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Biology

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए एमआरएनए और बिसल्फाइट-एमआरएनए लाइब्रेरी की तैयारी का संवर्धन

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65352
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

Summary

यह प्रोटोकॉल रुचि के जैविक नमूने के लिए मानकीकृत उपकरणों का उपयोग करके पॉली (ए) आरएनए शुद्धिकरण, बाइसल्फाइट रूपांतरण और पुस्तकालय तैयारी का संचालन करने के लिए एक आसान-से-पालन वर्कफ़्लो प्रदान करता है।

Abstract

विभिन्न प्रकार के आरएनए प्रतिलेख में आरएनए पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधन यूकेरियोटिक कोशिकाओं में विविध आरएनए विनियमन से जुड़े होते हैं। असामान्य आरएनए 5-मिथाइलसाइटोसिन संशोधन और आरएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ की अनियमित अभिव्यक्ति को कैंसर सहित विभिन्न बीमारियों से जुड़ा हुआ दिखाया गया है। बेस-पेयर रिज़ॉल्यूशन पर बिसल्फाइट-परिवर्तित आरएनए में स्थितियों और मात्रात्मक साइटोसिन मिथाइलेशन स्तरों को चिह्नित करने के लिए ट्रांसक्रिपटम-वाइड बिसल्फाइट-अनुक्रमण विकसित किया गया था। यहां, यह प्रोटोकॉल पॉली (ए) आरएनए शुद्धिकरण के दो दौरों, बिसल्फाइट प्रतिक्रिया के तीन चक्रों और एमआरएनए 5-मिथाइलसाइटोसिन संशोधन साइटों के ट्रांसक्रिपटम-वाइड मैपिंग की अनुमति देने के लिए पुस्तकालय की तैयारी की प्रक्रियाओं को विस्तार से प्रस्तुत करता है। मुख्य प्रतिक्रिया के बाद आरएनए की मात्रा और गुणवत्ता का आकलन आरएनए अखंडता की निगरानी के लिए आवश्यक है और उच्च गुणवत्ता वाले अनुक्रमण पुस्तकालयों को सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। आदर्श रूप से, प्रक्रियाओं को तीन दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के साथ, इनपुट के रूप में उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए का उपयोग व्यावहारिक रूप से रुचि के नमूने से अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए मजबूत बिसल्फाइट-एमआरएनए पुस्तकालयों का निर्माण कर सकता है।

Introduction

150 से अधिक प्रकार के पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों में1, 5-मिथाइलसाइटोसिन (एम5सी) संशोधन की पहचान विभिन्न प्रकार के आरएनए में की गई है, जिसमें राइबोसोमल आरएनए, ट्रांसफर आरएनए, मैसेंजर आरएनए, माइक्रो आरएनए, लॉन्ग नॉन-कोडिंग आरएनए, वॉल्ट आरएनए, एन्हांसर आरएनए और छोटे कैजल बॉडी-विशिष्ट आरएनए2 शामिल हैं। आरएनए एम 5 सी विभिन्न जैविक और पैथोलॉजिकल तंत्र से जुड़ा हुआ है जैसे कि पौधे की जड़ के विकासको विनियमित करना 3, वायरल जीन अभिव्यक्ति4, और कैंसरकी प्रगति5। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य विभिन्न विकास चरणों में या रोग सेटिंग में जैविक नमूनों के ट्रांसक्रिपटम-वाइड एमआरएनए एम5सी संशोधन प्रोफ़ाइल को चिह्नित करने के लिए सुव्यवस्थित पाइपलाइन प्रदान करना है। बेस-पेयर रिज़ॉल्यूशन 6,7,8,9 पर बिसल्फाइट-परिवर्तित आरएनए में स्थितियों और मात्रात्मक साइटोसिन मिथाइलेशन स्तरों को चिह्नित करने के लिए ट्रांसक्रिपटम-वाइड बिसल्फाइट-अनुक्रमण विकसित किया गया था। यह जीन अभिव्यक्ति और आरएनए भाग्य के साथ एम5सी के संबंध का अध्ययन करते समय विशेष रूप से उपयोगी है जो कोशिकाओं में जैविक नियामक तंत्र में शामिल है। स्तनधारी कोशिका में, दो ज्ञात एम 5 सी पाठक हैं: एएलवाईआरईएफ नाभिक में एम 5 सी को पहचान सकता है और एमआरएनए न्यूक्लियस-टू-साइटोसोल ट्रांसपोर्टर10 के रूप में कार्य करता है, जबकि वाईबीएक्स 1 साइटोप्लाज्म में एम5सी को पहचानसकता है और एमआरएनए स्थिरीकरण11 को बढ़ा सकता है। प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस सीडी 4 + टी कोशिकाओं12 में प्रतिरक्षा मार्गों से संबंधित असामान्य एम5सी एमआरएनए की सूचना दी गई थी। अध्ययनों से एमआरएनएएम 5सी संशोधन और कैंसर प्रतिरक्षा के मॉड्यूलेशन और कैंसर की प्रगति13,14 के बीच एक संबंध का पता चला है। इसलिए, एमआरएनए पर एम5सी संशोधन प्रोफ़ाइल का मानचित्रण संभावित नियामक मशीनरी को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है।

कुछ जैविक परिस्थितियों के तहत आरएनए एम 5सी संशोधन की कार्यात्मक भूमिकाओं की जांच करने के लिए, बाइसल्फाइट रूपांतरण-आधारित (बीएसआरएनए-सेक) और एंटीबॉडी आत्मीयता संवर्धन-आधारित दृष्टिकोण जैसे कि एम 5 सी-आरआईपी-सेक, एमआईसीएलआईपी-सेक और 5-एज़ा-सेक को उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण मंच के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि ट्रांसक्रिपटम-वाइड स्केल15 पर एम5सी संशोधनों के साथ लक्षित क्षेत्रों और अनुक्रमों का कुशल पता लगाया जा सके। 16. इस प्रोटोकॉल का लाभ एकल-आधार रिज़ॉल्यूशन पर व्यापकआरएनए एम 5 सी परिदृश्य प्रदान करता है क्योंकि एंटीबॉडी आत्मीयता संवर्धन-आधारित दृष्टिकोण उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी की उपलब्धता पर निर्भर करता है और एम5सी मिथाइलेशन लैंडस्केप17 के एकल-टुकड़े रिज़ॉल्यूशन को प्राप्त कर सकता है।

सभी आरएनए नमूनों को ओलिगो (डीटी) मोतियों का उपयोग करके एमआरएनए संवर्धन के दो दौरों, बिसल्फाइट प्रतिक्रिया के तीन चक्रों और अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी के साथ संसाधित किया जाएगा। आरएनए गुणवत्ता की निगरानी के लिए, प्रत्येक आरएनए नमूने की जांच टुकड़े वितरण का आकलन करने के लिए एमआरएनए शुद्धिकरण और बाइसल्फाइट प्रतिक्रिया की प्रक्रियाओं से पहले और बाद में केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा की जाएगी। शुद्ध पुस्तकालयों की जांच उनके पीसीआर एम्प्लिकॉन गुणों, केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा डीएनए आकार वितरण टुकड़े, और अनुक्रमण से पहले प्रतिदीप्ति रंजक-आधारित मात्रात्मक परख द्वारा उनकी समग्र मात्रा की जांच की जाएगी। प्रणाली का उपयोग जैविक नमूनों के व्यापक स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करने के लिए भी किया जा सकता है जैसे कि कृषि उपज, पृथक वायरियन, सेल लाइनें, मॉडल जीव और पैथोलॉजिकल नमूने।

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Protocol

1. पॉली (ए) आरएनए शुद्धिकरण

नोट: DNase I के साथ इलाज किए गए कुल आरएनए का उपयोग करें और पॉली (ए) आरएनए शुद्धिकरण के लिए आगे बढ़ने से पहले केशिका या पारंपरिक जेल वैद्युतकणसंचलन मूल्यांकन द्वारा कुल आरएनए गुणवत्ता और अखंडता की जांच करें। जांचकर्ताओं को इलेक्ट्रोफेरोग्राम में किसी भी महत्वपूर्ण स्मीयर बैंड के बिना उच्च आणविक भार क्षेत्र में 28 एस और 18 एस आरआरएनए राइबोसोमल बैंड और कम आणविक भार क्षेत्र में 5.8 एस आरआरएनए बैंड की पहचान करने में सक्षम होना चाहिए। शुद्धिकरण चरण अनिवार्य रूप से विशिष्ट चरणों में इंगित मामूली संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों का पालन करते हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

  1. तैयारी
    1. निम्नलिखित प्रक्रियाओं का संचालन करने से पहले 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अभिकर्मक, वॉशिंग बफर, ऑलिगो (डीटी) मोती और लाइसिस बफर को गर्म करें।
    2. पॉली (ए) -समृद्ध आरएनए के अलगाव के लिए, पर्याप्त मात्रा में आरएनए को न्यूक्लियस-मुक्त 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करके प्रारंभिक सामग्री के रूप में उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए के एलिकोट का 10-20 μg तैयार करें। 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ब्लॉक में इनक्यूबेट करें, फिर 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
      नोट: प्रारंभिक सामग्री के रूप में कुल आरएनए की मात्रा को एमआरएनए की वांछित मात्रा और उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की प्रकृति के आधार पर उचित रूप से समायोजित किया जाना चाहिए। अनुभवजन्य रूप से, पॉली (ए) -समृद्ध आरएनए कुल आरएनए में 1-5% बहुतायत के लिए जिम्मेदार हो सकता है। उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए के 10 μg का एक एलिकोट, डाउनस्ट्रीम बाइसल्फाइट रूपांतरण के लिए 100-500 एनजी रेंज में उच्च गुणवत्ता वाले पॉली (ए) समृद्ध आरएनए प्रदान करना चाहिए।
    3. इस बीच, ओलिगो (डीटी) मोतियों को पूरी तरह से निलंबित करें। मोती निलंबन की आवश्यक मात्रा को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, फिर चुंबक पर 3 मिनट के लिए रखें जब तक कि चुंबकीय मोती गोली न बना लें।
      नोट: कुल आरएनए इनपुट के 10 μg के लिए 50 μL ऑलिगो (dT) मोतियों का उपयोग करें। इस चरण में मोतियों की मात्रा को उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं के आधार पर और अनुकूलित किया जा सकता है।
    4. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और लाइसिस बफर के समान मात्रा (चरण 1.1.3 में उपयोग किए जाने वाले मोती निलंबन की मात्रा) के साथ ऑलिगो (डीटी) मोतियों को फिर से निलंबित करें और सतह पर तैरने से पहले 3 मिनट के लिए चुंबक पर रखें।
      नोट: मोतियों को अधिक न सुखाएं; उपयोगकर्ता को जल्दी से चरण 1.2.1 पर आगे बढ़ना चाहिए।
  2. शुद्धिकरण का पहला दौर
    1. आरएनए नमूना ट्यूब (वॉल्यूम अनुपात 4: 1) में लाइसिस बफर जोड़ें और ऑलिगो (डीटी) मोतियों में स्थानांतरित करने से पहले अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: यदि आरएनए नमूना मात्रा 20 μL है, तो लाइसिस बफर के 80 μL जोड़ें।
    2. आरएनए को फिर से निलंबित करें: कम से कम 10x पाइप िंग करके लाइसिस बफर मिक्स और ओलिगो (डीटी) मोतियों को पूरी तरह से निलंबित करें।
    3. नमूने को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए निरंतर रोटेशन के साथ इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
    4. नमूने को चुंबक पर 5 मिनट के लिए रखें या जब तक कि सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट न हो; सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    5. मोतियों में वॉश बफर 1 के 600 μL जोड़ें और मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए सावधानीपूर्वक मिलाएं।
    6. ट्यूब को चुंबक पर 5 मिनट के लिए रखें या जब तक कि सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट न हो जाए, सतह पर तैरने वाला को छोड़ दें, और एक बार धोने के चरण 1.2.5 को दोहराएं।
    7. वॉश बफर 2 के 300 μL जोड़कर मोतियों को धोएं, और धीरे से मोतियों को फिर से निलंबित करें।
    8. ट्यूब को चुंबक पर 5 मिनट के लिए रखें या जब तक कि सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट न हो जाए, सतह पर तैरने वाला को छोड़ दें, और एक बार धोने के चरण 1.2.7 को दोहराएं।
    9. नमूना ट्यूब में 30 μL ठंडा 10 mM Tris-HCl (क्षालन बफर) जोड़ें और 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    10. ट्यूब को जल्दी से चुंबक पर स्थानांतरित करें, और जब 20 सेकंड या उससे अधिक के बाद निलंबन स्पष्ट हो, तो नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इल्यूटेड पॉली (ए) समृद्ध आरएनए युक्त सुपरनैटेंट को स्थानांतरित करें।
  3. शुद्धिकरण का दूसरा दौर
    1. 120 μL (इल्यूटेड नमूने की मात्रा का 4 गुना) लाइसिस बफर को इल्यूटेड आरएनए नमूने में जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. शुद्धिकरण के पहले दौर में उपयोग किए जाने वाले मोतियों को चरण 1.1.4 के समान मात्रा में लाइसिस बफर के साथ धोएं, मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए 10x पिपेट करें, और फिर उन्हें सतह पर तैरने से पहले 5 मिनट के लिए चुंबक पर रखें।
    3. आरएनए: लाइसिस बफर मिश्रण को धुले हुए मोतियों में स्थानांतरित करें और कम से कम 10 x को पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं।
    4. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए निरंतर रोटेशन के साथ नमूने को इनक्यूबेट करें।
    5. नमक और अन्य आरएनए उपप्रकारों को हटाने के लिए चरण 1.2.4 से 1.2.8 दोहराएं।
      नोट: वॉशिंग बफर की मात्रा वॉश बफर 1 के 300 μL और वॉश बफर 2 के 150 μL तक कम की जा सकती है।
    6. नमूना ट्यूब में ठंडे 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल (क्षालन बफर) के 25 μL (वांछित मात्रा) जोड़ें और 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    7. ट्यूब को जल्दी से चुंबक पर स्थानांतरित करें, और जब 20 सेकंड या उससे अधिक के बाद निलंबन स्पष्ट हो, तो सतह पर तैरनेवाला को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    8. आरएनए उच्च-संवेदनशीलता परख का उपयोग करके आरएनए मात्रा और गुणवत्ता के गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए 2.2 μL को 8-स्ट्रिप ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    9. नमूने को छोटी अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस और लंबी अवधि के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: यह प्रोटोकॉल में एक विराम बिंदु हो सकता है।

2. बाइसल्फाइट रूपांतरण

नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन चरण सभी कमरे के तापमान पर किए गए थे। प्रक्रियाओं को अनिवार्य रूप से निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया जाता है, लेकिन बाइसल्फाइट प्रतिक्रिया चरण 2.3 से पहले स्पाइक-इन कंट्रोल एमआरएनए अनुक्रम (ओं) को जोड़ने के लिए एक अतिरिक्त चरण 2.2 के साथ।

  1. शुद्ध पॉली (ए) समृद्ध आरएनए नमूने के 19 μL को 0.2 एमएल 8-स्ट्रिप ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. चरण 2.1 के आरएनए नमूने में 1.0 μL स्पाइक-इन नियंत्रण जोड़ें, जो पूर्व निर्धारित 1: 10,000 मात्रा अनुपात (यानी, लूसिफेरस एमआरएनए का 0.1 एनजी: शुद्ध पॉली (ए) समृद्ध आरएनए का 1 μg) पर किसी भी संशोधन से मुक्त है।
    नोट: स्पाइक-इन नियंत्रण अनुक्रम जुगनू लूसिफेरस आरएनए, रेनिला लूसिफेरस या इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड आरएनए अनुक्रम हो सकता है जिसमें कोई मिथाइलेटेड साइटोसिन नहीं होता है।
  3. ट्यूब में रूपांतरण रीजेंट के 130 μL जोड़ें और पूरी तरह से मिश्रण के लिए कई बार धीरे से इनवर्ट करें।
  4. ट्यूब को पीसीआर मशीन में रखें और 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग के तीन चक्र करें, इसके बाद 45 मिनट के लिए 64 डिग्री सेल्सियस पर इंक्यूबेट करें और फिर 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने के लिए अंतिम चरण करें।
  5. कॉलम को संग्रह ट्यूब पर रखें और कॉलम में आरएनए बाइंडिंग बफर के 250 μL स्थानांतरित करें।
  6. चरण 2.4 से नमूने को चरण 2.5 से कॉलम में स्थानांतरित करें और अच्छी तरह से पाइप करें।
  7. कॉलम में 95-100% इथेनॉल के 400 μL जोड़ें, जल्दी से कैप बंद करें, और कई बार इनवर्ट करें।
  8. 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए 10,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और प्रवाह को छोड़ दें।
  9. कॉलम में आरएनए वॉश बफर के 200 μL जोड़ें।
  10. 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए 10,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और प्रवाह को छोड़ दें।
  11. 200 μL डिसल्फोनेशन बफर जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  12. 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए 10,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और प्रवाह को छोड़ दें।
  13. 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए 10,000 × ग्राम पर 400 μL आरएनए वॉश बफर और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें और प्रवाह को छोड़ दें। इस चरण को एक बार दोहराएं।
  14. अवशिष्ट वॉश बफर को पूरी तरह से हटाने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: क्षालन से पहले 2 मिनट के लिए अन्य सेंट्रीफ्यूजेशन चरण 2.14 वॉश बफर को पूरी तरह से हटाना है। बाइसल्फाइट अभिकर्मक से उच्च नमक घटक को धोने के लिए धोने का चरण दो बार किया जाता है और कॉलम पर डीसल्फोनेशन बफर।
  15. कॉलम को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  16. कॉलम में न्यूक्लियस-मुक्त एच2ओ के 20-30 μL जोड़ें और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े रहें।
  17. सेंट्रीफ्यूज 10,000 × ग्राम पर 30 सेकंड के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर।
  18. आरएनए मात्रा और गुणवत्ता के मूल्यांकन के लिए 2.2 μL को 8-स्ट्रिप ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  19. बिसल्फाइट-उपचारित आरएनए नमूने को छोटी अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस और लंबी अवधि के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: यह प्रोटोकॉल में एक विराम बिंदु हो सकता है।

3. बिसल्फाइट-उपचारित एमआरएनए लाइब्रेरी तैयार करना।

नोट: शुद्ध एमआरएनए या आरआरएनए-क्षीण आरएनए के साथ उपयोग के लिए पुस्तकालय तैयारी निर्देश प्रोटोकॉल खंड 4 का पालन करें। पहला प्राइमिंग चरण एफएफपीई आरएनए प्रोटोकॉल का पालन करना चाहिए क्योंकि बिसल्फाइट उपचार आरएनए को विभाजित करता है। लामिनर प्रवाह हुड में हर चरण का प्रदर्शन करें और बर्फ-ठंडा शीतलन रैक पर प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें।

  1. इनपुट आरएनए को भड़काना
    1. कुल 5 μL में बिसल्फाइट-उपचारित एमआरएनए नमूने की वांछित मात्रा को स्थानांतरित करें या कुल 5 μL बनाने के लिए न्यूक्लियस-मुक्त H2O जोड़ें।
      नोट: इस प्रकार की आरएनए लाइब्रेरी तैयारी के लिए इनपुट के रूप में न्यूनतम 10 एनजी बिसल्फाइट-उपचारित एमआरएनए की सिफारिश की जाती है और 4एनएम लाइब्रेरी उत्पाद की अंतिम मोलरिटी उत्पन्न करने के लिए।
    2. नमूने में रैंडम प्राइमर (लिलैक) के 1 μL जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
    3. नमूना ट्यूब को पीसीआर मशीन में 65 डिग्री सेल्सियस पर प्रीसेट करें और 5 मिनट के लिए 105 डिग्री सेल्सियस पर ढक्कन रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. प्रथम-स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण;
    1. नमूने में 4 μL संश्लेषण प्रतिक्रिया बफर (लिलैक), स्ट्रैंड विशिष्टता अभिकर्मक (भूरा) का 8 μL, और संश्लेषण एंजाइम मिश्रण (भूरा) का 2 μL जोड़ें, जो 20 μL की कुल मात्रा बनाता है। कम से कम 10x पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं और जल्दी से नीचे घुमाएं।
    2. पीसीआर मशीन में नमूना ट्यूब को 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, 50 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: 200 से अधिक आधारों को सम्मिलित करने के लिए, 50 मिनट की 42 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन अवधि का सुझाव दिया जाता है; 200 बेस से नीचे के आकार को सम्मिलित करने के लिए, 15 मिनट की 42 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन अवधि का सुझाव दिया जाता है।
  3. दूसरा-स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण।
    1. DUTP मिश्रण (नारंगी), 4 μL संश्लेषण एंजाइम मिश्रण (नारंगी), और 48 μL न्यूक्लियस-मुक्त H2O के साथ संश्लेषण प्रतिक्रिया बफर के 8 μL जोड़ें।
    2. नमूना ट्यूब को पीसीआर मशीन में 1 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर ढक्कन बंद या ≤40 डिग्री सेल्सियस के साथ रखें।
  4. डीएनए शुद्धिकरण मोतियों के साथ डबल-फंसे हुए सीडीएनए का शुद्धिकरण।
    1. मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए शुद्धिकरण और भंवर का संचालन करने से पहले डीएनए शुद्धिकरण मोतियों को 30 मिनट पहले गर्म करें।
    2. चरण 3.3.2 से सीडीएनए नमूने में पुन: निलंबित डीएनए शुद्धि मोती के 144 μL जोड़ें और कम से कम 10x पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।
    3. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    4. नमूना ट्यूब को 5 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर रखें जब तक कि घोल स्पष्ट न हो जाए और फिर, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और डीएनए युक्त मोतियों को रखें।
    5. चुंबकीय रैक पर नमूना रखते हुए ट्यूब में 200 μL ताजा बनाए गए 80% इथेनॉल जोड़ें और 30 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    6. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और चरण 3.4.5 को एक बार दोहराएं, लेकिन इस बार सभी अवशिष्ट सतह पर तैरनेवाला को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    7. चुंबक पर नमूना रखते हुए मोतियों को 1-5 मिनट के लिए हवा में सुखाएं।
      नोट: मोतियों को अधिक न सुखाएं; रंग गहरा भूरा होना चाहिए।
    8. चुंबकीय रैक से नमूना निकालें और मोतियों में 0.1x TE (10 mM Tris-HCl और 1 mM EDTA, pH 8.0) बफर के 53 μL जोड़कर डीएनए को अलग करें। कम से कम 10x पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    9. ट्यूब को चुंबकीय रैक पर 5 मिनट के लिए रखें या जब तक समाधान स्पष्ट न हो जाए।
    10. डबल-स्ट्रैंडेड सीडीएनए युक्त सतह पर तैरनेवाले के 50 μL को एक नई 8-स्ट्रिप ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: प्रोटोकॉल को इस बिंदु पर रोका जा सकता है और नमूना -30 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. सीडीएनए लाइब्रेरी की अंतिम तैयारी
    1. 7 μL एंड-पॉलिशिंग रिएक्शन बफर (हरा) और एंड-पॉलिशिंग एंजाइम मिक्स (हरा) के 3 μL को इल्यूटेड डबल-स्ट्रैंडेड सीडीएनए नमूने में जोड़ें।
    2. बुलबुले बनाने के बिना 50 μL वॉल्यूम सेटिंग के साथ 10x पाइपकर मिश्रण को मिलाएं, फिर जल्दी से नमूने को स्पिन करें।
    3. नमूने को पीसीआर मशीन में रखें और 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  6. एडाप्टर बंधाव
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एडाप्टर (लाल) को पतला करें।
    2. नमूने में पतला एडाप्टर का 2.5 μL, लिगेशन एन्हांसर का 1 μL (लाल), और 30 μL लिगेशन मास्टर मिक्स (लाल) जोड़ें।
    3. बुलबुले बनाने के बिना 80 μL वॉल्यूम सेटिंग के साथ 10x पाइपकर मिश्रण को मिलाएं, फिर जल्दी से नमूने को स्पिन करें।
    4. नमूने को पीसीआर मशीन में रखें और 15 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. यूरैसिल डीएनए ग्लाइकोसिलेज और डीएनए ग्लाइकोसिलेज-लाइज़ एंडोन्यूक्लिज़ VIII (नीला) के मिश्रण के 3 μL को नमूने और पिपेट में अच्छी तरह से जोड़ें।
    6. पीसीआर मशीन में नमूना वापस रखें और ढक्कन को 75 डिग्री सेल्सियस पर सेट करने के साथ 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. बंधाव प्रतिक्रिया के शुद्धिकरण ने सीडीएनए का इलाज किया।
    नोट: एसपीआरआईसिलेक्ट बीड्स के साथ आकार चयन, या वैकल्पिक रूप से एएमप्योर एक्सपी बीड्स के साथ दोनों का उपयोगइस उद्देश्य के लिए किया जा सकता है।
    1. शुद्धिकरण और भंवर का संचालन करने से पहले मोतियों को 30 मिनट पहले गर्म करें ताकि उन्हें फिर से निलंबित किया जा सके।
    2. चरण 3.6.6 से सीडीएनए नमूने में 25 μL पुन: निलंबित मोतियों को स्थानांतरित करें और कम से कम 10x को पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं।
    3. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    4. नमूना ट्यूब को 5 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर रखें जब तक कि समाधान स्पष्ट न हो जाए और फिर सतह पर तैरनेवाला को एक नई 8-स्ट्रिप ट्यूब में स्थानांतरित करें और मोतियों को छोड़ दें।
    5. सतह पर तैरनेवाले में 10 μL पुन: निलंबित मोती जोड़ें और कम से कम 10x पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं।
    6. नमूना ट्यूब को 5 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर रखें जब तक कि घोल स्पष्ट न हो जाए और फिर सतह पर तैरने वाला को छोड़ दें और मोतियों को परेशान न करें।
    7. चुंबकीय रैक पर नमूना रखते हुए ट्यूब में 200 μL ताजा बनाए गए 80% इथेनॉल जोड़ें और 30 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    8. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और चरण 3.7.7 को एक बार दोहराएं, लेकिन इस बार सभी अवशिष्ट सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    9. चुंबक पर नमूना रखते हुए मोतियों को 1-5 मिनट के लिए हवा में सुखाएं।
      नोट: मोतियों को अधिक न सुखाएं; रंग गहरा भूरा होना चाहिए।
    10. चुंबकीय रैक से नमूना निकालें और मोतियों में 0.1x टीई बफर के 17 μL जोड़कर डीएनए को अलग करें। कम से कम 10x पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    11. ट्यूब को चुंबकीय रैक पर 5 मिनट के लिए रखें जब तक कि घोल स्पष्ट न हो जाए।
    12. सुपरनैटेंट के 15 μL को स्थानांतरित करें, जिसमें लक्ष्य अंत-तैयार डीएसडीएनए को एक नई 8-स्ट्रिप ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है।
  8. एडाप्टर-लिगेटेड डीएनए का पीसीआर संवर्धन
    1. एडाप्टर-लिगेटेड डीएनए नमूने में मास्टर मिक्स (नीला) के 25 μL, 5 'एडाप्टर प्राइमर के 5 μL, और 3' एडाप्टर प्राइमर के 5 μL जोड़ें। कम से कम 10x पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं।
    2. पीसीआर मशीन में नमूना रखें और निम्नलिखित चरणों का उपयोग करके पीसीआर प्रवर्धन करें: (1) 30 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, (2) 10 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, (3) 75 सेकंड के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, (4) 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, और (5) 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़; जिसमें चरण (2) और (3) को एन + 2 चक्र संख्या के लिए दोहराया जाना चाहिए जहां एन निर्देश पुस्तिका में आरएनए इनपुट मात्रा के बराबर है। इसका मतलब है कि चरण 3.7 में किए गए नमूनों के डबल-साइड आकार चयन के कारण 2 अतिरिक्त चक्रों की आवश्यकता है।
      नोट: उदाहरण के लिए, पीसीआर के 9-10 चक्रों के साथ शुद्ध एमआरएनए इनपुट के 8 एनजी की सिफारिश की जाएगी; लेकिन चरण 3.7 में डबल-साइड, आकार-चयनित, लिगेटेड सीडीएनए के साथ, अनुशंसित पीसीआर चक्र 11-12 चक्र होगा।
  9. पीसीआर-प्रवर्धित पुस्तकालयों का शुद्धिकरण
    1. मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए शुद्धिकरण और भंवर का संचालन करने से पहले 30 मिनट के लिए डीएनए शुद्धिकरण मोतियों को गर्म करें।
    2. चरण 3.8.2 से पीसीआर उत्पाद में पुन: निलंबित मोतियों के 45 μL (0.9x) स्थानांतरित करें और कम से कम 10x पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।
    3. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    4. नमूना ट्यूब को 5 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर रखें जब तक कि घोल स्पष्ट न हो जाए और फिर सतह पर तैरने वाला को हटा दें और डीएनए युक्त मोतियों को रखें।
    5. मोतियों के साथ ट्यूब में ताजा बने 80% इथेनॉल के 200 μL जोड़ें, नमूना को चुंबकीय रैक पर छोड़ दें और इसे 30 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर खड़े होने दें।
    6. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और चरण 3.9.5 को एक बार दोहराएं, लेकिन इस बार सभी अवशिष्ट सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    7. चुंबक पर नमूना रखते हुए मोतियों को 1-5 मिनट के लिए हवा में सुखाएं।
      नोट: मोतियों को अधिक न सुखाएं; रंग गहरा भूरा होना चाहिए।
    8. चुंबकीय रैक से नमूना लें और डीएनए को अलग करने के लिए मोतियों में 0.1 x टीई बफर के 22 μL जोड़ें। कम से कम 10x पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    9. ट्यूब को चुंबकीय रैक पर रखें और इसे 5 मिनट तक खड़े रहने दें या जब तक समाधान कमरे के तापमान पर स्पष्ट न हो जाए।
    10. सुपरनैटेंट के 20 μL को एक नई 8-स्ट्रिप ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    11. पुस्तकालय की मात्रा और गुणवत्ता के गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए 2.2 μL को 8-स्ट्रिप ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
      नोट: पुस्तकालय की मात्रा का पता क्यूपीसीआर द्वारा भी लगाया जा सकता है (सामग्री की तालिका देखें)।
    12. बीएसआरएनए-सेक लाइब्रेरी नमूना -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

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Representative Results

सेल लाइनों19 से बीएसआरएनए-सेक पुस्तकालयों की एक श्रृंखला इस रिपोर्ट (चित्रा 1) में प्रक्रियाओं का पालन करके उत्पन्न की गई थी। सेल लाइन नमूनों पर किए गए DNase उपचार के साथ कुल आरएनए शुद्धिकरण और जेल वैद्युतकणसंचलन और UV-Vis स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री (A260/A280) द्वारा जांचकी गई गुणवत्ता के बाद, आरएनए नमूना पॉली (ए) आरएनए संवर्धन के लिए आगे बढ़ सकता है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या डबल शुद्धि राइबोसोमल आरएनए के बहुमत को हटा सकती है, पॉली (ए) आरएनए की शुद्धि दक्षता का मूल्यांकन केशिका वैद्युतकणसंचलन कुल आरएनए परख द्वारा किया गया था जो स्वचालित रूप से आरआरएनए संदूषण प्रतिशत (चित्रा 2) की गणना कर सकता है। आरएनए टुकड़ा पीक पैटर्न और आरआरएनए संदूषण प्रतिशत से, दो बार शुद्धिकरण वाले आरएनए नमूनों ने वास्तव में राइबोसोमल आरएनए के संदूषण को क्रमशः एएसपीसी -1 और बीएक्सपीसी -3 में 6.5% से 2.2% और 2.6% से 1.1% तक कम कर दिया। मानव अग्नाशय ी कैंसर सेल लाइनों के साथ, मोती शुद्धिकरण के दो दौर कुल आरएनए नमूनों से औसतन 2.8 ± 1% पॉली (ए) समृद्ध आरएनए बहुतायत तक पहुंच सकते हैं। इसलिए, डबल शुद्धिकरण चरणों के साथ ऑलिगो (डीटी) मोतियों द्वारा पॉली (ए) आरएनए संवर्धन ने राइबोसोमल आरएनए को कम कर दिया और डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए एक व्यवहार्य एमआरएनए नमूना संवर्धन का प्रतिनिधित्व करता है।

आरएनए 5-मिथाइलसाइटोसिन संशोधन (तालिका 1) पर कई अध्ययनों में बिसल्फाइट रूपांतरण प्रोटोकॉल की सूचना दी गई थी। बाइसल्फाइट प्रतिक्रिया को उपयोगकर्ता-पुनर्गठित प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ किया जा सकता है जिसमें 40% सोडियम बाइसल्फाइट और 600 एमएम हाइड्रोक्विनोन शामिल हैं, जलीय घोल (पीएच 5.1) में जलीय घोल (पीएच 5.1) में 4 घंटे10,20,21 के लिए। वैकल्पिक रूप से, आरएनए नमूने का एक अधिक कठोर बाइसल्फाइट उपचार भी एक वाणिज्यिक किट के साथ किया जा सकता है; जो दूसरों और हमारे 6,22,23,24 के कई अध्ययनों में बिसल्फाइट प्रतिक्रिया समय को तीन इनक्यूबेशन चक्रों तक बढ़ा ता है। चूंकि तीन-चक्र इनक्यूबेशन चरण कुशलतासे इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड और संरचनात्मक रूप से अधिक मुड़े हुए एस्चेरिचिया कोलाई 16 एस आरआरएनए सेगमेंट8 में अनमेथिलेटेड साइटोसिन को परिवर्तित करता है, इसलिए इस प्रोटोकॉल में तीन-चक्र इनक्यूबेशन चरण भी लागू किया गया था।

दो बार पॉली (ए) संवर्धन और तीन-चक्र बाइसल्फाइट रूपांतरण के साथ, प्रतिक्रिया से पहले और बाद में आरएनए गुणवत्ता का मूल्यांकन केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा किया गया था। बिसल्फाइट उपचार के बाद आरएनए आकार वितरण ने बिसल्फाइट प्रतिक्रिया (चित्रा 3) के कारण विखंडन के कारण ~ 200-500 न्यूक्लियोटाइड का शिखर दिखाया। इसके अतिरिक्त, खंडित बीएसआरएनए एक और विखंडन चरण का संचालन करने की आवश्यकता के बिना पुस्तकालय की तैयारी के लिए आदर्श है। एडाप्टर-लिगेटेड डीएनए के अंतिम पीसीआर प्रवर्धन में 9 से 11 चक्रों का उपयोग करके इस प्रोटोकॉल के अनुसार पुस्तकालय के निर्माण के लिए इनपुट के रूप में बीएसआरएनए के कुल 8-10 एनजी का उपयोग किया गया था। एम्प्लिकॉन के केशिका वैद्युतकणसंचलन ने काफी सफल पुस्तकालय तैयारी दिखाई, जिसमें प्राइमर का केवल एक छोटा सा हिस्सा शेष था और अति-प्रवर्धन का कोई शिखर नहीं था (चित्रा 4)। प्रत्येक नमूना पुस्तकालय में रूपांतरण दक्षता की जांच करने के लिए, बाइसल्फाइट उपचार करने से पहले स्पाइक-इन नियंत्रण अनुक्रम के रूप में अनमेथिलेटेड जुगनू लुसिफेरस आरएनए को नमूने में जोड़ा गया था। मेरांटके टूल किट25 का उपयोग करके संदर्भ अनुक्रम के साथ संरेखित अनुक्रमण के बाद, कुल रीडिंग के 2,440 (0.006%) का औसत स्पाइक-इन अनुक्रम में मैप किया गया था, और कुल विश्लेषण किए गए सी-टू-टी रूपांतरण दर औसतन 99.81% तक पहुंच गई; स्थिति एकीकृत जीनोमिक्स व्यूअर (चित्रा 5) में देखी जा सकती है।

Figure 1
चित्र 1: बाइसल्फाइट एमआरएनए अनुक्रमण का वर्कफ़्लो आरेख। पाइपलाइन में तीन मुख्य प्रोटोकॉल शामिल हैं, जिनमें एमआरएनए संवर्धन, बाइसल्फाइट रूपांतरण और पुस्तकालय की तैयारी शामिल है। संक्षिप्त नाम: बीएसआरएनए = बिसल्फाइट एमआरएनए; क्यूसी। = गुणवत्ता नियंत्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: केशिका वैद्युतकणसंचलन के साथ पॉली (ए) -समृद्ध आरएनए नमूनों के गुणवत्ता नियंत्रण परिणाम। (ए) बीएक्सपीसी -3 कोशिकाओं से कुल आरएनए का प्रतिनिधि केशिका वैद्युतकणसंचलन प्रोफाइल। (बी ) एएसपीसी -1 और बीएक्सपीसी -3 कोशिकाओं से ऑलिगो (डीटी) शुद्धिकरण के साथ संसाधित नमूनों के प्रतिनिधि केशिका वैद्युतकणसंचलन प्रोफाइल। एमआरएनए ई 1, एक बार शुद्धिकरण से एमआरएनए क्षालन; एमआरएनए ई 2, एमआरएनए क्षालन दो बार शुद्धिकरण से। आरआरएनए संदूषण अनुमानों की गणना वैद्युतकणसंचलन ऑपरेशन सिस्टम द्वारा की गई थी जो कुल आरएनए विश्लेषण परख को नियंत्रित करती है। (सी) लैडर मार्करों के केशिका वैद्युतकणसंचलन प्रोफाइल को पैनल बी में प्रस्तुत नमूनों के साथ उसी रन में प्राप्त किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा आरएनए नमूनों का गुणवत्ता मूल्यांकन। (ए ) कुल आरएनए के प्रतिनिधि केशिका वैद्युतकणसंचलन प्रोफाइल, (बी) पॉली (ए ) -समृद्ध एमआरएनए दो गुना शुद्धिकरण से, और (सी) बीएक्सपीसी -3 कोशिकाओं से बिसल्फाइट-उपचारित एमआरएनए। संक्षेप: B_empty = बीएक्सपीसी -3 कोशिकाओं को खाली वेक्टर के साथ ट्रांसड्यूस किया गया; B_shScr = BxPC-3 कोशिकाओं को स्क्रैम्बल अनुक्रमों के साथ ट्रांसड्यूस किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: बीएसआरएनए-सेक पुस्तकालयों का गुणवत्ता मूल्यांकन। (A-C) निर्मित बीएसआरएनए-सेक पुस्तकालयों के प्रतिनिधि केशिका वैद्युतकणसंचलन प्रोफाइल के तीन सेट पीसीआर द्वारा बीएक्सपीसी -3 कोशिकाओं के एक सेट से बीएसआरएनए का उपयोग करके 9 और 11 चक्रों की विभिन्न पीसीआर चक्र संख्याओं पर प्रवर्धित किए गए। बिसल्फाइट-उपचारित आरएनए की अनुमानित इनपुट मात्रा एक उच्च-संवेदनशीलता आरएनए परिमाणीकरण परख द्वारा निर्धारित की गई थी। (ए ) बीएक्सपीसी -3 मॉक, ( बी) बीएक्सपीसी -3 खाली और (सी) बीएक्सपीसी -3 एसएचएन 2 यूएन 2 नमूनों में क्रमशः कुल 8, 8.4, और 9.6 एनजी बीएसआरएनए का उपयोग किया गया था। सीढ़ी मार्कर 35 बीपी और 10,380 बीपी पर चोटियां प्रत्येक नमूने के वैद्युतकणसंचलन प्रोफ़ाइल में निचली और ऊपरी-सीमा के आंतरिक मानकों का प्रतिनिधित्व करती हैं। क्रमशः लगभग 100 बीपी का एक प्रमुख शिखर और लगभग 127 बीपी का एक अस्पष्ट शिखर, पीसीआर प्राइमरों (<100 बीपी) और एडाप्टर-डिमर (~ 127 बीपी) को इंगित करता है, जो पीसीआर सफाई के बाद एलुएट में बने रहे। संक्षेप: BxPC-3 मॉक = अनट्रांसड्यूस्ड BxPC-3 कोशिकाएं; BxPC-3 खाली = BxPC-3 कोशिकाओं को खाली वेक्टर नियंत्रण के साथ ट्रांसड्यूस किया गया; BxPC-3 shN2UN2 = BxPC-3 कोशिकाओं को shNSUN2 संरचनाओं के साथ ट्रांसड्यूस किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: प्रत्येक बीएसआरएनए-सेक लाइब्रेरी के अनुक्रम संरेखण प्रोफाइल को स्पाइक-इन-कंट्रोल संदर्भ अनुक्रम में मैप किया गया है। बीएक्सपीसी -3 मॉक, खाली, स्क्रैम्बल, और एसएचएनएसयूएन 2 बीएसआरएनए-सेक पुस्तकालयों के प्रतिनिधि संरेखण प्रोफाइल जुगनू लूसिफेरस स्पाइक-इन कंट्रोल संदर्भ अनुक्रम ("जेड" जीन के रूप में इंगित); 2 प्रतिनिधि क्षेत्र दिखाए गए थे। ग्रे बार उन सभी पाठों को इंगित करते हैं जो संदर्भ अनुक्रम के संकेतित आधार स्थिति पर आम सहमति न्यूक्लियोटाइड से मेल खाते हैं। लाल सलाखों ने रीड की आधार स्थिति पर थाइमिडीन (टी) पहचान को उजागर किया; नीली पट्टियां उन लोगों को इंगित करती हैं जिनके पास स्थिति में साइटोसिन (सी) पहचान होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: बाइसल्फाइट प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल और रूपांतरण दर की तुलना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, मानकीकृत घटकों का उपयोग करके पॉली (ए) संवर्धन, बाइसल्फाइट रूपांतरण और पुस्तकालय तैयारी की एक विस्तृत पाइपलाइन हासिल की गई थी। आगे के अनुक्रमण विश्लेषण ने रुचि के नमूनों में एमआरएनए 5-मिथाइलसाइटोसिन की पहचान प्रदान की।

महत्वपूर्ण कदम सामग्री-कुल आरएनए शुरू करने की गुणवत्ता है- क्योंकि आरएनए का क्षरण पॉली (ए) आरएनए शुद्धिकरण की वसूली दर को प्रभावित करेगा। पॉली (ए) आरएनए शुद्धिकरण चरण का संचालन करने से पहले नमूने को सावधानीपूर्वक संभाला जाना चाहिए और आरएनएस संदूषण से बचा जाना चाहिए। प्रक्रिया का एक और महत्वपूर्ण हिस्सा पुस्तकालय की तैयारी में पीसीआर चक्रों की संख्या है। चक्र संख्या का निर्णय पुस्तकालय की तैयारी के लिए उपयोग किए जाने वाले बिसल्फाइट-उपचारित एमआरएनए की मात्रा पर निर्भर करता है और क्या पीसीआर से पहले चरण में एक आकार चयन या दोहरे आकार चयन का उपयोग किया जाता है। रुचि के नमूने के लिए उपयुक्त चक्र संख्याओं को इस प्रकार एक परीक्षण चलाने की आवश्यकता होगी और एक ही सेल लाइन या ऊतक के लिए इष्टतम चक्र संख्या निर्धारित करने के लिए केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पाद आकार वितरण का आकलन करना होगा।

इस प्रोटोकॉल में, पॉली (ए) आरएनए को समृद्ध और शुद्ध करने के लिए ऑलिगो (डीटी) मोती शुद्धिकरण के दो दौर का उपयोग किया गया था और राइबोसोमल आरएनए और अन्य आरएनए के बहुमत को समाप्त कर दिया गया था। राइबोसोमल आरएनए को हटाने और नमूने में अन्य आरएनए प्रकारों को रखने के अन्य तरीके हैं, जैसे कि आरआरएनए26 की ऑलिगो-आधारित कमी। फिर, अन्य आरएनए प्रकारों में मौजूद 5-मिथाइलसाइटोसिन संशोधन को भी विश्लेषण में लिया जा सकता है और एमआरएनए और अन्य आरएनए में 5-मिथाइलसाइटोसिन विशेषताओं की समझ का विस्तार किया जा सकता है।

बिसल्फाइट प्रतिक्रिया को अन्य संशोधनों से एम 5 सी को अलग करनेमें सक्षम नहीं होने के लिए जाना जाता है, जिसमें 5-हाइड्रॉक्सीमिथाइलसाइटोसिन (एचएम5सी), 3-मिथाइलसाइटिडीन (एम3सी), और एन 4-मिथाइलसाइटिडीन (एम4सी) 27 शामिल हैं। हालांकि, एम 5 सी आरएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ वध या नॉकआउट सहित प्रयोगात्मक डिजाइन को उच्च आत्मविश्वास विनियमित एम5सी साइटों केसूचनात्मक सबूत प्रदान करना चाहिए। इसके अतिरिक्त, अनुक्रमण या पीसीआर या एलसी-एमएस / एमएस-आधारित विधियों के बाद एंटीबॉडी-आधारित संवर्धन जैसे विभिन्न तरीकों का उपयोग करके सत्यापन अनिवार्य रूप से उम्मीदवार एम5सी साइटों16 को प्रमाणित कर सकता है। प्रत्यक्ष नैनोपोर आरएनए अनुक्रमण की उभरती हुई तकनीक वर्तमान सिग्नल या बेस-तथाकथित 'त्रुटि' सुविधाओं के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के माध्यम से आरएनए संशोधन की संभावित पहचान भी प्रदान करती है।

जॉनसन एट अल द्वारा हाल ही में किए गए एक अध्ययन से पता चला है कि बाइसल्फाइट रूपांतरण के तीन दौर के बाद माइटोकॉन्ड्रिया आरएनए नमूनों में विखंडन चरण को जोड़ने से वास्तव में उच्च रूपांतरण दर दिखाई दी और सीडीएनए लाइब्रेरी उत्पाद31 की उपज में वृद्धि हुई। इस पेपर ने विशेष रूप से रूपांतरण दर का विश्लेषण किया और माइटोकॉन्ड्रिया जीनोम में मैप की गई गुणवत्ता को पढ़ा, न कि एमआरएनए ट्रांसक्रिपटम। इसलिए, विखंडन चरण का उपयोग तालिका 1 में अपडेट किया गया है ताकि यह उजागर किया जा सके कि प्रकाशित रिपोर्टों में आरएनए विखंडन चरण शामिल है ताकि दर्शक प्रोटोकॉल को आसानी से दोहरा सकें। झांग एट अल द्वारा किए गए एक अन्य अध्ययन से पता चला है कि नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड संशोधन-मुक्त आरएनए लाइब्रेरी का उपयोग करना बाइसल्फाइट उपचार32 से गलत-सकारात्मक संकेत को खत्म करने के लिए कुशल है। हाल के अध्ययनों ने पुस्तकालय निर्माण के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न प्रोटोकॉल की तुलना कीहै। उपयोगकर्ता आगे एक अतिरिक्त विखंडन चरण के साथ या उसके बिना बीएसआरएनए-सेक पाइपलाइन का संचालन करना चुन सकता है और उपयुक्त वर्कफ़्लो को अनुकूलित करने के लिए इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड संशोधन-मुक्त आरएनए लाइब्रेरी का चयन कर सकता है।

विभिन्न सिद्धांतों द्वारा एम5सी की ट्रांसक्रिपटम-वाइड पहचान संशोधन परिदृश्य के निष्कर्षों को मजबूत कर सकती है और स्वस्थ या रोग मॉडल में आरएनए संशोधनों के नियामक तंत्र की अधिक समझ प्रदान कर सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को ताइवान के राष्ट्रीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी परिषद द्वारा समर्थित किया गया था। [एनएसटीसी 111-2314-बी-006-003]

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System Agilent, Santa Clara, CA RNA quality detection
AMpure XP beads Beckman Coulter A63881 purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-4626 DNA quality detection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-1513 RNA quality detection
DiaMag02 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000001 assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000003 assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 61011 poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol J.T.Baker 64-17-5
EZ RNA methylation kit Zymo, Irvine, CA R5002 bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA Promega, Madison, WI, USA L4561 spike in control seqeunce 
KAPA Library Quantification Kits Roche, Switzerland KK4824 library quantification
Nanodrop spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) New England Biolabs, Ipswich, MA E7335S library preparation
NEBNext Ultra Equation 1 Directional RNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs, Ipswich, MA E7760S library preparation
Nuclease-free Water Thermo Fisher Scientific AM9932
P2 pipetman Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 4641010
Qubit 2.0 fluorometer  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32854 DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32852 RNA quantity detection

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References

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Chen, S. Y., Huang, P. H. Enrichment … More

Chen, S. Y., Huang, P. H. Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (197), e65352, doi:10.3791/65352 (2023).

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