 1:10,000 수량 비율(즉, 루시페라아제 mRNA 0.1ng: 정제된 폴리(A) 농축 RNA 1μg)에서 변형이 없는 1.0μL의 스파이크인 대조군을 2.1단계의 RNA 샘플에 추가합니다.
    참고: 스파이크인 대조군 염기서열은 반딧불이 루시페라아제 RNA, 레닐라 루시페라아제 또는 메틸화된 시토신이 없는 in vitro 전사 RNA 염기서열일 수 있습니다.
  3. 130μL의 변환 리젠트를 튜브에 넣고 완전히 혼합하기 위해 여러 번 부드럽게 뒤집습니다.
  4. 튜브를 PCR 기계에 넣고 70°C에서 10분 동안 가열한 다음 64°C에서 각각 45분 동안 배양한 다음 마지막 단계를 수행하여 4°C로 냉각합니다.
  5. 컬럼을 수집 튜브에 놓고 250μL의 RNA 결합 완충액을 컬럼으로 옮깁니다.
  6. 2.4단계의 샘플을 2.5단계의 컬럼으로 옮기고 피펫을 철저히 피펫합니다.
  7. 400μL의 95-100% 에탄올을 컬럼에 넣고 캡을 빠르게 닫은 다음 여러 번 뒤집습니다.
  8. 10,000× g 에서 25°C에서 30초 동안 원심분리하고 플로우스루를 버립니다.
  9. 컬럼에 200μL의 RNA 세척 완충액을 추가합니다.
  10. 10,000 × g 에서 25 °C에서 30 초 동안 원심 분리하고 플로우 스루를 버립니다.
  11. 탈황 완충액 200μL를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  12. 25°C에서 30초 동안 10,000× g 에서 원심분리하고 플로우스루를 버립니다.
  13. 400μL의 RNA 세척 완충액과 10,000× g 의 원심분리기를 25°C에서 30초 동안 추가하고 플로우스루를 버립니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
  14. 25°C에서 2분 동안 10,000× g 으로 다시 원심분리하여 잔류 세척 버퍼를 완전히 제거합니다.
    알림: 용출 전 2.14분 동안 다른 원심분리 단계는 세척 버퍼를 완전히 제거하는 것입니다. 세척 단계는 중아황산염 시약 및 컬럼 상의 탈황 완충액으로부터 고염 성분을 세척하기 위해 두 번 수행된다.
  15. 컬럼을 새 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
  16. 20-30 μL의 뉴클레아제가 없는 H2O를 컬럼에 넣고 실온에서 1분 동안 그대로 둡니다.
  17. 10,000 × g 에서 25 °C에서 30 초 동안 원심분리기.
  18. RNA 수량 및 품질 평가를 위해 2.2μL를 8-strip tube로 옮깁니다.
  19. 중아황산염 처리된 RNA 샘플을 -20°C에서 단기간, -70°C에서 장기간 보관합니다.
    참고: 프로토콜의 일시 중지 지점이 될 수 있습니다.

3. 중아황산염 처리된 mRNA 라이브러리 준비

참고: 정제된 mRNA 또는 rRNA가 고갈된 RNA와 함께 사용하기 위해 라이브러리 준비 지침 프로토콜 섹션 4를 따르십시오. 첫 번째 프라이밍 단계는 중아황산염 처리가 RNA를 단편화하기 때문에 FFPE RNA 프로토콜을 따라야 합니다. 층류 후드의 모든 단계를 수행하고 얼음으로 냉각된 냉각 랙에 반응 혼합물을 추가합니다..

  1. 입력 RNA 프라이밍
    1. 총 최대 5 μL의 중아황산염 처리된 mRNA 샘플을 원하는 양으로 옮기거나 Nuclease-free H2O를 추가하여 총 5 μL를 만듭니다.
      참고: 이러한 유형의 RNA 라이브러리 준비 및 4nM 라이브러리 산물의 최종 몰 농도를 생성하기 위해 최소 10ng의 중아황산염 처리된 mRNA를 입력으로 사용하는 것이 좋습니다.
    2. 샘플에 1μL의 랜덤 프라이머(라일락)를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다.
    3. 65°C로 사전 설정된 PCR 기계에 샘플 튜브를 놓고 105°C에서 5분 동안 뚜껑을 덮고 4°C에서 유지합니다.
  2. 첫 번째 가닥 cDNA 합성
    1. 4μL의 합성 반응 완충액(라일락), 8μL의 가닥 특이성 시약(갈색) 및 2μL의 합성 효소 혼합물(갈색)을 샘플에 첨가하여 총 부피가 20μL가 됩니다. 피펫팅을 통해 10배 이상 완전히 혼합하고 빠르게 스핀 다운합니다.
    2. 샘플 튜브를 25°C에서 10분 동안, 42°C에서 50분 동안, 70°C에서 15분 동안 미리 설정된 PCR 기계에 놓고 4°C에서 유지합니다.
      알림: 염기가 200개 이상인 인서트의 경우 42°C 배양 기간 50분이 권장됩니다. 염기 크기가 200 미만인 경우 42°C 배양 기간을 15분으로 권장합니다.
  3. 두 번째 가닥 cDNA 합성
    1. 8 μL의 합성 반응 완충액을 dUTP 혼합물(주황색), 4 μL의 합성 효소 혼합물(주황색) 및 48 μL의 뉴클레아제가 없는 H2O를 추가합니다.
    2. 뚜껑을 닫은 상태에서 16°C로 사전 설정된 PCR 기계에 샘플 튜브를 1시간 동안 또는 ≤40°C로 놓습니다.
  4. DNA 정제 비드를 이용한 이중 가닥 cDNA 정제
    1. 정제 및 소용돌이를 수행하기 전에 DNA 정제 비드를 30분 동안 예열하여 비드를 재현탁시킵니다.
    2. 3.3.2 단계의 cDNA 샘플에 144μL의 재현탁 DNA 정제 비드를 추가하고 최소 10회 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
    3. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    4. 용액이 맑아질 때까지 샘플 튜브를 마그네틱 랙에 5분 동안 놓은 다음 상층액을 제거하고 DNA가 포함된 비드를 유지합니다.
    5. 갓 만든 80% 에탄올 200μL를 비드가 있는 튜브에 넣고 샘플을 마그네틱 랙에 보관하고 실온에서 30초 동안 배양합니다.
    6. 상층액을 제거하고 3.4.5단계를 한 번 반복하되 이번에는 잔여 상층액을 모두 조심스럽게 제거합니다.
    7. 샘플을 자석에 유지하면서 1-5분 동안 비드를 자연 건조시킵니다.
      알림: 비드를 과도하게 건조시키지 마십시오. 색상은 짙은 갈색이어야 합니다.
    8. 마그네틱 랙에서 샘플을 제거하고 53μL의 0.1x TE(10mM Tris-HCl 및 1mM EDTA, pH 8.0) 버퍼를 비드에 추가하여 DNA를 용리합니다. 최소 10회 피펫팅하여 완전히 혼합하고 실온에서 2분 동안 배양합니다.
    9. 튜브를 마그네틱 랙에 5분 동안 또는 용액이 맑아질 때까지 놓습니다.
    10. 이중 가닥 cDNA를 함유한 상층액 50μL를 새로운 8-스트립 튜브에 전달합니다.
      알림: 이 시점에서 프로토콜을 중지할 수 있으며 sample은 -30°C에서 보관할 수 있습니다.
  5. cDNA 라이브러리의 최종 준비
    1. 용리된 이중 가닥 cDNA 샘플에 7μL의 말단 연마 반응 완충액(녹색)과 3μL의 말단 연마 효소 혼합물(녹색)을 추가합니다.
    2. 기포를 생성하지 않고 50μL 부피 설정으로 10x 피펫팅하여 혼합물을 혼합한 다음 샘플을 빠르게 회전시킵니다.
    3. 검체를 PCR 기계에 넣고 20°C에서 30분, 65°C에서 30분간 배양한 후 4°C에서 유지합니다.
  6. 어댑터 결찰
    1. 제조업체의 지침에 따라 어댑터(빨간색)를 희석합니다.
    2. 희석된 어댑터 2.5μL, ligation enhancer(빨간색) 1μL, Ligation Master Mix(빨간색) 30μL를 샘플에 추가합니다.
    3. 기포를 생성하지 않고 80μL 부피 설정으로 10x 피펫팅하여 혼합물을 혼합한 다음 샘플을 빠르게 회전시킵니다.
    4. 샘플을 PCR 기계에 넣고 20°C에서 15분 동안 배양합니다.
    5. 우라실 DNA 글리코실라아제와 DNA 글리코실라아제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII(파란색)의 혼합물 3μL를 샘플에 넣고 피펫에 완전히 첨가합니다.
    6. 샘플을 PCR 기계에 다시 넣고 뚜껑을 75°C로 설정한 상태에서 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
  7. 결찰 반응 처리된 cDNA의 정제
    참고: SPRIselect 비드 또는 선택적으로 AMpure XP 비드를 사용한 크기 선택은 모두 이 목적을 위해 사용할 수 있습니다18.
    1. 정제 및 소용돌이를 수행하기 전에 비드를 30분 동안 예열하여 다시 현탁시킵니다.
    2. 3.6.6단계에서 재현탁된 비드 25μL를 cDNA 샘플로 옮기고 최소 10배 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
    3. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    4. 용액이 맑아질 때까지 샘플 튜브를 마그네틱 랙에 5분 동안 놓은 다음 상층액을 새 8스트립 튜브로 옮기고 비드를 버립니다.
    5. 10μL의 재현탁 비드를 상층액에 추가하고 최소 10회 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
    6. 용액이 맑아질 때까지 샘플 튜브를 마그네틱 랙에 5분 동안 놓고 상층액을 버리고 비드를 방해하지 마십시오.
    7. 갓 만든 80% 에탄올 200μL를 비드가 있는 튜브에 넣고 샘플을 마그네틱 랙에 보관하고 실온에서 30초 동안 배양합니다.
    8. 상층액을 제거하고 3.7.7단계를 한 번 반복하되 이번에는 잔여 상층액을 모두 조심스럽게 제거합니다.
    9. 샘플을 자석에 유지하면서 비드를 1-5분 동안 자연 건조합니다.
      알림: 비드를 과도하게 건조시키지 마십시오. 색상은 짙은 갈색이어야 합니다.
    10. 마그네틱 랙에서 샘플을 제거하고 비드에 17μL의 0.1x TE 버퍼를 추가하여 DNA를 용리합니다. 최소 10회 피펫팅하여 완전히 혼합하고 실온에서 2분 동안 배양합니다.
    11. 용액이 맑아질 때까지 튜브를 마그네틱 랙에 5분 동안 놓습니다.
    12. 표적 말단 준비 dsDNA가 포함된 15μL의 상층액을 새로운 8-스트립 튜브로 옮깁니다.
  8. 어댑터 연결 DNA의 PCR 농축
    1. 25μL의 마스터 믹스(파란색), 5μL의 5' 어댑터 프라이머, 5μL의 3' 어댑터 프라이머를 어댑터 연결 DNA 샘플에 추가합니다. 최소 10회 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
    2. 샘플을 PCR 기계에 넣고 다음 단계를 사용하여 PCR 증폭을 수행합니다: (1) 30초 동안 98°C, (2) 10초 동안 98°C, (3) 75초 동안 65°C, (4) 5분 동안 65°C, (5) 4°C에서 유지; 여기서 (2)와 (3) 단계는 N+2 주기 번호에 대해 반복되어야 하며, 여기서 N은 사용 설명서의 RNA 입력 양과 같습니다. 이는 3.7단계에서 수행된 샘플의 양면 크기 선택으로 인해 2개의 추가 사이클이 필요하다는 것을 의미합니다.
      참고: 예를 들어, 정제된 mRNA 입력의 8ng는 9-10 주기의 PCR과 함께 권장됩니다. 그러나 단계 3.7에 있는 두 배 측, 크기 선택한, ligated cDNA로, 추천한 PCR 주기는 11-12 주기일 것입니다.
  9. PCR 증폭 라이브러리의 정제
    1. DNA 정제 비드를 30분 동안 예열한 후 정제 및 와류를 수행하여 비드를 재현탁시킵니다.
    2. 45μL(0.9x)의 재현탁 비드를 3.8.2단계에서 PCR 산물로 옮기고 피펫팅하여 10배 이상 완전히 혼합합니다.
    3. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    4. 용액이 맑아질 때까지 샘플 튜브를 마그네틱 랙에 5분 동안 놓은 다음 상층액을 제거하고 DNA가 포함된 비드를 유지합니다.
    5. 갓 만든 80% 에탄올 200μL를 비드가 있는 튜브에 넣고 샘플을 마그네틱 랙에 그대로 두고 실온에서 30초 동안 그대로 둡니다.
    6. 상층액을 제거하고 3.9.5단계를 한 번 반복하되 이번에는 잔여 상층액을 모두 조심스럽게 제거합니다.
    7. 샘플을 자석에 유지하면서 비드를 1-5분 동안 자연 건조합니다.
      알림: 비드를 과도하게 건조시키지 마십시오. 색상은 짙은 갈색이어야 합니다.
    8. 마그네틱 랙에서 샘플을 꺼내고 22μL의 0.1x TE 버퍼를 비드에 추가하여 DNA를 용리합니다. 최소 10회 피펫팅하여 완전히 혼합하고 실온에서 2분 동안 배양합니다.
    9. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 5분 동안 또는 실온에서 용액이 맑아질 때까지 그대로 두십시오.
    10. 20μL의 상층액을 새 8-스트립 튜브로 옮깁니다.
    11. 라이브러리 수량 및 품질의 품질 평가를 위해 2.2 μL를 8-strip tube로 옮깁니다.
      참고: 라이브러리의 수량은 qPCR로도 감지할 수 있습니다( 재료 표 참조).
    12. bsRNA-seq 라이브러리 검체를 -20°C에서 보관합니다.

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Representative Results

세포주 19로부터의 일련의 bsRNA-seq 라이브러리는 이 보고서의 절차에 따라 생성되었습니다(그림 1). 세포주 샘플에 대해 수행된 DNase 처리와 함께 전체 RNA 정제 및 겔 전기영동 및 UV-Vis 분광광도법(A260/A280)으로 품질을 확인한 후 RNA 샘플은 폴리(A) RNA 농축을 진행할 수 있습니다. 이중 정제가 리보솜 RNA의 대부분을 제거할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 rRNA 오염 비율을 자동으로 계산할 수 있는 모세관 전기영동 총 RNA 분석으로 폴리(A) RNA의 정제 효율을 평가했습니다(그림 2). RNA 절편 피크 패턴과 rRNA 오염 비율에서 두 번 정제한 RNA 샘플은 실제로 AsPC-1 및 BxPC-3에서 리보솜 RNA의 오염이 각각 6.5%에서 2.2%로, 2.6%에서 1.1%로 감소한 것으로 나타났습니다. 인간 췌장암 세포주를 사용하면 두 차례의 비드 정제로 전체 RNA 샘플에서 평균 2.8 ± 1% 폴리(A) 농축 RNA 함량에 도달할 수 있습니다. 따라서 이중 정제 단계를 거친 올리고(dT) 비드에 의한 폴리(A) RNA 농축은 리보솜 RNA를 최소화하고 다운스트림 실험을 위한 실현 가능한 mRNA 샘플 농축을 나타냅니다.

중아황산염 전환 프로토콜은 RNA 5-메틸시토신 변형에 대한 여러 연구에서 보고되었습니다(표 1). 중아황산염 반응은 75°C에서 4시간 동안 수용액(pH 5.1)에서 40% 중아황산나트륨 및 600mM 하이드로퀴논으로 구성된 사용자 재구성 반응 혼합물로 수행할 수 있다(10,20,21). 대안적으로, RNA 샘플의 보다 엄격한 중아황산염 처리는 또한 상용 키트를 사용하여 수행될 수 있습니다. 다른 사람들과 우리의 6,22,23,24의 많은 연구에서 중아황산염 반응 시간을 3 배양 주기로 연장했습니다. 3-사이클 배양 단계는 in vitro 전사 및 구조적으로 더 많이 접힌 Escherichia coli 16S rRNA 세그먼트8에서 메틸화되지 않은 시토신을 효율적으로 전환하기 때문에 3-사이클 배양 단계도 이 프로토콜에 적용되었습니다.

2회 폴리(A) 농축 및 3주기 중아황산염 변환을 통해 반응 전후의 RNA 품질을 모세관 전기영동으로 평가했습니다. 중아황산염 처리 후의 RNA 크기 분포는 중아황산염 반응에 의한 단편화로 인해 ~200-500개의 뉴클레오티드의 피크를 보여주었습니다(그림 3). 또한 fragmented bsRNA는 다른 fragmentation 단계를 수행할 필요 없이 라이브러리 준비에 이상적입니다. 총 8-10ng의 bsRNA를 어댑터-결찰된 DNA의 최종 PCR 증폭에서 9 내지 11 사이클을 사용하여 이 프로토콜에 따라 라이브러리를 구축하기 위해 입력으로 사용하였다. 앰플리콘의 모세관 전기영동은 프라이머의 작은 부분만 남아 있고 과증폭 피크가 없는 매우 성공적인 라이브러리 준비를 보여주었습니다(그림 4). 각 샘플 라이브러리에서 변환 효율을 확인하기 위해 스파이크인 제어 서열로서의 메틸화되지 않은 반딧불이 루시페라아제 RNA를 중아황산염 처리를 수행하기 전에 샘플에 첨가했습니다. meRanTK 툴 키트(25)를 사용하여 기준 서열에 정렬된 서열분석 판독 후, 총 판독의 평균 2,440(0.006%)이 스파이크-인 서열에 매핑되었고, 분석된 총 C-to-T 전환율은 평균 99.81%에 도달했다; 상태는 통합 유전체학 뷰어에서 볼 수 있습니다(그림 5).

Figure 1
그림 1: 중아황산염 mRNA 염기서열분석의 워크플로우 다이어그램. 파이프라인은 mRNA 농축, 중아황산염 전환 및 라이브러리 준비를 포함한 세 가지 주요 프로토콜로 구성됩니다. 약어: bsRNA = 중아황산염 mRNA; 품질 관리. = 품질 관리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 모세관 전기영동을 사용한 폴리(A)-농축 RNA 샘플의 품질 관리 결과. (A) BxPC-3 세포의 총 RNA의 대표적인 모세관 전기영동 프로파일. (B ) AsPC-1 및 BxPC-3 세포에서 올리고(dT) 정제로 처리된 샘플의 대표적인 모세관 전기영동 프로파일. mRNA E1, 1회 정제에서 mRNA 용출; mRNA E2, 2회 정제를 통한 mRNA 용출. rRNA 오염 추정치는 전체 RNA 분석 분석을 제어하는 전기영동 작동 시스템에 의해 계산되었습니다. (C) Ladder 마커의 모세관 전기영동 프로파일은 패널 B에 제시된 샘플과 동일한 실행에서 획득되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 모세관 전기영동에 의한 RNA 샘플의 품질 평가. (A ) 총 RNA, ( B ) 2회 정제로 얻은 폴리(A) 농축 mRNA, (C) BxPC-3 세포의 중아황산염 처리된 mRNA의 대표적인 모세관 전기영동 프로파일. 약어: B_empty = 빈 벡터로 형질도입된 BxPC-3 세포; B_shScr = 스크램블 서열로 형질도입된 BxPC-3 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: bsRNA-seq 라이브러리의 품질 평가. (A-C) BxPC-3 세포 세트의 bsRNA를 사용하여 9 및 11 사이클의 서로 다른 PCR 주기 번호에서 PCR에 의해 증폭된 구성된 bsRNA-seq 라이브러리의 대표적인 모세관 전기영동 프로파일 3세트. 중아황산염 처리된 RNA의 추정된 투입량은 고감도 RNA 정량 분석에 의해 결정되었습니다. 총 8, 8.4 및 9.6 ng bsRNA가 ( A) BxPC-3 모의, ( B ) BxPC-3 비어 있음 및 (C) BxPC-3 shN2UN2 샘플에 각각 사용되었습니다. 래더 마커 피크는 35bp이고 10,380bp는 각 샘플의 전기영동 프로파일에서 하한과 상한의 내부 표준물질을 나타냅니다. 약 100 bp의 두드러진 피크와 약 127 bp의 모호한 피크는 PCR 프라이머(<100 bp)와 어댑터 이량체(~127 bp)를 나타내며, 이는 PCR 클린업 후 용리액에 남아 있습니다. 약어: BxPC-3 mock = 형질도입되지 않은 BxPC-3 세포; BxPC-3 빈 = 빈 벡터 대조군으로 형질주입된 BxPC-3 세포; BxPC-3 shN2UN2 = shNSUN2 구조체로 형질도입된 BxPC-3 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: spike-in-control reference sequence에 매핑된 각 bsRNA-seq 라이브러리의 염기서열 정렬 프로파일. BxPC-3 mock, empty, scramble 및 shNSUN2 bsRNA-seq 라이브러리의 대표적인 정렬 프로파일을 반딧불이 루시페라아제 스파이크-인 대조군 참조 서열("Z" 유전자로 표시)에 대함; 2개의 대표 지역이 표시되었습니다. 회색 막대는 기준 염기서열에 대해 표시된 염기 위치에 일치하는 합의 뉴클레오티드를 나타내는 모든 판독을 나타냅니다. 빨간색 막대는 판독값의 기본 위치에서 티미딘(T) 정체성을 강조 표시합니다. 파란색 막대는 해당 위치에서 시토신(C) 동일성을 갖는 판독값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 중아황산염 반응 프로토콜과 전환율 비교. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 프로토콜에서는 표준화된 구성 요소를 활용하여 폴리(A) 농축, 중아황산염 변환 및 라이브러리 준비의 상세한 파이프라인을 달성했습니다. 추가 염기서열분석 분석을 통해 관심 샘플에서 mRNA 5-methylcytosine을 식별할 수 있었습니다.

중요한 단계는 RNA의 분해가 poly(A) RNA 정제의 회수율에 영향을 미치기 때문에 출발 물질-총 RNA의 품질입니다. poly(A) RNA 정제 단계를 수행하기 전에 샘플을 조심스럽게 취급하고 RNase 오염을 방지해야 합니다. 절차의 또 다른 중요한 부분은 도서관 준비에 있는 PCR 주기의 수이다. 사이클 번호의 결정은 라이브러리 준비에 사용되는 중아황산염 처리된 mRNA의 양과 PCR 전 단계에서 단일 크기 선택 또는 이중 크기 선택의 사용 여부에 따라 달라집니다. 따라서 관심 샘플에 적합한 사이클 수는 동일한 세포주 또는 조직에 대한 최적의 사이클 수를 결정하기 위해 모세관 전기영동에 의한 PCR 산물 크기 분포를 평가하고 시험 실행이 필요합니다.

이 프로토콜에서는 폴리(A) RNA를 농축 및 정제하기 위해 두 차례의 올리고(dT) 비드 정제를 사용했으며 대부분의 리보솜 RNA 및 기타 RNA를 제거했습니다. 리보솜 RNA를 제거하고 rRNA26의 올리고 기반 고갈과 같은 샘플에서 다른 RNA 유형을 유지하는 다른 방법이 있습니다. 그런 다음 다른 RNA 유형에 존재하는 5-메틸시토신 변형도 분석에 사용할 수 있으며 mRNA 및 기타 RNA의 5-메틸시토신 기능에 대한 이해를 확장할 수 있습니다.

중아황산염 반응은 5-하이드록시메틸시토신(hm5C), 3-메틸시티딘(m3C) 및 N4-메틸시티딘(m4C)27을 포함한 다른 변형체와m5C를 구별할 수 없는 것으로 알려져 있습니다. 그러나, m5C RNA methyltransferase knockdown 또는 knockout을 포함한 실험 설계는 신뢰도가 높은 조절된m5C부위에 대한 유익한 증거를 제공해야합니다. 또한, 염기서열분석 또는 PCR 또는 LC-MS/MS-기반 방법에 뒤따르는 항체 기반 농축과 같은 상이한 방법을 사용한 검증은 근본적으로 후보m5C부위를 인증할 수 있었다16. 직접적인 Nanopore RNA 연속의 새로운 기술은 또한 현재 신호 또는 염기라고 불리는 '과실' 특징28,29,30의 계산 분석을 통해 RNA 수정의 잠재적인 ID를 제공합니다.

Johnson et al.에 의한 최근 연구는 중아황산염 전환의 3 라운드 후에 미토콘드리아 RNA 샘플에 단편화 단계를 추가하는 것이 실제로 더 높은 전환율을 나타내고 cDNA 라이브러리 제품31의 수율을 증가시킨다는 것을 보여주었다. 이 논문은 특히 mRNA 전사체가 아닌 미토콘드리아 게놈에 매핑된 전환율과 판독 품질을 분석했습니다. 따라서, 단편화 단계의 사용은 뷰어가 프로토콜을 쉽게 복제할 수 있도록 게시된 보고서에 RNA 단편화 단계가 포함되었는지 여부를 강조하기 위해 표 1 에서 업데이트되었습니다. Zhang et al.의 또 다른 연구는 in vitro transcribeed modification-free RNA 라이브러리를 음성 대조군으로 활용하는 것이 중아황산염 처리로부터 위양성 신호를 제거하는 데 효율적임을 보여주었다32. 최근 연구에서는 도서관 건설에 사용되는 다양한 프로토콜을 비교했다33. 사용자는 추가 단편화 단계와 in vitro transcribeed modification-free RNA library를 사용하거나 사용하지 않고 bsRNA-seq 파이프라인을 수행하여 적절한 워크플로우를 맞춤화할 수 있습니다.

다양한 원리에 의한m5C의 전사체 전체 식별은 변형 환경의 발견을 강화하고 건강한 또는 질병 모델에서 RNA 변형의 조절 메커니즘에 대한 더 많은 이해를 제공할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 대만 국가과학기술위원회(National Science and Technology Council of Taiwan)의 지원을 받았습니다. [NSTC 111-2314-B-006-003]

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System Agilent, Santa Clara, CA RNA quality detection
AMpure XP beads Beckman Coulter A63881 purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-4626 DNA quality detection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-1513 RNA quality detection
DiaMag02 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000001 assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000003 assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 61011 poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol J.T.Baker 64-17-5
EZ RNA methylation kit Zymo, Irvine, CA R5002 bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA Promega, Madison, WI, USA L4561 spike in control seqeunce 
KAPA Library Quantification Kits Roche, Switzerland KK4824 library quantification
Nanodrop spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) New England Biolabs, Ipswich, MA E7335S library preparation
NEBNext Ultra Equation 1 Directional RNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs, Ipswich, MA E7760S library preparation
Nuclease-free Water Thermo Fisher Scientific AM9932
P2 pipetman Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 4641010
Qubit 2.0 fluorometer  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32854 DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32852 RNA quantity detection

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References

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