Summary
Ett normotermiskt ex vivo leverperfusionssystem (NEVLP) skapades för muslever. Detta system kräver erfarenhet av mikrokirurgi men möjliggör reproducerbara perfusionsresultat. Möjligheten att använda muslever underlättar undersökningen av molekylära vägar för att identifiera nya perfusattillsatser och möjliggör utförande av experiment med fokus på organreparation.
Abstract
Detta protokoll presenterar ett optimerat erytrocytfritt NEVLP-system med muslever. Ex vivo-konservering av muslever uppnåddes genom att använda modifierade kanyler och tekniker anpassade från konventionell kommersiell ex vivo-perfusionsutrustning. Systemet användes för att utvärdera bevaranderesultaten efter 12 timmars perfusion. C57BL/6J-möss fungerade som leverdonatorer, och levern explanterades genom kanylering av portalvenen (PV) och gallgången (BD) och därefter spolning av organet med varm (37 °C) hepariniserad saltlösning. Därefter överfördes de explanterade leverna till perfusionskammaren och utsattes för normotermisk syresatt maskinperfusion (NEVLP). Inlopps- och utloppsperfusatprover samlades in med 3 timmars intervall för perfusatanalys. Efter avslutad perfusion erhölls leverprover för histologisk analys, med morfologisk integritet bedömd med modifierad Suzuki-Score genom hematoxylin-Eosin (HE) färgning. Optimeringsexperimenten gav följande resultat: (1) möss som vägde över 30 g ansågs mer lämpliga för experimentet på grund av den större storleken på deras gallgång (BD). (2) en 2 Fr (ytterdiameter = 0,66 mm) polyuretankanyl var bättre lämpad för kanylering av portalvenen (PV) jämfört med en polypropenkanyl. Detta tillskrevs polyuretanmaterialets förbättrade grepp, vilket resulterade i minskad kateterglidning under överföringen från kroppen till organkammaren. (3) för kanylering av gallgången (BD) visade sig en 1 Fr (ytterdiameter = 0,33 mm) polyuretankanyl vara effektivare jämfört med polypropen UT - 03 (ytterdiameter = 0,30 mm) kanyl. Med detta optimerade protokoll bevarades muslever framgångsrikt under en varaktighet av 12 timmar utan signifikant inverkan på den histologiska strukturen. Hematoxylin-Eosin (HE) färgning avslöjade en välbevarad morfologisk arkitektur i levern, kännetecknad av övervägande livskraftiga hepatocyter med tydligt synliga kärnor och mild utvidgning av leverbihåleoider.
Introduction
Levertransplantation representerar guldstandardbehandlingen för personer med leversjukdom i slutstadiet. Tyvärr överstiger efterfrågan på donerade organ det tillgängliga utbudet, vilket leder till en betydande brist. År 2021 stod cirka 24 936 patienter på väntelistan för ett levertransplantat, medan endast 9 234 transplantationer framgångsrikt utfördes1. Den betydande skillnaden mellan utbud och efterfrågan på levertransplantat belyser det pressande behovet av att undersöka alternativa strategier för att bredda givarpoolen och förbättra tillgängligheten av levertransplantat. Ett sätt att utöka donatorpoolen är att använda marginella givare2. Marginella givare inkluderar de med hög ålder, måttlig eller svår steatos. Även om transplantation av marginella organ kan ge gynnsamma resultat, förblir de övergripande resultaten suboptimala. Som ett resultat pågår för närvarande utvecklingen av terapeutiska strategier som syftar till att förbättra funktionen hos marginella givare 3,4.
En av strategierna är att använda maskinperfusion, särskilt normotermisk syresatt maskinperfusion, för att förbättra funktionen hos dessa marginella organ5. Det finns dock fortfarande en begränsad förståelse för de molekylära mekanismer som ligger till grund för de fördelaktiga effekterna av normotermisk syresatt maskinperfusion (NEVLP). Möss, med sin rikliga tillgång på genetiskt modifierade stammar, fungerar som värdefulla modeller för att undersöka molekylära vägar. Till exempel har betydelsen av autofagivägar för att mildra hepatisk ischemi-reperfusionsskada alltmer erkänts 6,7. En viktig molekylär väg i leverischemi-reperfusionsskadan är miR-20b-5p / ATG7-vägen8. För närvarande finns det ett antal ATG-knockout- och villkorade knock-out-musstammar tillgängliga men inga motsvarande råttstammar9.
Baserat på denna bakgrund var målet att skapa en miniatyriserad NEVLP-plattform för levertransplantat från möss. Denna plattform skulle underlätta utforskning och utvärdering av potentiella genetiskt modifierade strategier som syftar till att förbättra funktionaliteten hos donatorns lever. Dessutom var det viktigt att systemet var lämpligt för långvarig perfusion, vilket möjliggjorde ex vivo-behandling av levern, vanligen kallad "organreparation".
Med tanke på den begränsade tillgången på relevanta in vitro-data om leverperfusion på möss fokuserade litteraturgenomgången på studier utförda på råtta. En systematisk sökning av litteratur som sträckte sig från 2010 till 2022 utfördes med hjälp av nyckelord som "normotermisk leverperfusion", "ex vivo eller in vitro" och "råttor". Denna sökning syftade till att identifiera optimala förhållanden hos gnagare, så att vi kunde bestämma det lämpligaste tillvägagångssättet.
Perfusionssystemet består av en förseglad vattenmantlad glasbuffertbehållare, en peristaltisk rullpump, en oxygenator, en bubbelfälla, en värmeväxlare, en orgelkammare och ett slutet cykelrörsystem (figur 1). Systemet säkerställer exakt underhåll av en konstant perfusionstemperatur på 37 °C med hjälp av en särskild termostatisk maskin. Den peristaltiska rullpumpen driver perfusatets flöde genom hela kretsen. Perfusionskretsen initieras vid den isolerade vattenmantlade behållaren. Därefter riktas perfusatet genom oxygenatorn, som mottar en gasblandning av 95% syre och 5% koldioxid från en dedikerad gasflaska. Efter syresättning passerar perfusatet genom bubbelfällan, varvid eventuella fångade bubblor omdirigeras tillbaka till behållaren av den peristaltiska pumpen. Det återstående perfusatet strömmar genom värmeväxlaren och går in i orgelkammaren, varifrån det återvänder till behållaren.
Här rapporterar vi våra erfarenheter av att etablera en NEVLP för muslever och delar de lovande resultaten av ett pilotexperiment utfört med det syresatta mediet utan syrebärare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök utfördes enligt gällande tyska regler och riktlinjer för djurskydd och ARRIVE-riktlinjerna för rapportering av djurförsök. Djurförsöksprotokollet godkändes av Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thüringen, Tyskland (godkännandenummer: UKJ - 17 - 106).
OBS: Möss av typen C57BL / 6J av hankön som vägde 34 ± 4 g (medelvärde ± standardfel för medelvärdet [SEM]) användes som leverdonatorer. De hölls under kontrollerade miljöförhållanden (50% luftfuktighet och 18 - 23 °C) med fri tillgång till standard mussoppa och vatten. Under hela det kirurgiska ingreppet bibehölls en andningsfrekvens som översteg 60 andetag/min och kroppstemperaturen hölls över 34 °C.
1. Förberedelse
- Ställa in operationsbordet
- Autoklav alla kirurgiska instrument och förbrukningsvaror för steriliseringsändamål.
- Slå på all utrustning, inklusive värmebrädan och elektrokoagulering.
- Placera en 50 ml spruta med 25 ml hepariniserad (2 500 E/L) saltlösning i en varm inkubator (37 °C).
- Placera de kirurgiska instrumenten, 6 - 0 silkesuturen, steril liten bomullsapplikator, veterinär saltlösning (500 ml) och non-woven gasvävsvampar (10 cm x 10 cm) på operationsbordet på lämpligt sätt.
- Placera en 26 G nål på operationsbordet för att skapa ett litet hål i locket på 0,5 ml mikrocentrifugröret för att ta emot gallröret för galluppsamling.
- Placera kanylen (1 Fr polyuretankanyl eller UT - 03 polyetenkanyl) och ett steriliserat 0,5 ml mikrocentrifugrör för galluppsamling på operationsbordet.
- Självgjord portal venkanyl
- Håll 2 Fr-kanylen med pincett och punktera väggen med en 30 G nål på 1 cm avstånd från kanylens ände. Tryck nålen genom kanylen tills nålspetsen blir synlig.
- Trimma kanylens spets vilket resulterar i en skarp triangel.
- Beredning av hepariniserad saltlösning
- Bered 25 ml hepariniserad saltlösning med en slutlig koncentration på 2 500 IE/ml.
- Ta bort alla luftbubblor och placera sprutan i 40 °C inkubatorn.
- Demonstration av perfusionssystemet
- Se figur 1 för huvudkomponenterna i maskinens perfusionssystem.
- Uppsättning av orgelkammaren
- Se figur 2 för orgelkammarens utformning.
- Uppsättning av perfusionssystemet
- Aktivera labbdiagramprogrammet för tryckövervakning.
- Anslut tryckkalibratorn och trycksensorn på orgelkammarnivå.
- Justera tryckkalibratorn så att den läser 0 mmHg och kontrollera motsvarande värde på tryckkontrollprogramvaran.
- Justera tryckkalibratorn för att läsa 20 mmHg och kontrollera igen motsvarande värde på tryckkontrollprogramvaran.
- Sätt på vattenbadet och förvärm orgelkammaren till 40 °C.
- Spola hela VVS-systemet två gånger med destillerat avjoniserat vatten i 30 minuter vardera, vilket säkerställer fullständigt avlägsnande av saneringslösningen.
- Starta cirkulationen av desinfektionslösningen i hela systemet under 20 minuter för att säkerställa grundlig desinfektion.
- Slå på gasblandningen (95% syre (O2) och 5% koldioxid (CO2).
- Perfusera fyllning
- Komplettera 250 ml Williams E-medium med 50 ml fetalt bovint serum, 3 ml penicillin / streptomycin (1 mg / ml), 0,17 ml insulin (100 IE / ml), 0,34 ml heparin (5000 U / ml) och 0,07 ml hydrokortison (100 mg / 2 ml) för att förbereda hela Williams E-medium.
- Tillsätt lika stora volymer (150 ml) perfusat till behållaren och orgelkammaren för att fylla systemet.
OBS: Särskild uppmärksamhet måste ägnas åt att upprätthålla sterilitet under fyllningsprocessen. Perfusatet pumpas ständigt genom dessa två nyckelkomponenter i den slutna återcirkulerande maskinperfusionen. - Slå på peristaltisk pump med medelhastighet (15 ml/min) för att fylla perfusionssystemet med det syresatta mediet.
2. Lever explantation
- Förberedelse före operationen
- Väg djuret. Bered det smärtstillande medlet buprenorfin (0,3 mg/ml) (0,05 mg/kg kroppsvikt).
- Anslut induktionskammaren till vägguttaget. Vrid syret till 0,5 l/min. Sänk isofluran till 3%.
- Placera djuret i kammaren tills djupbedövning (rätningsreflex positiv) uppnås.
- Använd en mikrospruta för att applicera kroppsviktsanpassad dos av analgesi subkutant.
- Använd en elektrisk rakapparat för att trimma pälsen på bukhuden.
- Överför musen till operationsbordet och slå på isofluranförångaren till 2,5% för att bibehålla anestesi. Bekräfta anestesidjupet genom att testa den interdigitala tåreflexen.
- Förberedelse av musbuken
- Placera musen i ryggläge.
- Testa interdigital reflex för att dubbelbekräfta lämpligt anestesidjup. Fixa alla fyra lemmarna med tejp.
- Desinficera båda sidor av buken till mitten av axillära linjen med tre på varandra följande omgångar jodalkohol. Använd non-woven steriliserad gasbindning för att täcka området runt det kirurgiska fältet.
- Gör ett 3 cm tvärgående snitt 1 cm under xiphoid i musens bukområde med Metzenbaum babysax och kirurgiska pincett.
- Förläng hudsnittet bilateralt till midaxillärlinjen på båda sidor.
- Gör försiktigt ett 2 cm längsgående snitt längs linea alba med en fjädersax.
- Skär igenom bukmuskelskiktet med elektrokoagulering och Vannas fjädersax.
- Placera försiktigt en bit våt gasbindning för att skydda levern från elektrokoagulering.
- Använd en 6 - 0 silkesutur med den runda nålen för att dra tillbaka xiphoidprocessen för bättre exponering av koronarbandet.
- Använd två revbensupprullare för att helt exponera musens bukhålighet.
- Flytta försiktigt tunntarmen ur bukhålan med en våt bomullspinne för att helt exponera hilum.
- Vanlig gallgångsberedning
- Transektera falciforma, freniska och gastrohepatiska ligament med vassa saxar.
- Frigör försiktigt den gemensamma gallgången med fina böjda pincett utan tänder.
OBS: Den gemensamma gallgången skadas mycket lätt och går sönder. När den går sönder kan den inte kanyleras. På grund av riktningen för den anatomiska positionen är böjda pincett bättre att använda. - Placera två 6 - 0 silkesuturslingor över den gemensamma gallgången som förberedelse för nästa steg.
- Vanlig gallgångskanylering
- Punktera försiktigt gallgången med en 30 G nål. Använd spetsiga böjda pincett för att förstora det lilla hålet så att det passar gallgångens cannulation.
- Använd kärlkanylpincett för att ta tag i gallgångskanylen och trycka in den i gallgången.
- Dubbelsäkra kanylen med de förinställda 6 - 0 suturslingorna.
OBS: Under kannulationen känns motstånd mot gallan. Om kraften inte är väl kontrollerad kommer kanylen att skjutas ut ur gallvägarna genom trycket av gallflödet. Justera kanylens djup försiktigt. Om det är för djupt kan det skada gallgången, och om det inte är tillräckligt djupt kan det glida ut. - Observera gallflödet i kanylen efter framgångsrik cannulation.
- Portal ven förberedelse
- Kläm fast portalvenen med plana pincett och frigör försiktigt bindväven med böjda pincett. Dra inte hårt för att undvika att riva av portalvenen. När portalvenen är skadad är det svårt att återuppliva portalvenen.
- Dissekera PV precis överlägsen bifurkationen och placera den första suturslingan med 6 - 0 silkesutur på PV nära sammanflödet för senare användning.
- Placera den andra suturslingan för senare fixering av PV så nära leverhilum som möjligt.
- Portal ven kanylering
- Använd ett arteriellt klipp för att stänga den distala portalvenen.
- Punktera portalvenen mycket noggrant med en av ovanstående portalvenkanyler. Blodflödet kan tydligt observeras i kanylen efter en lyckad punktering.
- Säkra solcellskanylen med den förplacerade suturslingan 6 - 0.
- Leverspolning
- Öka isofluran till 5% och avliva musen med en överdos av isofluran inhalation.
- Ta förvärmd heparin saltlösning från inkubatorn. Ta bort alla luftbubblor som bildas inuti den hepariniserade saltlösningen.
- Fäst sprutan med förvärmd hepariniserad saltlösning i sprutpumpen.
- Anslut sprutpumpens förlängningsrör till kanylen i portalvenen, justera hastigheten till 2 ml/min och starta leverspolningen.
- Observera leverns färg i slutet av spolningsproceduren. Punktskatt levern när färgen blir en homogen gul.
- Transekt membranet, suprahepatisk inferior vena cava, infra hepatisk vena cava, leverartär, distal portalven och eventuell kvarvarande bindväv.
- Lägg levern i petriskålen.
3. Lever- och kammaranslutning
- Leveröverföring
- Överför försiktigt levern till orgelkammaren med en petriskål.
- Håll en liten mängd saltlösning i petriskålen för att förhindra att levern torkar ut.
OBS: Portal ven och gallgången kan lätt vridas under denna procedur, vilket kan påverka leverperfusion och galluppsamling.
- Portal ven kanyl anslutning
- Infusera långsamt normal saltlösning i portalvenkanylen med en spruta för att evakuera luftbubblorna i kanylen.
- Anslut portalvenkanylen till perfusatutflödesröret i orgelkammaren.
- Anslutning av gallkanalkanyl
- Styr musgallgångskanylen genom ventilen på ett gummilock som är anslutet till orgelkammaren.
- Sätt in gallgångskanylen i ett förberedt 0,5 ml mikrorör med ett litet hål i locket.
- Placera mikroröret på lera utanför orgelkammaren.
4. Justera flödet enligt solcellstrycket
- Slå på peristaltikpumpen från 1 ml / min.
- Kontrollera tryckavläsningen i portalvenen för att justera flödeshastigheten.
- Håll portalventrycket i det fysiologiska området mellan 7 - 10 mmHg genom att justera flödeshastigheten.
OBS: Nominell flödeshastighet kan variera något beroende på rörens användning och placering.
5. Insamling av prover
- Skaffa inloppsperfusatprover från portalvenens inflödesrör och utloppsperfusera prover från organkammaren i 3h intervall.
- Samla prover från alla leverlober för histologisk analys vid slutet av perfusionsperioden på 12 timmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering av kirurgiskt ingrepp
Totalt 17 djur användes för detta experiment: 14 möss användes för att optimera organupphandlingsprocessen, inklusive kanylering av portalvenen (PV) och gallgången (BD), medan 3 möss användes för att validera proceduren (tabell 1). Histologiska resultat (figur 3) jämfördes för att underlätta identifieringen av det optimala perfusionstillståndet.
Urval av perfusat
Ett tidigare använt hepatocytodlingsmedium valdes för denna studie10,11. Williams E-medium designades ursprungligen av Williams och Gunn som ett serumreducerat medium för långvarig in vitro-odling av mogna leverepitelceller12. Icke desto mindre, Det har också funnit nytta i att stödja tillväxt och underhåll av gnagare hepatocyter13. Fetalt bovint serum (FBS) är ett allmänt använt cellodlingstillskott på grund av dess rika sammansättning av väsentliga näringsämnen och tillväxtfaktorer som underlättar celltillväxt, proliferation och livskraft14. Complete Williams E-medium användes som perfusat (tabell 2), som kompletteras med 20% fetalt bovint serum, 1% penicillin/streptomycin, 5 000 E/L heparin, 50 E/L insulin och 0,010 g/L hydrokortison.
Val av kanyl
Kanyleringsförfarandet innebar först kanylering av gallgången (BD) för uppsamling av gallvätska, följt av kanylering av portalvenen (PV). För BD-kannulation användes ursprungligen ett UT-03 polypropenrör med en ytterdiameter på 0,3 mm och en innerdiameter på 0,18 mm. På grund av oro för potentiella BD-skador och den högre risken för oavsiktlig kateterförskjutning i samband med den trimmade och styva UT-03-spetsen, föredrogs emellertid 1 Fr-polyuretanrören. Polyuretanrören, med sitt mjukare material och minskade halka, ansågs mer lämpade för BD-kannulation.
Ursprungligen användes en 26 G polypropen intravenös nålkanyl för kanylering av portalvenen (PV). Avlägsnandet av nålen och efterföljande fästning av kanylen till perfusionsröret resulterade emellertid i bildandet av bubblor, vilket hade potential att hindra de intrahepatiska sinusoiderna. För att lösa detta problem konstruerades en kvarliggande kanyl med hjälp av en 30 G nål införd i distala 1 cm av en 2 Fr polyuretankanyl. Denna självtillverkade "nålstyrda kanyl" sattes sedan in i det distala PV ovanför sammanflödet. Eftersom katetern placerades i PV drogs nålen långsamt ut samtidigt som röret fördes framåt. Änden av den självtillverkade kanylen var ansluten till perfusionsröret inuti kammaren. Att använda ett mjukt material i denna kanyleringsteknik gav en fördel genom att minska risken för skador på kärlets bakvägg.
Valideringsstudier
Inlopps- och utloppsperfusatprover utsattes för bestämning av pH- och kaliumnivåer. De erhållna resultaten (figur 4) jämfördes sedan med de resultat som rapporterats i de senaste publikationerna15,16,17. Tre muslever perfuserades med syresättning och kompletterades med Williams E-medium i 12 timmar. Under hela denna period registrerades ett stabilt perfusionstryck på 7 - 10 mmHg kontinuerligt. Det genomsnittliga pH-värdet var relativt stabilt under hela 12-timmarsperfusionen och varierade mellan 7,3 och 7,7. Genomsnittliga kaliumnivåer var också stabila under hela perfusionsperioden och varierade mellan 5,9 och 6,8 mmol / L (figur 4). PV-flödet bibehölls inom ett intervall på 0,8 - 1,2 ml / min / g beroende på användning och placering av pumprör under experimentprocedurerna. Alla resultat som observerats vid leverperfusion på mus visade likheter med tidigare rapporterade observationer vid leverperfusion på råtta (tabell 3).
Vävnadsprover samlades in från tre lever (N = 3) och utsattes för 12 timmars perfusion med det optimerade protokollet för HE-färgning, följt av helbildsskanning. Varje leverlob poängsattes med hjälp av en modifierad Suzuki-poäng (tabell 4). Den klassiska Suzuki-poängen18 förstärktes genom att införliva tre ytterligare parametrar: pyknos av kärnor, avlägsnande av kärl och närvaro av erytrocyter i sinusoider och stora kärl. Varje parameter graderades som frånvarande (0), mild (1), måttlig (2) och svår (3). Slutresultatet 0–7 ansågs återspegla god konservering, 8–14 togs som måttligt bevarande och 14–21 visade på dålig konservering.
Bevarandet av muslevern bedömdes baserat på den modifierade Suzuki-poängen. Två medicinska experter genomförde en oberoende bedömning av morfologin hos de sju loberna i de tre leveren (figur 5, figur 6, figur 7). Medelvärdet av de sju lobpoängen för varje leverlob beräknades; Lägre poäng indikerar en bättre bevarad lever. De utvärderingar som experterna gjorde uppvisade en hög grad av överensstämmelse. I synnerhet, medan små skillnader i poängen som tilldelats av de två experterna observerades vid bedömningen av pyknos av kärnor, påverkade dessa variationer inte de övergripande poängresultaten signifikant.
I bästa fall var leverparenkymet relativt intakt med en välbevarad typisk lobulär struktur, knappast urskiljbar från en normal lever. Hepatocyter verkade livskraftiga med tydligt synliga cellmembran och runda kärnor. Vissa kärnor genomgick emellertid pyknos, och vissa leverbihåleoider var något dilaterade, vilket resulterade i en poäng på 4. (Figur 3, figur 6)
I värsta fall förvrängdes den lobulära strukturen, med kärl fristående från parenkymet och sammanflytande parenkymal nekros. På cellulär nivå blev cellulär vakuolisering och nuklei pyknos uppenbar, särskilt i den pericentrala regionen. Vidare observerades mild till måttlig vakuolisering. Upp till 30 % av hepatocyterna genomgick nekros, vilket resulterade i en maximal poäng på 14. (Figur 3, figur 7)
Tabell 1: Steg-för-steg-etablering av en musleverperfusionsmodell. Olika komplikationer observerades under etableringsprocessen på grund av skillnader i kanylstorlek, material och positionering. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Jämförelse av organkonserveringsmetoder in vitro 15,17,19,20,21,22. Optimeringen av perfusatval, syrebärarval och jämförelse av näringskomponenter är avgörande under olika lagringsförhållanden. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Hemodynamik och blodgasanalys hos normala råttor och råtta NEVLP 11,15,16,17,18,20,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Den tillhandahållna informationen beskriver selektivt de hemodynamiska egenskaperna hos råttlever och nyckelparametrar för normotermisk perfusion in vitro. Specifikt kan råttleverperfusion anses vara optimal när PV-trycket vanligtvis varierar från 4 till 10 mmHg, och partialtrycket av syre i perfusatet som kommer in i PV sträcker sig från 80 till 550 mmHg, vilket uppfyller de nödvändiga kriterierna för framgångsrik in vitro-råtta leverperfusion. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 4: Modifierad Suzuki-poäng. Den modifierade Suzuki-poängen som används i denna studie expanderar på den klassiska Suzuki-poängen genom att införliva tre ytterligare parametrar: pyknos av kärnor, avlägsnande av kärl och närvaron av erytrocyter i sinusoider och stora kärl. Varje parameter tilldelades ett betyg på en skala av 0 (frånvarande), 1 (mild), 2 (måttlig) eller 3 (svår). Den totala poängen, som sträcker sig från 0 till 8, indikerar god bevarande; 9 till 16 föreslår måttligt bevarande och 17 till 24 indikerar dåligt bevarande. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 5: Val av perfusatmedium, perfusatvolym och perfusionstryck baserat på en litteraturbearbetning av NEVLP hos råttor (2010-2022)3,8,10,14,17,19,27,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38,
39,40,41,42,43,44,45. Normothermisk maskinperfusion i råttlever kan uppvisa variabilitet mellan studier när det gäller den specifika typen och volymen av perfusat som används, liksom perfusionens varaktighet. Olika studier kan använda olika metoder, såsom dialys eller högvolymperfusion, under längre perioder. Trots dessa skillnader visar emellertid parametrar som portaltryck, portalvenflödeshastighet och partialtryck av syre i perfusatet i allmänhet minimal variation mellan de olika använda metoderna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Figur 1: Schematiskt diagram över perfusionssystemet. De viktigaste komponenterna är orgelkammaren, termostatmaskinen, rullpumpen, oxygenatorn och behållaren. Perfusatet pumpas från behållaren med en peristaltisk pump till en oxygenator. Det finns ett oavbrutet gasflöde på 95% O2 och 5% CO2 i oxygenatorn. Perfusatet passerar genom bubbelfällan, där eventuella luftbubblor som finns i perfusatet fångas upp och pumpas tillbaka till behållaren. Det återstående perfusatet strömmar till orgelkammaren, där röret är anslutet till portalvenen. Perfusatutflödet från orgelkammaren riktas tillbaka till behållaren av den peristaltiska pumpen. Ett galldräneringsrör är anslutet till organkammaren för att samla gallan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Närbild av perfusionskammaren. Orgelperfusionskammaren består av ett perfusatinlopp och utlopp, en bubbelfälla, en värmeväxlare och en galluppsamlingsport. Realtidsövervakning av perfusatpumpens tryck utförs med hjälp av en trycksensor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Histologiska resultat av normala och perfuserade muslever. (A) Normal levermorfologi hos möss (kontroll). (B) Exempel på bäst bevarad morfologi visualiserad genom HE-färgning efter 12 timmars perfusion. (C). Exempel på sämst bevarad morfologi visualiserad genom HE-färgning efter 12 timmars perfusion. Den svarta pilen indikerar vakuolisering, den röda pilen pekar på sinusformad dilatation, den gula pilen visar pyknos av kärnor och den gröna pilen anger vaskulär frigöring. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Perfusate analys. Ph (A) och kaliumnivåer (B). Båda parametrarna är stabila under observationstiderna på 12 timmar, vilket indikerar konstanta perfusionsförhållanden Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Mindre leverskada som resulterar i en modifierad Suzuki-poäng 4-7. Efter 12 timmars NEVLP genomfördes en semikvantitativ bedömning av levermorfologi. Prover från varje leverlob bedömdes och graderades separat, vilket resulterade i ett intervall och en medelpoäng för varje lever, med högsta möjliga poäng 4. Välbevarad levermorfologi med en poäng från 4-7 beroende på leverloben (medelvärde = 5) (Poäng 0-7: välbevarad levermorfologi, poäng 8-14 måttligt bevarad morfologi, poäng 15-21: dåligt bevarad levermorfologi) Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Måttlig leverskada som resulterar i en modifierad Suzuki-poäng 7-14. Semikvantitativ bedömning av levermorfologi efter 12 timmars normotermisk syresatt maskinperfusion enligt modifierad Suzuki-poäng. Måttligt bevarad morfologi med en poäng från 7 till 14 (medelvärde = 11). (Poäng 0-7: välbevarad levermorfologi, poäng 8-14 måttligt bevarad morfologi, poäng 15-21: dåligt bevarad levermorfologi) Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Mindre - måttlig leverskada som resulterar i en modifierad Suzuki-poäng 5-11. Den inhomogena perfusionen resulterade i mindre till måttlig bevarad morfologi i olika leverlober, med poäng från 5 till 11 (medelvärde = 8). (Poäng 0-7: välbevarad levermorfologi, poäng 8-14 måttligt bevarad morfologi, poäng 15-21: dåligt bevarad levermorfologi) Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i protokollet
De två avgörande stegen i leverexplantation är kanylering av portalvenen (PV) och efterföljande kanylering av gallgången (BD). Dessa steg är av yttersta vikt för att säkerställa framgångsrik organhämtning och efterföljande perfusions- eller transplantationsförfaranden.
Utmaningar och lösningar
PV-kanylering innebär tre utmaningar: skada på kärlväggen, förskjutning av katetern och genomförbarhet av införingsprocessen. PV-kärlväggens känsliga natur gör den mottaglig för punktering och efterföljande blödning om den inte hanteras försiktigt under cannulation. Dessutom minskar eventuell blodförlust från PV portaltrycket, vilket gör införandet av PV-kanylen mer utmanande. Dessutom kan en skada på portalvenös vägg införa luftemboli i det intrahepatiska kärlsystemet. Därför är det viktigt att utöva precision och försiktighet under PV-kanyleringsprocessen för att minimera risken för komplikationer.
Under PV-kannulation är risken för kateterförskjutning ett vanligt problem, särskilt vid användning av kanyler med hala material. I jämförelse med polypropen är användningen av polyuretankanyler mer gynnsam för PV-kannulation. Den mjuka och smidiga naturen hos polyuretan minskar avsevärt risken för kateterförskjutning eller förlust, vilket potentiellt kan hänföras till dess materialegenskaper. Dessutom minimerar användningen av en mjuk kanyl sannolikheten för att skada endotelskiktet i blodkärlen. I studien jämfördes tre typer av vaskulära åtkomstkanyler, nämligen 24 G polypropen, 26 G polypropen och 2 Fr polyuretan, för PV-kannulation. Bland dessa alternativ visade både 26 G och 2 Fr polyuretankanyler bättre kompatibilitet med storleken på musens PV. Medan 26 G-kanylen uppvisade bättre anatomisk kompatibilitet, ansågs 2 Fr polyuretankanyl med en ytterdiameter på 0,66 mm lämplig för den avsedda applikationen på grund av dess unika materialegenskaper, vilket effektivt minimerar risken för oavsiktlig kateterlossning från PV.
När det gäller genomförbarheten av insättning testades olika tekniker. Ett sätt är att klämma fast de proximala och distala ändarna på PV, klippa ett litet hål med fin sax och sätt in PV-kanylen. Denna teknik kräver involvering av en ytterligare person på grund av komplexiteten och kravet på samtidiga åtgärder. Följaktligen är det inte möjligt för en enda mikrokirurg att utföra proceduren självständigt. Därför behövs en kateter med en inre nål och en yttre kanyl. Som beskrivits tidigare medför användning av den kommersiellt tillgängliga styva och släta 26 G polypropenkanylen risken att glida ut och riskera bildandet av luftbubblor vid anslutning av kanylen till spolsystemet. För att ta itu med dessa problem utformades ett självkonstruerat "nålstyrt rörsystem" genom att sätta in en 26 G nål från en nålkateter i en lång och smidig polyuretan 2 Fr kanyl. Detta tillvägagångssätt erbjuder tre viktiga fördelar: (1) ett kateterinsättningssystem, (2) ett långt och flexibelt rör och (3) gynnsamma materialegenskaper. Under detta steg är det dock viktigt att vara försiktig för att förhindra att nålspetsen kommer i kontakt med solcellsväggen medan den går framåt, eftersom detta kan orsaka irreversibla skador på kärlväggen.
BD-kanylering presenterade samma tre utmaningar: skada på kärlväggen, förskjutning av katetern och genomförbarhet av införingsprocessen. I slutändan ansågs 1 Fr polyuretankanyl vara mer lämplig än UT - 03 polypropenkanyl på grund av dess gynnsamma materialegenskaper. Trots den något mindre ytterdiametern på UT - 03-kanylen (0,30 mm) jämfört med 1 Fr värmekänsliga polyuretanrör (0,33 mm) är polyuretanmaterialet styvt och mindre benäget att böjas. Å andra sidan erbjuder 1 Fr-kanylen, som är mjuk och flexibel, enklare insättning och blev därmed vårt föredragna val. Men i de fall där BD-storleken är exceptionellt liten och inte kan rymma den större 2 Fr-kanylen, förblir UT - 03-kanylen ett lönsamt alternativ. I sådana fall måste särskild uppmärksamhet ägnas åt att förhindra att kanylen förskjuts från BD.
Som sammanfattas i litteraturöversikten (tabell 5) använde de flesta experimenterna 19,41,42,46 en portalflödeshastighet på 1 - 3 ml / min / g lever. Flödeshastigheten bör dock justeras för att bibehålla det fysiologiska portaltrycket i intervallet 4 - 10 mmHg28. Högt PV-tryck kan orsaka sinusformad dilatation och vaskulär avlossning. Lågt PV-tryck och lågt PV-flöde kan resultera i en lågflödeshypooxygenering med efterföljande mid-zonal till pericentral nekros. Manipuleringen av PV-flödeshastigheten tjänar funktionen att reglera PV-trycket, vilket kan variera beroende på kanylen som används och leverns storlek, vilket kräver mindre justeringar av PV-flödeshastigheten. Så i denna studie startades perfusion med en flödeshastighet på 1 ml / min / g lever, och samtidigt övervakades PV-trycket med hjälp av en blodtrycksgivare för att upprätthålla fysiologiskt PV-tryck genom att justera flödeshastigheten.
Under utvecklingen av NEVLP-modellen gjordes ett försök att ytterligare förbättra syretillförseln till den perfuserade levern genom att tillsätta tvättade röda blodkroppar till perfusatet. Ändå observerades signifikant sedimentering av erytrocyter i den stora kammaren och behållaren, vilket minskade tillförseln av syrebärare till organet under perfusion. Vidare orsakades skador på erytrocyter av den mekaniska verkan av den peristaltiska perfusionspumpen, som driver perfusatet genom att komprimera ett kiselrör. Båda orsakerna underlättade vårt beslut att inte använda röda blodkroppar i detta experiment. Perfluorkarbonbaserade syrebärare kan lösa dessa problem47.
För att bedöma levertransplantatets livskraft under perfusion samlades gallvätska från mus med 3 timmars intervall. Ändå är det svårt att samla gallan via katetern på grund av den höga viskositeten hos musgallvätska. Detta kompenseras initialt av kapillärkrafterna inducerade av den fina 1 Fr polyuretankatetern placerad i BD. Endast cirka 20 μL gallvätska kunde emellertid samlas in inom experimentets första timme. Istället för att dränera genom kanylen observerades retrograd fyllning av gallblåsan.
I slutet av den 12 h perfusionsperioden fylldes gallblåsan med klar gallvätska, vilket tyder på aktiv gallproduktion under maskinperfusion. Detta kan potentiellt motverkas genom att placera ett större rör i gallblåsan.
Under tiden bedömdes den histologiska skadan av den hepatiska cellulära och lobulära strukturen för att bestämma resultatet av bevarande. Det observerades att även inom samma lever var konserveringen inhomogen. Inhomogeniteten hos de strukturella förändringarna tyder på att perfusionen var heterogen i hela levern (figur 5, figur 6, figur 7). Dessutom ger de histologiska fynden bevis för att det är lönsamt att bevara den strukturella integriteten hos muslevertransplantatet under minst 12 timmar under maskinperfusion. Förekomsten av intakt leverhistologi kan dock endast hjälpa till vid bedömningen men kan inte definitivt bestämma leverns funktion och livskraft. Det bör noteras att nekros, som den ultimata manifestationen av cellulär skada, kanske inte är lätt observerbar förrän i ett senare skede. Att enbart förlita sig på histologisk bedömning kan således inte ge en övergripande förståelse för leverns funktionella status och livskraft. Andra kompletterande analyser och utvärderingar krävs för att fastställa leverns övergripande tillstånd, inklusive funktionella analyser, biokemiska markörer och bedömning av metabolisk aktivitet.
God konservering uppnåddes efter 12 timmars perfusion. Att ytterligare förlänga perfusionstiden som eventuellt behövs för organreparation kräver dock att man tar itu med vissa problem. För det första bör det noteras att uppnåendet av långvariga perfusionsperioder som överstiger 12 timmar skulle kräva att sterila förhållanden upprätthålls snarare än bara rena förhållanden. Men i dessa inledande experiment var fokus på att upprätthålla rena förhållanden snarare än sterila förhållanden, eftersom säkerställande av sterilitet skulle införa ytterligare komplexitet i proceduren. För det andra skulle längre perfusion möjligen kräva tillsats av en dialysenhet, som beskrivs av Herman Tolboom22, för att avlägsna ackumulerande giftiga metaboliska avfallsprodukter. De använde ett system med en total volym på 55 - 60 ml för att perfusera en råttlever på 10 g i 4 timmar. I denna studie användes en relativt stor reservoar med en total volym på 300 ml trots den lilla storleken på muslevern, som väger cirka 1 g. Denna konfiguration resulterade i en ytterligare utspädningsfaktor på 50 gånger. Anmärkningsvärt observerades inga skadliga effekter under 12 timmars perfusionsperiod med denna inställning. För det tredje skulle längre perfusion också kräva tillsats av syrebärare, i bästa fall i form av artificiellt hemoglobin för att säkerställa tillräcklig syretillförsel, som beskrivs av Dondossola et al.47 och Jägers et al.48.
Utvecklingen av "icke-ischemisk" levertransplantation baserad på NEVLP har utan tvekan medfört nya idéer och metoder för att lösa eller till och med förebygga problemet med ischemi-reperfusionsskada. NEVLP är dock ett mycket lovande koncept för att förbättra organbevarande och dess potentiella tillämpning för att utvidga organbevarande till organreparation47.
För närvarande används tre olika tekniker för maskinperfusion experimentellt och kliniskt. Huvudskillnaden är arbetstemperaturen: hypotermisk maskinperfusion, subnomothermisk maskinperfusion och normotermisk maskinperfusion (tabell 2). Andra skillnader inkluderar valet av konserveringslösning, perfusatlösning och tillsats av syrebärare (tabell 5).
NEVLP är huvudsakligen en fördel eftersom (1) organet hålls vid sin normala temperatur, (2) det syresätts och (3) det levereras metaboliskt fullständigt. Systemet ger en utmärkt plattform för diagnostisk utvärdering, interventionsterapi och slutligen organreparation49. NEVLP utgör dock en stor utmaning för ex vivo-organstödstekniken. Utmaningen för NEVLP är att spegla det nära fysiologiska tillståndet. Fram till nyligen, på grund av den lilla storleken och bristen på standardutvärderingskriterier, utfördes endast ett begränsat antal NEVLP-studier på gnagare 25,26,27,28,29,30,31.
Det har visats här att musmodellen är en giltig modell som tillåter en bevarandetid på 12 timmar. Som jämförelse har de flesta råttstudier rapporterat perfusionstider på 6 timmar eller mindre28,33. Dessutom är användningen av små djur en fördel för molekylära studier jämfört med stora djur på grund av tillgången på rikliga reagens och de lägre experimentkostnaderna. Till exempel är möss för närvarande ett föredraget alternativ för att testa knockoutmodeller av ATG-genfamiljen, särskilt för att studera signalvägar för ischemi-reperfusionsskada i levern 8,50.
Experiment på råttlever avseende NEVLP har visat att normotermisk maskinperfusionskonservering är förknippad med minskad hepatocellulär skada och förbättrad tidig överlevnad efter transplantation jämfört med kall konservering 31,40,51,52,53,54. NEVLP med råttlever är också lämplig för att studera tillsatser av läkemedel eller celler till perfusatet. Ett imponerande exempel är studien av Xuan Tian26, som använde hemoxygenas-1-modifierade mesenkymala stamceller i kombination med normotermisk maskinperfusion för att förbättra kvaliteten på levertransplantat via Wnt-signalvägen. Haojie Wang,39, har bekräftat i sin senaste studie att tillsats av benmärgs mesenkymala stamceller till perfusatet kan förbättra kvaliteten på NEVLP hos råttor för korttidsperfusion. I deras studie med DCD-lever hämmade benmärgsmesenkymala stamceller i kombination med NEVLP leversinusformad trängsel och endotelskada. Tillsatsen av mesenkymala stamceller förhindrade intrahepatisk makrofagaktivering och intercellulär vidhäftning. Vidare reglerade tillsatsen av mesenkymala stamceller endotelin-1 / endotelial kväveoxidbalans för att förbättra leverperfusion och mikrocirkulation.
Möss erbjuder en tydlig fördel jämfört med råttor när det gäller NEVLP, särskilt i samband med molekylära studier fokuserade på transgena eller genetiskt modifierade lever. På grund av djurets lilla storlek utgör proceduren dock en större men hanterbar utmaning för mikrokirurgen37.
Betygssystem för histologisk bedömning
Den histologiska bedömningen är avgörande för att bestämma effekten av perfusionsförhållanden på transplantatets morfologiska integritet.
Medan Suzuki-poängen ofta används i studier som bedömer leverpatologi, har det noterats att detta poängsystem kanske inte tillräckligt fångar de specifika fynd som observerats vid leverkonservering ex vivo. För att hantera denna begränsning infördes ytterligare fyra kriterier för att förbättra den omfattande utvärderingen av bevarad levervävnad (tabell 4). För det första genomfördes införandet av nukleär pyknosbedömning, eftersom den fungerar som en värdefull parameter som indikerar cellskador. För det andra införlivades utvärderingen av kärl- och hepatocytavskiljning, vilket innebär skada på leverlobuleen, som ett ytterligare kriterium. Slutligen användes graderingen av erytrocyternas närvaro i sinusoider som en indikator på heterogen spolning och perfusion. Genom att införliva dessa kompletterande kriterier uppnåddes en mer nyanserad och korrekt bedömning av den bevarade levervävnadens tillstånd, vilket gav en djupare förståelse för effekterna av leverkonservering ex vivo.
Hepatocytvakuolisering55 inträffar efter förändringar i substratanvändning, energiförbrukning, mikrotubulisönderdelning och hämning av proteinsyntes. Hepatocytens kärna tvingas flytta mot cellens periferi av stora vakuoler. Denna process åtföljs ofta av nukleär pyknos. I denna studie ledde 12 timmar normotermisk maskinperfusion till olika grader av vakuolisering av hepatocyter jämfört med kontrollen, vilket tyder på inhomogen perfusion.
Förekomsten av dilaterade sinusoider mellan hepatocytsträngar var anmärkningsvärd i denna studie. Detta fenomen uppstår främst från hepatisk venös utflödesobstruktion, vilket leder till vaskulär stasis och trängsel inom leverparenkymen. I denna muslevermodell kan utmaningarna i samband med att upprätthålla ett konsekvent portalperfusionstryck på grund av organets lilla storlek bidra till den observerade utvidgningen av leverbihåleoider.
Nekrotiska förändringar manifesteras vanligtvis i cellkluster, regionala områden eller specifika zoner. Det välperfuserade periportalområdet uppvisade relativt bättre bevarande av hepatocyter jämfört med det pericentrala området. Leverperfusion med dubbla kärl, som visats i råttlever20, utgör en större utmaning i muslever på grund av leverartärens lilla storlek. Följaktligen kan den observerade inhomogena perfusionen av muslevern åtminstone delvis tillskrivas denna begränsning.
Dessa observationer är inte exklusiva för muslever som genomgår NEVLP men kan också visualiseras i histologiska bilder från andra NEVLP-studier, även om de kanske inte uttryckligen beskrivs.
Betydelse och potentiella tillämpningar av mus NEVLP
NEVLP av muslever är ett utmanande men genomförbart förfarande. Ytterligare ansträngningar krävs för att på bästa sätt utnyttja denna teknik för att belysa den mekanism som ligger till grund för den gynnsamma effekten av NEVLP. Att förbättra vår kunskap kommer att underlätta den progressiva utvecklingen av denna teknik, överföra den bortom organbevarande mot sfären av "organreparation".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga finansiella intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Under skrivandet av detta dokument har jag fått mycket stöd och hjälp. Jag vill särskilt tacka min lagkamrat XinPei Chen för hans underbara samarbete och tålmodiga stöd under min operation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100x15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT - 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
References
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
- Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
- Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
- Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
- Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B.
- Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. 3rd Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
- Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
- Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N.
- van der, V. alk J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
- Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
- Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
- Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
- Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
- Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
- Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
- Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
- Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
- Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
- Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
- Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
- Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
- Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
- Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
- Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
- Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) - farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
- Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
- Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
- Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
- Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
- Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
- Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
- Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
- Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
- Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
- Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
- Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
- Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
- Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
- Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
- Von,, Horn, C., Zlatev, H., Pletz, J., Lüer, B., Minor, T. Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
- Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William's E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
- Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
- Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
- Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
- Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
- Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
- Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
- Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
- Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
- van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).
