Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Generering av pasientavledede podocytter fra hudbiopsier

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65364
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Nephrology and Hypertension, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University (FAU) Erlangen-Nürnberg, 2Research Center on Rare Kidney Diseases (RECORD), University Hospital Erlangen

Summary

Dette manuskriptet beskriver en to-trinns protokoll for å generere pasientspesifikke podocytter fra dermale fibroblaster via episomal omprogrammering til menneskeinduserte pluripotente stamceller (hiPSCs) og påfølgende differensiering til podocytter.

Abstract

Podocytter er epitelceller som sitter på urinstedet til den glomerulære filtreringsbarrieren som bidrar til glomerulusens selektive filterfunksjon. Mutasjoner i podocyttspesifikke gener kan forårsake fokal segmental glomerulosklerose (FSGS), og podocytter påvirkes også i mange andre primære og sekundære nefropatier. På grunn av deres differensierte natur er primære cellekulturmodeller begrenset for podocytter. Derfor brukes ofte betinget immortaliserte celler. Imidlertid har disse betinget udødeliggjorte podocyttene (ciPodocytter) flere begrensninger: cellene kan dedifferensiere i kultur, spesielt når de når sammenløp, og flere podocyttspesifikke markører er enten bare litt eller ikke uttrykt i det hele tatt. Dette setter spørsmålstegn ved bruken av ciPodocytter og deres anvendelighet for fysiologisk, patofysiologisk og klinisk rekkevidde. Her beskriver vi en protokoll for generering av humane podocytter - inkludert pasientspesifikke podocytter - fra en hudstansebiopsi ved episomal omprogrammering av dermale fibroblaster til hissc og påfølgende differensiering i podocytter. Disse podocyttene ligner in vivo podocytter mye bedre når det gjelder morfologiske egenskaper, som utviklingen av fotprosesser og uttrykket av den podocytspesifikke markøren. Til slutt, men viktigere, opprettholder disse cellene pasientens mutasjoner, noe som resulterer i en forbedret ex vivo-modell for å studere podocyttsykdommer og potensielle terapeutiske stoffer i en individualisert tilnærming.

Introduction

Podocytter er spesialiserte, postmitotiske nyreepitelceller som danner den glomerulære filtreringsbarrieren til nyrene sammen med den glomerulære kjellermembranen (GBM), glomerulære endotelceller og glykokalyx. Fenotypisk består podocytter av en cellekropp og primære, mikrotubulidrevne membranforlengelser, samt sekundære forlengelser kalt fotprosesser 1,2. Den glomerulære filtreringsbarrieren som filtrerer urin fra blodet er bygget av fenestrert endotel, GBM, og en spesialisert type intercellulært kryss som forbinder nærliggende podocytfotprosesser, kalt spaltemembranen til podoctyes3. Under sunne forhold beholdes proteiner større enn albumin fra filtreringsbarrieren på grunn av deres størrelse og ladning4.

Mutasjoner i cytoskjelett- eller podocyttspesifikke gener, samt sirkulerende faktorer som påvirker podocyttsignalveier, er kjent for å indusere podocytt effacement, løsrivelse eller apoptose, noe som resulterer i proteinuri og glomerulær sklerose. Spesielt er cytoskjelettrearrangering, endringer i podocytpolaritet eller skade på fotprosesser med tilhørende tap av spaltekryss avgjørende5. På grunn av deres terminalt differensierte status kan podocytter nesten ikke erstattes etter løsrivelse av GBM. Men hvis podocytter er festet til GBM, kan de fortsatt komme seg fra effacement og reformere interdigitating fotprosesser 6,7,8. Videre forståelse av hendelsene som fører til podocyttskade i ulike glomerulære lidelser kan gi nye terapeutiske mål som vil hjelpe til med å utvikle behandlinger for disse sykdommene. Podocyttskade er et kjennetegn på forskjellige glomerulære sykdommer, inkludert fokal segmental glomerulosklerose (FSGS), diabetisk nefropati, minimal endringssykdom og membranøs glomerulonefropati, som krever pålitelige podocyt ex vivo-modeller for å studere patologiske mekanismer og potensielle behandlingsmetoder for disse sykdommene 9,10. Podocytter kan studeres ex vivo ved klassisk primærcellekultur basert på isolering av glomeruli ved differensialsikting11. På grunn av den terminalt differensierte tilstanden med begrenset spredningskapasitet, bruker de fleste forskere imidlertid mus eller humane ciPodocyttcellelinjer som uttrykker temperaturfølsomme varianter av SV40 stort T-antigen. Alternativt isoleres ciPodocytter fra transgene mus som har SV40 Tag immortaliserende gen 1,12.

CiPodocytter prolifererer ved 33 °C, men går inn i vekststans og begynner å differensiere ved 37 °C13,14. Det må huskes at eksperimentelle data oppnådd med disse cellene skal tolkes med en viss forsiktighet, da cellene genereres ved hjelp av en unaturlig geninnsetting15. Siden disse cellene har et udødeliggjørende gen, endres den cellulære fysiologien på grunn av pågående spredning12. Podocyttcellelinjer generert av denne tilnærmingen har nylig blitt stilt spørsmålstegn ved, da mus-, menneske- og rottekocytter uttrykker mindre enn 5% synaptopodin og nefrin på proteinnivå, samt NPHS1 og NPHS2 på mRNA-nivå sammenlignet med glomerulært uttrykk16. Dessuten uttrykker de fleste podocyttcellelinjer ikke nefrin17,18. Chittiprol et al. beskrev også en signifikant forskjell i cellemotilitet og respons på puromycin og doksorubicin i ciPodocytter16. Podocytter kan bli funnet i urinen etter løsrivelse fra GBM i forskjellige glomerulære sykdommer 19,20,21,22. Levedyktige urinpodocytter kan dyrkes ex vivo i opptil 2-3 uker, men de fleste celler gjennomgår apoptose23,24. Interessant nok finnes podocytter ikke bare i urinen hos pasienter med glomerulær sykdom, men også i urinen til friske personer, mest sannsynlig når de er senescent-again med et begrenset potensial for replikasjon i kultur24. Videre er det urinavledede podocyttallet begrenset, og cellene dedifferensierer i kultur, viser mindre fotprosesser, endrer morfologi, og viktigst av alt har begrenset spredningskapasitet. Ekspresjonen av podocyttspesifikke gener er fraværende, forsvinner i løpet av få uker, eller varierer mellom disse celleklonene. Noen celler som er positive for den podocyttspesifikke markøren, uttrykte samtidig markøren for tubulære epitelceller eller myofibroblaster og mesangialceller, noe som antyder dedifferensiering og/eller transdifferensiering av de dyrkede urinpodocyttene24,25.

Nylig er generering av ciPodocyttcellelinjer avledet fra urinen til pasienter og friske frivillige ved transduksjon med et termofølsomt SV40 stort T-antigen og hTERT beskrevet26. mRNA-ekspresjon for synaptopodin, nestin og CD2-assosiert protein ble påvist, men podocin mRNA var fraværende i alle kloner. I tillegg til problemene med urinpodocytter, inneholder disse cellene også det innsatte immortaliserende genet, noe som resulterer i ulempene diskutert ovenfor.

I motsetning til dette har humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs) en enorm kapasitet til selvfornyelse og differensiering til flere celletyper under passende forhold. Det har tidligere blitt vist at hissc kan tjene som en nesten ubegrenset kilde til podocytter27,28.

Her beskrives en totrinnsprotokoll for å generere pasientspesifikke podocytter fra dermale fibroblaster av hudstansebiopsier med påfølgende episomal omprogrammering til hissc og endelig differensiering til hisc-deriverte podocytter (figur 1).

Figure 1
Figur 1: Protokoll for å generere pasientspesifikke hiPSC-deriverte podocytter. Grafisk oversikt over protokollen for å generere pasientspesifikke podocytter fra dermale fibroblaster av en hudbiopsi ved omprogrammering til hisscc og differensiering til podocytter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Som et første skritt ble somatiske dermale fibroblaster vokst ut fra en hudstansebiopsi og omprogrammert til hiPSCs ved hjelp av en integrasjonsfri metode ved elektroporering med plasmider som uttrykker transkripsjonsfaktorene OCT3/4, KLF4, SOX2 og c-MYC 29,30,31. Oppståtte hiPSC-kolonier ble senere valgt og utvidet. Differensiering begynte med induksjon av mesodermal avstamning ved aktivering av WNT-signalveien, etterfulgt av generering av nephron-stamceller som fortsatt var i stand til å spre seg. Til slutt ble cellene differensiert til podocytter. I denne prosedyren modifiserte og kombinerte vi tidligere publiserte protokoller for episomal omprogrammering for generering av hiPSCs av Bang et al.32 og Okita et al.33, samt en protokoll for differensiering av hissc i podocytter av Musah et al.28,34,35.

Faktisk hadde podocytter generert av vår protokoll en fenotype nærmere podocytter in vivo, angående utviklingen av et distinkt nettverk av primære og sekundære fotprosesser og ekspresjonen av podocyttspesifikke markører, som synaptopodin, podocin og nephrin. Ved bruk av hiPSC-avledede podocytter opprettholdes pasientens genetiske bakgrunn under omprogrammering og differensiering. Dette muliggjør pasientspesifikk podocyttsykdomsmodellering og oppdagelse av potensielle terapeutiske stoffer ex vivo i et nesten ubegrenset celleantall. Videre er denne protokollen minimalt invasiv, kostnadseffektiv, etisk akseptabel og kan legge til rette for nye veier for narkotikautvikling.

Protocol

Protokollen ble godkjent av etikkomiteen ved Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg (251_18B), og alle pasienter og probander ga skriftlig samtykke. Alle eksperimenter ble utført i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter. For sammensetning av alle medier og løsninger som brukes her, se tabell 1.

1. Utvekst av dermale fibroblaster fra en hudstansebiopsi

  1. Overfør hudstansebiopsien til et sterilt 15 ml konisk rør med 10 ml forvarmet fibroblastmedium.
  2. Fjern mediet og vask hudstansebiopsien tre ganger med 5 ml steril, forvarmet 1x fosfatbufret saltvann (PBS). Overfør hudstansebiopsien med steril tang til en 10 cm cellekulturplate og kutt den i bredden i tre eller fire stykker med en steril skalpell, og etterlater epidermis og dermis.
  3. Overfør hver bit til en steril 35 mm plastcellekulturskål og press den forsiktig mot kulturfatet. Fjern overflødig medium rundt biopsibitene. La tørke i 5-10 min til væsken fordamper og biopsien er festet til cellekulturplasten.
  4. Tilsett 1 ml fibroblastmedium dråpevis med en 1000 μl pipette rundt biopsien og fyll forsiktig opp til et endelig volum på 3 ml. Dyrk ved 37 °C, 5% CO2 i 7 dager uten å mate og flytte parabolen. Bytt forsiktig mediet til friskt, forvarmet fibroblastmedium. Etter 7 dager kan utvokste spindellignende fibroblaster overvåkes rundt hudbiopsien ved hjelp av et fasekontrastmikroskop36.
    MERK: Når utvokste fibroblaster når kanten av parabolen, fortsett igjen fra trinn 1.3 for å generere en annen gruppe fibroblaster.
  5. For utvidelse av de utvokste fibroblastene, vask med 2 ml forvarmet 1x PBS, dissocier fibroblastene med 1 ml 1x trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og inkuber i 5 minutter ved 37 ° C, 5% CO2. Overfør de frittliggende cellene til et 15 ml konisk rør og vask cellekulturskålen med 2 ml friskt, forvarmet fibroblastmedium.
  6. Basseng vaskemediet i røret for å nøytralisere dissosiasjonsmidlet og sentrifuger ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten med 1 ml friskt, forvarmet fibroblastmedium. Telle cellene med et Neubauer-kammer eller automatisert celleteller ved hjelp av trypanblå og frø 2,5 x 10 3 til 5 x 103 fibroblaster per cm2 i ferske cellekulturflasker.
  7. Plasser kolbene tilbake i inkubatoren og fordel cellene jevnt ved å flytte kolbene tre ganger i hver retning. Neste dag, erstatt mediet med friskt, forvarmet fibroblastmedium. Bytt medium to ganger i uken og del når fibroblastene når rundt 80% sammenløp.

2. Frysing dermal fibroblaster

  1. For å fryse fibroblastene, vask dem med 5 ml forvarmet 1x PBS. Aspirer PBS og dissocier fibroblastene med 4 ml 1x trypsin-EDTA. Legg kolben tilbake i inkubatoren og rug i 5-7 minutter ved 37 °C ved 5% CO2. Overvåk løsningen ved hjelp av et fasekontrastmikroskop og trykk mot siden av kolben for å løsne cellene.
  2. Overfør de frittliggende cellene til et 15 ml konisk rør. Vask cellekulturkolben med 5 ml friskt, forvarmet fibroblastmedium. Basseng vaskemediet i konisk rør og sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C.
  3. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten med 2 ml friskt, forvarmet fibroblastmedium. Tell cellene og overfør 1 x 106 celler til et nytt konisk rør. Sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C.
  4. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten med 1 ml kaldt fibroblastfrysemedium bestående av 90% føtalkalveserum og 10% dimetylsulfoksid (DMSO). Overfør til en cryovial, legg i en frysebeholder, og frys over natten ved -80 °C. For langtidsoppbevaring, plasser kryovialet i en flytende nitrogentank neste dag.

3. Episomal omprogrammering av fibroblaster for å generere hiPSCs

  1. For episomal omprogrammering, bruk 1,5 x 106 fibroblaster fra passasje 4 til 8. For å nå dette celletallet, bruk to til tre 250 ml kolber med rundt 70% sammenløp.
  2. Dagen før omprogrammering, splitt fibroblastene i forholdet 1: 2 for å sikre deres proliferative tilstand. Aspirer derfor mediet og vask kolbene med 5 ml forvarmet 1x PBS per kolbe. Aspirer PBS og dissocier fibroblastene med 4 ml 1x trypsin-EDTA. Legg kolbene tilbake i inkubatoren og rug i 5-7 minutter ved 37 °C og 5% CO2. Overvåk løsningen ved hjelp av et fasekontrastmikroskop og trykk mot siden av kolben for å løsne cellene fra plastoverflaten.
  3. Overfør de frittliggende cellene til et 50 ml konisk rør og vask cellekulturflaskene med 5 ml friskt, forvarmet fibroblastmedium. Basseng vaskemediet i konisk rør og sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 6 ml friskt, forvarmet fibroblastmedium.
  4. Forbered seks nye cellekulturflasker ved å legge til 5 ml friskt, forvarmet fibroblastmedium per kolbe. Tilsett 1 ml fibroblastcellesuspensjon til hver kolbe. Plasser kolbene tilbake i inkubatoren og fordel cellene jevnt ved å flytte kolbene tre ganger i hver retning.
  5. For episomal omprogrammering, belegg to 10 cm cellekulturplater egnet for hiPSC-kultur med 4 ml kaldbeleggsoppløsning per plate. Inkuber platene i 1 time ved 37 °C.
    MERK: For å dyrke hiPSCer kreves forskjellig cellekulturplast og ytterligere ekstracellulært matriksbelegg (se materialtabell).
  6. Fjern mediet fra fibroblastene og vask med 10 ml forvarmet 1x PBS per kolbe. Aspirer PBS og dissosiere fibroblastene med 4 ml 1x trypsin-EDTA per kolbe ved å inkubere i 5-7 minutter ved 37 °C. Overvåk løsningen ved hjelp av et fasekontrastmikroskop, og trykk om nødvendig mot siden av kolben for å løsne cellene fra plastoverflaten.
  7. Overfør de frittliggende cellene til et 50 ml konisk rør. Vask de tomme kolbene med 6 ml forvarmet fibroblastmedium for å samle de resterende cellene og bassenget i det koniske røret. Sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 3 ml fersk, forvarmet 1x PBS.
  8. Telle cellene og overføre 1,5 x 106 fibroblaster i et nytt konisk rør. Sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 5 ml elektroporeringsmedium og sentrifuge igjen. I mellomtiden aspirerer du beleggløsningen fra de belagte 10 cm cellekulturplatene og tilsett 7 ml forvarmet fibroblastmedium.
  9. Etter sentrifugering kastes supernatanten og resuspenderer cellepelleten i elektroporeringsmedium med en konsentrasjon på 1,5 x 106 celler i 250 μL. Overfør cellesuspensjonen på 250 μL til en elektroporeringskyvette med 4 mm avstandsavstand (se materialfortegnelse).
  10. Forbered en plasmidtransfeksjonsblanding ved å tilsette 4 μg av hvert plasmid (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) til et totalt volum på 50 μL elektroporasjonsmedium. Overfør til kyvetten og bland ved å bla forsiktig. Elektroporat med en puls ved 280 V.
  11. Klipp en pipettespiss med steril saks og overfør 125 μL av de elektroporerte fibroblastene til hver av de tilberedte 10 cm cellekulturplatene. Fordel cellene ved å røre platene tre ganger i alle retninger og legg dem tilbake i inkubatoren. Inkuber over natten ved 37 °C med 5 % CO2 uten forstyrrelser.
  12. For å fjerne døde celler, erstatt mediet neste dag med 7 ml friskt, forvarmet fibroblastmedium. Bytt medium til hissc-dyrkningsmedium 2 dager etter elektroporering og bytt det annenhver dag de neste 20 dagene.

4. Valg, utvidelse og kvalitetskontroll av genererte hiPSCer

  1. Overvåk cellene daglig i minst 20 dager ved hjelp av et fasekontrastmikroskop med et 10x eller 20x mål for å observere dannelsen av hiPSC-kolonier etter elektroporering. Hvis hiPSC-koloniene er rundt 300 μm diameter i størrelse med tydelige grenser og hiPSCene viser et høyt kjerne-til-kropp-forhold, er hiPSC-koloniene klare for valg ved plukking (figur 2B, C og figur 3).
  2. Før plukking, belegg en 96-brønns plate egnet for hiPSC-kultur med 100 μL beleggløsning per brønn og inkuber i 1 time ved 37 °C. Under inkubasjon, merk kolonier av interesse på bunnen av cellekulturskålen med en penn. For endelig forberedelse av 96-brønnsplaten, fjern beleggoppløsningen og tilsett 100 μL forvarmet hiPSC-kulturmedium inneholdende 10 μM ROCK-hemmer Y27632 til hver brønn.
  3. Vask cellene med forvarmet 1x PBS og tilsett friskt, forvarmet hisc-dyrkningsmedium inneholdende 10 μM ROCK-hemmer Y27632 før du plukker for å fjerne døde celler. For å plukke hiPSC-kolonier, bruk en målernål og del hiPSC-koloniene i små biter ved å tegne et rutenett i hver koloni.
  4. Bruk et fasekontrastmikroskop, kontroller at koloniene er vellykket delt inn i stykker. Overfør dem med en 100 μL pipette til den tilberedte 96-brønnplaten. Hold pipetten loddrett over kolonien uten å berøre cellene for å unngå riper og tap av kolonien.
  5. Plasser 96-brønnsplaten i inkubatoren ved 37 °C med 5% CO2 og la cellene feste seg over natten uten forstyrrelser. Hold oppvasken med fibroblast- og hiPSC-blandingen, i tilfelle plukkingen ikke lykkes. Fjern derfor ROCK-hemmer Y27632 ved å endre medium til hiPSC kulturmedium og plasser platene tilbake i inkubatoren.
  6. Neste dag, bytt medium på 96-brønnsplaten til 200 μL ferskt hiPSC-kulturmedium og bytt det annenhver dag. Overvåk 96-brønnplaten neste dag og merk brønnene med vellykkede plukkede kloner.
    MERK: Hvis de plukkede hiPSC-klonene ikke er fullt utvalgt etter første forsøk, og fibroblastene kan finnes i brønnen, gjenta plukkingen fra 96-brønnen eller skrap fibroblastene av platen.

5. Utvidelse av utvalgte hiPSC-kloner

  1. Overvåk hiPSC-klonene ved hjelp av et fasekontrastmikroskop. Hvis de utvalgte hiPSCene når rundt 70% sammenløp, er hiPSC-klonene klare for ekspansjon.
  2. Belegg en 48-brønns plate egnet for hiPSC-kultur med 250 μL beleggløsning per brønn i 1 time ved 37 °C. Erstatt beleggløsningen med 200 μL friskt, forvarmet hisc-dyrkningsmedium inneholdende 10 μM ROCK-hemmer Y27632.
  3. For å løsne hiPSCene fra 96-brønnsplaten, skrap plastoverflaten med en 1000 μL pipettespiss. Overfør de frittliggende hiPSC-ene fra 96-brønnsplaten til en 48-brønnsplate. Bytt medium neste dag til friskt, forvarmet hisc-dyrkningsmedium for å fjerne døde celler og ROCK-hemmeren Y27632.
  4. Hvis hiPSC-klonene når rundt 70% sammenløp, overfør hiPSCene til en 24-brønnsplate. Belegg derfor en 24-brønns plate egnet for hiPSC-kultur med 400 μL beleggløsning per brønn i 1 time ved 37 °C. Erstatt beleggløsningen med 400 mikrol ferskt, forvarmet hisc-dyrkningsmedium inneholdende 10 μM ROCK-hemmer Y27632. Aspirer mediet fra de 48 brønnene og vask med 500 μL forvarmet 1x PBS.
  5. Erstatt PBS med 100 μL enzymatisk celledetachmentoppløsning inneholdende 10 μM ROCK-hemmer Y27632 og inkuber ved 37 °C i 4 minutter. Skyll hisscene av platen med en 1000 μL pipette. Overfør de dissosierte cellene til et 15 ml konisk rør. Vask den tomme 48-brønnsplaten med hiPSC dyrkningsmedium inneholdende 10 μM ROCK inhibitor Y27632 og basseng i konisk rør.
  6. Sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Aspirer supernatanten og resuspender hiPSCene i 1 ml hiPSC kulturmedium inneholdende 10 μM ROCK-hemmer Y27632 og overfør til en 24-brønnsplate. Plasser platen i inkubatoren ved 37 °C ved 5% CO2 og fordel cellene ved å bearbeide platen tre ganger i alle retninger. La cellene feste seg over natten uten forstyrrelser.
  7. Neste dag, bytt medium til hiPSC kultur medium uten ROCK inhibitor Y27632.
    MERK: Hvis hissc-kloner når rundt 70 % sammenløp, overfør hiPSCene til en 12-brønnsplate ved å gjenta trinn 5.4 til 5.7 med økte volumer egnet for et 12-brønnsformat. Hvis hiPSCene fra 12-brønnsplaten når rundt 70% sammenløp, overfør hiPSC-klonene til en 6-brønnsplate med økte volumer for et 6-brønnsformat.

6. Frysing av utvalgte hiPSC-kloner

  1. For å fryse utvalgte hissc-kloner, aspirer mediet fra en 6-brønnsplate. Vask brønnene med 2 ml 1x PBS. Aspirer og dissosiere hiPSCene med 1 ml enzymatisk celledetachmentoppløsning inneholdende 10 μM Y27632. Legg platen tilbake i inkubatoren og inkuber i 4 minutter ved 37 °C og 5% CO2.
  2. Skyll hisscene av platen med en 1000 μL pipette og overfør de frittliggende cellene til et 15 ml konisk rør. Vask platen med 2 ml ferskt, forvarmet hisc-dyrkningsmedium som inneholder 10 μM ROCK-hemmer Y27632. Basseng i konisk rør og sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten med 2 ml ferskt, forvarmet hisc-dyrkningsmedium inneholdende 10 μM ROCK-hemmer Y27632.
  3. Tell cellene og overfør 1 x 106 celler til et nytt konisk rør. Sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Aspirer supernatanten, resuspender cellepelleten i 1 ml kaldt, serumfritt hiPSC-frysemedium, og frys ned i en kryovial ved hjelp av en frysebeholder over natten ved -80 °C. For langtidsoppbevaring, plasser kryovialet i en flytende nitrogentank neste dag.

7. HiPSC kvalitetskontroll

  1. Karakterisering av hiPSC-morfologi
    1. Sjekk den karakteristiske hiPSC-morfologien ved hjelp av et fasekontrastmikroskop med et 20x objektiv. Etter omprogrammering endres cellemorfologien fra lange, spindellignende fibroblaster til små, runde hiPSCer, og presenterer et høyt kjerne-til-kropp-forhold som vokser i kolonier med distinkte grenser (figur 2C).
    2. Hvis hiPSC-koloniene blir for tette og spontan differensiering oppstår, skraper du de differensierte delene av platen med en pipettespiss (figur 3). Siden hissc har en høy spredningsrate, fôr hiPSC-kulturene hver dag med ferskt, forvarmet hiPSC-fôringsmedium.
  2. Karakterisering av pluripotensmarkører ved immunfluorescensfarging
    1. For å kontrollere de genererte hiPSCene for pluripotensmarkør via immunfluorescensfarging, plasser plastdeksler i en 24-brønns plate og belegg med 250 μL beleggløsning i 1 time ved 37 °C og 5% CO2. Erstatt beleggløsningen med 1 ml forvarmet hisc-dyrkningsmedium inneholdende 10 μM ROCK-hemmer Y27632.
    2. Frø 1,9 x 104 dissosierte hiPSCer per 24-brønn. La hisscene feste seg over natten ved 37 °C og 5 % CO2 uten forstyrrelser. Se trinn 5.4 til 5.6 for dissosiasjon av hiPSCene. Erstatt mediet neste dag med hiPSC dyrkningsmedium uten ROCK inhibitor Y27632.
    3. For farging, vask cellene med 1 ml forvarmet 1x PBS og fest deretter hiPSCene med 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur. Vask de faste hiPSCene med 1x PBS og blokker uspesifikke bindingssteder med 200 mikrol preinkubasjonsløsning per brønn i 1 time ved romtemperatur. Fortynne primære antistoffer Ki67 (1:300), OCT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) i antistoff fortynningsmiddel.
    4. Rengjør en plastfolie med 70% etanol og legg den i et fargekammer fylt med en vannbeholder. Plasser dråper med 30 μL primære antistofffortynninger på folien. Legg de faste prøvene opp ned i fortynningen og rug over natten ved 4 °C.
    5. Neste dag, vask prøvene tre ganger med 1x PBS i 5 minutter og legg 30 μL dråper sekundære antistofffortynninger (1: 1,000) på rene flekker på folien. Plasser dekselet glir opp ned i fortynningen. Inkuber i 1 time ved romtemperatur i mørket.
    6. Etter inkubering, vask tre ganger med 1x PBS i 5 minutter. Monter prøvene på glassglass i monteringsmediet som inneholder DAPI. La det tørke over natten ved romtemperatur og i mørket, og avbilde prøvene med et konfokalmikroskop (figur 4).
  3. Utelukkelse av bakterier og mykoplasmaforurensning
    1. For å utelukke bakteriekontaminering, overfør 500 μL dissosierte hiPSCs til 5 ml forvarmet Luria-Bertani (LB) medium. Se trinn 5.4 til 5.6 for dissosiasjon av hiPSCene. Inkuber over natten ved 37 °C. Hvis LB-mediet virker uklart, har bakterieforurensning sannsynligvis oppstått. Kast cellene.
    2. For å utelukke mykoplasmakontaminasjon, samles medium som ikke har blitt erstattet på 2 dager fra 6 brønner med rundt 90% sammenflytende hiPSCs. Bruk kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) for å oppdage mykoplasmakontaminering. Mange kommersielle mykoplasmadeteksjonssett er tilgjengelige for dette formålet.

8. Differensiering av hiPSCs i podocytter

  1. Forberedelse og lagring av vekstfaktorer
    1. For å forberede en stamkonsentrasjon på 10 mM Y27632, rekonstitueres 10 mg Y27632 (molekylvekt på 320,26 g/mol) i 3,12 ml sterilt vann. Oppbevar 100 μL alikoter ved -20 °C og fortynn 1:1000 i cellekulturmedium for å nå en endelig konsentrasjon på 10 μM.
    2. For å forberede en stamkonsentrasjon på 30 mM CHIR99021, rekonstituer 5 mg CHIR99021 (molekylvekt på 465,34 g/mol) i 358,2 mikrol steril DMSO. Oppbevar 50 μL alikoter ved -20 °C og fortynn 1:10 000 i cellekulturmedium for å nå en endelig konsentrasjon på 3 μM.
    3. For å forberede en stamkonsentrasjon på 100 μg/ml activin A, rekonstituer 100 mikrogram activin A i 1 ml 1x PBS inneholdende 0,1 % bovint serumalbumin (BSA). Oppbevar 100 μL alikoter ved -20 °C og fortynn 1:2 000 i cellekulturmedium for å nå en endelig konsentrasjon på 50 ng/ml.
    4. For å forberede en lagerkonsentrasjon på 100 μg/ml benmorfogenprotein 7 (BMP7), rekonstituer 100 mikrogram BMP7 i 1 ml sterilt vann inneholdende 0,1 % BSA. Oppbevar 100 μL alikoter ved -20 °C og fortynn 1:2 000 i cellekulturmedium for å nå en endelig konsentrasjon på 50 ng/ml.
    5. For å forberede en stamkonsentrasjon på 100 μg/ml vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), rekonstituer 100 mikrogram VEGF i 1 ml sterilt vann. Oppbevar 100 μL alikoter ved -20 °C og fortynn 1:4 000 i cellekulturmedium for å nå en endelig konsentrasjon på 25 ng/ml.
    6. For å forberede en 10 mM stamkonsentrasjon av all-trans retinsyre, rekonstituer 10 mg all-trans retinsyre i 3,33 ml steril DMSO. Oppbevar 100 μL alikoter ved -20 °C og fortynn 1:100 i cellekulturmedium for å nå en endelig konsentrasjon på 0,5 μM.
  2. Aktivering av WNT-signalvei for å indusere mesodermavstamning
    1. For differensiering av hissc til hiPSC-avledede podocytter, pelscellekulturplater eller kolber egnet for hiPSC-kultur med beleggløsning i 1 time ved 37 °C og 5 % CO2. Det totale volumet av beleggoppløsning er 1 ml per 6-brønns kulturplate eller 4 ml per 10 cm cellekulturplate.
    2. Aspirer mediet og vask hiPSCene med forvarmet 1x PBS. Aspirer PBS og tilsett enzymatisk celledetachmentoppløsning inneholdende 10 μM Y27632 i et totalt volum på 1 ml per 6-brønns kulturplate eller 4 ml per 10 cm cellekulturplate.
    3. Legg platen tilbake i inkubatoren og inkuber i 4 minutter ved 37 °C og 5% CO2. Skyll hisscene av platen med en 1000 μL pipette. Overfør de frittliggende cellene til et konisk rør.
    4. Vask platen med et nytt, forvarmet hisc-dyrkningsmedium som inneholder 10 μM ROCK-hemmer Y27632. Basseng vaskemediet i det koniske røret for å nøytralisere dissosiasjonsreagenset. Sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten med 2 ml ferskt, forvarmet hisc-dyrkningsmedium inneholdende 10 μM ROCK-hemmer Y27632.
    5. Tell cellene og frøet 1 x 104 hiPSCs/cm2. Fordel cellene ved å røre tre ganger i alle retninger. La hisscene feste seg over natten ved 37 °C med 5 % CO2 uten forstyrrelser.
    6. Neste dag, erstatt mediet med 2 ml forvarmet mesodermdifferensieringsmedium inneholdende 1x B27-supplement, 1% penicillin-streptomycin, 3 μM CHIR99021, 50 ng / ml aktivin A og 10 μM ROCK-hemmer Y27632.
  3. Differensiering i nephron stamceller
    1. Etter 2 dager, bytt mesodermmediet til 2 ml forvarmet nephronprogenitordifferensieringsmedium inneholdende 1x B27-supplement, 1% penicillin-streptomycin, 3 μM CHIR99021, 50 ng / ml activin A og 50 ng / ml BMP7 per 6-brønns kulturplate eller 6 ml per 10 cm cellekulturplate. Bytt medium annenhver dag de neste 14 dagene.
      MERK: Nephron stamceller prolifererer og kan passeres og fryses etter 7 dager med differensiering i nephronprogenitorekspansjonsmedium.
    2. For å splitte nephron-stamcellene, belegg cellekulturplasten egnet for hiPSC-kultur med beleggløsning i 1 time ved 37 °C. Bytt ut beleggløsningen med nephronprogenitorekspansjonsmedium. Aspirer mediet og vask cellene med forvarmet 1x PBS. Fjern PBS og dissosiere cellene med 1x trypsin-EDTA.
    3. Inkuber i 5 minutter ved 37 °C og 5 % CO2. Overvåk løsningen av cellene ved hjelp av et fasekontrastmikroskop. Om nødvendig, bank mot siden av plasten for å løsne cellene fra overflaten. Skyll cellene av platen og overfør til et konisk rør. Vask den tomme kolben eller platen med samme volum forvarmet nephronprogenitorekspansjonsmedium som dissosiasjonsreagenset.
    4. Basseng vaskemediet i det koniske røret. Sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten med 2 ml friskt, forvarmet nefronprogenitorekspansjonsmedium. Telle cellene og frøet 1,5 x 104 nephronprogenitorceller per cm2 for ytterligere differensiering.
      MERK: For å fryse nephron-stamcellene, resuspender 1 x 106 celler i 1 ml kaldt serumfritt kryopreserveringsmedium og overfør til et kryovial. Frys i en frysebeholder ved -80 °C over natten og overfør til en tank med flytende nitrogen for langtidslagring.
    5. Plasser platene tilbake i inkubatoren og fordel cellene jevnt ved omrøring tre ganger i alle retninger. Bytt medium neste dag til friskt, forvarmet nephronprogenitordifferensieringsmedium. Bytt ut mediet annenhver dag til cellene er differensiert i 14 dager i nephronprogenitordifferensieringsmedium.
  4. Terminal differensiering til hiPSC-avledede podocytter
    1. Aspirer mediet og tilsett 2 ml forvarmet podocytdifferensieringsmedium inneholdende 1x B27-supplement, 1% penicillin-streptomycin, 3 μM CHIR99021, 50 ng / ml aktivin A, 50 ng / ml BMP7, 25 ng / μL VEGF og 0,5 μM all-trans retinsyre per 6-brønns kulturplate eller 6 ml per 10 cm cellekulturplate. Sett platene tilbake i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2. Bytt medium annenhver dag i 4 dager med friskt, forvarmet podocyttdifferensieringsmedium.
    2. For å holde hiPSC-podocyttene i kultur etter differensiering, mate cellene to ganger i uken med podocytt vedlikeholdsmedium inneholdende 10% føtal kalveserum, 1% penicillin-streptomycin og 0,1% insulin-transferrin-selen.
      MERK: Terminale differensierte hisc-podocytter sprer seg ikke lenger. Det er imidlertid mulig å holde dem i cellekultur i opptil 4 uker.
  5. Tining og utvidelse av frosne nephron-stamceller
    1. Belegg en ny cellekulturplastkolbe egnet for hiPSC-kultur med beleggløsning i 1 time ved 37 °C og 5% CO2. Bytt ut beleggløsningen med 5 ml nephron-stamekspansjonsmedium.
    2. Klargjør et 15 ml konisk rør med 7 ml forvarmet nephronprogenitorekspansjonsmedium. Tine de frosne cellene ved 37 °C i et vannbad uten bevegelse i ca. 20 s. Ta kryovialet ut av vannbadet når halvparten av cellene er tint, og det er litt is igjen.
    3. Spray cryovial med 70% etanol og sett i et biosikkerhetsskap. Overfør tinte celler til det koniske røret med det forvarmede nephronprogenitorekspansjonsmediet. Bruk en 1000 μL pipette og la cellene løpe veldig sakte nedover rørveggen.
    4. Vask den tomme kryovialen med 1 ml nephronprogenitor-ekspansjonsmedium for å samle de resterende cellene og bassenget i det koniske røret. Sentrifuger ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C og resuspender cellepelleten i ferskt, forvarmet nephronprogenitorekspansjonsmedium.
    5. Overfør de tinte cellene til den belagte kolben og bytt medium neste dag til friskt, forvarmet nephronprogenitorekspansjonsmedium. Før videre differensiering, la cellene proliferere i nephronprogenitorekspansjonsmedium ved å endre mediet annenhver dag, og fortsett fra trinn 8.3.5.

9. Karakterisering av hiPSC-avledede podocytter ved immunfluorescensfarging

  1. For å kontrollere de differensierte podocyttene for den podocyttspesifikke markøren via immunfluorescensfarging, plasser plastdeksler i en 24-brønns plate og belegg med 250 μL beleggoppløsning i 1 time ved 37 ° C og 5% CO2. Erstatt beleggoppløsningen med 1 ml forvarmet nephronprogenitorekspansjonsmedium. Frø 2,5 x 104 dissosierte nephron-stamceller per 24-brønnsplate. Se trinn 8.3.2 til 8.3.4 for dissosiasjon av nefron stamceller.
  2. La cellene feste seg over natten ved 37 °C og 5 % CO2 uten forstyrrelser. Bytt ut mediet neste dag med forvarmet nephronprogenitordifferensieringsmedium.
  3. Avslutt differensiering ved å bytte medium annenhver dag til cellene er differensiert i totalt 14 dager i nephronprogenitordifferensieringsmedium og ytterligere 5 dager i podocytdifferensieringsmedium.
  4. Etter den endelige differensieringen, vask cellene med 1 ml forvarmet 1x PBS. Fest hiPSC-podocyttene med 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur. Vask de faste cellene med 1x PBS og blokker uspesifikke bindingssteder med 200 μL preinkubasjonsløsning per brønn i 1 time ved romtemperatur.
  5. Fortynn de primære antistoffene synaptopodin (1:200), podocin (1:100) og nefrin (1:25) i antistofffortynningsmiddel og plasser dråper med 30 μL primærantistofffortynning på en ren plastfolie i et fargekammer som inneholder en vannbeholder.
  6. Plasser dekksklier med faste hisc-podocytter opp ned i fortynningen. Inkuber over natten ved 4 °C. Neste dag, vask tre ganger med 1x PBS i 5 min. Fortynn de sekundære antistoffene (1:1000) i 1x PBS og plasser dråper med 30 μL sekundær antistofffortynning på rene flekker på folien. Plasser dekselet glir opp ned i fortynningen.
  7. Inkuber i 1 time ved romtemperatur i mørket. Etter inkubering, vask tre ganger med 1x PBS i 5 minutter. Monter prøvene på glassglass i monteringsmedium som inneholder DAPI. La tørke over natten ved romtemperatur og i mørket. Bilde prøvene ved hjelp av et konfokalmikroskop.

Representative Results

Med denne trinnvise protokollen som kombinerer episomal omprogrammering og differensiering, er det mulig å generere podocytter som bærer pasientens mutasjon i et podocyttrelevant gen. Dette muliggjør analyse av sykdomsspesifikke podocyttendringer ex vivo. Pasientens genetiske bakgrunn bevares under protokollen under alle de forskjellige cellestadiene. I tillegg kan begrensningen av utilstrekkelig cellenummer av terminalt differensierte ikke-prolifererende podocytter overvinnes ved å bruke hiPSC-avledede podocytter. Selv om det tar flere måneder før hissc-podocytter genereres fra utvokste dermale fibroblaster via omprogrammering til hisscc og påfølgende differensiering til podocytter, er det mulig å fryse celler i tre forskjellige trinn i protokollen (figur 2). Frysing er mulig for fibroblaster, hiPSCs og nephronprogenitorceller etter differensiering i nephronprogenitordifferensieringsmedium i 7 dager. Derfor er generering av arbeidscellebanker og store eksperimenter mulig.

Figure 2
Figur 2: Individuelle trinn i protokollen gjennom et fasekontrastmikroskop. (A) Utvokste dermale fibroblaster. (B) hiPSC-kolonidannelse etter omprogrammering. (C) Utvalgt hiPSC-kultur. (D) Mesodermceller etter 2 dagers differensiering. (E) Nephron stamceller etter 14 dager med differensiering i nefron stamfar differensiering medium. (F) Terminale differensierte hiPSC-avledede podocytter. Skalastenger representerer 300 μm (A,B,D-F) og 150 μm (C). Snøfnugg fremhever mulige frysetrinn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ettersom de genererte hisc-avledede podocyttene krysser en lang protokoll med drastiske endringer angående celletype og morfologi, er cellekarakterisering obligatorisk. Cellemorfologi, som størrelse og celleform, samt vekstadferd, kan overvåkes ved hjelp av et fasekontrastmikroskop. Fibroblaster presenterer en lang spindellignende fenotype med en størrelse på 150 μm til 300 μm (figur 2A). Etter omprogrammering oppstår kolonier med 50 μm små hiPSCer. Disse koloniene viser distinkte grenser og hiPSCer som skiller seg ut med et høyt kjerne-til-kropp-forhold og økt spredningshastighet (figur 2C). Siden podocytter er terminalt differensierte celler, reduseres proliferasjonshastigheten med progressiv differensiering, og cellemorfologien endres til 300 μm store stjerneformede podocytter med fremtredende fotprosesser (figur 2F).

Konfluens er et kritisk punkt i hiPSC-kulturen, og spontan differensiering kan oppstå når koloniene blir for tette (figur 3). Disse koloniene må fjernes før de passerer ved å skrape de berørte delene av kulturretten.

Figure 3
Figur 3: Eksempler på hiPSCer av ulik kvalitet. Fasekontrastbilder av vellykkede (A) omprogrammerte hiPSC-kolonier og (B) utvalgte hiPSC-er, samt (C) spontan differensiering, (D,E) ikke-hiPSC-kolonier og (F) en altfor tett hiPSC-kultur. Skalastenger representerer 300 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

De forskjellige celletypene i denne protokollen må valideres med hensyn til uttrykket av en bestemt markør. Etter omprogrammering gjenvinner hiPSCer pluripotenskapasitet og uttrykker spredning og pluripotensmarkører som SSEA4, OCT3/4 og Ki67 (figur 4)38,39,40. Det er kjent at omprogrammering, så vel som den lange kulturen av hissc og differensiering, kan føre til en unormal karyotype, eller rettere indusere mutasjoner41. Derfor bør den genetiske bakgrunnen til de dyrkede cellene overvåkes over tid og i forskjellige passasjer ved g-bånd og hele eksomsekvensering.

Figure 4
Figur 4: Karakterisering av genererte hiPSCer ved immunfluorescensfarging. Karakterisering av genererte hiPSCer ved farging for (A) den proliferative markøren Ki67, samt pluripotensmarkørene (B) OCT3/4 og (C) SSEA4. Skalastenger representerer 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Morfologisk virker hiscc-avledede podocytter stjerneformede og uttrykker et distinkt nettverk av lange primære og sekundære fotprosesser sammenlignet med ciPodocytter (figur 5). HiPSC-avledede podocytter uttrykker podocyttspesifikke markørproteiner som synaptopodin, nefrin og podocin (figur 6A-C)42.

Figure 5
Figur 5: Morfologi av hiPSC-deriverte podocytter sammenlignet med ciPodocytter. Sammenligning av (A,B) hiPSC-deriverte podocytter fra en frisk donor med (C,D) ciPodocytter angående cellemorfologi og filopodi ved bruk av et fasekontrastmikroskop (A,C) og skanningselektronmikroskop (B,D). Skalastenger representerer 150 μm (A,C) og 20 μm (B,D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Derfor tillater sammenligningen av hiPSC-avledede podocytter, ikke bare fra friske givere, men også fra pasienter med mutasjoner i podocyttspesifikke gener, individualisert karakterisering av pasientens mutasjon ex vivo.

Figure 6
Figur 6 Karakterisering av en podocyttspesifikk markør i hiPSC-deriverte podocytter og ciPodocytter. Sammenligning av (A-C) hiPSC-avledede podocytter fra en frisk donor med (D-F) ciPodocytter angående podocyttspesifikke markørproteiner synaptopodin (A,D), nefrin (B,E) og podocin (C,F). Skalastenger representerer 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1. Sammensetning av alle cellekulturmedier og løsninger som brukes i studien. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Denne cellekulturbaserte protokollen kombinerer episomal omprogrammering av humane dermale fibroblaster til pasientspesifikke hiPSCer og påfølgende differensiering til hiPSC-avledede podocytter. Dette gjør at vi kan studere mutasjonsrelaterte endringer av podocytter fra pasienter med genetisk glomerulær sykdom angående podocyttskade. Protokollen for å omprogrammere dermale fibroblaster med en integrasjonsfri metode ved elektroporering er tilpasset fra det publiserte arbeidet til Bang et al.32 og Okita et al.33. Protokollen for å skille podocytter fra hiPSCs er tilpasset fra den publiserte protokollen fra Musah et al.28,34,35. Det finnes allerede publikasjoner som beskriver genereringen av podocytter fra hiPSCs 27,34,35. Imidlertid er protokollen gitt her optimalisert og billigere med hensyn til differensiering av hissc i podocytter. Sammenlignet med den publiserte protokollen fra Musah et al., testet vi denne protokollen på forskjellige beleggreagenser, som vitronectin, laminin silke-511 og solubilisert kjellermembranmatrise. Konsentrasjonene av vitronectin og laminin silke-511 kunne reduseres til 2,5 μg/ml i stedet for 5 μg/ml 28,34,35. Videre var det mulig å redusere konsentrasjonene av BMP7 og activin A-to svært dyre vekstfaktorer med 50%, fra 100 ng / ml til 50 ng / ml.

Dette muliggjør rimeligere differensiering. Nephrons stamceller fra dag 7 spredte seg fortsatt, og muligheten for frysing ble vist tidligere. Vi utvidet disse cellene etter tining og før endelig differensiering i basisk medium som inneholder Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) og B27 i flere dager, noe som reduserte kostnadene ytterligere. I tillegg til differensieringstrinnene beskriver denne protokollen utveksten av fibroblaster fra hudbiopsier med påfølgende generering av pasientspesifikke hiPSCer via episomal omprogrammering. Kombinasjonen av disse to metodene muliggjør generering av pasientspesifikke podocytter. Derfor er det gitt en komplett trinnvis protokoll for å generere pasientspesifikke hiPSC-avledede podocytter her som ikke ble beskrevet før i så detalj.

Siden den overordnede protokollen inneholder flere forskjellige celletyper, er det avgjørende å karakterisere de genererte celletypene på forskjellige trinn. Celler er i kultur i lengre tid, så kvalitetskontroll bør utføres ved forskjellige passasjer. Når du arbeider med hiPSCs, er daglig fôring samt overvåking av celleatferd og morfologi nødvendig. Steriliteten til differensieringsmediet må sikres ved filtersterilisering gjennom et 0,2 μm filter. Hele protokollen, fra hudbiopsi til hiPSC-avledede podocytter, tar flere måneder, men det er mulig å fryse cellene på forskjellige stadier av prosessen. Fibroblaster, utvalgte hiPSC-kloner og proliferative nephron-stamceller etter 7 dager i nephronprogenitordifferensieringsmedium kan fryses, og en fungerende cellebank kan genereres.

Selv om hiPSC-deriverte friske podocytter utvikler et distinkt nettverk av primære og sekundære fotprosesser (figur 5A,B) og uttrykker typisk podocyttspesifikk markør (figur 6A-C), er karakteristiske spaltemembraner, sett in vivo, vanskelig å etterligne i klassiske todimensjonale cellekulturmodeller. Videre er intercellkommunikasjon med andre glomerulære celletyper ikke mulig i denne monokulturinnstillingen.

På grunn av deres terminale differensierte tilstand og mangel på spredningskapasitet er det vanskelig å studere podocytter ex vivo. Ved hjelp av betinget immortalisering av primære podocytter er det mulig å overvinne denne begrensningen ved innsetting av en termosensitiv bryter, noe som resulterer i en cellekulturmodell hvor celler prolifererer ved 33 °C og differensierer ved 37 °C13,14. Selv om disse ciPodocytter har høyt potensial for podocyttforskning, er det begrensninger, som mangel på markøruttrykk, dedifferensiert morfologi og manglende dannelse av fotprosesser15,16.

Differensieringen av podocytter fra pasientavledede somatiske celler muliggjør generering og sammenligning av syke podocytter med friske kontrollceller ex vivo. Dette gjør oss i stand til å studere podocyttskader på grunn av mutasjoner i podocyttspesifikke gener. Videre har arbeid med hiPSCs potensialet for å skape tredimensjonale cellekultursykdomsmodeller, eller rettere organoider43,44. Samkultur av hiPSC-avledede podocytter med andre glomerulære celler, som glomerulære endotelceller eller mesangialceller, kan føre til ny innsikt om intercellulær kommunikasjon i helse og glomerulær sykdom.

Videre kan karakterisering og behandling av de pasientspesifikke podocyttene utføres ex vivo i høy gjennomstrømningsanalyse. Den individualiserte tilnærmingen åpner muligheten til å undersøke nye terapeutiske mål for spesifikke mutasjoner og å utføre individualisert medisin i fremtiden.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) ved Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg med stipendnummer M4-IZKF-F009 gitt til Janina Müller-Deile, og av Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) under prosjektnavnet STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, stipendnummer 01GM2202D gitt til Janina Müller-Deile. Vi takker Annalena Kraus for støtten til å ta SEM-bilder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm sterile filter Rotilab P668.1 for sterilization of differentiation medium
all-trans retinoic acid Stem Cell Technologies 72262 supplement for differentiation
B27 supplement (50 x), serum free Gibco 17504044 supplement for serum-free differentiation medium
BG iMatrix-511 Silk biogems RL511S additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Bovine serum albumin (BSA)  Roth 8076.4
CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL Greiner bio-one 82050-856 cell culture plastics suitable for fibroblast culture
CHIR99021 (5 mg) Sigma-Aldrich 252917-06-9  supplement for differentiation
Corning Matrigel hESC qualified matrix  Corning 354277 additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix)
countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283 to count cells
countess II FL  Automated Cell Counter Invitrogen to count cells
cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white Sarstedt 72380 cryovials for freezing of cells
dimethyl sulfoxide (DMSO)  Roth A994.1 for fibroblast freezing medium
DMEM/F12 (1:1) (1 x) Gibco 11320074 basic medium for differentiation
DMEM/F12 + Glutamax Gibco 10565018 basic medium for fibroblast medium
EVOS M5000 Imaging System Thermo Fisher Scientific AMF5000 phase contrast microscope
fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) PAN Biotech P301902 serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium
fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile Fisherbrand FB104 cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap)
fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI Invitrogen 00-4959-52 mounting medium containing dapi
gauge needle (0.6 x 30 mm) BD Microlance3 300700 for separation of hiPSC colonies into small pieces
human Recombinant Activin A Protein 78001.1 Stem cell technologies supplement for differentiation
human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) Peprotech 120-03P supplement for differentiation
human VEGF-165 Recombinant Protein Thermo Scientific PHC9394 supplement for differentiation
insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) Gibco 41400045 supplement for podocyte maintenance medium
LB medium Roth X964.1 for sterility test of hiPSC culture
lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma Aldrich MP0035-1KT commercial mycoplasma detection kit
microscope slides Diagonal GmbH & Co.KG 21,102
microtube 1.5 mL  Sarstedt 72706400
mTeSR1 Complete Kit Stem Cell Technologies 85850 basic medium for serum-free hiPSC culture medium
nalgene freezing container Mr.Frosty Roth AC96.1  to ensure optimal freezing conditions
normal goat serum abcam ab 7481 for preincubation solution and antibody diluent
nunc 24 well plates Thermo Scientific 142485 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 48 well plates  Thermo Scientific 152640 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 6 well plates  Thermo Scientific 140685 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc EasYDish Dishes 100 mm Thermo Scientific 150466 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 167008 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nutriFreez D10 Cryopreservation Medium Sartorius 05-713-1E  serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells
Opti-MEM Gibco 11058021 electroporation medium 
pCXLE-hMLN Addgene #27079 plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hOCT3/4 plasmid Addgene #27077 plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hSK plasmid Addgene #27078 plasmid for episomal reprogramming
penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100ML to avoid bacterial contamination
plastic coverslips Sarstedt   83.1840.002 for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes
ROTI Histofix Roth P087.3 commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells
RPMI 1640 + L-Glutamine Gibco 21875034 basic medium for podocyte maintenance medium
staining chamber StainTray Black lid Roth HA51.1
stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501 enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs
sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) Gibco 14190094 used for washing and coating
sterile water Roth T1432
syringe without needle 20 mL BD Plastipak 300629 to filter sterilize differentiation medium
TC dish 100 mm Sarstedt 8,33,902 sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture
TC dish 35 mm Sarstedt 8,33,900 sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy
triton X 100 Roth 3051.3 for preincubation solution 
trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter Invitrogen T10282 to count cells
trypsin-EDTA (10 x)  Biowest X0930-100 dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells
tube 15 mL Greiner bio-one 188271-N
tube 50 mL Greiner bio-one 227261
vitronectin ACF Sartorius 05-754-0002 extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Y-27632 dihydrochloride (10 mg) Tocris 1254 to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting
Primary antibodies
OCT4  Stem Cell Technologies 60093.1 pluripotency marker, dilution 1:200
SSEA-4 Stem Cell Technologies 60062FI.1 pluripotency marker, dilution 1:100
Ki67 Abcam ab15580 proliferation marker, dilution 1:300
synaptopodin Proteintech 21064-1-AP podocyte-specific marker, dilution 1:200
nephrin Progen GP-N2 podocyte-specific marker, dilution 1:25
podocin proteintech 20384-1-AP podocyte-specific marker, dilution 1:100
Secondary antibodies
goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21435 secondary anditbody, dilution 1:1000
alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed Invitrogen A31634 secondary anditbody, dilution 1:1000
donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21422 secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 secondary anditbody, dilution 1:1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
  2. Grgic, I., et al. Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).
  3. Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub. Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).
  4. Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. Structural determinants of glomerular permeability. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).
  5. Schell, C., Huber, T. B. The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).
  6. Muller-Deile, J., Schiffer, M. Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out. Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).
  7. Boehlke, C., et al. Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement. American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).
  8. Schiffer, M., et al. Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models. Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).
  9. Kopp, J. B., et al. Podocytopathies. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68 (2020).
  10. Wiggins, R. C. The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases. Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).
  11. Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
  12. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).
  13. Saleem, M. A., et al. A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).
  14. Eto, N., et al. Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression. Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).
  15. Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).
  16. Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).
  17. Shih, N. Y., et al. CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain. The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).
  18. Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).
  19. Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. Dipping your feet in the water: podocytes in urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).
  20. Camici, M. Urinary detection of podocyte injury. Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).
  21. Muller-Deile, J., et al. Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 3621 (2018).
  22. Schenk, H., et al. Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb. Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).
  23. Petermann, A., Floege, J. Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity. Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).
  24. Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).
  25. Petermann, A. T., et al. Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable. Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).
  26. Sakairi, T., et al. Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).
  27. Rauch, C., et al. Differentiation of human iPSCs into functional podocytes. PLoS One. 13 (9), e0203869 (2018).
  28. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
  29. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  30. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  31. Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell. Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).
  32. Bang, J. S., et al. Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts. Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).
  33. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  34. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
  35. Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299 (2020).
  36. Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).
  37. Hoffding, M. K., Hyttel, P. Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).
  38. Bharathan, S. P., et al. Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells. Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).
  39. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
  40. Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
  41. Vaz, I. M., et al. Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming. Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147 (2021).
  42. Reiser, J., Altintas, M. M. Podocytes. F1000Research. 5, 114 (2016).
  43. Ohmori, T., et al. Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells. Scientific Reports. 11 (1), 3982 (2021).
  44. Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).

Tags

Biologi utgave 195
Generering av pasientavledede podocytter fra hudbiopsier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rose, V., Müller-Deile, J.… More

Rose, V., Müller-Deile, J. Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies. J. Vis. Exp. (195), e65364, doi:10.3791/65364 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter