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Biology

Geração de Podócitos Derivados do Paciente a partir de Biópsias de Pele

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65364
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Nephrology and Hypertension, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University (FAU) Erlangen-Nürnberg, 2Research Center on Rare Kidney Diseases (RECORD), University Hospital Erlangen

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo de duas etapas para gerar podócitos específicos do paciente a partir de fibroblastos dérmicos via reprogramação epissomal em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) e subsequente diferenciação em podócitos.

Abstract

Os podócitos são células epiteliais situadas no sítio urinário da barreira de filtração glomerular que contribuem para a função filtrante seletiva do glomérulo. Mutações em genes específicos de podócitos podem causar glomeruloesclerose segmentar e focal (GESF), e podócitos também são afetados em muitas outras nefropatias primárias e secundárias. Devido à sua natureza diferenciada, os modelos de cultura celular primária são limitados para podócitos. Portanto, células comumente imortalizadas condicionalmente são usadas. No entanto, esses podócitos condicionalmente imortalizados (ciPodócitos) têm várias limitações: as células podem se desdiferenciar em cultura, especialmente quando atingem confluência, e vários marcadores específicos de podócitos são apenas ligeiramente ou não são expressos. Isso coloca em questão o uso de ciPodócitos e sua aplicabilidade para alcance fisiológico, fisiopatológico e clínico. Aqui, descrevemos um protocolo para a geração de podócitos humanos - incluindo podócitos específicos do paciente - a partir de uma biópsia por punch de pele por reprogramação epissomal de fibroblastos dérmicos em hiPSCs e posterior diferenciação em podócitos. Esses podócitos se assemelham muito melhor aos podócitos in vivo em termos de características morfológicas, como o desenvolvimento de processos podais e a expressão do marcador específico de podócitos. Finalmente, mas importante, essas células mantêm as mutações dos pacientes, resultando em um modelo ex vivo aprimorado para estudar doenças podocitárias e potenciais substâncias terapêuticas em uma abordagem individualizada.

Introduction

Os podócitos são células epiteliais renais pós-mitóticas especializadas que formam a barreira de filtração glomerular do rim, juntamente com a membrana basal glomerular (MBG), células endoteliais glomerulares e glicocálice. Fenotipicamente, os podócitos consistem de um corpo celular e extensões primárias de membrana conduzidas por microtúbulos, bem como extensões secundárias denominadas processos podais 1,2. A barreira de filtração glomerular que filtra a urina do sangue é constituída por endotélio fenestrado, GBM, e um tipo especializado de junção intercelular que conecta processos podocitários vizinhos do pé, chamado diafragma de fenda de podoctyes3. Em condições saudáveis, proteínas maiores que a albumina são retidas da barreira de filtração devido ao seu tamanho e carga4.

Mutações em genes específicos do citoesqueleto ou podócitos, bem como fatores circulantes que afetam as vias de sinalização podocitária, são conhecidos por induzir apagamento, descolamento ou apoptose de podócitos, resultando em proteinúria e esclerose glomerular. Em particular, o rearranjo citoesquelético, mudanças na polaridade podocitária ou danos dos processos podais com perda associada das junções da fenda sãofundamentais5. Devido ao seu status terminalmente diferenciado, os podócitos dificilmente podem ser substituídos após o descolamento do GBM. No entanto, se os podócitos estiverem aderidos ao GBM, eles ainda podem se recuperar do apagamento e reformar os processos interdigitais do pé 6,7,8. Uma maior compreensão dos eventos que levam a danos podocitários em várias desordens glomerulares pode fornecer novos alvos terapêuticos que ajudarão no desenvolvimento de tratamentos para essas doenças. O dano podocitário é uma característica de diferentes doenças glomerulares, incluindo glomeruloesclerose segmentar e focal (GESF), nefropatia diabética, doença de lesões mínimas e glomerulonefropatia membranosa, exigindo modelos confiáveis ex vivo de podócitos para estudar os mecanismos patológicos e as abordagens potenciais de tratamento para essas doenças 9,10. Os podócitos podem ser estudados ex vivo por cultura celular primária clássica baseada no isolamento de glomérulos por peneiramentodiferencial11. No entanto, devido ao estado terminalmente diferenciado com capacidade de proliferação limitada, a maioria dos pesquisadores usa linhagens celulares de camundongos ou humanos que expressam variantes sensíveis à temperatura do antígeno T grande SV40. Alternativamente, os ciPodócitos são isolados de camundongos transgênicos que abrigam o gene imortalizante SV40 Tag 1,12.

Os crivócitos proliferam a 33 °C, mas entram em parada de crescimento e começam a se diferenciar a 37 °C13,14. Deve-se ter em mente que os dados experimentais obtidos com essas células devem ser interpretados com certa cautela, uma vez que as células são geradas por inserção gênica não natural15. Como essas células abrigam um gene imortalizante, a fisiologia celular é alterada devido à proliferação contínua12. Linhagens de podocitários geradas por essa abordagem têm sido recentemente questionadas, uma vez que ciPodócitos de camundongos, humanos e ratos expressam menos de 5% de sinaptopodina e nefrina em nível de proteína, bem como NPHS1 e NPHS2 em nível de RNAm em comparação com a expressão glomerular16. Além disso, a maioria das linhagens de podocitários não expressa nefrina17,18. Chittiprol e col. também descreveram diferença significativa na motilidade celular e nas respostas à puromicina e doxorrubicina em ciPodócitos16. Podócitos podem ser encontrados na urina após descolamento do GBM em diferentes doenças glomerulares 19,20,21,22. Podócitos urinários viáveis podem ser cultivados ex vivo por até 2-3 semanas, mas a maioria das células sofre apoptose23,24. Curiosamente, os podócitos não são encontrados apenas na urina de pacientes com doença glomerular, mas também na urina de indivíduos saudáveis, provavelmente quando estão senescentes novamente com um potencial limitado de replicação em cultura24. Além disso, o número de podócitos derivados da urina é limitado, e as células se desdiferenciam em cultura, apresentam menos processos podais, mudam a morfologia e, mais importante, têm capacidade de proliferação limitada. A expressão de genes podocito-específicos está ausente, desaparece em poucas semanas ou varia entre esses clones celulares. Algumas células positivas para o marcador podocitário específico co-expressaram o marcador de células epiteliais tubulares ou miofibroblastos e células mesangiais, o que sugere desdiferenciação e/ou transdiferenciação dos podócitos urinários cultivados24,25.

Recentemente, foi descrita a geração de linhagens celulares de ciPodócitos derivadas da urina de pacientes e voluntários sadios por transdução com antígeno T grande SV40 termossensível e hTERT26. A expressão de RNAm para sinaptopodina, nestina e proteína associada a CD2 foi detectada, mas o RNAm da podocina esteve ausente em todos os clones. Além dos problemas com podócitos urinários, essas células também contêm o gene imortalizante inserido, resultando nas desvantagens discutidas acima.

Em contraste, as células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) têm uma enorme capacidade de se auto-renovar e se diferenciar em vários tipos celulares sob condições apropriadas. Já foi demonstrado anteriormente que as hiPSCs podem servir como uma fonte quase ilimitada de podócitos27,28.

Aqui é descrito um protocolo de duas etapas para gerar podócitos específicos do paciente a partir de fibroblastos dérmicos de biópsias de punch de pele com subsequente reprogramação epissomal em hiPSCs e uma diferenciação final em podócitos derivados de hiPSC (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Protocolo para geração de podócitos derivados da hiPSC específicos do paciente. Visão gráfica do protocolo de geração de podócitos específicos do paciente a partir de fibroblastos dérmicos de uma biópsia de pele através da reprogramação em hiPSCs e diferenciação em podócitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como primeiro passo, fibroblastos somáticos dérmicos foram superados de uma biópsia por punch de pele e reprogramados em hiPSCs usando um método livre de integração por eletroporação com plasmídeos expressando os fatores de transcrição OCT3/4, KLF4, SOX2 e c-MYC 29,30,31. Colônias de hiPSC emergentes foram posteriormente selecionadas e expandidas. A diferenciação iniciou-se com a indução da linhagem mesodérmica pela ativação da via de sinalização WNT, seguida pela geração de células progenitoras de néfrons que ainda eram capazes de proliferar. Finalmente, as células foram diferenciadas em podócitos. Nesse procedimento, modificamos e combinamos protocolos de reprogramação epissomal para geração de hiPSCs de Bang et al.32 e Okita et al.33 publicados anteriormente, bem como um protocolo de diferenciação de hiPSCs em podócitos de Musah et al.28,34,35.

De fato, os podócitos gerados pelo nosso protocolo apresentaram um fenótipo mais próximo dos podócitos in vivo, no que diz respeito ao desenvolvimento de uma rede distinta de processos podais primários e secundários e à expressão de marcadores podocitários específicos, como sinaptopodina, podocina e nefrina. Com o uso de podócitos derivados da hiPSC, o background genético do paciente é mantido durante a reprogramação e diferenciação. Isso permite a modelagem da doença podocitária específica do paciente e a descoberta de potenciais substâncias terapêuticas ex vivo em um número de células quase ilimitado. Além disso, esse protocolo é minimamente invasivo, custo-eficiente, eticamente aceitável e pode facilitar novos caminhos para o desenvolvimento de fármacos.

Protocol

O protocolo foi aprovado pelo comitê de ética da Friedrich-Alexander University Erlangen-Nuremberg (251_18B), e todos os pacientes e probandos assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes. Para a composição de todos os meios e soluções utilizados aqui, consulte a Tabela 1.

1. Crescimento de fibroblastos dérmicos de uma biópsia por punch de pele

  1. Transferir a biópsia de punção de pele para um tubo cônico estéril de 15 mL com 10 mL de meio fibroblasto pré-aquecido.
  2. Retirar o meio e lavar a biópsia por punch de pele três vezes com 5 mL de solução salina estéril pré-aquecida 1x tamponada com fosfato (PBS). Transfira a biópsia de punção de pele com pinça estéril para uma placa de cultura celular de 10 cm e corte-a longitudinalmente em três ou quatro pedaços com bisturi estéril, deixando a epiderme e derme.
  3. Transfira cada peça para uma placa de cultura de células plásticas estéril de 35 mm e pressione-a suavemente na placa de cultura. Retire o excesso de meio ao redor das peças de biópsia. Deixe secar por 5-10 min até que o líquido evapore e a biópsia seja anexada ao plástico de cultura celular.
  4. Adicionar 1 mL de fibroblasto em meio gota a gota com uma pipeta de 1.000 μL ao redor da biópsia e encher cuidadosamente até um volume final de 3 mL. Cultivar a 37 °C, 5% CO2 por 7 dias sem alimentar e movimentar o prato. Mude cuidadosamente o meio para meio de fibroblastos fresco e pré-aquecido. Após 7 dias, fibroblastos fusiformes podem ser monitorados ao redor da biópsia de pele usando um microscópio de contraste de fase36.
    NOTA: Quando os fibroblastos ultrapassados atingirem a borda do prato, prossiga novamente da etapa 1.3 para gerar outro lote de fibroblastos.
  5. Para expansão dos fibroblastos crescidos, lavar com 2 mL de PBS 1x pré-aquecido, dissociar os fibroblastos com 1 mL de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) 1x e incubar por 5 min a 37 °C, 5% CO2. Transfira as células destacadas para um tubo cônico de 15 mL e lave a placa de cultura celular com 2 mL de meio de fibroblastos fresco pré-aquecido.
  6. Colocar o meio de lavagem no tubo para neutralizar o agente de dissociação e centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular com 1 mL de meio de fibroblasto fresco pré-aquecido. Contar as células com câmara de Neubauer ou contador automático de células usando azul de tripano e semente 2,5 x 10 3 a 5 x 103 fibroblastos por cm2 em frascos de cultura de células frescas.
  7. Coloque os frascos de volta na incubadora e distribua as células uniformemente, movendo os frascos três vezes em cada direção. No dia seguinte, substitua o meio por meio fibroblasto fresco e pré-aquecido. Troque o meio duas vezes por semana e divida quando os fibroblastos atingirem em torno de 80% de confluência.

2. Congelamento de fibroblastos dérmicos

  1. Para congelar os fibroblastos, lave-os com 5 mL de PBS 1x pré-aquecido. Aspirar o PBS e dissociar os fibroblastos com 4 mL de 1x tripsina-EDTA. Colocar o balão de volta na incubadora e incubar durante 5-7 min a 37 °C a 5% CO2. Monitorar o descolamento usando um microscópio de contraste de fase e bater na lateral do frasco para desprender as células.
  2. Transfira as células destacadas para um tubo cônico de 15 mL. Lavar o frasco de cultura celular com 5 mL de meio de fibroblasto fresco pré-aquecido. Coloque o meio de lavagem no tubo cônico e centrífuga a 200 x g por 5 min a 20 °C.
  3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular com 2 mL de meio de fibroblasto fresco pré-aquecido. Conte as células e transfira 1 x 106 células para um novo tubo cônico. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C.
  4. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular com 1 mL de meio de congelação de fibroblastos a frio constituído por 90% de soro fetal de bezerro e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Transfira para um criovial, coloque em um recipiente de congelamento e congele durante a noite a -80 °C. Para armazenamento a longo prazo, coloque o criovial em um tanque de nitrogênio líquido no dia seguinte.

3. Reprogramação epissomal de fibroblastos para gerar hiPSCs

  1. Para reprogramação epissomal, utilizar 1,5 x 106 fibroblastos da passagem 4 a 8. Para atingir esse número de células, utilizar de dois a três frascos de 250 mL com cerca de 70% de confluência.
  2. No dia anterior à reprogramação, dividir os fibroblastos na proporção de 1:2 para garantir seu estado proliferativo. Portanto, aspirar o meio e lavar os frascos com 5 mL de PBS pré-aquecido 1x por frasco. Aspirar o PBS e dissociar os fibroblastos com 4 mL de 1x tripsina-EDTA. Colocar os frascos de volta na incubadora e incubar durante 5-7 minutos a 37 °C e 5% CO2. Monitorar o descolamento usando um microscópio de contraste de fase e bater contra a lateral do frasco para desprender as células da superfície plástica.
  3. Transferir as células destacadas para um tubo cônico de 50 mL e lavar os frascos de cultura celular com 5 mL de meio de fibroblastos fresco pré-aquecido. Coloque o meio de lavagem no tubo cônico e centrífuga a 200 x g por 5 min a 20 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 6 mL de meio de fibroblastos fresco pré-aquecido.
  4. Preparar seis novos frascos de cultura celular adicionando 5 mL de meio de fibroblastos fresco pré-aquecido por frasco. Adicionar 1 ml de suspensão de células de fibroblastos a cada balão. Coloque os frascos de volta na incubadora e distribua as células uniformemente, movendo os frascos três vezes em cada direção.
  5. Para reprogramação epissomal, revestir duas placas de cultura celular de 10 cm adequadas para cultura de hiPSC com 4 mL de solução de revestimento a frio por placa. Incubar as placas durante 1 h a 37 °C.
    NOTA: Para cultivar hiPSCs, são necessários diferentes plásticos de cultura celular e revestimento adicional da matriz extracelular (ver Tabela de Materiais).
  6. Retirar o meio dos fibroblastos e lavar com 10 mL de PBS pré-aquecido 1x por frasco. Aspirar o PBS e dissociar os fibroblastos com 4 mL de 1x tripsina-EDTA por frasco incubando por 5-7 min a 37 °C. Monitorar o descolamento usando um microscópio de contraste de fase e, se necessário, bater contra a lateral do frasco para desprender as células da superfície plástica.
  7. Transfira as células destacadas para um tubo cônico de 50 mL. Lavar os frascos vazios com 6 mL de meio fibroblasto pré-aquecido para coletar as células remanescentes e agrupar no tubo cônico. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 3 mL de PBS 1x fresco pré-aquecido.
  8. Contar as células e transferir 1,5 x 106 fibroblastos em um novo tubo cônico. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 5 mL de meio de eletroporação e centrífuga novamente. Enquanto isso, aspirar a solução de revestimento das placas de cultura celular revestidas de 10 cm e adicionar 7 mL de meio de fibroblastos pré-aquecido.
  9. Após a centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em meio de eletroporação com concentração de 1,5 x 106 células em 250 μL. Transfira a suspensão celular de 250 μL para uma cubeta de eletroporação com uma distância de intervalo de 4 mm (ver Tabela de Materiais).
  10. Preparar uma mistura de transfecção de plasmídios adicionando 4 μg de cada plasmídeo (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) a um volume total de 50 μL de meio de eletroporação. Transfira para a cubeta e misture mexendo suavemente. Eletroporato com um pulso a 280 V.
  11. Cortar uma ponta de pipeta com uma tesoura estéril e transferir 125 μL dos fibroblastos eletroporados para cada uma das placas de cultura celular de 10 cm preparadas. Distribua as células agitando as placas três vezes em todas as direções e coloque-as de volta na incubadora. Incubar durante a noite a 37 °C com 5% de CO2 sem perturbação.
  12. Para remover as células mortas, substitua o meio no dia seguinte por 7 mL de meio fibroblasto fresco pré-aquecido. Troque o meio para o meio de cultura hiPSC 2 dias após a eletroporação e troque-o a cada dois dias pelos próximos 20 dias.

4. Seleção, expansão e controle de qualidade das hiPSCs geradas

  1. Monitorar as células diariamente por pelo menos 20 dias usando um microscópio de contraste de fase com objetiva de 10x ou 20x para observar a formação de colônias hiPSC após a eletroporação. Se as colônias hiPSC têm cerca de 300 μm de diâmetro com bordas distintas e as hiPSC apresentam uma alta relação núcleo-corpo, as colônias hiPSC estão prontas para seleção por picking (Figura 2B,C e Figura 3).
  2. Antes da colheita, revestir uma placa de 96 poços adequada para a cultura hiPSC com 100 μL de solução de revestimento por poço e incubar por 1 h a 37 °C. Durante a incubação, marque colônias de interesse no fundo da placa de cultura celular com uma caneta. Para a preparação final da placa de 96 poços, remova a solução de revestimento e adicione 100 μL de meio de cultura hiPSC pré-aquecido contendo 10 μM do inibidor de ROCK Y27632 em cada poço.
  3. Lave as células com 1x PBS pré-aquecido e adicione meio de cultura hiPSC fresco e pré-aquecido contendo 10 μM inibidor de ROCK Y27632 antes de colher para remover as células mortas. Para escolher colônias hiPSC, use uma agulha calibre e divida as colônias hiPSC em pequenos pedaços, desenhando uma grade em cada colônia.
  4. Usando um microscópio de contraste de fase, verifique se as colônias são divididas com sucesso em pedaços. Transfira-os com uma pipeta de 100 μL para a placa preparada de 96 poços. Segure a pipeta na vertical sobre a colônia sem tocar nas células para evitar arranhões e perda da colônia.
  5. Coloque a placa de 96 poços na incubadora a 37 °C com 5% de CO2 e deixe as células fixarem-se durante a noite sem perturbação. Mantenha os pratos com a mistura de fibroblasto e hiPSC, caso a colheita não seja bem-sucedida. Portanto, remova o inibidor de ROCK Y27632 trocando o meio para meio de cultura hiPSC e coloque as placas de volta na incubadora.
  6. No dia seguinte, troque o meio da placa de 96 poços para 200 μL de meio de cultura fresco hiPSC e troque-o a cada dois dias. Monitore a placa de 96 poços no dia seguinte e marque os poços com clones colhidos com sucesso.
    NOTA: Se os clones hiPSC escolhidos não forem totalmente selecionados após a primeira tentativa e os fibroblastos puderem ser encontrados no poço, repita a coleta do poço 96 ou raspe os fibroblastos da placa.

5. Expansão de clones hiPSC selecionados

  1. Monitorar os clones de hiPSC usando um microscópio de contraste de fase. Se as hiPSCs selecionadas atingirem cerca de 70% de confluência, os clones hiPSC estarão prontos para expansão.
  2. Revestir uma placa de 48 poços adequada para a cultura hiPSC com 250 μL de solução de revestimento por poço durante 1 h a 37 °C. Substitua a solução de revestimento por 200 μL de meio de cultura hiPSC fresco pré-aquecido contendo 10 μM do inibidor de ROCK Y27632.
  3. Para separar os hiPSCs da placa de 96 poços, raspe a superfície plástica com uma ponta de pipeta de 1.000 μL. Transfira as hiPSCs destacadas da placa de 96 poços para uma placa de 48 poços. Troque o meio no dia seguinte para meio de cultura hiPSC fresco e pré-aquecido para remover as células mortas e o inibidor de ROCK Y27632.
  4. Se os clones hiPSC atingirem cerca de 70% de confluência, transfira os hiPSCs para uma placa de 24 poços. Portanto, revestir uma placa de 24 poços adequada para a cultura hiPSC com 400 μL de solução de revestimento por poço por 1 h a 37 °C. Substitua a solução de revestimento por 400 μL de meio de cultura hiPSC fresco pré-aquecido contendo 10 μM do inibidor de ROCK Y27632. Aspirar o meio dos 48 poços e lavar com 500 μL de PBS 1x pré-aquecido.
  5. Substitua o PBS por 100 μL de solução de descolamento enzimático de células contendo 10 μM do inibidor de ROCK Y27632 e incube a 37 °C durante 4 minutos. Enxágue as hiPSCs da placa usando uma pipeta de 1.000 μL. Transferir as células dissociadas para um tubo cônico de 15 mL. Lavar a placa vazia de 48 poços com meio de cultura hiPSC contendo 10 μM inibidor de ROCK Y27632 e piscina no tubo cônico.
  6. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as hiPSCs em 1 mL de meio de cultura hiPSC contendo 10 μM inibidor de ROCK Y27632 e transferir para uma placa de 24 poços. Colocar a placa na incubadora a 37 °C a 5% CO2 e distribuir as células agitando a placa três vezes em todas as direções. Deixe as células se ligarem durante a noite sem perturbação.
  7. No dia seguinte, trocar o meio para o meio de cultura hiPSC sem o inibidor de ROCK Y27632.
    NOTA: Se os clones hiPSC atingirem cerca de 70% de confluência, transfira os hiPSCs para uma placa de 12 poços repetindo as etapas 5.4 a 5.7 com volumes maiores adequados para um formato de 12 poços. Se as hiPSCs da placa de 12 poços atingirem cerca de 70% de confluência, transfira os clones de hiPSC para uma placa de 6 poços com volumes aumentados para um formato de 6 poços.

6. Congelamento de clones hiPSC selecionados

  1. Para congelar clones selecionados de hiPSC, aspirar o meio a partir de uma placa de 6 poços. Lave os poços com 2 mL de 1x PBS. Aspirar e dissociar as hiPSCs com 1 mL de solução de descolamento enzimático de células contendo 10 μM Y27632. Coloque a placa de volta na incubadora e incube por 4 min a 37 °C e 5% de CO2.
  2. Enxaguar as hiPSCs da placa usando uma pipeta de 1.000 μL e transferir as células destacadas para um tubo cônico de 15 mL. Lavar a placa com 2 mL de meio de cultura hiPSC fresco e pré-aquecido contendo 10 μM inibidor de ROCK Y27632. Piscina no tubo cônico e centrífuga a 200 x g por 5 min a 20 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular com 2 mL de meio de cultura hiPSC fresco pré-aquecido contendo 10 μM inibidor de ROCK Y27632.
  3. Conte as células e transfira 1 x 106 células para um novo tubo cônico. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C. Aspirar o sobrenadante, ressuspender o pellet de células em 1 mL de meio de congelamento hiPSC frio e sem soro e congelar em criovial usando um recipiente de congelamento durante a noite a -80 °C. Para armazenamento a longo prazo, coloque o criovial em um tanque de nitrogênio líquido no dia seguinte.

7. Controle de qualidade HiPSC

  1. Caracterização da morfologia hiPSC
    1. Verificar a morfologia característica da hiPSC utilizando microscópio de contraste de fase com objetiva de 20x. Após a reprogramação, a morfologia celular muda de fibroblastos fusiformes longos para pequenos hiPSCs redondos, apresentando uma alta relação núcleo-corpo crescendo em colônias com bordas distintas (Figura 2C).
    2. Se as colônias hiPSC crescerem muito densas e ocorrer diferenciação espontânea, raspe as partes diferenciadas da placa usando uma ponta de pipeta (Figura 3). Como as hiPSCs têm uma alta taxa de proliferação, alimente as culturas hiPSC todos os dias com meio de alimentação hiPSC fresco e pré-aquecido.
  2. Caracterização de marcadores de pluripotência pela coloração por imunofluorescência
    1. Para verificar as hiPSCs geradas quanto ao marcador de pluripotência via coloração de imunofluorescência, colocar as lamínulas plásticas em uma placa de 24 poços e revestir com 250 μL de solução de revestimento por 1 h a 37 °C e 5% de CO2. Substitua a solução de revestimento por 1 mL de meio de cultura hiPSC pré-aquecido contendo 10 μM do inibidor de ROCK Y27632.
    2. Semente 1,9 x 104 hiPSCs dissociadas por 24 poços. Deixe que os hiPSCs se fixem durante a noite a 37 °C e 5% CO2 sem perturbação. Veja as etapas 5.4 a 5.6 para dissociação das hiPSCs. Substitua o meio no dia seguinte por meio de cultura hiPSC sem inibidor de ROCK Y27632.
    3. Para a coloração, lavar as células com 1 mL de PBS 1x pré-aquecido e, posteriormente, fixar as hiPSCs com paraformaldeído a 4% por 10 min à temperatura ambiente. Lavar as hiPSCs fixas com 1x PBS e bloquear sítios de ligação inespecíficos com 200 μL de solução de pré-incubação por poço durante 1 h à temperatura ambiente. Diluir anticorpos primários Ki67 (1:300), OCT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) em diluente de anticorpos.
    4. Limpe uma folha de plástico com etanol 70% e coloque-a em uma câmara de coloração cheia de um reservatório de água. Coloque gotículas de diluições de anticorpos primários de 30 μL sobre a folha. Colocar as amostras fixas de cabeça para baixo na diluição e incubar durante a noite a 4 °C.
    5. No dia seguinte, lavar as amostras três vezes com 1x PBS por 5 min e colocar gotículas de 30 μL de diluições secundárias de anticorpos (1:1.000) em pontos limpos na folha. Coloque a tampa desliza de cabeça para baixo na diluição. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente no escuro.
    6. Após a incubação, lavar três vezes com 1x PBS por 5 min. Monte as amostras em lâminas de vidro no meio de montagem contendo DAPI. Deixar secar durante a noite à temperatura ambiente e no escuro e obter imagens das amostras utilizando um microscópio confocal (Figura 4).
  3. Exclusão de bactérias e contaminação por micoplasma
    1. Para excluir contaminação bacteriana, transfira 500 μL de hiPSCs dissociados para 5 mL de meio Luria-Bertani (LB) pré-aquecido. Veja as etapas 5.4 a 5.6 para dissociação das hiPSCs. Incubar durante a noite a 37 °C. Se o meio LB parecer turvo, é provável que tenha ocorrido contaminação bacteriana. Descarte as células.
    2. Para excluir contaminação por micoplasma, coletar meio que não tenha sido substituído por 2 dias de 6 poços com cerca de 90% de hiPSCs confluentes. Use a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para detectar a contaminação por micoplasma. Muitos kits comerciais de detecção de micoplasma estão disponíveis para esta finalidade.

8. Diferenciação de hiPSCs em podócitos

  1. Preparação e armazenamento de fatores de crescimento
    1. Para preparar uma concentração de estoque de 10 mM Y27632, reconstituir 10 mg de Y27632 (peso molecular de 320,26 g/mol) em 3,12 mL de água estéril. Armazenar 100 μL de alíquotas a -20 °C e diluir 1:1.000 em meio de cultura celular para atingir uma concentração final de 10 μM.
    2. Para preparar uma concentração estoque de 30 mM CHIR99021, reconstituir 5 mg de CHIR99021 (peso molecular de 465,34 g/mol) em 358,2 μL de DMSO estéril. Armazenar alíquotas de 50 μL a -20 °C e diluir 1:10.000 em meio de cultura celular para atingir uma concentração final de 3 μM.
    3. Para preparar uma concentração estoque de 100 μg/mL de activina A, reconstituir 100 μg de activina A em 1 mL de 1x PBS contendo 0,1% de albumina de soro bovino (BSA). Armazenar alíquotas de 100 μL a -20 °C e diluir 1:2.000 em meio de cultura celular para atingir uma concentração final de 50 ng/mL.
    4. Para preparar uma concentração estoque de 100 μg/mL de proteína morfogênica óssea 7 (BMP7), reconstituir 100 μg de BMP7 em 1 mL de água estéril contendo 0,1% de BSA. Armazenar alíquotas de 100 μL a -20 °C e diluir 1:2.000 em meio de cultura celular para atingir uma concentração final de 50 ng/mL.
    5. Para preparar uma concentração estoque de 100 μg/mL de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), reconstituir 100 μg de VEGF em 1 mL de água estéril. Armazenar alíquotas de 100 μL a -20 °C e diluir 1:4.000 em meio de cultura celular para atingir uma concentração final de 25 ng/mL.
    6. Para preparar uma concentração estoque de 10 mM de ácido all-trans retinóico, reconstituir 10 mg de ácido all-trans retinóico em 3,33 mL de DMSO estéril. Armazenar alíquotas de 100 μL a -20 °C e diluir 1:100 em meio de cultura celular para atingir uma concentração final de 0,5 μM.
  2. Ativação da via de sinalização WNT para induzir linhagem mesodérmica
    1. Para a diferenciação de hiPSCs em podócitos derivados de hiPSC, revestir placas ou frascos de cultura de células adequadas para cultura de hiPSC com solução de revestimento por 1 h a 37 °C e 5% de CO2. O volume total da solução de revestimento é de 1 mL por placa de cultura de 6 poços ou 4 mL por placa de cultura celular de 10 cm.
    2. Aspirar o meio e lavar as hiPSCs com 1x PBS pré-aquecido. Aspirar o PBS e adicionar solução enzimática de descolamento celular contendo 10 μM Y27632 a um volume total de 1 mL por placa de cultura de 6 poços ou 4 mL por placa de cultura celular de 10 cm.
    3. Coloque a placa de volta na incubadora e incube por 4 min a 37 °C e 5% de CO2. Enxágue as hiPSCs da placa usando uma pipeta de 1.000 μL. Transfira as células destacadas para um tubo cônico.
    4. Lavar a placa com meio de cultura hiPSC fresco e pré-aquecido contendo 10 μM inibidor de ROCK Y27632. Agrupar o meio de lavagem no tubo cônico para neutralizar o reagente de dissociação. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular com 2 mL de meio de cultura hiPSC fresco pré-aquecido contendo 10 μM inibidor de ROCK Y27632.
    5. Conte as células e sementes 1 x 104 hiPSCs/cm2. Distribua as células agitando três vezes em todas as direções. Deixe os hiPSCs fixarem durante a noite a 37 °C com 5% de CO2 sem perturbação.
    6. No dia seguinte, substituir o meio por 2 mL de meio de diferenciação mesodérmica pré-aquecido contendo 1x suplemento B27, penicilina-estreptomicina a 1%, CHIR99021 μM, ativina A 50 ng/mL e inibidor de ROCK Y27632 10 μM.
  3. Diferenciação em células progenitoras de néfrons
    1. Após 2 dias, trocar o meio mesodérmico para 2 mL de meio de diferenciação do progenitor de néfron pré-aquecido contendo 1x suplemento B27, penicilina-estreptomicina a 1%, CHIR99021 μM, 50 ng/mL de activina A e 50 ng/mL de BMP7 por placa de cultura de 6 poços ou 6 mL por placa de cultura celular de 10 cm. Troque o meio a cada dois dias pelos próximos 14 dias.
      NOTA: As células progenitoras de néfrons proliferam e podem ser passadas e congeladas após 7 dias de diferenciação em meio de expansão do progenitor de néfrons.
    2. Para dividir as células progenitoras de néfrons, revestir os plásticos de cultura celular adequados para cultura de hiPSC com solução de revestimento por 1 h a 37 °C. Substitua a solução de revestimento por meio de expansão do progenitor de néfrons. Aspirar o meio e lavar as células com PBS 1x pré-aquecido. Remover o PBS e dissociar as células com 1x tripsina-EDTA.
    3. Incubar durante 5 min a 37 °C e 5% de CO2. Monitorar o descolamento das células usando um microscópio de contraste de fase. Se necessário, bata contra a lateral do plástico para separar as células da superfície. Enxágue as células da placa e transfira para um tubo cônico. Lavar o balão ou placa vazios com o mesmo volume de meio expansor progenitor de néfrons pré-aquecido que o reagente de dissociação.
    4. Coloque o meio de lavagem no tubo cônico. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular com 2 mL de meio de expansão progenitor de néfron pré-aquecido fresco. Conte as células e sementes 1,5 x 104 células progenitoras de néfrons por cm2 para maior diferenciação.
      NOTA: Para congelar as células progenitoras de néfrons, ressuspenda 1 x 106 células em 1 mL de meio de criopreservação sem soro frio e transfira para um criovial. Congelar em um recipiente de congelamento a -80 °C durante a noite e transferir para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.
    5. Coloque as placas de volta na incubadora e distribua as células uniformemente por agitação três vezes em todas as direções. Troque o meio no dia seguinte para um meio de diferenciação de progenitores de néfrons fresco e pré-aquecido. Substitua o meio a cada dois dias até que as células sejam diferenciadas por 14 dias em meio de diferenciação do progenitor de néfrons.
  4. Diferenciação terminal em podócitos derivados de hiPSC
    1. Aspirar o meio e adicionar 2 mL de meio de diferenciação podocitária pré-aquecido contendo 1x suplemento B27, 1% de penicilina-estreptomicina, 3 μM CHIR99021, 50 ng/mL de activina A, 50 ng/mL de BMP7, 25 ng/μL de VEGF e 0,5 μM de ácido trans-retinóico por placa de cultura de 6 poços ou 6 mL por placa de cultura celular de 10 cm. Colocar as placas novamente na incubadora a 37 °C e 5% de CO2. Troque o meio a cada dois dias por 4 dias com meio de diferenciação podocitária fresco e pré-aquecido.
    2. Para manter os podócitos hiPSC em cultura após a diferenciação, alimentar as células duas vezes por semana com meio de manutenção podocitária contendo 10% de soro fetal de bezerros, 1% de penicilina-estreptomicina e 0,1% de insulina-transferrina-selênio.
      NOTA: Os hiPSC-podócitos diferenciais terminais não proliferam mais. No entanto, é possível mantê-los em cultura celular por até 4 semanas.
  5. Descongelamento e expansão de células progenitoras de néfrons congelados
    1. Revestir um novo frasco plástico de cultura celular adequado para a cultura hiPSC com solução de revestimento por 1 h a 37 °C e 5% CO2. Substitua a solução de revestimento por 5 mL de meio de expansão progenitor de néfrons.
    2. Preparar um tubo cônico de 15 mL com 7 mL de meio de expansão progenitor de néfron pré-aquecido. Descongelar as células congeladas a 37 °C em banho-maria sem movimento por aproximadamente 20 s. Tire o criovial do banho-maria quando metade das células estiver descongelada e sobrar gelo.
    3. Borrifar o criovial com etanol 70% e colocar em um armário de biossegurança. Transfira as células descongeladas para o tubo cônico com o meio de expansão do progenitor de néfrons pré-aquecido. Use uma pipeta de 1.000 μL e deixe as células correrem pela parede do tubo muito lentamente.
    4. Lavar o criovial vazio com 1 mL de meio de expansão do progenitor de néfrons para coletar as células restantes e agrupar no tubo cônico. Centrifugar a 200 x g por 5 min a 20 °C e ressuspender o pellet de células em meio de expansão progenitor de néfron fresco e pré-aquecido.
    5. Transfira as células descongeladas para o frasco revestido e troque o meio no dia seguinte para meio de expansão do progenitor de néfrons fresco e pré-aquecido. Antes de uma diferenciação mais aprofundada, deixe as células proliferarem em meio de expansão do progenitor de néfrons, trocando o meio a cada dois dias, e prossiga a partir do passo 8.3.5.

9. Caracterização de podócitos derivados de hiPSC pela coloração de imunofluorescência

  1. Para verificar os podócitos diferenciados para o marcador específico de podócitos através da coloração de imunofluorescência, colocar lamínulas plásticas em uma placa de 24 poços e revestir com 250 μL de solução de revestimento por 1 h a 37 °C e 5% de CO2. Substitua a solução de revestimento por 1 mL de meio de expansão progenitor de néfrons pré-aquecido. Semente 2,5 x 104 células progenitoras de néfrons dissociadas por placa de 24 poços. Ver passos 8.3.2 a 8.3.4 para dissociação das células progenitoras de néfrons.
  2. Deixe as células fixarem-se durante a noite a 37 °C e 5% de CO2 sem perturbação. Substitua o meio no dia seguinte por meio de diferenciação de progenitores de néfrons pré-aquecidos.
  3. Finalizar a diferenciação trocando o meio a cada dois dias até que as células sejam diferenciadas por um total de 14 dias em meio de diferenciação de progenitores de néfrons e mais 5 dias em meio de diferenciação de podócitos.
  4. Após a diferenciação final, lavar as células com 1 mL de PBS 1x pré-aquecido. Fixar os podócitos hiPSC com paraformaldeído a 4% durante 10 minutos à temperatura ambiente. Lavar as células fixas com 1x PBS e bloquear os sítios de ligação inespecíficos com 200 μL de solução de pré-incubação por poço durante 1 h à temperatura ambiente.
  5. Diluir os anticorpos primários sinaptopodina (1:200), podocina (1:100) e nefrina (1:25) em diluente de anticorpos e colocar gotículas de diluição primária de anticorpos de 30 μL em uma folha de plástico limpa em uma câmara de coloração contendo um reservatório de água.
  6. Coloque lâminas de cobertura com podócitos hiPSC fixos de cabeça para baixo na diluição. Incubar durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, lave três vezes com 1x PBS por 5 min. Diluir os anticorpos secundários (1:1.000) em 1x PBS e colocar gotículas de diluição de anticorpos secundários de 30 μL em pontos limpos na folha. Coloque a tampa desliza de cabeça para baixo na diluição.
  7. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, lavar três vezes com 1x PBS por 5 min. Monte as amostras em lâminas de vidro em meio de montagem contendo DAPI. Deixe secar durante a noite à temperatura ambiente e no escuro. Obtenha imagens das amostras usando um microscópio confocal.

Representative Results

Com este protocolo passo-a-passo que combina reprogramação e diferenciação epissomal, é possível gerar podócitos portadores da mutação de um paciente em um gene relevante para podócitos. Isso permite a análise de alterações podocitárias doença-específicas ex vivo. O background genético do paciente é preservado durante o protocolo durante todos os diferentes estágios celulares. Além disso, a limitação do número insuficiente de células de podócitos não proliferantes terminalmente diferenciados pode ser superada com o uso de podócitos derivados de hiPSC. Embora os hiPSC-podócitos sejam gerados a partir de fibroblastos dérmicos crescidos por meio de reprogramação em hiPSCs e posterior diferenciação em podócitos, é possível congelar as células em três etapas diferentes do protocolo (Figura 2). O congelamento é possível para fibroblastos, hiPSCs e células progenitoras de néfrons após diferenciação em meio de diferenciação de progenitores de néfrons por 7 dias. Portanto, a geração de bancos de células em funcionamento e experimentos em larga escala é possível.

Figure 2
Figura 2: Etapas individuais do protocolo através de microscópio de contraste de fase. (A) Fibroblastos dérmicos crescidos. (B) formação de colônias hiPSC após reprogramação. (C) Cultura hiPSC selecionada. (D) Células mesodérmicas após 2 dias de diferenciação. (E) Células progenitoras de néfrons após 14 dias de diferenciação em meio de diferenciação de progenitores de néfrons. (F) Podócitos terminais diferenciados derivados de hiPSC. As barras de escala representam 300 μm (A,B,D-F) e 150 μm (C). O floco de neve destaca possíveis etapas de congelamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como os podócitos derivados da hiPSC gerados atravessam um longo protocolo com mudanças drásticas em relação ao tipo e morfologia celular, a caracterização celular é obrigatória. A morfologia celular, como tamanho e forma celular, bem como o comportamento de crescimento, podem ser monitorados usando um microscópio de contraste de fase. Os fibroblastos apresentam fenótipo fusiforme longo, com tamanho de 150 μm a 300 μm (Figura 2A). Após a reprogramação, ocorrem colônias com 50 μm de pequenas hiPSCs. Essas colônias exibem bordas distintas e hiPSCs distinguem-se com uma alta relação núcleo-corpo e aumento da taxa de proliferação (Figura 2C). Como os podócitos são células terminalmente diferenciadas, a taxa de proliferação diminui com a diferenciação progressiva, e a morfologia celular muda para 300 μm de grandes podócitos estrelados com processos proeminentes nos pés (Figura 2F).

A confluência é um ponto crítico da cultura hiPSC, e a diferenciação espontânea pode aparecer quando as colônias crescem muito densas (Figura 3). Essas colônias devem ser removidas antes da passagem, raspando as partes afetadas da placa de cultura.

Figure 3
Figura 3: Exemplos de hiPSCs de diferentes qualidades. Imagens de contraste de fase de (A) colônias hiPSC reprogramadas com sucesso e (B) hiPSCs selecionadas, bem como (C) diferenciação espontânea, (D,E) colônias não-hiPSC e (F) uma cultura hiPSC muito densa. As barras de escala representam 300 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os diferentes tipos celulares deste protocolo devem ser validados quanto à expressão de um marcador específico. Após a reprogramação, as hiPSCs recuperam a capacidade de pluripotência e expressam marcadores de proliferação e pluripotência como SSEA4, OCT3/4 e Ki67 (Figura 4)38,39,40. Sabe-se que a reprogramação, assim como a longa cultura das hiPSCs e diferenciação, pode levar a um cariótipo anormal, ou melhor, induzir mutações41. Portanto, o background genético das células cultivadas deve ser monitorado ao longo do tempo e em diferentes passagens por bandas G e sequenciamento completo do exoma.

Figure 4
Figura 4: Caracterização das hiPSCs geradas pela coloração por imunofluorescência. Caracterização das hiPSCs geradas pela coloração para (A) o marcador proliferativo Ki67, bem como os marcadores de pluripotência (B) OCT3/4 e (C) SSEA4. As barras de escala representam 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Morfologicamente, os podócitos derivados da hiPSC aparecem em forma de estrela e expressam uma rede distinta de processos longos primários e secundários do pé em comparação com os ciPodócitos (Figura 5). Os podócitos derivados da HiPSC expressam proteínas marcadores específicas para podócitos, como sinaptopodina, nefrina e podocina (Figura 6A-C)42.

Figure 5
Figura 5: Morfologia dos podócitos derivados da hiPSC em comparação com os iiPodócitos. Comparação de podócitos derivados de (A,B) hiPSC de um doador saudável com ciPodócitos (C,D) em relação à morfologia celular e filópodes usando um microscópio de contraste de fase (A,C) e microscópio eletrônico de varredura (B,D). As barras de escala representam 150 μm (A,C) e 20 μm (B,D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Portanto, a comparação de podócitos derivados da hiPSC não apenas de doadores saudáveis, mas também de pacientes com mutações em genes específicos de podócitos, permite caracterizar de forma individualizada a mutação do paciente ex vivo.

Figure 6
Figura 6: Caracterização de um marcador podocito-específico em podócitos e ciPodócitos derivados de hiPSC. Comparação de podócitos derivados de hiPSC (A-C) de um doador saudável com ciPodócitos (D-F) em relação às proteínas marcadores específicas de podócitos sinaptopodina (A,D), nefrina (B,E) e podocina (C,F). As barras de escala representam 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1. Composição de todos os meios de cultura celular e soluções utilizadas no estudo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussion

Este protocolo baseado em cultura celular combina a reprogramação epissomal de fibroblastos dérmicos humanos em hiPSCs específicas do paciente e subsequente diferenciação em podócitos derivados de hiPSC. Isso nos permite estudar alterações relacionadas à mutação de podócitos de pacientes com doença genética glomerular em relação à lesão podocitária. O protocolo de reprogramação de fibroblastos dérmicos com método livre de integração por eletroporação é adaptado dos trabalhos publicados de Bang et al.32 e Okita et al.33. O protocolo para diferenciar podócitos de hiPSCs é adaptado do protocolo publicado de Musah et al.28,34,35. Já existem publicações disponíveis descrevendo a geração de podócitos a partir de hiPSCs27,34,35. No entanto, o protocolo aqui apresentado é otimizado e menos dispendioso quanto à diferenciação de hiPSCs em podócitos. Em comparação com o protocolo publicado de Musah et al., testamos este protocolo em diferentes reagentes de revestimento, como vitronectina, laminina silk-511 e matriz de membrana basal solubilizada. As concentrações de vitronectina e laminina seda-511 puderam ser reduzidas para 2,5 μg/mL em vez de 5 μg/mL 28,34,35. Além disso, foi possível diminuir as concentrações de BMP7 e activina A-dois fatores de crescimento muito caros- em 50%, de 100 ng/mL para 50 ng/mL.

Isso permite uma diferenciação menos dispendiosa. As células progenitoras de néfrons a partir do 7º dia ainda estavam proliferando, e a possibilidade de congelamento foi mostrada antes. Expandimos essas células após o descongelamento e antes da diferenciação final em meio básico contendo meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) e B27 por vários dias, diminuindo ainda mais os custos. Além das etapas de diferenciação, este protocolo descreve o crescimento de fibroblastos de biópsias de pele com subsequente geração de hiPSCs específicas do paciente via reprogramação epissomal. A combinação desses dois métodos permite a geração de podócitos específicos para o paciente. Portanto, um protocolo passo-a-passo completo para gerar podócitos derivados de hiPSC específicos para pacientes é fornecido aqui que não foi descrito antes com tantos detalhes.

Como o protocolo geral inclui vários tipos celulares diferentes, é crucial caracterizar os tipos celulares gerados em diferentes etapas. As células estão em cultura por um longo período de tempo, portanto, o controle de qualidade deve ser realizado em diferentes passagens. Ao trabalhar com hiPSCs, a alimentação diária, bem como o monitoramento do comportamento e morfologia celular são necessários. A esterilidade do meio de diferenciação deve ser assegurada pela esterilização do filtro através de um filtro de 0,2 μm. Todo o protocolo, desde a biópsia de pele até os podócitos derivados da hiPSC, leva vários meses, mas é possível congelar as células em etapas distintas do processo. Fibroblastos, clones selecionados de hiPSC e células progenitoras proliferativas de néfrons após 7 dias em meio de diferenciação de progenitores de néfrons podem ser congelados, e um banco de células em funcionamento pode ser gerado.

Embora os podócitos saudáveis derivados da hiPSC desenvolvam uma rede distinta de processos primários e secundários do pé (Figura 5A,B) e expressem marcadores típicos específicos de podócitos (Figura 6A-C), diafragmas de fenda característicos, como visto in vivo, são difíceis de imitar em modelos clássicos de cultura celular bidimensional. Além disso, a comunicação intercelular com outros tipos de células glomerulares não é possível neste ambiente de monocultura.

Devido ao seu estado terminal diferenciado e à falta de capacidade de proliferação, é difícil estudar podócitos ex vivo. Com a ajuda da imortalização condicional dos podócitos primários, é possível superar essa limitação com a inserção de um interruptor termossensível, resultando em um modelo de cultura celular em que as células proliferam a 33 °C e se diferenciam a 37 °C13,14. Embora esses CDovócitos tenham alto potencial para pesquisa de podócitos, existem limitações, como a falta de expressão de marcadores, morfologia desdiferenciada e falha na formação de processospodais15,16.

A diferenciação de podócitos de células somáticas derivadas de pacientes permite a geração e comparação de podócitos doentes com células controle saudáveis ex vivo. Isso nos permite estudar danos em podócitos devido a mutações em genes específicos de podócitos. Além disso, o trabalho com hiPSCs tem o potencial de criar modelos tridimensionais de cultura de células para doenças, ou melhor, organoides43,44. O co-cultivo de podócitos derivados de hiPSC com outras células glomerulares, como células endoteliais glomerulares ou células mesangiais, pode levar a novos conhecimentos sobre a comunicação intercelular na saúde e na doença glomerular.

Além disso, a caracterização e o tratamento dos podócitos específicos do paciente podem ser realizados ex vivo em análises de alto rendimento. A abordagem individualizada abre a oportunidade para investigar novos alvos terapêuticos para mutações específicas e realizar medicina individualizada no futuro.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF) da Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg com o número de bolsa M4-IZKF-F009 dado a Janina Müller-Deile, e pelo Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) sob o nome de projeto STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, número de concessão 01GM2202D dado a Janina Müller-Deile. Agradecemos a Annalena Kraus pelo apoio na obtenção de imagens MEV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm sterile filter Rotilab P668.1 for sterilization of differentiation medium
all-trans retinoic acid Stem Cell Technologies 72262 supplement for differentiation
B27 supplement (50 x), serum free Gibco 17504044 supplement for serum-free differentiation medium
BG iMatrix-511 Silk biogems RL511S additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Bovine serum albumin (BSA)  Roth 8076.4
CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL Greiner bio-one 82050-856 cell culture plastics suitable for fibroblast culture
CHIR99021 (5 mg) Sigma-Aldrich 252917-06-9  supplement for differentiation
Corning Matrigel hESC qualified matrix  Corning 354277 additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix)
countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283 to count cells
countess II FL  Automated Cell Counter Invitrogen to count cells
cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white Sarstedt 72380 cryovials for freezing of cells
dimethyl sulfoxide (DMSO)  Roth A994.1 for fibroblast freezing medium
DMEM/F12 (1:1) (1 x) Gibco 11320074 basic medium for differentiation
DMEM/F12 + Glutamax Gibco 10565018 basic medium for fibroblast medium
EVOS M5000 Imaging System Thermo Fisher Scientific AMF5000 phase contrast microscope
fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) PAN Biotech P301902 serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium
fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile Fisherbrand FB104 cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap)
fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI Invitrogen 00-4959-52 mounting medium containing dapi
gauge needle (0.6 x 30 mm) BD Microlance3 300700 for separation of hiPSC colonies into small pieces
human Recombinant Activin A Protein 78001.1 Stem cell technologies supplement for differentiation
human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) Peprotech 120-03P supplement for differentiation
human VEGF-165 Recombinant Protein Thermo Scientific PHC9394 supplement for differentiation
insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) Gibco 41400045 supplement for podocyte maintenance medium
LB medium Roth X964.1 for sterility test of hiPSC culture
lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma Aldrich MP0035-1KT commercial mycoplasma detection kit
microscope slides Diagonal GmbH & Co.KG 21,102
microtube 1.5 mL  Sarstedt 72706400
mTeSR1 Complete Kit Stem Cell Technologies 85850 basic medium for serum-free hiPSC culture medium
nalgene freezing container Mr.Frosty Roth AC96.1  to ensure optimal freezing conditions
normal goat serum abcam ab 7481 for preincubation solution and antibody diluent
nunc 24 well plates Thermo Scientific 142485 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 48 well plates  Thermo Scientific 152640 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 6 well plates  Thermo Scientific 140685 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc EasYDish Dishes 100 mm Thermo Scientific 150466 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 167008 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nutriFreez D10 Cryopreservation Medium Sartorius 05-713-1E  serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells
Opti-MEM Gibco 11058021 electroporation medium 
pCXLE-hMLN Addgene #27079 plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hOCT3/4 plasmid Addgene #27077 plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hSK plasmid Addgene #27078 plasmid for episomal reprogramming
penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100ML to avoid bacterial contamination
plastic coverslips Sarstedt   83.1840.002 for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes
ROTI Histofix Roth P087.3 commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells
RPMI 1640 + L-Glutamine Gibco 21875034 basic medium for podocyte maintenance medium
staining chamber StainTray Black lid Roth HA51.1
stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501 enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs
sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) Gibco 14190094 used for washing and coating
sterile water Roth T1432
syringe without needle 20 mL BD Plastipak 300629 to filter sterilize differentiation medium
TC dish 100 mm Sarstedt 8,33,902 sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture
TC dish 35 mm Sarstedt 8,33,900 sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy
triton X 100 Roth 3051.3 for preincubation solution 
trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter Invitrogen T10282 to count cells
trypsin-EDTA (10 x)  Biowest X0930-100 dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells
tube 15 mL Greiner bio-one 188271-N
tube 50 mL Greiner bio-one 227261
vitronectin ACF Sartorius 05-754-0002 extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Y-27632 dihydrochloride (10 mg) Tocris 1254 to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting
Primary antibodies
OCT4  Stem Cell Technologies 60093.1 pluripotency marker, dilution 1:200
SSEA-4 Stem Cell Technologies 60062FI.1 pluripotency marker, dilution 1:100
Ki67 Abcam ab15580 proliferation marker, dilution 1:300
synaptopodin Proteintech 21064-1-AP podocyte-specific marker, dilution 1:200
nephrin Progen GP-N2 podocyte-specific marker, dilution 1:25
podocin proteintech 20384-1-AP podocyte-specific marker, dilution 1:100
Secondary antibodies
goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21435 secondary anditbody, dilution 1:1000
alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed Invitrogen A31634 secondary anditbody, dilution 1:1000
donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21422 secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 secondary anditbody, dilution 1:1000

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References

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Biologia Edição 195
Geração de Podócitos Derivados do Paciente a partir de Biópsias de Pele
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Rose, V., Müller-Deile, J.… More

Rose, V., Müller-Deile, J. Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies. J. Vis. Exp. (195), e65364, doi:10.3791/65364 (2023).

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