Summary
Dit manuscript beschrijft een tweestapsprotocol om patiëntspecifieke podocyten te genereren uit dermale fibroblasten via episomale herprogrammering in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) en daaropvolgende differentiatie in podocyten.
Abstract
Podocyten zijn epitheelcellen die zich op de urineplaats van de glomerulaire filtratiebarrière bevinden en die bijdragen aan de selectieve filterfunctie van de glomerulus. Mutaties in podocyt-specifieke genen kunnen focale segmentale glomerulosclerose (FSGS) veroorzaken, en podocyten worden ook beïnvloed in veel andere primaire en secundaire nefropathieën. Vanwege hun gedifferentieerde aard zijn primaire celkweekmodellen beperkt voor podocyten. Daarom worden gewoonlijk voorwaardelijk vereeuwigde cellen gebruikt. Deze voorwaardelijk vereeuwigde podocyten (ciPodocyten) hebben echter verschillende beperkingen: de cellen kunnen in cultuur dedifferentiëren, vooral wanneer ze confluentie bereiken, en verschillende podocyt-specifieke markers worden slechts licht of helemaal niet uitgedrukt. Dit brengt het gebruik van ciPodocyten en hun toepasbaarheid voor fysiologisch, pathofysiologisch en klinisch bereik in twijfel. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van menselijke podocyten - inclusief patiëntspecifieke podocyten - uit een huidponsbiopsie door episomale herprogrammering van dermale fibroblasten in hiPSC's en daaropvolgende differentiatie in podocyten. Deze podocyten lijken veel beter op in vivo podocyten in termen van morfologische kenmerken, zoals de ontwikkeling van voetprocessen en de expressie van de podocyt-specifieke marker. Ten slotte, maar belangrijk, houden deze cellen de mutaties van patiënten in stand, wat resulteert in een verbeterd ex vivo model om podocytenziekten en potentiële therapeutische stoffen te bestuderen in een geïndividualiseerde benadering.
Introduction
Podocyten zijn gespecialiseerde, post-mitotische renale epitheelcellen die de glomerulaire filtratiebarrière van de nier vormen, samen met het glomerulaire keldermembraan (GBM), glomerulaire endotheelcellen en glycocalyx. Fenotypisch bestaan podocyten uit een cellichaam en primaire, microtubule-aangedreven membraanextensies, evenals secundaire extensies die voetprocessen 1,2 worden genoemd. De glomerulaire filtratiebarrière die urine uit het bloed filtert, is gebouwd van fenestrated endotheel, GBM en een gespecialiseerd type intercellulaire junctie die naburige podocytenvoetprocessen verbindt, het spleetmembraan van podoctyes3 genoemd. Onder gezonde omstandigheden worden eiwitten groter dan albumine vastgehouden van de filtratiebarrière vanwege hun grootte en lading4.
Mutaties in cytoskelet- of podocyt-specifieke genen, evenals circulerende factoren die podocytensignaleringsroutes beïnvloeden, zijn bekend om podocyten-effacement, loslating of apoptose te induceren, resulterend in proteïnurie en glomerulaire sclerose. Met name cytoskeletale herschikking, veranderingen in podocytenpolariteit of schade aan voetprocessen met een geassocieerd verlies van spleetverbindingen zijn cruciaal5. Vanwege hun terminaal gedifferentieerde status kunnen podocyten nauwelijks worden vervangen na het loskoppelen van de GBM. Als podocyten echter aan de GBM zijn bevestigd, kunnen ze nog steeds herstellen van uitwissen en interdigiterende voetprocessen hervormen 6,7,8. Verder begrip van de gebeurtenissen die leiden tot schade aan podocyten bij verschillende glomerulaire aandoeningen kan nieuwe therapeutische doelen bieden die zullen helpen bij het ontwikkelen van behandelingen voor deze ziekten. Podocytenschade is een kenmerk van verschillende glomerulaire ziekten, waaronder focale segmentale glomerulosclerose (FSGS), diabetische nefropathie, minimale veranderingsziekte en vliezige glomerulonefropathie, waarvoor betrouwbare podocyte ex vivo modellen nodig zijn om de pathologische mechanismen en mogelijke behandelingsbenaderingen voor deze ziekten te bestuderen 9,10. Podocyten kunnen ex vivo worden bestudeerd door klassieke primaire celkweek op basis van de isolatie van glomeruli door differentiële zeven11. Vanwege de terminaal gedifferentieerde toestand met beperkte proliferatiecapaciteit gebruiken de meeste onderzoekers echter muis- of menselijke ciPodocytencellijnen die temperatuurgevoelige varianten van het SV40 grote T-antigeen tot expressie brengen. Als alternatief worden ciPodocyten geïsoleerd uit transgene muizen met het SV40 Tag onsterfelijke gen 1,12.
CiPodocyten prolifereren bij 33 °C, maar komen tot groeistilstand en beginnen te differentiëren bij 37 °C13,14. Er moet rekening mee worden gehouden dat experimentele gegevens die met deze cellen zijn verkregen, met enige voorzichtigheid moeten worden geïnterpreteerd, omdat de cellen worden gegenereerd met behulp van een onnatuurlijke geninbrenging15. Omdat deze cellen een vereeuwigend gen herbergen, is de cellulaire fysiologie veranderd vanwege de voortdurende proliferatie12. Podocytencellijnen die door deze benadering worden gegenereerd, zijn onlangs in twijfel getrokken, omdat ciPodocyten van muizen, mensen en ratten minder dan 5% van synaptopopodie en nefrine op eiwitniveau tot expressie brengen, evenals NPHS1 en NPHS2 op mRNA-niveau in vergelijking met glomerulaire expressie16. Bovendien drukken de meeste podocytencellijnen geen nefrine17,18 uit. Chittiprol et al. beschreven ook een significant verschil in celmotiliteit en reacties op puromycine en doxorubicine in ciPodocyten16. Podocyten kunnen worden gevonden in urine na loslating van de GBM bij verschillende glomerulaire ziekten 19,20,21,22. Levensvatbare urinaire podocyten kunnen ex vivo worden gekweekt gedurende maximaal 2-3 weken, maar de meeste cellen ondergaan apoptose23,24. Interessant is dat podocyten niet alleen worden aangetroffen in de urine van patiënten met glomerulaire ziekte, maar ook in de urine van gezonde proefpersonen, hoogstwaarschijnlijk wanneer ze senescent-again zijn met een beperkt potentieel van replicatie in cultuur24. Bovendien is het van de urine afgeleide podocytenaantal beperkt en dedifferentiëren de cellen in cultuur, vertonen ze minder voetprocessen, veranderen ze van morfologie en hebben ze vooral een beperkte proliferatiecapaciteit. De expressie van podocyt-specifieke genen is afwezig, verdwijnt binnen enkele weken of varieert tussen deze celklonen. Sommige cellen die positief waren voor de podocyt-specifieke marker drukten samen de marker van tubulaire epitheelcellen of myofibroblasten en mesangiale cellen uit, wat dedifferentiatie en / of transdifferentiatie van de gekweekte urinaire podocyten suggereert24,25.
Onlangs is de generatie van ciPodocyt-cellijnen afgeleid van de urine van patiënten en gezonde vrijwilligers door transductie met een thermogevoelig SV40 groot T-antigeen en hTERT beschreven26. mRNA-expressie voor synaptopodia, nestine en CD2-geassocieerd eiwit werd gedetecteerd, maar podocine-mRNA was afwezig in alle klonen. Naast de problemen met urinaire podocyten bevatten deze cellen ook het ingebrachte onsterfelijke gen, wat resulteert in de hierboven besproken nadelen.
Daarentegen hebben door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) een enorm vermogen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in meerdere celtypen onder de juiste omstandigheden. Het is al eerder aangetoond dat hiPSC's kunnen dienen als een bijna onbeperkte bron van podocyten27,28.
Hier wordt een tweestapsprotocol beschreven om patiëntspecifieke podocyten te genereren uit dermale fibroblasten van huidponsbiopten met daaropvolgende episomale herprogrammering in hiPSC's en een laatste differentiatie in hiPSC-afgeleide podocyten (figuur 1).
Figuur 1: Protocol om patiëntspecifieke hiPSC-afgeleide podocyten te genereren. Grafisch overzicht van het protocol om patiëntspecifieke podocyten te genereren uit dermale fibroblasten van een huidbiopsie door herprogrammering in hiPSC's en differentiatie in podocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Als eerste stap werden somatische dermale fibroblasten ontgroeid uit een huidponsbiopsie en geherprogrammeerd tot hiPSC's met behulp van een integratievrije methode door elektroporatie met plasmiden die de transcriptiefactoren OCT3/4, KLF4, SOX2 en c-MYC 29,30,31 tot expressie brachten. Opkomende hiPSC-kolonies werden vervolgens geselecteerd en uitgebreid. Differentiatie begon met de inductie van de mesodermale afstamming door activering van de WNT-signaleringsroute, gevolgd door de generatie van nefronvoorlopercellen die nog steeds in staat waren om zich te vermenigvuldigen. Ten slotte werden de cellen gedifferentieerd tot podocyten. In deze procedure hebben we eerder gepubliceerde protocollen voor episomale herprogrammering voor het genereren van hiPSC's door Bang et al.32 en Okita et al.33 gewijzigd en gecombineerd, evenals een protocol voor de differentiatie van hiPSC's in podocyten door Musah et al.28,34,35.
Inderdaad, podocyten gegenereerd door ons protocol hadden een fenotype dat dichter bij podocyten in vivo lag, met betrekking tot de ontwikkeling van een duidelijk netwerk van primaire en secundaire voetprocessen en de expressie van podocyt-specifieke markers, zoals synaptopode, podocine en nefrine. Met het gebruik van hiPSC-afgeleide podocyten wordt de genetische achtergrond van de patiënt behouden tijdens herprogrammering en differentiatie. Dit maakt patiëntspecifieke podocytenziektemodellering mogelijk en de ontdekking van potentiële therapeutische stoffen ex vivo in een bijna onbeperkt celnummer. Bovendien is dit protocol minimaal invasief, kostenefficiënt, ethisch aanvaardbaar en kan het nieuwe wegen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen vergemakkelijken.
Protocol
Het protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Friedrich-Alexander Universiteit Erlangen-Neurenberg (251_18B) en alle patiënten en probands gaven schriftelijke toestemming. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften. Voor de samenstelling van alle media en oplossingen die hier worden gebruikt, zie tabel 1.
1. Uitgroei van dermale fibroblasten uit een huidponsbiopsie
- Breng de huidponsbiopsie over in een steriele conische buis van 15 ml met 10 ml voorverwarmd fibroblastmedium.
- Verwijder het medium en was de huidponsbiopsie drie keer met 5 ml steriele, voorverwarmde 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Breng de huidponsbiopsie met een steriele tang over op een celkweekplaat van 10 cm en snijd deze in de breedte in drie of vier stukken met een steriel scalpel, waardoor de opperhuid en de dermis overblijven.
- Breng elk stuk over in een steriele 35 mm plastic celkweekschaal en druk het zachtjes tegen de kweekschaal. Verwijder overtollig medium rond de biopsiestukken. Laat 5-10 minuten drogen totdat de vloeistof verdampt en de biopsie aan het celkweekplastic is bevestigd.
- Voeg druppelsgewijs 1 ml fibroblastmedium toe met een pipet van 1.000 μL rond de biopsie en vul voorzichtig tot een eindvolume van 3 ml. Kweek bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 7 dagen zonder het gerecht te voeren en te verplaatsen. Verander het medium voorzichtig in vers, voorverwarmd fibroblastmedium. Na 7 dagen kunnen ontgroeide spindelachtige fibroblasten rond de huidbiopsie worden gecontroleerd met behulp van een fasecontrastmicroscoop36.
OPMERKING: Wanneer ontgroeide fibroblasten de rand van het gerecht bereiken, gaat u opnieuw verder met stap 1.3 om een nieuwe partij fibroblasten te genereren. - Voor uitbreiding van de ontgroeide fibroblasten, wassen met 2 ml voorverwarmde 1x PBS, dissociëren van de fibroblasten met 1 ml 1x trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C, 5% CO2. Breng de losgemaakte cellen over in een conische buis van 15 ml en was de celkweekschaal met 2 ml vers, voorverwarmd fibroblastmedium.
- Bundel het wasmedium in de buis om het dissociatiemiddel te neutraliseren en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 20 °C op 200 x g. Zuig het supernatant op en resuspensie de celkorrel met 1 ml vers, voorverwarmd fibroblastmedium. Tel de cellen met een Neubauer-kamer of geautomatiseerde celteller met trypanblauw en zaai 2,5 x 10 3 tot 5 x 103 fibroblasten per cm2 in verse celkweekkolven.
- Plaats de kolven terug in de broedmachine en verdeel de cellen gelijkmatig door de kolven driemaal in elke richting te bewegen. Vervang de volgende dag het medium door vers, voorverwarmd fibroblastmedium. Verander het medium twee keer per week en splits wanneer de fibroblasten ongeveer 80% confluency bereiken.
2. Invriezen van dermale fibroblasten
- Om de fibroblasten in te vriezen, was je ze met 5 ml voorverwarmde 1x PBS. Zuig de PBS aan en dissocieer de fibroblasten met 4 ml 1x trypsine-EDTA. Plaats de kolf terug in de incubator en incubeer gedurende 5-7 minuten bij 37 °C bij 5% CO2. Controleer het loslaten met behulp van een fasecontrastmicroscoop en tik tegen de zijkant van de kolf om de cellen los te maken.
- Breng de losgemaakte cellen over in een conische buis van 15 ml. Was de celkweekkolf met 5 ml vers, voorverwarmd fibroblastmedium. Giet het wasmedium in de conische buis en centrifugeer op 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C.
- Zuig het supernatant op en resuspensie de celkorrel met 2 ml vers, voorverwarmd fibroblastmedium. Tel de cellen en breng 1 x 106 cellen over naar een nieuwe conische buis. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C.
- Zuig het supernatant op en resuspensie de celpellet met 1 ml koud fibroblastvriesmedium bestaande uit 90% foetaal kalfsserum en 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Breng over in een cryovial, plaats in een vriescontainer en vries een nacht in bij -80 °C. Voor langdurige opslag, plaats de cryovial de volgende dag in een tank met vloeibare stikstof.
3. Episomale herprogrammering van fibroblasten om hiPSC's te genereren
- Gebruik voor episomale herprogrammering 1,5 x 106 fibroblasten van passage 4 tot 8. Om dit celnummer te bereiken, gebruikt u twee tot drie kolven van 250 ml met ongeveer 70% samenvloeiing.
- De dag voor het herprogrammeren, splits de fibroblasten in een verhouding van 1: 2 om hun proliferatieve toestand te garanderen. Zuig daarom het medium aan en was de kolven met 5 ml voorverwarmd 1x PBS per kolf. Zuig de PBS aan en dissocieer de fibroblasten met 4 ml 1x trypsine-EDTA. Plaats de kolven terug in de couveuse en incubeer gedurende 5-7 minuten bij 37 °C en 5% CO2. Bewaak het loslaten met behulp van een fasecontrastmicroscoop en tik tegen de zijkant van de kolf om de cellen los te maken van het plastic oppervlak.
- Breng de losgemaakte cellen over in een conische buis van 50 ml en was de celkweekkolven met 5 ml vers, voorverwarmd fibroblastmedium. Giet het wasmedium in de conische buis en centrifugeer op 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de celpellet in 6 ml vers, voorverwarmd fibroblastmedium.
- Bereid zes nieuwe celkweekkolven door 5 ml vers, voorverwarmd fibroblastmedium per kolf toe te voegen. Voeg 1 ml fibroblastcelsuspensie toe aan elke kolf. Plaats de kolven terug in de broedmachine en verdeel de cellen gelijkmatig door de kolven driemaal in elke richting te bewegen.
- Voor episomale herprogrammering, bedek twee 10 cm celkweekplaten die geschikt zijn voor hiPSC-cultuur met 4 ml koude coatingoplossing per plaat. Incubeer de platen gedurende 1 uur bij 37 °C.
OPMERKING: Om hiPSC's te kweken, zijn verschillende celkweekplastics en extra extracellulaire matrixcoating vereist (zie materiaaltabel). - Verwijder de media uit de fibroblasten en was met 10 ml voorverwarmde 1x PBS per kolf. Zuig de PBS aan en dissocieer de fibroblasten met 4 ml 1x trypsine-EDTA per kolf door gedurende 5-7 minuten bij 37 °C te broeden. Controleer het loslaten met een fasecontrastmicroscoop en tik indien nodig tegen de zijkant van de kolf om de cellen los te maken van het plastic oppervlak.
- Breng de losgemaakte cellen over in een conische buis van 50 ml. Was de lege kolven met 6 ml voorverwarmd fibroblastmedium om de resterende cellen te verzamelen en zich in de conische buis te verzamelen. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de celkorrel in 3 ml verse, voorverwarmde 1x PBS.
- Tel de cellen en breng 1,5 x 106 fibroblasten over in een nieuwe conische buis. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Gooi het supernatant weg en resuspensie de celkorrel in 5 ml elektroporatiemedium en centrifugeer opnieuw. Zuig ondertussen de coatingoplossing op uit de gecoate celkweekplaten van 10 cm en voeg 7 ml voorverwarmd fibroblastmedium toe.
- Gooi na centrifugatie het supernatant weg en resuspensie van de celpellet in elektroporatiemedium met een concentratie van 1,5 x 106 cellen in 250 μL. Breng de 250 μL celsuspensie over naar een elektroporatiecuvet met een spleetafstand van 4 mm (zie materiaaltabel).
- Bereid een plasmidetransfectiemengsel door 4 μg van elk plasmide (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) toe te voegen aan een totaal volume van 50 μL elektroporatiemedium. Breng over op de cuvette en meng door zachtjes te vegen. Elektroporaat met één puls bij 280 V.
- Knip een pipetpunt met een steriele schaar en breng 125 μL van de geëlektroperde fibroblasten over op elk van de voorbereide celkweekplaten van 10 cm. Verdeel de cellen door de platen drie keer in alle richtingen te roeren en plaats ze terug in de incubator. Incubeer 's nachts bij 37 °C met 5% CO2 zonder verstoring.
- Om dode cellen te verwijderen, vervangt u het medium de volgende dag door 7 ml vers, voorverwarmd fibroblastmedium. Verander het medium 2 dagen na elektroporatie in hiPSC-kweekmedium en vervang het om de andere dag gedurende de volgende 20 dagen.
4. Selectie, uitbreiding en kwaliteitscontrole van gegenereerde hiPSC's
- Controleer de cellen dagelijks gedurende ten minste 20 dagen met behulp van een fasecontrastmicroscoop met een 10x of 20x objectief om de vorming van hiPSC-kolonies na elektroporatie te observeren. Als hiPSC-kolonies ongeveer 300 μm groot zijn met duidelijke randen en de hiPSC's een hoge kern-tot-lichaamsverhouding vertonen, zijn de hiPSC-kolonies klaar voor selectie door te plukken (figuur 2B, C en figuur 3).
- Vóór het plukken bekleedt u een plaat met 96 putten die geschikt is voor hiPSC-cultuur met 100 μL coatingoplossing per put en incubeer u gedurende 1 uur bij 37 °C. Markeer tijdens de incubatie kolonies van belang op de bodem van de celkweekschaal met een pen. Verwijder voor de laatste bereiding van de 96-putplaat de coatingoplossing en voeg 100 μL voorverwarmd hiPSC-kweekmedium met 10 μM ROCK-remmer Y27632 toe aan elke put.
- Was de cellen met voorverwarmde 1x PBS en voeg vers, voorverwarmd hiPSC-kweekmedium toe dat 10 μM ROCK-remmer Y27632 bevat voordat u plukt om dode cellen te verwijderen. Om hiPSC-kolonies te plukken, gebruikt u een meetnaald en verdeelt u de hiPSC-kolonies in kleine stukjes door een raster in elke kolonie te tekenen.
- Controleer met behulp van een fasecontrastmicroscoop of de kolonies met succes in stukken zijn verdeeld. Breng ze met een pipet van 100 μL over op de voorbereide plaat met 96 putten. Houd de pipet rechtop boven de kolonie zonder de cellen aan te raken om krassen en verlies van de kolonie te voorkomen.
- Plaats de 96-putplaat in de incubator bij 37 °C met 5% CO2 en laat de cellen een nacht ongestoord hechten. Bewaar de gerechten met de fibroblast- en hiPSC-mix, voor het geval het plukken niet lukt. Verwijder daarom ROCK-remmer Y27632 door het medium te veranderen in hiPSC-kweekmedium en plaats de platen terug in de incubator.
- Vervang de volgende dag het medium van de 96-wells plaat tot 200 μL vers hiPSC-kweekmedium en vervang het om de andere dag. Controleer de 96-putplaat de volgende dag en markeer de putten met succesvol geplukte klonen.
OPMERKING: Als de geplukte hiPSC-klonen na de eerste poging niet volledig zijn geselecteerd en de fibroblasten in de put kunnen worden gevonden, herhaal dan het plukken uit de 96-put of schraap de fibroblasten van de plaat.
5. Uitbreiding van geselecteerde hiPSC-klonen
- Bewaak de hiPSC-klonen met een fasecontrastmicroscoop. Als de geselecteerde hiPSC's ongeveer 70% confluency bereiken, zijn de hiPSC-klonen klaar voor uitbreiding.
- Bedek een 48-putplaat geschikt voor hiPSC-cultuur met 250 μL coatingoplossing per put gedurende 1 uur bij 37 °C. Vervang de coatingoplossing door 200 μL vers, voorverwarmd hiPSC-kweekmedium dat 10 μM ROCK-remmer Y27632 bevat.
- Om de hiPSC's los te maken van de 96-putplaat, schraapt u het plastic oppervlak met een pipetpunt van 1.000 μL. Breng de losgemaakte hiPSC's over van de 96-well plaat naar een 48-well plaat. Verander het medium de volgende dag in vers, voorverwarmd hiPSC-kweekmedium om dode cellen en de ROCK-remmer Y27632 te verwijderen.
- Als de hiPSC-klonen ongeveer 70% confluentie bereiken, breng de hiPSC's dan over in een 24-putplaat. Bedek daarom een 24-putplaat die geschikt is voor hiPSC-cultuur met 400 μL coatingoplossing per put gedurende 1 uur bij 37 °C. Vervang de coatingoplossing door 400 μL vers, voorverwarmd hiPSC-kweekmedium dat 10 μM ROCK-remmer Y27632 bevat. Zuig het medium uit de 48 putjes en was met 500 μL voorverwarmde 1x PBS.
- Vervang de PBS door 100 μL enzymatische celloslatingsoplossing met 10 μM ROCK-remmer Y27632 en incubeer gedurende 4 minuten bij 37 °C. Spoel de hiPSC's van de plaat met een pipet van 1.000 μL. Breng de gedissocieerde cellen over in een conische buis van 15 ml. Was de lege plaat met 48 putten met hiPSC-kweekmedium met 10 μM ROCK-remmer Y27632 en pool in de conische buis.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de hiPSC's in 1 ml hiPSC-kweekmedium met 10 μM ROCK-remmer Y27632 en breng over op een 24-wellsplaat. Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C bij 5% CO2 en verdeel de cellen door de plaat drie keer in alle richtingen te roeren. Laat de cellen zich een nacht ongestoord hechten.
- Verander de volgende dag het medium in hiPSC-kweekmedium zonder ROCK-remmer Y27632.
OPMERKING: Als hiPSC-klonen ongeveer 70% confluentie bereiken, breng de hiPSC's dan over naar een 12-wells plaat door stappen 5.4 tot 5.7 te herhalen met verhoogde volumes die geschikt zijn voor een 12-well formaat. Als de hiPSC's van de 12-well plaat ongeveer 70% confluency bereiken, breng de hiPSC-klonen over naar een 6-well plaat met verhoogde volumes voor een 6-well formaat.
6. Invriezen van geselecteerde hiPSC-klonen
- Om geselecteerde hiPSC-klonen te bevriezen, zuigt u het medium op uit een plaat met 6 putten. Was de putjes met 2 ml 1x PBS. Zuig en dissocieer de hiPSC's met 1 ml enzymatische celloslatingsoplossing die 10 μM Y27632 bevat. Plaats de plaat terug in de incubator en incubeer gedurende 4 minuten bij 37 °C en 5% CO2.
- Spoel de hiPSC's van de plaat met behulp van een pipet van 1.000 μL en breng de losgemaakte cellen over in een conische buis van 15 ml. Was de plaat met 2 ml vers, voorverwarmd hiPSC-kweekmedium met 10 μM ROCK-remmer Y27632. Zwembad in de conische buis en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de celpellet met 2 ml vers, voorverwarmd hiPSC-kweekmedium dat 10 μM ROCK-remmer Y27632 bevat.
- Tel de cellen en breng 1 x 106 cellen over naar een nieuwe conische buis. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op, resuspensie de celpellet in 1 ml koud, serumvrij hiPSC-vriesmedium en vries het in een cryoviaal in met behulp van een vriescontainer gedurende een nacht bij -80 °C. Voor langdurige opslag, plaats de cryovial de volgende dag in een tank met vloeibare stikstof.
7. HiPSC kwaliteitscontrole
- Karakterisering van hiPSC-morfologie
- Controleer de karakteristieke hiPSC-morfologie met behulp van een fasecontrastmicroscoop met een 20x-objectief. Na herprogrammering verandert de celmorfologie van lange, spindelachtige fibroblasten naar kleine, ronde hiPSC's, met een hoge kern-tot-lichaamsverhouding die groeit in kolonies met verschillende grenzen (figuur 2C).
- Als de hiPSC-kolonies te dicht worden en spontane differentiatie optreedt, schraapt u de gedifferentieerde delen van de plaat met behulp van een pipetpunt (figuur 3). Aangezien hiPSC's een hoge proliferatiesnelheid hebben, voedt u de hiPSC-culturen elke dag met vers, voorverwarmd hiPSC-voedingsmedium.
- Karakterisering van pluripotentiemarkers door immunofluorescentiekleuring
- Om de gegenereerde hiPSC's te controleren op pluripotentiemarker via immunofluorescentiekleuring, plaatst u plastic afdekplaten in een 24-wells plaat en bedekt u met 250 μL coatingoplossing gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2. Vervang de coatingoplossing door 1 ml voorverwarmd hiPSC-kweekmedium met 10 μM ROCK-remmer Y27632.
- Zaad 1,9 x 104 gedissocieerde hiPSC's per 24-put. Laat de hiPSC's een nacht hechten bij 37 °C en 5% CO2 zonder verstoring. Zie stap 5.4 tot en met 5.6 voor dissociatie van de hiPSC's. Vervang het medium de volgende dag door hiPSC kweekmedium zonder ROCK-remmer Y27632.
- Was voor het kleuren de cellen met 1 ml voorverwarmde 1x PBS en fixeer vervolgens de hiPSC's met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de vaste hiPSC's met 1x PBS en blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen met 200 μL preïncubatieoplossing per put gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verdun primaire antilichamen Ki67 (1:300), OCT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) in antilichaamverdunningsmiddel.
- Reinig een plastic folie met 70% ethanol en plaats deze in een vlekkamer gevuld met een waterreservoir. Plaats druppeltjes van 30 μL primaire antilichaamverdunningen op de folie. Plaats de vaste monsters ondersteboven in de verdunning en incubeer een nacht bij 4 °C.
- Was de monsters de volgende dag drie keer met 1x PBS gedurende 5 minuten en plaats 30 μL druppeltjes secundaire antilichaamverdunningen (1:1.000) op schone plekken op de folie. Leg de dekselglaasjes ondersteboven in de verdunning. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
- Na incubatie drie keer wassen met 1x PBS gedurende 5 min. Monteer de monsters op glasplaten in het montagemedium dat DAPI bevat. Laat een nacht drogen bij kamertemperatuur en in het donker en breng de monsters in beeld met een confocale microscoop (figuur 4).
- Uitsluiting van bacteriën en mycoplasmabesmetting
- Om bacteriebesmetting uit te sluiten, brengt u 500 μL gedissocieerde hiPSC's over op 5 ml voorverwarmd Luria-Bertani (LB) medium. Zie stap 5.4 tot en met 5.6 voor dissociatie van de hiPSC's. Incubeer een nacht bij 37 °C. Als het LB-medium troebel lijkt, is er waarschijnlijk bacteriebesmetting opgetreden. Gooi de cellen weg.
- Om mycoplasmabesmetting uit te sluiten, verzamelt u medium dat gedurende 2 dagen niet is vervangen uit 6 putten met ongeveer 90% confluente hiPSC's. Gebruik kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) om mycoplasmabesmetting te detecteren. Veel commerciële mycoplasma detectiekits zijn beschikbaar voor dit doel.
8. Differentiatie van hiPSC's in podocyten
- Bereiding en opslag van groeifactoren
- Om een stamconcentratie van 10 mM Y27632 te bereiden, reconstitueert u 10 mg Y27632 (molecuulgewicht van 320,26 g/mol) in 3,12 ml steriel water. Bewaar 100 μL aliquots bij -20 °C en verdun 1:1.000 in celkweekmedium tot een eindconcentratie van 10 μM.
- Om een stamconcentratie van 30 mM CHIR99021 te bereiden, reconstitueert u 5 mg CHIR99021 (molecuulgewicht van 465,34 g/mol) in 358,2 μl steriele DMSO. Bewaar 50 μL aliquots bij -20 °C en verdun 1:10.000 in celkweekmedium tot een eindconcentratie van 3 μM.
- Om een stamconcentratie van 100 μg/ml activine A te bereiden, reconstitueert u 100 μg activine A in 1 ml 1x PBS met 0,1% runderserumalbumine (BSA). Bewaar 100 μL aliquots bij -20 °C en verdun 1:2.000 in celkweekmedium tot een eindconcentratie van 50 ng/ml.
- Om een stamconcentratie van 100 μg/ml botmorfogeen eiwit 7 (BMP7) te bereiden, reconstitueert u 100 μg BMP7 in 1 ml steriel water met 0,1% BSA. Bewaar 100 μL aliquots bij -20 °C en verdun 1:2.000 in celkweekmedium tot een eindconcentratie van 50 ng/ml.
- Om een stamconcentratie van 100 μg/ml vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) te bereiden, reconstitueert u 100 μg VEGF in 1 ml steriel water. Bewaar 100 μL aliquots bij -20 °C en verdun 1:4.000 in celkweekmedium tot een eindconcentratie van 25 ng/ml.
- Om een 10 mM stockconcentratie van all-trans retinoïnezuur te bereiden, reconstitueert u 10 mg all-trans retinoïnezuur in 3,33 ml steriele DMSO. Bewaar 100 μL aliquots bij -20 °C en verdun 1:100 in celkweekmedium tot een eindconcentratie van 0,5 μM.
- Activering van WNT-signaleringsroute om mesoderm-afstamming te induceren
- Voor differentiatie van hiPSC's in van hiPSC afgeleide podocyten, coatcelkweekplaten of kolven geschikt voor hiPSC-cultuur met coatingoplossing gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2. Het totale volume van de coatingoplossing is 1 ml per kweekplaat met 6 putten of 4 ml per celkweekplaat van 10 cm.
- Zuig het medium aan en was de hiPSC's met voorverwarmde 1x PBS. Zuig de PBS aan en voeg een enzymatische celloslatingsoplossing toe die 10 μM Y27632 bevat met een totaal volume van 1 ml per 6-well kweekplaat of 4 ml per 10 cm celkweekplaat.
- Plaats de plaat terug in de incubator en incubeer gedurende 4 minuten bij 37 °C en 5% CO2. Spoel de hiPSC's van de plaat met een pipet van 1.000 μL. Breng de losgemaakte cellen over in een conische buis.
- Was de plaat met vers, voorverwarmd hiPSC-kweekmedium met 10 μM ROCK-remmer Y27632. Bundel het wasmedium in de conische buis om het dissociatiereagens te neutraliseren. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de celpellet met 2 ml vers, voorverwarmd hiPSC-kweekmedium dat 10 μM ROCK-remmer Y27632 bevat.
- Tel de cellen en zaai 1 x 104 hiPSC's/cm2. Verdeel de cellen door drie keer in alle richtingen te roeren. Laat de hiPSC's een nacht hechten bij 37 °C met 5% CO2 zonder verstoring.
- Vervang het medium de volgende dag door 2 ml voorverwarmd mesodermdifferentiatiemedium met 1x B27-supplement, 1% penicilline-streptomycine, 3 μM CHIR99021, 50 ng / ml activine A en 10 μM ROCK-remmer Y27632.
- Differentiatie in nefron voorlopercellen
- Verander na 2 dagen het mesodermmedium in 2 ml voorverwarmd nefronvoorloperdifferentiatiemedium met 1x B27-supplement, 1% penicilline-streptomycine, 3 μM CHIR99021, 50 ng / ml activine A en 50 ng / ml BMP7 per 6-well kweekplaat of 6 ml per 10 cm celkweekplaat. Verander het medium om de dag gedurende de komende 14 dagen.
OPMERKING: Nefron voorlopercellen prolifereren en kunnen worden gepasseerd en ingevroren na 7 dagen differentiatie in nefron voorloperexpansiemedium. - Om de nefronvoorlopercellen te splitsen, bedekt u de celkweekplastics die geschikt zijn voor hiPSC-cultuur gedurende 1 uur bij 37 °C. Vervang de coatingoplossing door nefron voorloperexpansiemedium. Zuig de media aan en was de cellen met voorverwarmde 1x PBS. Verwijder de PBS en dissocieer de cellen met 1x trypsine-EDTA.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C en 5% CO2. Controleer het loslaten van de cellen met behulp van een fasecontrastmicroscoop. Tik indien nodig tegen de zijkant van het plastic om de cellen van het oppervlak los te maken. Spoel de cellen van de plaat en breng ze over in een conische buis. Was de lege kolf of plaat met hetzelfde volume voorverwarmd nefronvoorloperexpansiemedium als het dissociatiereagens.
- Bundel het wasmedium in de conische buis. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de celkorrel met 2 ml vers, voorverwarmd nefronvoorloperexpansiemedium. Tel de cellen en zaad 1,5 x 104 nefron voorlopercellen per cm2 voor verdere differentiatie.
OPMERKING: Om de nefronvoorlopercellen te bevriezen, resuspensie 1 x 106 cellen in 1 ml koud serumvrij cryopreservatiemedium en overgebracht naar een cryovial. Bevries in een vriescontainer bij -80 °C gedurende een nacht en breng over naar een tank met vloeibare stikstof voor langdurige opslag. - Plaats de platen terug in de couveuse en verdeel de cellen gelijkmatig door drie keer in alle richtingen te roeren. Verander het medium de volgende dag in vers, voorverwarmd nefron voorloperdifferentiatiemedium. Vervang het medium om de dag totdat de cellen gedurende 14 dagen zijn gedifferentieerd in nefron voorloperdifferentiatiemedium.
- Verander na 2 dagen het mesodermmedium in 2 ml voorverwarmd nefronvoorloperdifferentiatiemedium met 1x B27-supplement, 1% penicilline-streptomycine, 3 μM CHIR99021, 50 ng / ml activine A en 50 ng / ml BMP7 per 6-well kweekplaat of 6 ml per 10 cm celkweekplaat. Verander het medium om de dag gedurende de komende 14 dagen.
- Terminale differentiatie in hiPSC-afgeleide podocyten
- Zuig het medium aan en voeg 2 ml voorverwarmd podocytendifferentiatiemedium toe met 1x B27-supplement, 1% penicilline-streptomycine, 3 μM CHIR99021, 50 ng / ml activine A, 50 ng / ml BMP7, 25 ng / μL VEGF en 0,5 μM volledig trans retinoïnezuur per 6-well kweekplaat of 6 ml per 10 cm celkweekplaat. Plaats de platen terug in de incubator bij 37 °C en 5% CO2. Vervang het medium om de andere dag gedurende 4 dagen met vers, voorverwarmd podocytendifferentiatiemedium.
- Om de hiPSC-podocyten na differentiatie in cultuur te houden, voedt u de cellen twee keer per week met podocytenonderhoudsmedium dat 10% foetaal kalfsserum, 1% penicilline-streptomycine en 0,1% insuline-transferrine-selenium bevat.
OPMERKING: Terminale gedifferentieerde hiPSC-podocyten vermenigvuldigen zich niet meer. Het is echter mogelijk om ze tot 4 weken in celkweek te houden.
- Ontdooien en uitzetten van bevroren nefron voorlopercellen
- Bekleed een nieuwe plastic kolf voor celkweek geschikt voor hiPSC-kweek gedurende 1 uur met coatingoplossing bij 37 °C en 5% CO2. Vervang de coatingoplossing door 5 ml nefron voorloperexpansiemedium.
- Bereid een conische buis van 15 ml met 7 ml voorverwarmd nefronvoorloperexpansiemedium. Ontdooi de bevroren cellen bij 37 °C in een waterbad zonder beweging gedurende ongeveer 20 s. Haal de cryovial uit het waterbad als de helft van de cellen is ontdooid en er wat ijs overblijft.
- Spuit de cryovial in met 70% ethanol en plaats in een bioveiligheidskast. Breng ontdooide cellen over naar de conische buis met het voorverwarmde nefron voorloperexpansiemedium. Gebruik een pipet van 1.000 μL en laat de cellen heel langzaam langs de wand van de buis lopen.
- Was de lege cryoviaal met 1 ml nefron voorloperexpansiemedium om de resterende cellen te verzamelen en zich in de conische buis te verzamelen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g bij 20 °C en resuspensie van de celpellet in vers, voorverwarmd expansiemedium voor nefronvoorlopercellen.
- Breng de ontdooide cellen over in de gecoate kolf en verander het medium de volgende dag in vers, voorverwarmd nefronvoorloperexpansiemedium. Laat de cellen vóór verdere differentiatie zich vermenigvuldigen in het expansiemedium van de nefronvoorloper door het medium om de andere dag te veranderen en ga verder met stap 8.3.5.
9. Karakterisering van van hiPSC afgeleide podocyten door immunofluorescentiekleuring
- Om de gedifferentieerde podocyten te controleren op de podocyt-specifieke marker via immunofluorescentiekleuring, plaatst u plastic coverslips in een 24-wells plaat en bedekt u met 250 μL coatingoplossing gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2. Vervang de coatingoplossing door 1 ml voorverwarmd nefronvoorloperexpansiemedium. Zaad 2,5 x 104 gedissocieerde nefron voorlopercellen per 24-well plaat. Zie de stappen 8.3.2 tot en met 8.3.4 voor dissociatie van nefronvoorlopercellen.
- Laat de cellen zich een nacht hechten bij 37 °C en 5% CO2 zonder verstoring. Vervang het medium de volgende dag door voorverwarmd nefron voorloperdifferentiatiemedium.
- Voltooi differentiatie door het medium om de dag te veranderen totdat de cellen in totaal 14 dagen zijn gedifferentieerd in nefron voorloperdifferentiatiemedium en nog eens 5 dagen in podocytendifferentiatiemedium.
- Na de laatste differentiatie was u de cellen met 1 ml voorverwarmde 1x PBS. Bevestig de hiPSC-podocyten met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de vaste cellen met 1x PBS en blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen met 200 μL preïncubatieoplossing per put gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verdun de primaire antilichamen synaptopopodie (1:200), podocine (1:100) en nefrine (1:25) in antilichaamverdunningsmiddel en plaats druppeltjes van 30 μL primaire antilichaamverdunning op een schone plastic folie in een kleuringskamer met een waterreservoir.
- Plaats afdekglaasjes met vaste hiPSC-podocyten ondersteboven in de verdunning. Incubeer een nacht bij 4 °C. De volgende dag drie keer wassen met 1x PBS gedurende 5 min. Verdun de secundaire antilichamen (1:1.000) in 1x PBS en plaats druppeltjes van 30 μL secundaire antilichaamverdunning op schone plekken op de folie. Leg de dekselglaasjes ondersteboven in de verdunning.
- Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Na incubatie drie keer wassen met 1x PBS gedurende 5 min. Monteer de monsters op glasplaten in een montagemedium dat DAPI bevat. Laat een nacht drogen bij kamertemperatuur en in het donker. Beeld de monsters af met een confocale microscoop.
Representative Results
Met dit stapsgewijze protocol dat episomale herprogrammering en differentiatie combineert, is het mogelijk om podocyten te genereren die de mutatie van een patiënt in een podocytenrelevant gen dragen. Dit maakt de analyse van ziektespecifieke podocytenveranderingen ex vivo mogelijk. De genetische achtergrond van de patiënt blijft tijdens het protocol behouden tijdens alle verschillende celstadia. Bovendien kan de beperking van onvoldoende celaantal terminaal gedifferentieerde niet-prolifererende podocyten worden overwonnen door hiPSC-afgeleide podocyten te gebruiken. Hoewel het enkele maanden duurt voordat hiPSC-podocyten worden gegenereerd uit ontgroeide dermale fibroblasten via herprogrammering in hiPSC's en daaropvolgende differentiatie in podocyten, is het mogelijk om cellen te bevriezen in drie verschillende stappen van het protocol (figuur 2). Invriezen is mogelijk voor fibroblasten, hiPSC's en nefronvoorlopercellen na differentiatie in nefronvoorloperdifferentiatiemedium gedurende 7 dagen. Daarom is het genereren van werkende celbanken en grootschalige experimenten mogelijk.
Figuur 2: Individuele stappen van het protocol door een fasecontrastmicroscoop. (A) Ontgroeide dermale fibroblasten. B) hiPSC-kolonievorming na herprogrammering. (C) Geselecteerde hiPSC-cultuur. (D) Mesodermcellen na 2 dagen differentiatie. (E) Nefronvoorlopercellen na 14 dagen differentiatie in nefron voorloperdifferentiatiemedium. (F) Terminale gedifferentieerde hiPSC-afgeleide podocyten. Schaalstaven vertegenwoordigen 300 μm (A,B,D-F) en 150 μm (C). De sneeuwvlok markeert mogelijke vriesstappen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Omdat de gegenereerde hiPSC-afgeleide podocyten een lang protocol doorlopen met drastische veranderingen met betrekking tot celtype en morfologie, is celkarakterisering verplicht. Celmorfologie, zoals grootte en celvorm, evenals groeigedrag, kan worden gevolgd met behulp van een fasecontrastmicroscoop. Fibroblasten vertonen een lang spindelachtig fenotype met een grootte van 150 μm tot 300 μm (figuur 2A). Na herprogrammering ontstaan kolonies met 50 μm kleine hiPSC's. Deze kolonies vertonen verschillende grenzen en hiPSC's onderscheiden met een hoge kern-tot-lichaam verhouding en verhoogde proliferatiesnelheid (figuur 2C). Aangezien podocyten terminaal gedifferentieerde cellen zijn, neemt de proliferatiesnelheid af met progressieve differentiatie en verandert de celmorfologie in 300 μm grote stervormige podocyten met prominente voetprocessen (figuur 2F).
Confluentie is een kritiek punt van hiPSC-cultuur en spontane differentiatie kan optreden wanneer kolonies te dicht worden (figuur 3). Deze kolonies moeten worden verwijderd voordat ze passeren door de aangetaste delen van de kweekschaal te schrapen.
Figuur 3: Voorbeelden van hiPSC's van verschillende kwaliteit. Fasecontrastbeelden van succesvol (A) geherprogrammeerde hiPSC-kolonies en (B) geselecteerde hiPSC's, evenals (C) spontane differentiatie, (D,E) niet-hiPSC-kolonies en (F) een te dichte hiPSC-cultuur. Schaalbalken vertegenwoordigen 300 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De verschillende celtypen van dit protocol moeten worden gevalideerd met betrekking tot de expressie van een specifieke marker. Na herprogrammering herwinnen hiPSC's pluripotentiecapaciteit en drukken ze proliferatie- en pluripotentiemarkers uit zoals SSEA4, OCT3/4 en Ki67 (figuur 4)38,39,40. Het is bekend dat herprogrammering, evenals de langdurige cultuur van hiPSC's en differentiatie, kan leiden tot een abnormaal karyotype, of liever mutaties kan induceren41. Daarom moet de genetische achtergrond van de gekweekte cellen in de loop van de tijd en bij verschillende passages worden gecontroleerd door g-banding en whole exome sequencing.
Figuur 4: Karakterisering van gegenereerde hiPSC's door immunofluorescentiekleuring. Karakterisering van gegenereerde hiPSC's door kleuring voor (A) de proliferatieve marker Ki67, evenals de pluripotentiemarkers (B) OCT3/4 en (C) SSEA4. Schaalstaven vertegenwoordigen 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Morfologisch gezien lijken hiPSC-afgeleide podocyten stervormig en drukken ze een duidelijk netwerk van lange primaire en secundaire voetprocessen uit in vergelijking met ciPodocyten (figuur 5). HiPSC-afgeleide podocyten drukken podocyt-specifieke markereiwitten zoals synaptopopoline, nefrine en podocine uit (figuur 6A-C)42.
Figuur 5: Morfologie van hiPSC-afgeleide podocyten in vergelijking met ciPodocyten. Vergelijking van (A,B) hiPSC-afgeleide podocyten van een gezonde donor met (C,D) ciPodocyten met betrekking tot celmorfologie en filopodia met behulp van een fasecontrastmicroscoop (A,C) en scanningelektronenmicroscoop (B,D). Schaalstaven vertegenwoordigen 150 μm (A,C) en 20 μm (B,D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Daarom maakt de vergelijking van hiPSC-afgeleide podocyten, niet alleen van gezonde donoren, maar ook van patiënten met mutaties in podocyt-specifieke genen, een geïndividualiseerde karakterisering van de mutatie van de patiënt ex vivo mogelijk.
Figuur 6: Karakterisering van een podocyt-specifieke marker in hiPSC-afgeleide podocyten en ciPodocyten. Vergelijking van (A-C) hiPSC-afgeleide podocyten van een gezonde donor met (D-F) ciPodocyten met betrekking tot podocyt-specifieke markereiwitten synaptopopodie (A,D), nefrine (B,E) en podocine (C,F). Schaalbalken vertegenwoordigen 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. Samenstelling van alle celkweekmedia en -oplossingen die in het onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
Dit op celcultuur gebaseerde protocol combineert de episomale herprogrammering van menselijke dermale fibroblasten in patiëntspecifieke hiPSC's en daaropvolgende differentiatie in hiPSC-afgeleide podocyten. Dit stelt ons in staat om mutatiegerelateerde veranderingen van podocyten van patiënten met genetische glomerulaire ziekte met betrekking tot podocytenbeschadiging te bestuderen. Het protocol om dermale fibroblasten te herprogrammeren met een integratievrije methode door elektroporatie is aangepast aan het gepubliceerde werk van Bang et al.32 en Okita et al.33. Het protocol om podocyten te onderscheiden van hiPSC's is aangepast van het gepubliceerde protocol van Musah et al.28,34,35. Er zijn al publicaties beschikbaar die de generatie van podocyten uit hiPSC'sbeschrijven 27,34,35. Het protocol dat hier wordt aangeboden, is echter geoptimaliseerd en goedkoper met betrekking tot de differentiatie van hiPSC's in podocyten. Vergeleken met het gepubliceerde protocol van Musah et al., hebben we dit protocol getest op verschillende coatingreagentia, zoals vitronectine, laminine silk-511 en opgeloste keldermembraanmatrix. De concentraties van vitronectine en laminine zijde-511 konden worden verlaagd tot 2,5 μg/ml in plaats van 5 μg/ml 28,34,35. Bovendien was het mogelijk om de concentraties van BMP7 en activine A-twee zeer dure groeifactoren met 50% te verlagen, van 100 ng / ml tot 50 ng / ml.
Dit maakt goedkopere differentiatie mogelijk. Nefron-voorlopercellen vanaf dag 7 waren nog steeds aan het vermenigvuldigen en de mogelijkheid van bevriezing was eerder aangetoond. We breidden deze cellen uit na het ontdooien en vóór de uiteindelijke differentiatie in basismedium met Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) en B27 gedurende enkele dagen, waardoor de kosten nog verder daalden. Naast de differentiatiestappen beschrijft dit protocol de uitgroei van fibroblasten uit huidbiopten met daaropvolgende generatie patiëntspecifieke hiPSC's via episomale herprogrammering. De combinatie van deze twee methoden maakt het genereren van patiëntspecifieke podocyten mogelijk. Daarom wordt hier een compleet stapsgewijs protocol gegeven om patiëntspecifieke hiPSC-afgeleide podocyten te genereren die niet eerder in zo'n detail zijn beschreven.
Omdat het algemene protocol verschillende celtypen bevat, is het cruciaal om de gegenereerde celtypen in verschillende stappen te karakteriseren. Cellen zijn gedurende een langere periode in cultuur, dus kwaliteitscontrole moet op verschillende passages worden uitgevoerd. Bij het werken met hiPSC's is dagelijkse voeding en celgedrag en morfologiemonitoring noodzakelijk. De steriliteit van de differentiatiemedia moet worden gewaarborgd door filtersterilisatie door een filter van 0,2 μm. Het hele protocol, van huidbiopsie tot hiPSC-afgeleide podocyten, duurt enkele maanden, maar het is mogelijk om de cellen in verschillende stadia van het proces te bevriezen. Fibroblasten, geselecteerde hiPSC-klonen en proliferatieve nefronvoorlopercellen na 7 dagen in nefron-voorloperdifferentiatiemedium kunnen worden ingevroren en een werkende celbank kan worden gegenereerd.
Hoewel van hiPSC afgeleide gezonde podocyten een duidelijk netwerk van primaire en secundaire voetprocessen ontwikkelen (figuur 5A, B) en typische podocytspecifieke marker uitdrukken (figuur 6A-C), zijn karakteristieke spleetmembranen, zoals in vivo gezien, moeilijk na te bootsen in klassieke tweedimensionale celcultuurmodellen. Bovendien is intercellulaire communicatie met andere glomerulaire celtypen niet mogelijk in deze monocultuursetting.
Vanwege hun terminale gedifferentieerde toestand en gebrek aan proliferatiecapaciteit is het moeilijk om podocyten ex vivo te bestuderen. Met behulp van voorwaardelijk vereeuwigende primaire podocyten is het mogelijk om deze beperking te overwinnen door het inbrengen van een thermosensitieve schakelaar, resulterend in een celkweekmodel waarbij cellen prolifereren bij 33 °C en differentiëren bij 37 °C13,14. Hoewel deze ciPodocyten een hoog potentieel hebben voor podocytenonderzoek, zijn er beperkingen, zoals het ontbreken van markerexpressie, gededifferentieerde morfologie en het niet vormen van voetprocessen15,16.
De differentiatie van podocyten van van de patiënt afgeleide somatische cellen maakt het mogelijk om zieke podocyten te genereren en te vergelijken met gezonde controlecellen ex vivo. Dit stelt ons in staat om podocytenschade te bestuderen als gevolg van mutaties in podocyt-specifieke genen. Bovendien heeft het werken met hiPSC's het potentieel voor het creëren van driedimensionale celkweekziektemodellen, of beter gezegd organoïden43,44. Co-cultuur van hiPSC-afgeleide podocyten met andere glomerulaire cellen, zoals glomerulaire endotheelcellen of mesangiale cellen, kan leiden tot nieuwe inzichten met betrekking tot intercellulaire communicatie in gezondheid en glomerulaire ziekte.
Bovendien kan de karakterisering en behandeling van de patiëntspecifieke podocyten ex vivo worden uitgevoerd in high-throughput analyse. De geïndividualiseerde aanpak opent de mogelijkheid om nieuwe therapeutische doelen voor specifieke mutaties te onderzoeken en in de toekomst geïndividualiseerde geneeskunde uit te voeren.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) van de Friedrich-Alexander Universiteit Erlangen-Nürnberg met het subsidienummer M4-IZKF-F009 gegeven aan Janina Müller-Deile, en door Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) onder de projectnaam STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, subsidienummer 01GM2202D gegeven aan Janina Müller-Deile. We bedanken Annalena Kraus voor de steun bij het maken van SEM-beelden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm sterile filter | Rotilab | P668.1 | for sterilization of differentiation medium |
| all-trans retinoic acid | Stem Cell Technologies | 72262 | supplement for differentiation |
| B27 supplement (50 x), serum free | Gibco | 17504044 | supplement for serum-free differentiation medium |
| BG iMatrix-511 Silk | biogems | RL511S | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| Bovine serum albumin (BSA) | Roth | 8076.4 | |
| CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL | Greiner bio-one | 82050-856 | cell culture plastics suitable for fibroblast culture |
| CHIR99021 (5 mg) | Sigma-Aldrich | 252917-06-9 | supplement for differentiation |
| Corning Matrigel hESC qualified matrix | Corning | 354277 | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix) |
| countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | to count cells |
| countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | to count cells | |
| cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white | Sarstedt | 72380 | cryovials for freezing of cells |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Roth | A994.1 | for fibroblast freezing medium |
| DMEM/F12 (1:1) (1 x) | Gibco | 11320074 | basic medium for differentiation |
| DMEM/F12 + Glutamax | Gibco | 10565018 | basic medium for fibroblast medium |
| EVOS M5000 Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | phase contrast microscope |
| fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) | PAN Biotech | P301902 | serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium |
| fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile | Fisherbrand | FB104 | cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap) |
| fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | mounting medium containing dapi |
| gauge needle (0.6 x 30 mm) | BD Microlance3 | 300700 | for separation of hiPSC colonies into small pieces |
| human Recombinant Activin A Protein | 78001.1 | Stem cell technologies | supplement for differentiation |
| human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) | Peprotech | 120-03P | supplement for differentiation |
| human VEGF-165 Recombinant Protein | Thermo Scientific | PHC9394 | supplement for differentiation |
| insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) | Gibco | 41400045 | supplement for podocyte maintenance medium |
| LB medium | Roth | X964.1 | for sterility test of hiPSC culture |
| lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit | Sigma Aldrich | MP0035-1KT | commercial mycoplasma detection kit |
| microscope slides | Diagonal GmbH & Co.KG | 21,102 | |
| microtube 1.5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| mTeSR1 Complete Kit | Stem Cell Technologies | 85850 | basic medium for serum-free hiPSC culture medium |
| nalgene freezing container Mr.Frosty | Roth | AC96.1 | to ensure optimal freezing conditions |
| normal goat serum | abcam | ab 7481 | for preincubation solution and antibody diluent |
| nunc 24 well plates | Thermo Scientific | 142485 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nunc 48 well plates | Thermo Scientific | 152640 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nunc 6 well plates | Thermo Scientific | 140685 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nunc EasYDish Dishes 100 mm | Thermo Scientific | 150466 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 167008 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nutriFreez D10 Cryopreservation Medium | Sartorius | 05-713-1E | serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells |
| Opti-MEM | Gibco | 11058021 | electroporation medium |
| pCXLE-hMLN | Addgene | #27079 | plasmid for episomal reprogramming |
| pCXLE-hOCT3/4 plasmid | Addgene | #27077 | plasmid for episomal reprogramming |
| pCXLE-hSK plasmid | Addgene | #27078 | plasmid for episomal reprogramming |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | to avoid bacterial contamination |
| plastic coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes |
| ROTI Histofix | Roth | P087.3 | commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells |
| RPMI 1640 + L-Glutamine | Gibco | 21875034 | basic medium for podocyte maintenance medium |
| staining chamber StainTray Black lid | Roth | HA51.1 | |
| stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs |
| sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) | Gibco | 14190094 | used for washing and coating |
| sterile water | Roth | T1432 | |
| syringe without needle 20 mL | BD Plastipak | 300629 | to filter sterilize differentiation medium |
| TC dish 100 mm | Sarstedt | 8,33,902 | sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture |
| TC dish 35 mm | Sarstedt | 8,33,900 | sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy |
| triton X 100 | Roth | 3051.3 | for preincubation solution |
| trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | to count cells |
| trypsin-EDTA (10 x) | Biowest | X0930-100 | dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells |
| tube 15 mL | Greiner bio-one | 188271-N | |
| tube 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| vitronectin ACF | Sartorius | 05-754-0002 | extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| Y-27632 dihydrochloride (10 mg) | Tocris | 1254 | to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting |
| Primary antibodies | |||
| OCT4 | Stem Cell Technologies | 60093.1 | pluripotency marker, dilution 1:200 |
| SSEA-4 | Stem Cell Technologies | 60062FI.1 | pluripotency marker, dilution 1:100 |
| Ki67 | Abcam | ab15580 | proliferation marker, dilution 1:300 |
| synaptopodin | Proteintech | 21064-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:200 |
| nephrin | Progen | GP-N2 | podocyte-specific marker, dilution 1:25 |
| podocin | proteintech | 20384-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:100 |
| Secondary antibodies | |||
| goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21435 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
| alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A31634 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
| donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
| goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
| goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
References
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Grgic, I., et al. Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).
- Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub. Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).
- Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D.
- Schell, C., Huber, T. B. The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).
- Muller-Deile, J., Schiffer, M. Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out. Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).
- Boehlke, C., et al. Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement. American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).
- Schiffer, M., et al. Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models. Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).
- Kopp, J. B., et al.
- Wiggins, R. C. The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases. Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).
- Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Saleem, M. A., et al. A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).
- Eto, N., et al. Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression. Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).
- Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T.
- Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).
- Shih, N. Y., et al. CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain. The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).
- Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).
- Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. Dipping your feet in the water: podocytes in urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).
- Camici, M.
- Muller-Deile, J., et al. Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 3621 (2018).
- Schenk, H., et al. Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb. Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).
- Petermann, A., Floege, J. Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity. Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).
- Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).
- Petermann, A. T., et al. Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable. Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).
- Sakairi, T., et al. Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).
- Rauch, C., et al. Differentiation of human iPSCs into functional podocytes. PLoS One. 13 (9), e0203869 (2018).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell. Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).
- Bang, J. S., et al. Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts. Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
- Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299 (2020).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).
- Hoffding, M. K., Hyttel, P. Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).
- Bharathan, S. P., et al. Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells. Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
- Vaz, I. M., et al. Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming. Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147 (2021).
- Reiser, J., Altintas, M. M.
- Ohmori, T., et al. Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells. Scientific Reports. 11 (1), 3982 (2021).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
