Summary
이 원고는 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)로의 에피솜 재프로그래밍과 후속 족세포로의 분화를 통해 진피 섬유아세포에서 환자 특이적 족세포를 생성하는 2단계 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
Podocytes는 사구체의 선택적 필터 기능에 기여하는 사구체 여과 장벽의 요로 부위에 있는 상피 세포입니다. 족세포 특이적 유전자의 돌연변이는 국소 분절 사구체 경화증(FSGS)을 유발할 수 있으며 족세포는 다른 많은 원발성 및 이차성 신병증에서도 영향을 받습니다. 이들의 분화된 특성으로 인해, 일차 세포 배양 모델은 족세포에 대해 제한적이다. 따라서 일반적으로 조건부로 불멸화 된 세포가 사용됩니다. 그러나, 이러한 조건부로 불멸화 된 족세포 (ciPodocytes)는 몇 가지 한계를 갖는다 : 세포는 배양에서 탈분화 될 수 있으며, 특히 합류도에 도달 할 때, 그리고 몇몇 족세포 특이 적 마커는 약간만 또는 전혀 발현되지 않는다. 이것은 ciPodocytes의 사용과 생리학적, 병태생리학적 및 임상적 도달 가능성에 의문을 제기합니다. 여기에서 우리는 피부 섬유아세포를 hiPSC로 에피솜 재프로그래밍하고 후속 족세포로 분화하여 피부 펀치 생검에서 환자 특이적 족세포를 포함한 인간 족세포 생성을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 족세포는 발 과정의 발달 및 족세포 특이적 마커의 발현과 같은 형태학적 특성 측면에서 생체 내 족세포와 훨씬 더 유사합니다. 마지막으로, 그러나 중요한 것은 이러한 세포가 환자의 돌연변이를 유지하여 개별화된 접근 방식으로 족세포 질환 및 잠재적인 치료 물질을 연구하기 위한 개선된 생체 외 모델을 제공한다는 것입니다.
Introduction
Podocytes는 사구체 기저막(GBM), 사구체 내피 세포 및 글리코칼릭스와 함께 신장의 사구체 여과 장벽을 형성하는 특수화된 유사분열 후 신장 상피 세포입니다. 표현형적으로, 족세포는 세포체와 1차, 미세소관 구동 막 확장뿐만 아니라 발 과정 1,2라고 하는 2차 확장으로 구성됩니다. 혈액에서 소변을 걸러내는 사구체 여과 장벽은 천공 내피, GBM 및 podoctyes3의 슬릿 다이어프램이라고 하는 인접한 족세포 발 돌기를 연결하는 특수한 유형의 세포간 접합부로 구성됩니다. 건강한 조건에서 알부민보다 큰 단백질은 크기와 전하로 인해 여과 장벽에서 유지됩니다4.
세포골격 또는 족세포 특이적 유전자의 돌연변이 및 족세포 신호 전달 경로에 영향을 미치는 순환 인자는 족세포 소실, 박리 또는 세포자멸사멸을 유도하여 단백뇨 및 사구체 경화증을 유발하는 것으로 알려져 있습니다. 특히, 세포골격 재배열, 족세포 극성의 변화 또는 슬릿 접합부의 손실과 관련된 발 돌기의 손상이 중추적인역할을 한다 5. 말기 분화 된 상태로 인해, 족세포는 GBM의 분리 후에 거의 대체 될 수 없다. 그러나, 족세포가 GBM에 부착되어 있다면, 그들은 여전히 소실로부터 회복 될 수 있고 interdigitating foot processes 6,7,8을 개혁 할 수있다. 다양한 사구체 장애에서 족세포 손상을 유발하는 사건에 대한 추가 이해는 이러한 질병에 대한 치료법 개발에 도움이 될 새로운 치료 표적을 제공할 수 있습니다. Podocyte 손상은 국소 분절 사구체 경화증(FSGS), 당뇨병성 신병증, 최소 변화 질환 및 막 사구체신병증을 포함한 다양한 사구체 질환의 특징이며, 이러한 질병에 대한 병리학적 메커니즘 및 잠재적 치료 접근법을 연구하기 위해 신뢰할 수 있는 족세포 생체 외 모델이 필요합니다 9,10. Podocytes는 차등 체질에 의한 사구체의 분리에 기초한 고전적인 1차 세포 배양에 의해 생체 외에서 연구될 수 있다11. 그러나, 제한된 증식 능력을 갖는 말기 분화 상태로 인해, 대부분의 연구자들은 SV40 거대 T 항원의 온도에 민감한 변이체를 발현하는 마우스 또는 인간 ciPodocyte 세포주를 사용한다. 대안적으로, ciPodocytes는 SV40 태그 불멸화 유전자 1,12를 보유하는 형질전환 마우스로부터 분리된다.
CiPodocytes는 33 °C에서 증식하지만, 성장 정지에 들어가 37 °C에서 분화를 시작한다13,14. 이러한 세포로 얻은 실험 데이터는 세포가 부자연스러운 유전자 삽입(15)을 사용하여 생성되기 때문에 어느 정도 주의해서 해석되어야 한다는 점을 명심해야 한다. 이 세포들은 불멸화 유전자를 가지고 있기 때문에, 지속적인 증식으로 인해 세포 생리학이 변화된다12. 이 접근법에 의해 생성된 Podocyte 세포주는 마우스, 인간 및 쥐 ciPodocytes가 사구체 발현16과 비교하여 mRNA 수준에서 NPHS1 및 NPHS2뿐만 아니라 단백질 수준에서 시냅토포딘 및 네프린의 5% 미만을 발현하기 때문에 최근에 의문이 제기되었습니다. 또한, 대부분의 족세포 세포주는 네프린17,18을 발현하지 않습니다. Chittiprol et al. 또한 ciPodocytes에서 세포 운동성과 퓨로마이신과 독소루비신에 대한 반응의 유의미한 차이를 설명했다16. Podocytes는 다른 사구체 질환 19,20,21,22에서 GBM에서 분리 된 후 소변에서 발견 될 수 있습니다. 생존 가능한 요족세포는 생체 외에서 최대 2-3주 동안 배양할 수 있지만 대부분의 세포는 세포자멸사를 겪습니다23,24. 흥미롭게도, 족세포는 사구체 질환 환자의 소변뿐만 아니라 건강한 피험자의 소변에서도 발견되며, 배양물에서 복제 가능성이 제한적인 노화 상태일 가능성이 높다24. 또한, 소변 유래 족세포 수는 제한되어 있고, 세포는 배양에서 탈분화되고, 발 과정이 적고, 형태가 변화하며, 가장 중요한 것은 제한된 증식 능력을 갖는다는 것입니다. 족세포 특이적 유전자의 발현은 부재하거나, 몇 주 이내에 사라지거나, 이러한 세포 클론 간에 다양합니다. 족세포 특이적 마커에 대해 양성인 일부 세포는 관상 상피 세포 또는 근섬유아세포와 간질 세포의 마커를 공동 발현했으며, 이는 배양된 요족세포의 탈분화 및/또는 형질전환을 시사한다24,25.
최근, 온도 민감성 SV40 거대 T 항원 및 hTERT로 형질도입에 의해 환자 및 건강한 자원자의 소변으로부터 유래된 ciPodocyte 세포주의 생성이 기술되었다26. 시냅토포딘, 네스틴 및 CD2 관련 단백질에 대한 mRNA 발현은 검출되었지만, 포도신 mRNA는 모든 클론에서 없었다. 비뇨기 족 세포의 문제 외에도,이 세포들은 또한 삽입 된 불멸화 유전자를 포함하고있어 위에서 논의한 단점을 초래합니다.
대조적으로, 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)는 적절한 조건에서 자가 재생 및 여러 세포 유형으로 분화할 수 있는 엄청난 능력을 가지고 있습니다. hiPSC가 족세포의 거의 무제한적인 공급원 역할을 할 수 있다는 것이 이전에 밝혀졌습니다27,28.
여기에서는 피부 펀치 생검의 진피 섬유아세포에서 환자 특이적 족세포를 생성하고 후속 에피솜을 hiPSC로 재프로그래밍하고 hiPSC 유래 족세포로의 최종 분화를 설명하는 2단계 프로토콜이 설명됩니다(그림 1).
그림 1: 환자 특이적 hiPSC 유래 족세포를 생성하는 프로토콜. hiPSC로 재프로그래밍하고 족세포로 분화하여 피부 생검의 진피 섬유아세포에서 환자 특이적 족세포를 생성하는 프로토콜의 그래픽 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
첫 번째 단계로, 체세포 진피 섬유아세포는 피부 펀치 생검에서 성장하여 전사 인자 OCT3/4, KLF4, SOX2 및 c-MYC 29,30,31을 발현하는 플라스미드로 전기천공에 의한 통합이 없는 방법을 사용하여 hiPSC로 재프로그래밍되었습니다. 이후 발생하는 hiPSC 콜로니를 선택하고 확장했습니다. 분화는 WNT 신호 전달 경로의 활성화에 의한 중배엽 계통의 유도로 시작되었고, 이어서 여전히 증식할 수 있는 네프론 전구 세포의 생성이 뒤따랐습니다. 마지막으로, 세포를 족세포로 분화시켰다. 이 절차에서 우리는 Bang et al.32 및 Okita et al.33에 의해 hiPSC 생성을 위한 에피솜 재프로그래밍을 위해 이전에 발표된 프로토콜과 Musah et al.28,34,35에 의해 hiPSC를 족세포로 분화하기 위한 프로토콜을 수정하고 결합했습니다.
실제로, 우리의 프로토콜에 의해 생성된 족세포는 1차 및 2차 발 과정의 뚜렷한 네트워크의 발달과 시냅토포딘, 포도신 및 네프린과 같은 족세포 특이적 마커의 발현과 관련하여 생체 내 족세포에 더 가까운 표현형을 가졌습니다. hiPSC 유래 족세포를 사용하여 환자의 유전적 배경이 재프로그래밍 및 분화 중에 유지됩니다. 이를 통해 환자 특이적 족세포 질환 모델링과 거의 무제한의 세포 수에서 생체 외 에서 잠재적인 치료 물질을 발견할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 최소 침습적이고, 비용 효율적이며, 윤리적으로 수용 가능하며, 약물 개발을 위한 새로운 길을 촉진할 수 있습니다.
Protocol
이 프로토콜은 Friedrich-Alexander University Erlangen-Nuremberg(251_18B)의 윤리 위원회의 승인을 받았으며 모든 환자와 프로밴드는 서면 동의를 했습니다. 모든 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다. 여기에 사용된 모든 매체 및 솔루션의 구성은 표 1을 참조하십시오.
1. 피부 펀치 생검에서 진피 섬유아세포의 성장
- 피부 펀치 생검을 10mL의 예열된 섬유아세포 배지가 있는 멸균된 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
- 배지를 제거하고 5mL의 멸균되고 예열된 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 피부 펀치 생검을 세 번 세척합니다. 멸균 겸자를 사용한 피부 펀치 생검을 10cm 세포 배양 플레이트에 옮기고 멸균 메스로 3-4 개로 너비로 자르고 표피와 진피를 남깁니다.
- 각 조각을 멸균된 35mm 플라스틱 세포 배양 접시에 옮기고 배양 접시에 부드럽게 누릅니다. 생검 조각 주변의 과도한 배지를 제거합니다. 액체가 증발하고 생검이 세포 배양 플라스틱에 부착될 때까지 5-10분 동안 건조시킵니다.
- 생검 주위에 1,000μL 피펫과 함께 섬유아세포 배지 1mL를 한 방울 떨어뜨리고 최종 부피 3mL까지 조심스럽게 채웁니다. 37°C, 5%CO2 에서 7일 동안 접시를 먹이거나 이동시키지 않고 배양한다. 배지를 신선하고 예열된 섬유아세포 배지로 조심스럽게 변경합니다. 7일 후, 성장된 방추형 섬유아세포를 위상차 현미경36을 사용하여 피부 생검 주위에서 모니터링할 수 있다.
참고: 자란 섬유아세포가 접시 가장자리에 도달하면 1.3단계부터 다시 진행하여 또 다른 배치의 섬유아세포를 생성합니다. - 성장한 섬유아세포의 확장을 위해, 예열된 1x PBS 2mL로 세척하고, 섬유아세포를 1mL의 1x 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 해리시키고, 37°C, 5%CO2에서 5분 동안 인큐베이션한다. 분리된 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 세포 배양 접시를 2mL의 신선하고 예열된 섬유아세포 배지로 세척합니다.
- 세척 매체를 튜브에 풀링하여 해리제를 중화하고 20°C에서 5분 동안 200 x g에서 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 1mL의 신선하고 예열된 섬유아세포 배지로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 신선한 세포 배양 플라스크에서 트리판 블루 및 시드 2.5 x 103 내지 5 x 10cm2 당3개의 섬유아세포를 사용하여 노이바우어 챔버 또는 자동 세포 계수기로 세포를 계수한다.
- 플라스크를 다시 인큐베이터에 넣고 플라스크를 각 방향으로 세 번 움직여 세포를 고르게 분배합니다. 다음날, 배지를 신선하고 예열된 섬유아세포 배지로 교체합니다. 일주일에 두 번 배지를 교체하고 섬유아세포가 약 80% 밀도에 도달하면 분할합니다.
2. 진피 섬유아세포 동결
- 섬유아세포를 동결시키려면 예열된 1x PBS 5mL로 세척합니다. PBS를 흡인하고 4mL의 1x 트립신-EDTA로 섬유아세포를 해리합니다. 플라스크를 다시 인큐베이터에 넣고 5%CO2에서 37°C에서 5-7분 동안 인큐베이션합니다. 위상차 현미경을 사용하여 분리를 모니터링하고 플라스크 측면을 두드려 세포를 분리합니다.
- 분리된 셀을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 세포 배양 플라스크를 5mL의 신선하고 예열된 섬유아세포 배지로 세척합니다. 세척 매체를 원뿔형 튜브에 넣고 200 x g에서 20° C 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 흡인하고 2mL의 신선하고 예열된 섬유아세포 배지로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 셀 수를 세고 1 x 106 셀을 새 원추형 튜브로 옮깁니다. 200 x g 에서 5 °C에서 20분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 흡인하고 90% 태아 송아지 혈청과 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 구성된 1mL의 차가운 섬유아세포 동결 배지로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 극저온으로 옮기고 냉동 용기에 넣고 -80°C에서 밤새 얼립니다. 장기간 보관하려면 다음날 액체 질소 탱크에 극저온 액체를 넣으십시오.
3. hiPSC를 생성하기 위한 섬유아세포의 에피솜 재프로그래밍
- 에피솜 재프로그래밍의 경우 통로 4에서 8까지 1.5 x 106 개의 섬유아세포를 사용합니다. 이 세포 수에 도달하려면 약 70%의 밀도로 2-3개의 250mL 플라스크를 사용하십시오.
- 재프로그래밍 전날 섬유아세포를 1:2 비율로 분할하여 증식 상태를 확인합니다. 따라서 배지를 흡인하고 플라스크당 5mL의 예열된 1x PBS로 플라스크를 세척합니다. PBS를 흡인하고 4mL의 1x 트립신-EDTA로 섬유아세포를 해리합니다. 플라스크를 다시 인큐베이터에 넣고 37°C 및 5%CO2에서 5-7분 동안 인큐베이션합니다. 위상차 현미경을 사용하여 분리를 모니터링하고 플라스크 측면을 두드려 플라스틱 표면에서 세포를 분리합니다.
- 분리된 세포를 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 세포 배양 플라스크를 5mL의 신선하고 예열된 섬유아세포 배지로 세척합니다. 세척 매체를 원뿔형 튜브에 넣고 200 x g에서 20° C 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 세포 펠릿을 6mL의 신선하고 예열된 섬유아세포 배지에 재현탁합니다.
- 플라스크당 5mL의 신선하고 예열된 섬유아세포 배지를 추가하여 6개의 새로운 세포 배양 플라스크를 준비합니다. 각 플라스크에 1mL의 섬유아세포 현탁액을 추가합니다. 플라스크를 다시 인큐베이터에 넣고 플라스크를 각 방향으로 세 번 움직여 세포를 고르게 분배합니다.
- 에피솜 재프로그래밍의 경우, hiPSC 배양에 적합한 10cm 세포 배양 플레이트 2개를 플레이트당 4mL의 저온 코팅 용액으로 코팅합니다. 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
참고: hiPSC를 배양하려면 다양한 세포 배양 플라스틱과 추가 세포외 기질 코팅이 필요합니다( 재료 표 참조). - 섬유아세포에서 배지를 제거하고 플라스크당 10mL의 예열된 1x PBS로 세척합니다. PBS를 흡인하고 37°C에서 5-7분 동안 인큐베이션하여 플라스크 당 4mL의 1x 트립신-EDTA로 섬유아세포를 해리시킵니다. 위상차 현미경을 사용하여 분리를 모니터링하고 필요한 경우 플라스크 측면을 두드려 플라스틱 표면에서 세포를 분리합니다.
- 분리된 셀을 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 빈 플라스크를 예열된 섬유아세포 배지 6mL로 세척하여 나머지 세포를 수집하고 원뿔형 튜브에 웅덩이합니다. 200 x g 에서 5 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 세포 펠릿을 3mL의 신선하고 예열된 1x PBS에 재현탁합니다.
- 세포를 세고 1.5 x 106 개의 섬유아세포를 새로운 원추형 튜브에 옮깁니다. 200 x g 에서 5 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 5mL의 전기천공 배지에 재현탁하고 다시 원심분리합니다. 그 동안 코팅된 10cm 세포 배양 플레이트에서 코팅 용액을 흡인하고 예열된 섬유아세포 배지 7mL를 추가합니다.
- 원심분리 후, 상층액을 버리고, 250 μL에 1.5 x 106 세포의 농도를 갖는 전기천공 배지에 세포 펠릿을 재현탁한다. 250 μL 세포 현탁액을 4 mm 간격 거리의 전기천공 큐벳으로 옮긴다( 재료 표 참조).
- 각 플라스미드(pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) 4μg을 총 부피 50μL의 전기천공 배지에 추가하여 플라스미드 형질주입 혼합물을 준비합니다. 큐벳으로 옮기고 부드럽게 튕겨서 섞습니다. 280V에서 하나의 펄스로 전기 증착하십시오.
- 멸균 가위를 사용하여 피펫 팁을 절단하고 전기천공된 섬유아세포 125μL를 준비된 10cm 세포 배양 플레이트 각각에 옮깁니다. 플레이트를 모든 방향으로 세 번 교반하여 세포를 분배하고 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 방해 없이 5%CO2 로 37°C에서 밤새 인큐베이션한다.
- 죽은 세포를 제거하려면 다음날 배지를 7mL의 신선하고 예열된 섬유아세포 배지로 교체하십시오. 전기천공 후 2일 후에 배지를 hiPSC 배지로 변경하고 다음 20일 동안 격일로 교체합니다.
4. 생성된 hiPSC의 선택, 확장 및 품질 관리
- 전기천공 후 hiPSC 콜로니의 형성을 관찰하기 위해 10x 또는 20x 대물렌즈의 위상차 현미경을 사용하여 최소 20일 동안 매일 세포를 모니터링합니다. hiPSC 콜로니의 크기가 약 300μm이고 경계가 뚜렷하고 hiPSC가 높은 핵 대 몸체 비율을 나타내는 경우 hiPSC 콜로니는 선별을 통해 선택할 준비가 된 것입니다(그림 2B, C 및 그림 3).
- 채취 전에 hiPSC 배양에 적합한 96웰 플레이트를 웰당 100μL의 코팅 용액으로 코팅하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 펜으로 세포 배양 접시의 바닥에 관심있는 콜로니를 표시하십시오. 96웰 플레이트의 최종 준비를 위해 코팅 용액을 제거하고 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 예열된 hiPSC 배양 배지 100μL를 각 웰에 추가합니다.
- 예열된 1x PBS로 세포를 세척하고 죽은 세포를 제거하기 위해 선택하기 전에 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 신선하고 예열된 hiPSC 배양 배지를 추가합니다. hiPSC 콜로니를 선택하려면 게이지 바늘을 사용하고 각 콜로니에 그리드를 그려 hiPSC 콜로니를 작은 조각으로 나눕니다.
- 위상차 현미경을 사용하여 콜로니가 성공적으로 조각으로 나뉘어져 있는지 확인합니다. 100μL 피펫을 사용하여 준비된 96웰 플레이트로 옮깁니다. 콜로니의 긁힘과 손실을 방지하기 위해 세포를 건드리지 않고 콜로니 위에 피펫을 똑바로 세우십시오.
- 96-웰 플레이트를 5%CO2 로 37°C의 인큐베이터에 놓고 세포가 방해 없이 밤새 부착되도록 합니다. 따기가 성공하지 못할 경우를 대비하여 섬유아세포와 hiPSC 혼합물로 접시를 보관하십시오. 따라서 배지를 hiPSC 배양 배지로 변경하여 ROCK 억제제 Y27632를 제거하고 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다.
- 다음날, 96-웰 플레이트의 배지를 신선한 hiPSC 배지 200 μL로 교체하고 격일로 교체하였다. 다음날 96웰 플레이트를 모니터링하고 성공적으로 선별된 클론으로 웰을 표시합니다.
참고: 첫 번째 시도 후 선별된 hiPSC 클론이 완전히 선택되지 않고 웰에서 섬유아세포가 발견될 수 있는 경우 96-웰에서 채취를 반복하거나 플레이트에서 섬유아세포를 긁어냅니다.
5. 선택된 hiPSC 클론의 확장
- 위상차 현미경을 사용하여 hiPSC 클론을 모니터링합니다. 선택한 hiPSC가 약 70% 밀도에 도달하면 hiPSC 클론을 확장할 준비가 된 것입니다.
- hiPSC 배양에 적합한 48웰 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 웰당 250μL의 코팅 용액으로 코팅합니다. 코팅 용액을 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 신선하고 예열된 hiPSC 배양 배지 200μL로 교체합니다.
- 96웰 플레이트에서 hiPSC를 분리하려면 1,000μL 피펫 팁으로 플라스틱 표면을 긁어냅니다. 분리된 hiPSC를 96웰 플레이트에서 48웰 플레이트로 옮깁니다. 다음날 배지를 신선하고 예열된 hiPSC 배지로 변경하여 죽은 세포 및 ROCK 억제제 Y27632를 제거하였다.
- hiPSC 클론이 약 70% 밀도에 도달하면 hiPSC를 24웰 플레이트로 옮깁니다. 따라서 hiPSC 배양에 적합한 24-웰 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 웰 당 400μL의 코팅 용액으로 코팅합니다. 코팅 용액을 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유한 신선하고 예열된 hiPSC 배양 배지 400μL로 교체합니다. 48개의 웰에서 배지를 흡인하고 예열된 500μL의 1x PBS로 세척합니다.
- PBS를 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 효소 세포 분리 용액 100μL로 교체하고 37°C에서 4분 동안 인큐베이션합니다. 1,000 μL 파이펫을 사용하여 플레이트에서 hiPSC를 헹굽니다. 해리된 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 빈 48-웰 플레이트를 10 μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 hiPSC 배양 배지로 세척하고 원뿔형 튜브에 풀링한다.
- 200 x g 에서 5 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 hiPSC 배양 배지 1mL에 hiPSC를 재현탁하고 24웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 5%CO2 에서 37°C의 인큐베이터에 넣고 플레이트를 모든 방향으로 3회 교반하여 세포를 분배하였다. 세포가 방해받지 않고 밤새 부착되도록하십시오.
- 다음날, 배지를 ROCK 억제제 Y27632가 없는 hiPSC 배지로 변경하였다.
참고: hiPSC 클론이 약 70% 밀도에 도달하면 12웰 형식에 적합한 부피를 증가시켜 5.4-5.7단계를 반복하여 hiPSC를 12웰 플레이트로 옮깁니다. 12웰 플레이트의 hiPSC가 약 70% 밀도에 도달하면 hiPSC 클론을 6웰 형식을 위해 부피가 증가된 6웰 플레이트로 옮깁니다.
6. 선택된 hiPSC 클론의 동결
- 선택된 hiPSC 클론을 동결하려면 6웰 플레이트에서 배지를 흡인합니다. 웰을 2mL의 1x PBS로 세척합니다. 10μM Y27632를 함유하는 효소 세포 분리 용액 1mL로 hiPSC를 흡인하고 해리합니다. 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣고 37°C 및 5%CO2에서 4분 동안 인큐베이션합니다.
- 1,000μL 피펫을 사용하여 플레이트에서 hiPSC를 헹구고 분리된 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 플레이트를 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 신선하고 예열된 hiPSC 배양 배지 2mL로 세척합니다. 원뿔형 튜브에 넣고 200 x g 에서 20°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 신선하고 예열된 hiPSC 배양 배지 2mL로 세포 펠릿을 재현탁합니다.
- 셀 수를 세고 1 x 106 셀을 새 원추형 튜브로 옮깁니다. 200 x g 에서 5 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고, 세포 펠릿을 1mL의 차가운 무혈청 hiPSC 동결 배지에 재현탁하고, -80°C에서 하룻밤 동안 냉동 용기를 사용하여 극저온 상태에서 동결합니다. 장기 보관을 위해 극저온 액체를 다음날 액체 질소 탱크에 넣으십시오.
7. HiPSC 품질 관리
- hiPSC 형태의 특성화
- 20x 대물렌즈의 위상차 현미경을 사용하여 특징적인 hiPSC 형태를 확인합니다. 재프로그래밍 후 세포 형태는 긴 방추형 섬유아세포에서 작고 둥근 hiPSC로 변화하여 뚜렷한 경계를 가진 콜로니에서 성장하는 높은 핵 대 체내 비율을 나타냅니다(그림 2C).
- hiPSC 콜로니가 너무 조밀하게 성장하여 자발적인 분화가 발생하면 피펫 팁을 사용하여 플레이트에서 분화된 부분을 긁어냅니다(그림 3). hiPSC는 증식률이 높기 때문에 신선하고 예열된 hiPSC 공급 배지를 매일 hiPSC 배양물에 공급하십시오.
- 면역형광 염색에 의한 다능성 마커의 특성 분석
- 면역형광 염색을 통해 생성된 hiPSC의 만능 마커를 확인하기 위해 플라스틱 커버슬립을 24웰 플레이트에 넣고 37°C 및 5%CO2에서 1시간 동안 250μL의 코팅 용액으로 코팅합니다. 코팅 용액을 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 예열된 hiPSC 배양 배지 1mL로 교체합니다.
- 시드 1.9 x 1024 웰당 4개의 해리된 hiPSC. hiPSC를 방해 없이 37°C 및 5%CO2 에서 밤새 부착합니다. hiPSC의 해리에 대해서는 5.4-5.6단계를 참조하십시오. 다음날 배지를 ROCK 억제제 Y27632가 없는 hiPSC 배양 배지로 교체합니다.
- 염색을 위해, 세포를 1 mL의 예열 된 1x PBS로 세척 한 후, 실온에서 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 hiPSCs를 고정시킨다. 고정된 hiPSC를 1x PBS로 세척하고 실온에서 1시간 동안 웰당 200μL의 사전 배양 용액으로 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 1차 항체 Ki67(1:300), OCT3/4(1:200), SSEA4(1:100)를 항체 희석액에 희석합니다.
- 70% 에탄올로 플라스틱 호일을 세척하고 물통으로 채워진 염색 챔버에 넣습니다. 호일에 30μL 1차 항체 희석액 방울을 놓습니다. 고정된 샘플을 희석액에 거꾸로 놓고 4°C에서 밤새 배양합니다.
- 다음날 샘플을 1x PBS로 5분 동안 세 번 세척하고 호일의 깨끗한 부분에 2차 항체 희석액(1:1,000) 30μL 방울을 놓습니다. 희석액에 덮개 슬라이드를 거꾸로 놓습니다. 어두운 곳에서 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 배양 후 1x PBS로 5분 동안 3회 세척한다. DAPI가 포함된 장착 매체의 유리 슬라이드에 샘플을 장착합니다. 실온과 어두운 곳에서 밤새 건조시키고 컨포칼 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화합니다(그림 4).
- 박테리아 및 마이코플라스마 오염 배제
- 박테리아 오염을 배제하기 위해 해리된 hiPSC 500μL를 예열된 Luria-Bertani(LB) 배지 5mL로 옮깁니다. hiPSC의 해리에 대해서는 5.4-5.6단계를 참조하십시오. 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다. LB 배지가 탁해 보이면 박테리아 오염이 발생했을 가능성이 있습니다. 셀을 버립니다.
- 마이코플라스마 오염을 배제하기 위해, 약 90%의 confluent hiPSCs가 있는 6개의 웰에서 2일 동안 교체되지 않은 배지를 수집하십시오. 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR)을 사용하여 마이코플라스마 오염을 검출합니다. 이를 위해 많은 상업용 마이코플라스마 검출 키트를 사용할 수 있습니다.
8. hiPSC를 족세포로 분화
- 성장 인자의 준비 및 저장
- 10mM Y27632의 스톡 농도를 준비하려면 3.12mL의 멸균수에 10mg의 Y27632(분자량 320.26g/mol)를 재구성합니다. -20°C에서 분취량 100μL를 보관하고 세포 배양 배지에 1:1,000으로 희석하여 최종 농도가 10μM이 되도록 합니다.
- 30mM CHIR99021의 스톡 농도를 준비하기 위해 358.2μL의 멸균 DMSO에 5mg의 CHIR99021(분자량 465.34g/mol)을 재구성합니다. -20°C에서 분취량 50μL를 보관하고 세포 배양 배지에 1:10,000으로 희석하여 최종 농도 3μM에 도달합니다.
- 100μg/mL 액티빈 A의 스톡 농도를 준비하려면 0.1% 소혈청알부민(BSA)이 포함된 1x PBS 1mL에 액티빈 A 100μg을 재구성합니다. -20°C에서 분취량 100μL를 보관하고 세포 배양 배지에 1:2,000으로 희석하여 최종 농도가 50ng/mL가 되도록 합니다.
- 100μg/mL 뼈 형태 형성 단백질 7(BMP7)의 스톡 농도를 준비하려면 0.1% BSA가 포함된 멸균수 1mL에 BMP7 100μg을 재구성합니다. -20°C에서 분취량 100μL를 보관하고 세포 배양 배지에 1:2,000으로 희석하여 최종 농도가 50ng/mL가 되도록 합니다.
- 100μg/mL 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 스톡 농도를 준비하려면 1mL의 멸균수에 100μg의 VEGF를 재구성합니다. 분취액 100μL를 -20°C에서 보관하고 세포 배양 배지에 1:4,000으로 희석하여 최종 농도가 25ng/mL가 되도록 합니다.
- 10mM 스톡 농도의 올-트랜스 레티노산을 제조하기 위해, 3.33 mL의 멸균 DMSO에 10 mg의 올-트랜스 레티노산을 재구성한다. 분취량 100μL를 -20°C에서 보관하고 세포 배양 배지에 1:100으로 희석하여 최종 농도 0.5μM에 도달합니다.
- 중배엽 계통을 유도하기 위한 WNT 신호전달 경로의 활성화
- hiPSCs를 hiPSC 유래 족세포로 분화시키기 위해, 코팅 용액으로 hiPSC 배양에 적합한 세포 배양 플레이트 또는 플라스크를 37°C 및 5%CO2에서 1시간 동안 코팅하였다. 코팅 용액의 총 부피는 6-웰 배양 플레이트당 1 mL 또는 10 cm 세포 배양 플레이트당 4 mL이다.
- 배지를 흡인하고 예열된 1x PBS로 hiPSC를 세척합니다. PBS를 흡인하고, 6-웰 배양 플레이트 당 1 mL 또는 10 cm 세포 배양 플레이트 당 4 mL의 총 부피로 10 μM Y27632를 함유하는 효소 세포 분리 용액을 추가한다.
- 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣고 37°C 및 5%CO2에서 4분 동안 인큐베이션합니다. 1,000 μL 파이펫을 사용하여 플레이트에서 hiPSC를 헹굽니다. 분리 된 셀을 원추형 튜브로 옮깁니다.
- 플레이트를 10 μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 신선하고 예열된 hiPSC 배양 배지로 세척한다. 해리 시약을 중화하기 위해 원추형 튜브에 세척 매체를 풀링합니다. 200 x g 에서 5 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 신선하고 예열된 hiPSC 배양 배지 2mL로 세포 펠릿을 재현탁합니다.
- 세포를 세고 1 x 104 hiPSCs/cm2를 시드합니다. 모든 방향으로 3회 교반하여 세포를 분배한다. hiPSC를 방해 없이 5%CO2 로 37°C에서 밤새 부착합니다.
- 다음날, 배지를 1x B27 보충제, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 3μM CHIR99021, 50ng/mL 액티빈 A 및 10μM ROCK 억제제 Y27632를 포함하는 예열 중배엽 분화 배지 2mL로 교체합니다.
- 네프론 전구 세포로의 분화
- 2일 후, 중배엽 배지를 1x B27 보충제, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 3μM CHIR99021, 50ng/mL 액티빈 A 및 50ng/mL BMP7을 포함하는 예열 네프론 전구체 분화 배지 2mL로 변경합니다. 다음 14일 동안 격일로 매체를 교체하십시오.
참고: 네프론 전구 세포는 증식하며 네프론 전구체 확장 배지에서 분화 7일 후에 계대 및 동결될 수 있습니다. - 네프론 전구 세포를 분할하기 위해, hiPSC 배양에 적합한 세포 배양 플라스틱을 37°C에서 1시간 동안 코팅 용액으로 코팅한다. 코팅 용액을 네프론 전구체 확장 배지로 교체하십시오. 배지를 흡인하고 예열된 1x PBS로 세포를 세척합니다. PBS를 제거하고 세포를 1x 트립신-EDTA로 해리합니다.
- 37°C 및 5%CO2에서 5분 동안 인큐베이션한다. 위상차 현미경을 사용하여 세포의 분리를 모니터링합니다. 필요한 경우 플라스틱 측면을 두드려 표면에서 셀을 분리합니다. 플레이트에서 세포를 헹구고 원추형 튜브로 옮깁니다. 해리 시약과 동일한 부피의 예열 된 네프론 전구체 팽창 배지로 빈 플라스크 또는 플레이트를 세척하십시오.
- 원뿔형 튜브에 세척 매체를 웅덩이. 200 x g에서 5 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 2mL의 신선하고 예열된 네프론 전구체 확장 배지로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 추가 분화를 위해 세포를 계수하고 1.5 x 10cm2 당4개의 네프론 전구 세포를 시드한다.
참고: 네프론 전구 세포를 동결하려면 1 x 106 세포를 1mL의 저온 무혈청 동결 보존 배지에 재현탁하고 냉동 상태로 옮깁니다. -80°C의 냉동 용기에서 하룻밤 동안 냉동하고 장기 보관을 위해 액체 질소 탱크로 옮깁니다. - 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣고 모든 방향으로 3회 교반하여 세포를 고르게 분배합니다. 다음날 배지를 신선하고 예열된 네프론 전구체 분화 배지로 변경합니다. 세포가 분화될 때까지 격일로 배지를 네프론 전구세포 분화 배지에서 14일 동안 교체한다.
- 2일 후, 중배엽 배지를 1x B27 보충제, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 3μM CHIR99021, 50ng/mL 액티빈 A 및 50ng/mL BMP7을 포함하는 예열 네프론 전구체 분화 배지 2mL로 변경합니다. 다음 14일 동안 격일로 매체를 교체하십시오.
- hiPSC 유래 족세포로의 말단 분화
- 배지를 흡인하고 1x B27 보충제, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 3μM CHIR99021, 50ng/mL 액티빈 A, 50ng/mL BMP7, 25ng/μL VEGF 및 0.5μM all-trans retinoic acid를 포함하는 예열 지세포 분화 배지 2mL를 추가합니다. 플레이트를 다시 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에 넣는다. 신선하고 예열된 족세포 분화 배지로 4일 동안 격일로 배지를 교체하십시오.
- 분화 후 배양액에 hiPSC-족세포를 유지하기 위해 10% 태아 송아지 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄을 함유한 족세포 유지 배지를 일주일에 두 번 세포에 공급합니다.
참고: 말단 분화된 hiPSC-족세포는 더 이상 증식하지 않습니다. 그러나 최대 4주 동안 세포 배양에 보관할 수 있습니다.
- 냉동 네프론 전구 세포의 해동 및 확장
- hiPSC 배양에 적합한 새로운 세포 배양 플라스틱 플라스크를 37°C 및 5%CO2에서 1시간 동안 코팅 용액으로 코팅합니다. 코팅 용액을 5mL의 네프론 전구체 확장 배지로 교체합니다.
- 예열된 네프론 전구체 확장 배지 7mL가 있는 15mL 원뿔형 튜브를 준비합니다. 냉동된 세포를 약 20초 동안 움직이지 않고 수조에서 37°C에서 해동합니다. 세포의 절반이 해동되고 약간의 얼음이 남을 때 수조에서 cryovial을 꺼냅니다.
- 극저온 액체에 70% 에탄올을 뿌리고 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 해동된 세포를 예열된 네프론 전구체 확장 배지를 사용하여 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 1,000 μL 피펫을 사용하여 세포가 튜브 벽을 따라 매우 천천히 흐르도록 합니다.
- 빈 극저온 난을 1mL의 네프론 전구체 확장 배지로 세척하여 나머지 세포를 수집하고 원뿔형 튜브에 고입니다. 20°C에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리하고 세포 펠릿을 신선하고 예열된 네프론 전구체 확장 배지에 재현탁합니다.
- 해동된 세포를 코팅된 플라스크로 옮기고 다음날 배지를 신선하고 예열된 네프론 전구체 확장 배지로 변경합니다. 추가 분화 전에, 배지를 격일로 변경하여 네프론 전구체 확장 배지에서 세포가 증식하도록 하고, 단계 8.3.5부터 진행한다.
9. 면역형광염색에 의한 hiPSC 유래 족세포의 특성화
- 면역형광 염색을 통해 족세포 특이적 마커에 대한 분화된 족세포를 확인하려면 플라스틱 커버슬립을 24웰 플레이트에 넣고 250μL의 코팅 용액으로 37°C 및 5% CO2에서 1시간 동안 코팅합니다. 코팅 용액을 예열된 네프론 전구체 확장 배지 1mL로 교체합니다. 시드 24-웰 플레이트 당 2.5 x 104 해리된 네프론 전구 세포. 8.3.2 - 8.3.4 단계에서 네프론 전구 세포의 해리를 참조하십시오.
- 세포가 방해 없이 37°C 및 5% CO2에서 밤새 부착되도록 합니다. 다음날 배지를 예열된 네프론 전구체 분화 배지로 교체합니다.
- 세포가 분화될 때까지 격일로 배지를 네프론 전구세포 분화 배지에서 총 14일간, 족세포 분화 배지에서 추가로 5일 동안 배지를 교체하여 분화를 마칩니다.
- 최종 분화 후, 1 mL의 예열 된 1x PBS로 세포를 세척하십시오. 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 hiPSC-족세포를 고정합니다. 고정된 세포를 1x PBS로 세척하고 실온에서 1시간 동안 웰당 200μL의 사전 배양 용액으로 비특이적 결합 부위를 차단합니다.
- 1차 항체 시냅토포딘(1:200), 포도신(1:100) 및 네프린(1:25)을 항체 희석액으로 희석하고 물 저장소가 있는 염색 챔버의 깨끗한 플라스틱 호일에 1차 항체 희석액 30μL를 놓습니다.
- 희석액에 고정된 hiPSC-족세포가 있는 덮개 슬라이드를 거꾸로 놓습니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 1x PBS로 5분 동안 3회 세척한다. 2차 항체(1:1,000)를 1x PBS로 희석하고 호일의 깨끗한 부분에 30μL 2차 항체 희석액 방울을 놓습니다. 희석액에 덮개 슬라이드를 거꾸로 놓습니다.
- 어두운 곳에서 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 배양 후 1x PBS로 5분 동안 3회 세척한다. DAPI가 포함된 장착 매체의 유리 슬라이드에 샘플을 장착합니다. 실온과 어두운 곳에서 밤새 말리십시오. 컨포칼 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화합니다.
Representative Results
에피솜 재프로그래밍과 분화를 결합한 이 단계별 프로토콜을 사용하면 족세포 관련 유전자에서 환자의 돌연변이를 운반하는 족세포를 생성할 수 있습니다. 이를 통해 생체 외에서 질병 특이적 족세포 변화를 분석할 수 있습니다. 환자의 유전적 배경은 프로토콜 동안 모든 다른 세포 단계에서 보존됩니다. 또한, 말단적으로 분화된 비증식성 족세포의 불충분한 세포 수의 한계는 hiPSC 유래 족세포를 사용함으로써 극복될 수 있다. hiPSC 로 재프로그래밍 되고 이후 족세포로 분화되어 자란 진피 섬유아세포에서 hiPSC-족세포가 생성되기까지 몇 개월이 걸리지만 프로토콜의 세 가지 다른 단계에서 세포를 동결할 수 있습니다(그림 2). 섬유아세포, hiPSC 및 네프론 전구세포는 네프론 전구체 분화 배지에서 7일 동안 분화한 후 동결이 가능합니다. 따라서 작업 세포 은행의 생성과 대규모 실험이 가능합니다.
그림 2: 위상차 현미경을 통한 프로토콜의 개별 단계. (A) 자란 진피 섬유아세포. (B) 재프로그래밍 후 hiPSC 콜로니 형성. (C) 선택된 hiPSC 배양액. (d) 분화 2일 후의 중배엽 세포. (e) 분화 14일 후 네프론 전구세포 분화 배지. (F) 말단 분화된 hiPSC 유래 족세포. 스케일 바는 300 μm (A, B, D-F) 및 150 μm (C)를 나타냅니다. 눈송이는 가능한 동결 단계를 강조 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
생성된 hiPSC 유래 족세포가 세포 유형 및 형태와 관련하여 급격한 변화를 보이는 긴 프로토콜을 통과하기 때문에 세포 특성화가 필수적입니다. 크기 및 세포 형태와 같은 세포 형태와 성장 거동은 위상차 현미경을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 섬유아세포는 150 μm 내지 300 μm 크기의 긴 방추형 표현형을 나타낸다(도 2A). 재프로그래밍 후 50μm의 작은 hiPSC가 있는 콜로니가 발생합니다. 이 콜로니는 높은 핵 대 몸체 비율과 증가된 증식 속도로 구별되는 뚜렷한 경계와 hiPSC를 나타냅니다(그림 2C). 족세포는 말기 분화된 세포이기 때문에 점진적인 분화에 따라 증식률이 감소하고 세포 형태는 두드러진 발 돌기를 가진 300μm의 큰 별 모양의 족세포로 변합니다(그림 2F).
밀도는 hiPSC 배양의 중요한 지점이며, 콜로니가 너무 조밀하게 성장하면 자발적인 분화가 나타날 수 있습니다(그림 3). 이 식민지는 배양 접시의 영향을받는 부분을 긁어 통과하기 전에 제거해야합니다.
그림 3: 다양한 품질의 hiPSC의 예. 성공적으로 (A) 재프로그래밍된 hiPSC 콜로니 및 (B) 선택된 hiPSC의 위상차 이미지, (C) 자발적 분화, (D,E) 비 hiPSC 콜로니 및 (F) 너무 조밀한 hiPSC 배양. 스케일 바는 300μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 프로토콜의 다양한 세포 유형은 특정 마커의 발현과 관련하여 검증되어야 합니다. 재프로그래밍 후 hiPSC는 만능 능력을 회복하고 SSEA4, OCT3/4 및 Ki67과 같은 증식 및 만능 마커를 발현합니다(그림 4)38,39,40. 재프로그래밍과 hiPSC의 긴 배양 및 분화는 비정상적인 핵형을 유발하거나 오히려 돌연변이를 유도할 수 있는 것으로 알려져 있습니다41. 따라서 배양된 세포의 유전적 배경은 g-banding 및 전체 엑솜 시퀀싱을 통해 시간이 지남에 따라 다른 계대에서 모니터링되어야 합니다.
그림 4: 면역형광 염색에 의한 생성된 hiPSC의 특성 분석. (A) 증식 마커 Ki67 및 다능성 마커 (B) OCT3/4 및 (C) SSEA4에 대한 염색을 통해 생성된 hiPSC의 특성화. 스케일 바는 100μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
형태학적으로 hiPSC 유래 족세포는 별 모양으로 나타나며 ciPodocytes에 비해 긴 1차 및 2차 발 과정의 뚜렷한 네트워크를 표현합니다(그림 5). HiPSC 유래 족세포는 시냅토포딘, 네프린 및 포도신과 같은 족세포 특이적 마커 단백질을 발현합니다(그림 6A-C)42.
그림 5: ciPodocytes와 비교한 hiPSC 유래 족세포의 형태. 위상차 현미경(A,C) 및 주사전자현미경(B,D)을 사용하여 세포 형태 및 필로포디아에 관한 건강한 기증자의 (A,B) hiPSC 유래 족세포와 (C,D) ciPodocytes의 비교. 스케일 바는 150 μm(A,C) 및 20 μm(B,D)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
따라서 건강한 기증자뿐만 아니라 족세포 특이적 유전자에 돌연변이가 있는 환자의 hiPSC 유래 족세포를 비교하면 생체 외 환자의 돌연변이에 대한 개별화된 특성화가 가능합니다.
그림 6: hiPSC 유래 족세포 및 ciPodocytes에서 족세포 특이적 마커의 특성화. 족세포 특이적 마커 단백질인 시냅토포딘(A,D), 네프린(B,E) 및 포도신(C,F)에 관한 건강한 기증자에서 (D-F) ciPodocytes까지의 (A-C) hiPSC 유래 족세포의 비교. 스케일 바는 50μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. 연구에 사용된 모든 세포 배양 배지 및 용액의 구성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 세포 배양 기반 프로토콜은 인간 진피 섬유아세포의 에피솜 재프로그래밍을 환자 특이적 hiPSC로 재프로그래밍하고 이후 hiPSC 유래 족세포로 분화하는 것을 결합합니다. 이를 통해 족세포 손상과 관련하여 유전적 사구체 질환이 있는 환자의 족세포의 돌연변이 관련 변화를 연구할 수 있습니다. 전기천공에 의한 무통합 방법으로 진피 섬유아세포를 재프로그래밍하는 프로토콜은 Bang et al.32 및 Okita et al.33의 발표된 연구에서 채택되었습니다. 족세포를 hiPSC와 구별하기 위한 프로토콜은 Musah et al.28,34,35의 공개된 프로토콜에서 채택되었습니다. hiPSC 27,34,35에서 족세포의 생성을 설명하는 간행물이 이미 있습니다. 그러나 여기에 제공된 프로토콜은 hiPSC를 족세포로 분화하는 것과 관련하여 최적화되고 저렴합니다. Musah et al.에서 발표한 프로토콜과 비교하여 비트로넥틴, 라미닌 실크-511 및 가용화된 기저막 매트릭스와 같은 다양한 코팅 시약에서 이 프로토콜을 테스트했습니다. 비트로넥틴과 라미닌 실크-511의 농도는 5 μg/mL 대신2.5 μg/mL로 감소될 수 있습니다 28,34,35. 또한, 매우 비싼 두 가지 성장 인자인 BMP7과 액티빈 A의 농도를 100ng/mL에서 50ng/mL로 50% 감소시킬 수 있었습니다.
이를 통해 더 저렴한 차별화가 가능합니다. 7일째부터 네프론 전구 세포는 여전히 증식하고 있었고, 동결의 가능성은 이전에 나타났다. 우리는 해동 후 최종 분화 전에 Dulbecco의 변형 된 Eagle 배지 (DMEM)와 B27을 포함하는 염기성 배지에서 며칠 동안 이러한 세포를 확장하여 비용을 더욱 줄였습니다. 분화 단계 외에도 이 프로토콜은 에피솜 재프로그래밍을 통해 환자 특이적 hiPSC의 후속 생성과 함께 피부 생검에서 섬유아세포의 성장을 설명합니다. 이 두 가지 방법의 조합은 환자 특이적 족세포의 생성을 가능하게 합니다. 따라서, 이전에 상세히 설명되지 않았던 환자 특이적 hiPSC 유래 족세포를 생성하기 위한 완전한 단계별 프로토콜이 여기에 제공된다.
전체 프로토콜에는 여러 가지 다른 세포 유형이 포함되기 때문에 생성된 세포 유형을 서로 다른 단계에서 특성화하는 것이 중요합니다. 세포는 오랜 기간 동안 배양되므로 품질 관리는 다른 계대에서 수행되어야 합니다. hiPSC로 작업할 때는 세포 행동 및 형태 모니터링뿐만 아니라 일일 공급이 필요합니다. 분화 배지의 무균성은 0.2μm 필터를 통한 필터 멸균으로 보장되어야 합니다. 피부 생검에서 hiPSC 유래 족세포에 이르기까지 전체 프로토콜은 몇 개월이 걸리지만 과정의 뚜렷한 단계에서 세포를 동결시킬 수 있습니다. 섬유아세포, 선별된 hiPSC 클론 및 증식성 네프론 전구세포를 네프론 전구체 분화 배지에서 7일 후에 동결시킬 수 있고, 작동하는 세포 은행을 생성할 수 있다.
hiPSC 유래의 건강한 족세포는 1차 및 2차 발 과정의 뚜렷한 네트워크를 개발하고(그림 5A, B) 전형적인 족세포 특이적 마커(그림 6A-C)를 발현하지만, 생체 내에서 볼 수 있듯이 특징적인 슬릿 다이어프램은 고전적인 2차원 세포 배양 모델에서 모방하기 어렵습니다. 또한, 다른 사구체 세포 유형과의 세포 간 통신은 이 단일 배양 환경에서 불가능합니다.
말단 분화 상태와 증식 능력의 부족으로 인해 생체 외에서 족세포를 연구하는 것은 어렵습니다. 조건부로 불멸화하는 일차 족세포의 도움으로 온도감응성 스위치를 삽입하여 이러한 한계를 극복할 수 있으며, 그 결과 세포가 33°C에서 증식하고 37°C에서 분화하는 세포 배양 모델이 생성됩니다13,14. 이러한 ciPodocytes는 족세포 연구에 대한 높은 잠재력을 가지고 있지만, 마커 발현의 부족, 탈분화 형태 및 발 과정 형성 실패와 같은 한계가 있습니다15,16.
환자 유래 체세포에서 족세포를 분화하면 생체 외에서 병에 걸린 족세포를 생성하고 건강한 조절 세포와 비교할 수 있습니다. 이를 통해 족세포 특이적 유전자의 돌연변이로 인한 족세포 손상을 연구할 수 있습니다. 또한, hiPSC로 작업하면 3차원 세포 배양 질환 모델 또는 오가노이드를 생성할 수 있는 잠재력이 있습니다43,44. hiPSC 유래 족세포를 사구체 내피 세포 또는 간질 세포와 같은 다른 사구체 세포와 공동 배양하면 건강 및 사구체 질환에서 세포 간 통신에 관한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.
또한, 환자 특이적 족세포의 특성화 및 치료는 고처리량 분석에서 생체 외 에서 수행될 수 있습니다. 개별화된 접근 방식은 특정 돌연변이에 대한 새로운 치료 표적을 조사하고 미래에 개별화된 의학을 수행할 수 있는 기회를 제공합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg의 Interdisciplinary Center for Clinical Research(IZKF)에서 Janina Müller-Deile에게 부여된 보조금 번호 M4-IZKF-F009와 Bundesministerium für Bildung und Forshung(BMBF)에서 프로젝트 이름 STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, 보조금 번호 01GM2202D로 Janina Müller-Deile에게 주어졌습니다. SEM 이미지 촬영을 지원해 주신 Annalena Kraus에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm sterile filter | Rotilab | P668.1 | for sterilization of differentiation medium |
| all-trans retinoic acid | Stem Cell Technologies | 72262 | supplement for differentiation |
| B27 supplement (50 x), serum free | Gibco | 17504044 | supplement for serum-free differentiation medium |
| BG iMatrix-511 Silk | biogems | RL511S | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| Bovine serum albumin (BSA) | Roth | 8076.4 | |
| CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL | Greiner bio-one | 82050-856 | cell culture plastics suitable for fibroblast culture |
| CHIR99021 (5 mg) | Sigma-Aldrich | 252917-06-9 | supplement for differentiation |
| Corning Matrigel hESC qualified matrix | Corning | 354277 | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix) |
| countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | to count cells |
| countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | to count cells | |
| cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white | Sarstedt | 72380 | cryovials for freezing of cells |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Roth | A994.1 | for fibroblast freezing medium |
| DMEM/F12 (1:1) (1 x) | Gibco | 11320074 | basic medium for differentiation |
| DMEM/F12 + Glutamax | Gibco | 10565018 | basic medium for fibroblast medium |
| EVOS M5000 Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | phase contrast microscope |
| fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) | PAN Biotech | P301902 | serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium |
| fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile | Fisherbrand | FB104 | cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap) |
| fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | mounting medium containing dapi |
| gauge needle (0.6 x 30 mm) | BD Microlance3 | 300700 | for separation of hiPSC colonies into small pieces |
| human Recombinant Activin A Protein | 78001.1 | Stem cell technologies | supplement for differentiation |
| human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) | Peprotech | 120-03P | supplement for differentiation |
| human VEGF-165 Recombinant Protein | Thermo Scientific | PHC9394 | supplement for differentiation |
| insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) | Gibco | 41400045 | supplement for podocyte maintenance medium |
| LB medium | Roth | X964.1 | for sterility test of hiPSC culture |
| lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit | Sigma Aldrich | MP0035-1KT | commercial mycoplasma detection kit |
| microscope slides | Diagonal GmbH & Co.KG | 21,102 | |
| microtube 1.5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| mTeSR1 Complete Kit | Stem Cell Technologies | 85850 | basic medium for serum-free hiPSC culture medium |
| nalgene freezing container Mr.Frosty | Roth | AC96.1 | to ensure optimal freezing conditions |
| normal goat serum | abcam | ab 7481 | for preincubation solution and antibody diluent |
| nunc 24 well plates | Thermo Scientific | 142485 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nunc 48 well plates | Thermo Scientific | 152640 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nunc 6 well plates | Thermo Scientific | 140685 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nunc EasYDish Dishes 100 mm | Thermo Scientific | 150466 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 167008 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nutriFreez D10 Cryopreservation Medium | Sartorius | 05-713-1E | serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells |
| Opti-MEM | Gibco | 11058021 | electroporation medium |
| pCXLE-hMLN | Addgene | #27079 | plasmid for episomal reprogramming |
| pCXLE-hOCT3/4 plasmid | Addgene | #27077 | plasmid for episomal reprogramming |
| pCXLE-hSK plasmid | Addgene | #27078 | plasmid for episomal reprogramming |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | to avoid bacterial contamination |
| plastic coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes |
| ROTI Histofix | Roth | P087.3 | commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells |
| RPMI 1640 + L-Glutamine | Gibco | 21875034 | basic medium for podocyte maintenance medium |
| staining chamber StainTray Black lid | Roth | HA51.1 | |
| stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs |
| sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) | Gibco | 14190094 | used for washing and coating |
| sterile water | Roth | T1432 | |
| syringe without needle 20 mL | BD Plastipak | 300629 | to filter sterilize differentiation medium |
| TC dish 100 mm | Sarstedt | 8,33,902 | sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture |
| TC dish 35 mm | Sarstedt | 8,33,900 | sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy |
| triton X 100 | Roth | 3051.3 | for preincubation solution |
| trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | to count cells |
| trypsin-EDTA (10 x) | Biowest | X0930-100 | dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells |
| tube 15 mL | Greiner bio-one | 188271-N | |
| tube 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| vitronectin ACF | Sartorius | 05-754-0002 | extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| Y-27632 dihydrochloride (10 mg) | Tocris | 1254 | to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting |
| Primary antibodies | |||
| OCT4 | Stem Cell Technologies | 60093.1 | pluripotency marker, dilution 1:200 |
| SSEA-4 | Stem Cell Technologies | 60062FI.1 | pluripotency marker, dilution 1:100 |
| Ki67 | Abcam | ab15580 | proliferation marker, dilution 1:300 |
| synaptopodin | Proteintech | 21064-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:200 |
| nephrin | Progen | GP-N2 | podocyte-specific marker, dilution 1:25 |
| podocin | proteintech | 20384-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:100 |
| Secondary antibodies | |||
| goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21435 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
| alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A31634 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
| donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
| goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
| goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
References
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