Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Генерация подоцитов, полученных от пациента, из биопсии кожи

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65364
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Nephrology and Hypertension, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University (FAU) Erlangen-Nürnberg, 2Research Center on Rare Kidney Diseases (RECORD), University Hospital Erlangen

Summary

В этой рукописи описывается двухэтапный протокол для получения специфических для пациента подоцитов из дермальных фибробластов посредством эписомального перепрограммирования в индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) и последующей дифференцировки в подоциты.

Abstract

Подоциты представляют собой эпителиальные клетки, расположенные на мочевом участке клубочкового фильтрационного барьера, которые способствуют селективной фильтрующей функции клубочка. Мутации в специфических для подоцитов генах могут вызывать фокальный сегментарный гломерулосклероз (ФСГС), и подоциты также поражаются при многих других первичных и вторичных нефропатиях. Из-за своей дифференцированной природы модели первичных клеточных культур ограничены для подоцитов. Поэтому обычно используются условно иммортализированные клетки. Однако эти условно иммортализированные подоциты (циподоциты) имеют ряд ограничений: клетки могут дедифференцироваться в культуре, особенно когда они достигают слияния, а некоторые подоцитарно-специфические маркеры либо незначительны, либо вообще не экспрессируются. Это ставит под сомнение использование циподоцитов и их применимость для физиологического, патофизиологического и клинического охвата. Здесь мы описываем протокол генерации подоцитов человека, в том числе специфических для пациента подоцитов, из биопсии пунша кожи путем эписомального перепрограммирования дермальных фибробластов в ИПСК и последующей дифференцировки в подоциты. Эти подоциты гораздо лучше напоминают подоциты in vivo с точки зрения морфологических характеристик, таких как развитие стопных отростков и экспрессия подоцитарного специфического маркера. Наконец, что важно, эти клетки поддерживают мутации пациентов, что приводит к улучшенной модели ex vivo для изучения заболеваний подоцитов и потенциальных терапевтических веществ в индивидуальном подходе.

Introduction

Подоциты представляют собой специализированные постмитотические эпителиальные клетки почек, которые образуют клубочковый фильтрационный барьер почки вместе с клубочковой базальной мембраной (GBM), клубочковыми эндотелиальными клетками и гликокаликсом. Фенотипически подоциты состоят из клеточного тела и первичных, управляемых микротрубочками мембранных расширений, а также вторичных расширений, называемых ножными отростками 1,2. Клубочковый фильтрационный барьер, который фильтрует мочу из крови, построен из фенестрированного эндотелия, GBM и специализированного типа межклеточного соединения, которое соединяет соседние отростки стопы подоцитов, называемого щелевой диафрагмой подокта3. В здоровых условиях белки, крупнее альбумина, удерживаются от фильтрационного барьера из-за их размера и заряда4.

Известно, что мутации в генах, специфичных для цитоскелета или подоцитов, а также циркулирующие факторы, влияющие на сигнальные пути подоцитов, индуцируют стирание, отслоение или апоптоз подоцитов, что приводит к протеинурии и клубочковому склерозу. В частности, ключевыми являются перестройка цитоскелета, изменение полярности подоцитов или повреждение отростков стопы с сопутствующей потерей щелевых соединений5. Из-за их терминально дифференцированного статуса подоциты вряд ли могут быть заменены после отслоения GBM. Однако, если подоциты прикреплены к GBM, они все еще могут восстанавливаться после стирания и реформировать межпальцевые отростки стопы 6,7,8. Дальнейшее понимание событий, которые приводят к повреждению подоцитов при различных клубочковых расстройствах, может обеспечить новые терапевтические цели, которые помогут в разработке методов лечения этих заболеваний. Повреждение подоцитов является отличительной чертой различных клубочковых заболеваний, включая фокальный сегментарный гломерулосклероз (ФСГС), диабетическую нефропатию, болезнь минимальных изменений и мембранозную гломерулонефропатию, что требует надежных моделей подоцитов ex vivo для изучения патологических механизмов и потенциальных подходов к лечению этих заболеваний 9,10. Подоциты могут быть изучены ex vivo с помощью классической первичной клеточной культуры, основанной на выделении клубочков методом дифференциального просеивания11. Однако из-за терминально дифференцированного состояния с ограниченной способностью к пролиферации большинство исследователей используют клеточные линии циподоцитов мыши или человека, которые экспрессируют чувствительные к температуре варианты большого Т-антигена SV40. В качестве альтернативы циподоциты выделяют от трансгенных мышей, несущих ген 1,12 SV40 Tag.

Циподоциты размножаются при 33 ° C, но вступают в остановку роста и начинают дифференцироваться при 37 ° C13,14. Следует иметь в виду, что экспериментальные данные, полученные с этими клетками, следует интерпретировать с определенной осторожностью, поскольку клетки генерируются с использованием неестественной вставки генов15. Поскольку эти клетки содержат иммортализирующий ген, клеточная физиология изменяется из-за продолжающейся пролиферации12. Клеточные линии подоцитов, полученные с помощью этого подхода, недавно были поставлены под сомнение, поскольку циподоциты мышей, человека и крыс экспрессируют менее 5% синаптоподина и нефрина на уровне белка, а также NPHS1 и NPHS2 на уровне мРНК по сравнению с клубочковой экспрессией16. Более того, большинство клеточных линий подоцитов не экспрессируют нефрин17,18. Chittiprol et al. также описали значительную разницу в подвижности клеток и ответах на пуромицин и доксорубицин в циподоцитах16. Подоциты могут быть обнаружены в моче после отделения от ГБМ при различных клубочковых заболеваниях 19,20,21,22. Жизнеспособные мочевые подоциты можно культивировать ex vivo до 2-3 недель, но большинство клеток подвергаются апоптозу23,24. Интересно, что подоциты обнаруживаются не только в моче пациентов с гломерулярной болезнью, но и в моче здоровых добровольцев, скорее всего, когда они стареют снова с ограниченным потенциалом репликации в культуре24. Кроме того, количество подоцитов, полученных из мочи, ограничено, и клетки дедифференцируются в культуре, показывают меньше отростков стопы, изменяют морфологию и, что наиболее важно, имеют ограниченную способность к пролиферации. Экспрессия генов, специфичных для подоцитов, отсутствует, исчезает в течение нескольких недель или варьируется среди этих клеточных клонов. Некоторые клетки, положительные на подоцитарно-специфический маркер, совместно экспрессировали маркер канальцевых эпителиальных клеток или миофибробластов и мезангиальных клеток, что предполагает дедифференцировку и/или трансдифференцировку культивируемых мочевых подоцитов24,25.

Недавно была описана генерация клеточных линий циподоцитов, полученных из мочи пациентов и здоровых добровольцев путем трансдукции термочувствительным большим Т-антигеном SV40 иhTERT26. Экспрессия мРНК синаптоподина, нестина и CD2-ассоциированного белка была обнаружена, но мРНК подоцина отсутствовала во всех клонах. В дополнение к проблемам с мочевыми подоцитами, эти клетки также содержат вставленный иммортализирующий ген, что приводит к недостаткам, рассмотренным выше.

Напротив, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) обладают огромной способностью к самообновлению и дифференцировке в несколько типов клеток при соответствующих условиях. Ранее было показано, что ИПСК могут служить практически неограниченным источником подоцитов27,28.

Здесь описан двухэтапный протокол генерации специфических для пациента подоцитов из дермальных фибробластов биопсии кожного пунша с последующим эписомальным перепрограммированием в ИПСК и окончательной дифференцировкой в подоциты, полученные из ИПСК (рис. 1).

Figure 1
Рисунок 1: Протокол генерации специфических для пациента подоцитов, полученных из hiPSC. Графический обзор протокола получения специфических для пациента подоцитов из дермальных фибробластов биопсии кожи путем перепрограммирования в ИПСК и дифференцировки в подоциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В качестве первого шага соматические дермальные фибробласты были выращены из биопсии кожи и перепрограммированы в ИПСК с использованием метода без интеграции путем электропорации с плазмидами, экспрессирующими факторы транскрипции OCT3/4, KLF4, SOX2 и c-MYC 29,30,31. Возникшие колонии hiPSC впоследствии были отобраны и расширены. Дифференцировка началась с индукции мезодермальной линии путем активации сигнального пути WNT с последующей генерацией клеток-предшественников нефрона, которые все еще были способны размножаться. Наконец, клетки дифференцировались в подоциты. В этой процедуре мы модифицировали и объединили ранее опубликованные протоколы эписомального перепрограммирования для генерации ИПСК Bang et al.32 и Okita et al.33, а также протокол дифференцировки hiPSC в подоциты Musah et al.28,34,35.

Действительно, подоциты, полученные по нашему протоколу, имели фенотип, более близкий к подоцитам in vivo, в отношении развития отдельной сети первичных и вторичных отростков стопы и экспрессии специфических для подоцитов маркеров, таких как синаптоподин, подоцин и нефрин. При использовании подоцитов, полученных из hiPSC, генетический фон пациента сохраняется при перепрограммировании и дифференцировке. Это позволяет моделировать специфическое для пациента заболевание подоцитов и обнаруживать потенциальные терапевтические вещества ex vivo в практически неограниченном количестве клеток. Кроме того, этот протокол является минимально инвазивным, экономически эффективным, этически приемлемым и может способствовать новым возможностям разработки лекарств.

Protocol

Протокол был одобрен комитетом по этике Университета Эрлангена-Нюрнберга им. Фридриха-Александра (251_18B), и все пациенты и пробанды дали письменное согласие. Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами. Состав всех используемых сред и растворов см. в таблице 1.

1. Рост дермальных фибробластов в результате биопсии кожного пунша

  1. Перенесите биопсию кожного пунша в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл с 10 мл предварительно разогретой среды фибробластов.
  2. Удалите средство и промойте кожу пункционной биопсией три раза 5 мл стерильного, предварительно разогретого 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Стерильными щипцами перенесите пункционную биопсию кожи на 10-сантиметровую пластину для культивирования клеток и разрежьте ее по ширине на три-четыре части стерильным скальпелем, оставив эпидермис и дерму.
  3. Переложите каждый кусочек в стерильную пластиковую чашку для культивирования клеток диаметром 35 мм и аккуратно прижмите ее к чашке для культивирования. Удалите излишки среды вокруг кусочков биопсии. Дайте высохнуть в течение 5-10 минут, пока жидкость не испарится и биопсия не будет прикреплена к пластику клеточной культуры.
  4. Добавьте 1 мл среды фибробластов по каплям с помощью пипетки объемом 1,000 мкл вокруг биопсии и осторожно заполните до конечного объема 3 мл. Выращивают при 37 °C, 5%CO2 в течение 7 дней без подкормки и перемещения посуды. Осторожно замените среду на свежую, предварительно разогретую среду фибробластов. Через 7 дней переросшие веретенообразные фибробласты можно контролировать вокруг биопсии кожи с помощью фазово-контрастного микроскопа36.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда переросшие фибробласты достигнут края чашки, повторите шаг 1.3, чтобы создать еще одну партию фибробластов.
  5. Для расширения переросших фибробластов промывают 2 мл предварительно подогретого 1x PBS, диссоциируют фибробласты 1x трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и инкубируют в течение 5 мин при 37 °C, 5% CO2. Переложите отделившиеся клетки в коническую пробирку объемом 15 мл и промойте чашку для культивирования клеток 2 мл свежей, предварительно разогретой среды фибробластов.
  6. Поместите моющее средство в пробирку для нейтрализации диссоциирующего агента и центрифугу при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу 1 мл свежей, предварительно нагретой среды фибробластов. Подсчитайте клетки с помощью камеры Нейбауэра или автоматического счетчика клеток, используя трипановый синий и семена 2,5 x 10 от3 до 5 x 103 фибробластов на см2 в колбах для свежих клеточных культур.
  7. Поместите колбы обратно в инкубатор и равномерно распределите ячейки, перемещая колбы по три раза в каждом направлении. На следующий день замените среду на свежую, предварительно подогретую среду фибробластов. Меняйте среду два раза в неделю и расщепляйте, когда фибробласты достигают слияния около 80%.

2. Замораживание дермальных фибробластов

  1. Чтобы заморозить фибробласты, промойте их 5 мл предварительно разогретого 1x PBS. Аспирируйте PBS и диссоциируйте фибробласты с 4 мл 1x трипсина-ЭДТА. Поместите колбу обратно в инкубатор и выдерживайте в течение 5-7 минут при 37 ° C при 5% CO2. Контролируйте отслоение с помощью фазово-контрастного микроскопа и постукивайте по боковой стороне колбы, чтобы отделить клетки.
  2. Перенесите отделенные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Промойте колбу клеточной культуры 5 мл свежей, предварительно подогретой среды фибробластов. Поместите моющую среду в коническую трубку и центрифугу при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C.
  3. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу с 2 мл свежей, предварительно подогретой среды фибробластов. Подсчитайте клетки и перенесите 1 х 106 клеток в новую коническую трубку. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C.
  4. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клеточную гранулу 1 мл холодной среды для замораживания фибробластов, состоящей из 90% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида (ДМСО). Переложите в криотерапию, поместите в морозильный контейнер и заморозьте на ночь при температуре -80 °C. Для длительного хранения поместите криовиал в резервуар с жидким азотом на следующий день.

3. Эписомальное перепрограммирование фибробластов для генерации ИПСК

  1. Для эписомального перепрограммирования используют 1,5 х 106 фибробластов из прохода с 4 по 8. Чтобы достичь этого количества ячеек, используйте две-три колбы по 250 мл с контесностью около 70%.
  2. За день до перепрограммирования расщепите фибробласты в соотношении 1:2, чтобы обеспечить их пролиферативное состояние. Поэтому аспирируйте среду и промойте колбы 5 мл предварительно разогретого 1x PBS на колбу. Аспирируйте PBS и диссоциируйте фибробласты с 4 мл 1x трипсина-ЭДТА. Поместите колбы обратно в инкубатор и выдерживайте в течение 5-7 минут при 37 ° C и 5% CO2. Контролируйте отслоение с помощью фазово-контрастного микроскопа и постукивайте по стенке колбы, чтобы отделить клетки от пластиковой поверхности.
  3. Перенесите отделенные клетки в коническую пробирку объемом 50 мл и промойте колбы для клеточных культур 5 мл свежей, предварительно разогретой среды фибробластов. Поместите моющую среду в коническую трубку и центрифугу при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 6 мл свежей, предварительно нагретой среды фибробластов.
  4. Приготовьте шесть новых колб для клеточных культур, добавив 5 мл свежей, предварительно подогретой среды фибробластов на колбу. Добавьте 1 мл суспензии клеток фибробластов в каждую колбу. Поместите колбы обратно в инкубатор и равномерно распределите ячейки, перемещая колбы по три раза в каждом направлении.
  5. Для эписомального перепрограммирования покройте две 10-сантиметровые пластины для культивирования клеток, подходящие для культивирования hiPSC, 4 мл раствора для холодного покрытия на пластину. Инкубировать пластины в течение 1 ч при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для культивирования ИПСК требуются различные пластмассы для клеточных культур и дополнительное покрытие внеклеточного матрикса (см. Таблицу материалов).
  6. Удалите среду из фибробластов и промойте 10 мл предварительно разогретого 1x PBS на колбу. Аспирируют PBS и диссоциируют фибробласты с 4 мл 1x трипсина-ЭДТА на колбу путем инкубации в течение 5-7 мин при 37 ° C. Контролируйте отслоение с помощью фазово-контрастного микроскопа и, при необходимости, постучите по стенке колбы, чтобы отделить клетки от пластиковой поверхности.
  7. Перенесите отделившиеся клетки в коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте пустые колбы 6 мл предварительно разогретой среды фибробластов, чтобы собрать оставшиеся клетки и собрать в коническую пробирку. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 3 мл свежего, предварительно подогретого 1x PBS.
  8. Подсчитайте клетки и перенесите 1,5 х 106 фибробластов в новую коническую трубку. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу клетки в 5 мл электропорационной среды и снова центрифугу. Тем временем аспирируйте раствор покрытия из покрытых 10 см планшетов для культивирования клеток и добавьте 7 мл предварительно разогретой среды фибробластов.
  9. После центрифугирования откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте гранулу ячейки в электропорационной среде с концентрацией 1,5 х 106 клеток в 250 мкл. Перенесите суспензию ячейки 250 мкл в кювету для электропорации с расстоянием между зазором 4 мм (см. Таблицу материалов).
  10. Готовят смесь для трансфекции плазмиды, добавляя по 4 мкг каждой плазмиды (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) к общему объему 50 мкл электропорационной среды. Переложите в кювету и аккуратно перемешайте. Электропорат одним импульсом на 280 В.
  11. Отрежьте наконечник пипетки стерильными ножницами и перенесите 125 мкл электропорированных фибробластов на каждый из подготовленных 10-сантиметровых планшетов для культивирования клеток. Распределите ячейки, трижды перемешав пластины во всех направлениях, и поместите их обратно в инкубатор. Инкубировать в течение ночи при 37 ° C с 5% CO2 без помех.
  12. Чтобы удалить мертвые клетки, замените среду на следующий день 7 мл свежей, предварительно разогретой среды фибробластов. Через 2 дня после электропорации замените среду на питательную среду hiPSC и замените ее через день в течение следующих 20 дней.

4. Отбор, расширение и контроль качества генерируемых ИПСК

  1. Ежедневно контролируйте клетки в течение не менее 20 дней с помощью фазово-контрастного микроскопа с 10-кратным или 20-кратным объективом, чтобы наблюдать за образованием колоний hiPSC после электропорации. Если колонии hiPSC имеют диаметр около 300 мкм с четкими границами, а hiPSC демонстрируют высокое отношение ядер к телу, колонии hiPSC готовы к отбору путем сбора (рис. 2B, C и рис. 3).
  2. Перед сбором покройте 96-луночную пластину, подходящую для культуры hiPSC, 100 мкл раствора покрытия на лунку и инкубируйте в течение 1 ч при 37 °C. Во время инкубации отметьте интересующие колонии на дне чашки для культивирования клеток ручкой. Для окончательного приготовления 96-луночной пластины удалите раствор покрытия и добавьте в каждую лунку по 100 мкл предварительно подогретой питательной среды hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632.
  3. Промойте клетки предварительно подогретым 1x PBS и добавьте свежую, предварительно подогретую питательную среду hiPSC, содержащую 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632, перед сбором для удаления мертвых клеток. Чтобы собрать колонии hiPSC, используйте калибровочную иглу и разделите колонии hiPSC на мелкие кусочки, нарисовав сетку в каждой колонии.
  4. С помощью фазово-контрастного микроскопа проверьте, чтобы колонии успешно разделились на кусочки. Перенесите их пипеткой объемом 100 мкл на подготовленную 96-луночную пластину. Держите пипетку вертикально над колонией, не касаясь клеток, чтобы избежать царапин и потери колонии.
  5. Поместите 96-луночную пластину в инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2 и дайте клеткам прикрепиться в течение ночи без помех. Храните посуду со смесью фибробластов и ИПСК на случай, если сбор не увенчается успехом. Поэтому удалите ингибитор ROCK Y27632, изменив среду на питательную среду hiPSC, и поместите планшеты обратно в инкубатор.
  6. На следующий день смените среду 96-луночного планшета на 200 мкл свежей питательной среды hiPSC и меняйте ее через день. На следующий день проконтролируйте 96-луночную пластину и отметьте скважины успешно отобранными клонами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если отобранные клоны hiPSC не полностью отобраны после первой попытки, и фибробласты могут быть обнаружены в лунке, повторите отбор из 96-лунки или соскребите фибробласты с пластины.

5. Расширение выбранных клонов hiPSC

  1. Контролируйте клоны hiPSC с помощью фазово-контрастного микроскопа. Если выбранные ИПСК достигают слияния около 70%, клоны ИПСК готовы к расширению.
  2. Покройте 48-луночную пластину, пригодную для культивирования hiPSC, 250 мкл раствора покрытия на лунку в течение 1 часа при 37 °C. Замените раствор покрытия 200 мкл свежей, предварительно подогретой питательной среды hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632.
  3. Чтобы отсоединить ИПСК от 96-луночной пластины, соскребите пластиковую поверхность наконечником пипетки объемом 1,000 мкл. Перенесите отсоединившиеся ИПСК с 96-луночного планшета на 48-луночный планшет. На следующий день смените среду на свежую, предварительно подогретую питательную среду hiPSC для удаления мертвых клеток и ингибитора ROCK Y27632.
  4. Если клоны hiPSC достигают слияния около 70%, перенесите hiPSC в 24-луночную пластину. Поэтому покройте 24-луночную пластину, подходящую для культивирования hiPSC, 400 мкл раствора покрытия на лунку в течение 1 часа при 37 ° C. Замените раствор покрытия 400 мкл свежей, предварительно подогретой питательной среды hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632. Аспирируйте среду из 48 лунок и промойте 500 мкл предварительно подогретого 1x PBS.
  5. Замените PBS 100 мкл ферментативного раствора для отслоения клеток, содержащего 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632, и инкубируйте при 37 ° C в течение 4 мин. Смойте ИПСК с пластины с помощью пипетки объемом 1,000 мкл. Перенесите диссоциированные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Промойте пустую 48-луночную пластину питательной средой hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632, и погрузите в коническую пробирку.
  6. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют ИПСК в 1 мл питательной среды ИПСК, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632, и переносят на 24-луночную пластину. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C при 5%CO2 и распределите ячейки, трижды перемешивая пластину во всех направлениях. Дайте клеткам прикрепиться в течение ночи без помех.
  7. На следующий день смените среду на питательную среду hiPSC без ингибитора ROCK Y27632.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если клоны hiPSC достигают слияния около 70%, перенесите hiPSC на 12-луночную пластину, повторив шаги с 5.4 по 5.7 с увеличенными объемами, подходящими для 12-луночного формата. Если hiPSC с 12-луночной пластины достигают слияния около 70%, перенесите клоны hiPSC на 6-луночную пластину с увеличенными объемами для 6-луночного формата.

6. Замораживание выбранных клонов hiPSC

  1. Чтобы заморозить выбранные клоны hiPSC, аспирируйте среду из 6-луночной пластины. Промойте лунки 2 мл 1x PBS. Аспирируют и диссоциируют ИПСК 1 мл ферментативного раствора для отсоединения клеток, содержащего 10 мкМ Y27632. Поместите пластину обратно в инкубатор и выдерживайте в течение 4 минут при 37 ° C и 5% CO2.
  2. Промойте ИПСК с пластины с помощью пипетки объемом 1000 мкл и перенесите отделенные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Вымойте тарелку 2 мл свежей, предварительно подогретой питательной среды hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632. Бассейн в конической трубке и центрифуге при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клеточную гранулу 2 мл свежей, предварительно подогретой питательной среды hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632.
  3. Подсчитайте клетки и перенесите 1 х 106 клеток в новую коническую трубку. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость, ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл холодной морозильной среды hiPSC без сыворотки и заморозьте в криовиале с использованием морозильного контейнера на ночь при -80 ° C. Для длительного хранения поместите криовиал в резервуар с жидким азотом на следующий день.

7. Контроль качества HiPSC

  1. Характеристика морфологии hiPSC
    1. Проверьте характерную морфологию hiPSC с помощью фазово-контрастного микроскопа с 20-кратным объективом. После перепрограммирования морфология клеток меняется от длинных веретенообразных фибробластов до небольших круглых ИПСК, представляющих высокое отношение ядер к телу, растущих в колониях с четкими границами (рис. 2C).
    2. Если колонии hiPSC становятся слишком плотными и происходит спонтанная дифференцировка, соскребите дифференцированные части с пластины с помощью наконечника пипетки (рис. 3). Поскольку ИПСК имеют высокую скорость пролиферации, ежедневно подкармливайте культуры ИПСК свежей, предварительно подогретой питательной средой ИПСК.
  2. Характеристика маркеров плюрипотентности методом иммунофлюоресцентного окрашивания
    1. Чтобы проверить сгенерированные ИПСК на маркер плюрипотентности с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания, поместите пластиковые покровные стекла в 24-луночную пластину и покройте 250 мкл раствора покрытия в течение 1 ч при 37 ° C и 5% CO2. Замените раствор покрытия 1 мл предварительно подогретой питательной среды hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632.
    2. Затравка 1,9 x 104 диссоциированных ИПСК на 24 лунки. Дайте ИПСК прикрепиться на ночь при 37 ° C и 5% CO2 без помех. См. шаги с 5.4 по 5.6 для диссоциации ИПСК. Замените среду на следующий день питательной средой hiPSC без ингибитора ROCK Y27632.
    3. Для окрашивания промойте клетки 1 мл предварительно подогретого 1x PBS, а затем зафиксируйте ИПСК 4% параформальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре. Неподвижные ИПСК промывают 1x PBS и блокируют неспецифические места связывания 200 мкл прединкубационного раствора на лунку в течение 1 ч при комнатной температуре. Разбавляют первичные антитела Ki67 (1:300), OCT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) в разбавителе антител.
    4. Очистите пластиковую фольгу 70% этанолом и поместите ее в камеру окрашивания, заполненную резервуаром для воды. Поместите капли 30 мкл первичных разведений антител на фольгу. Поместите фиксированные образцы вверх дном в разбавление и выдержите в течение ночи при температуре 4 °C.
    5. На следующий день трижды промойте образцы 1x PBS в течение 5 минут и поместите 30 мкл капель вторичных разведения антител (1:1,000) на чистые места на фольге. Поместите крышку вверх дном в разбавление. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
    6. После инкубации промыть три раза 1x PBS в течение 5 мин. Установите образцы на предметные стекла в монтажной среде, содержащей DAPI. Дайте высохнуть в течение ночи при комнатной температуре и в темноте и визуализируйте образцы с помощью конфокального микроскопа (рис. 4).
  3. Исключение бактерии и микоплазменного загрязнения
    1. Чтобы исключить заражение бактериями, перенесите 500 мкл диссоциированных ИПСК на 5 мл предварительно подогретой среды Лурия-Бертани (LB). См. шаги с 5.4 по 5.6 для диссоциации ИПСК. Инкубировать в течение ночи при температуре 37 °C. Если среда LB кажется мутной, вероятно, произошло заражение бактериями. Выбросьте ячейки.
    2. Чтобы исключить заражение микоплазмой, соберите среду, которая не заменялась в течение 2 дней, из 6 скважин с примерно 90% сливающимися ИПСК. Используйте количественную полимеразную цепную реакцию (кПЦР) для обнаружения загрязнения микоплазмами. Для этой цели доступно множество коммерческих наборов для обнаружения микоплазмы.

8. Дифференциация ИПСК в подоциты

  1. Подготовка и хранение факторов роста
    1. Чтобы получить исходную концентрацию 10 мМ Y27632, восстановите 10 мг Y27632 (молекулярная масса 320,26 г/моль) в 3,12 мл стерильной воды. Храните 100 мкл аликвот при -20 ° C и разбавляйте 1:1000 в среде для культивирования клеток до достижения конечной концентрации 10 мкМ.
    2. Чтобы получить исходную концентрацию 30 мМ CHIR99021, восстановите 5 мг CHIR99021 (молекулярная масса 465,34 г/моль) в 358,2 мкл стерильного ДМСО. Храните 50 мкл аликвот при -20 °C и разбавляйте 1:10 000 в среде для культивирования клеток до достижения конечной концентрации 3 мкМ.
    3. Чтобы получить исходную концентрацию 100 мкг/мл активина А, восстановите 100 мкг активина А в 1 мл 1x PBS, содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Храните 100 мкл аликвот при -20 ° C и разбавляйте 1:2000 в среде для культивирования клеток до достижения конечной концентрации 50 нг / мл.
    4. Чтобы получить исходную концентрацию 100 мкг/мл костного морфогенного белка 7 (BMP7), восстановите 100 мкг BMP7 в 1 мл стерильной воды, содержащей 0,1% BSA. Храните 100 мкл аликвот при -20 ° C и разбавляйте 1:2000 в среде для культивирования клеток до достижения конечной концентрации 50 нг / мл.
    5. Чтобы получить исходную концентрацию 100 мкг/мл фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), восстановите 100 мкг VEGF в 1 мл стерильной воды. Храните 100 мкл аликвот при -20 ° C и разбавляйте 1:4000 в среде для культивирования клеток до достижения конечной концентрации 25 нг / мл.
    6. Чтобы получить исходную концентрацию 10 мМ полностью транс-ретиноевой кислоты, восстановите 10 мг полностью транс-ретиноевой кислоты в 3,33 мл стерильного ДМСО. Храните 100 мкл аликвот при -20 ° C и разбавляйте 1:100 в среде для культивирования клеток до достижения конечной концентрации 0,5 мкМ.
  2. Активация сигнального пути WNT для индуцирования линии мезодермы
    1. Для дифференцировки ИПСК в подоциты, полученные из ИПСК, оболочку для культивирования клеток или колбы, подходящие для культивирования ИПСК, с раствором покрытия в течение 1 ч при 37 °С и 5%СО2. Общий объем раствора покрытия составляет 1 мл на 6-луночную культуральную пластину или 4 мл на 10-сантиметровую клеточную культуральную пластину.
    2. Аспирируйте среду и промойте ИПСК предварительно разогретым 1x PBS. Аспирируют PBS и добавляют ферментативный раствор для отсоединения клеток, содержащий 10 мкМ Y27632, общим объемом 1 мл на 6-луночную культуральную пластину или 4 мл на 10-сантиметровую клеточную культуральную пластину.
    3. Поместите пластину обратно в инкубатор и выдерживайте в течение 4 минут при 37 ° C и 5% CO2. Смойте ИПСК с пластины с помощью пипетки объемом 1,000 мкл. Перенесите отделившиеся клетки в коническую трубку.
    4. Вымойте тарелку свежей, предварительно подогретой питательной средой hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632. Поместите моющую среду в коническую трубку, чтобы нейтрализовать диссоциативный реагент. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клеточную гранулу 2 мл свежей, предварительно подогретой питательной среды hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632.
    5. Подсчитайте клетки и семена 1 х 104 ИПСК/см2. Распределите ячейки, трижды взбалтывая во все стороны. Дайте ИПСК прикрепиться на ночь при 37 °C с 5% CO2 без помех.
    6. На следующий день замените среду 2 мл предварительно подогретой среды для дифференцировки мезодермы, содержащей 1x добавку B27, 1% пенициллин-стрептомицин, 3 мкМ CHIR99021, 50 нг/мл активина А и 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632.
  3. Дифференцировка в клетки-предшественники нефрона
    1. Через 2 дня замените среду мезодермы на 2 мл предварительно подогретой среды для дифференцировки предшественника нефрона, содержащей 1x добавку B27, 1% пенициллин-стрептомицин, 3 мкМ CHIR99021, 50 нг/мл активина A и 50 нг/мл BMP7 на 6-луночную культуральную пластину или 6 мл на 10-сантиметровую клеточную культуральную пластину. Меняйте носитель через день в течение следующих 14 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки-предшественники нефрона размножаются и могут быть пройдены и заморожены после 7 дней дифференцировки в среде расширения предшественника нефрона.
    2. Чтобы расщепить клетки-предшественники нефронов, покройте пластик клеточной культуры, подходящий для культивирования hiPSC, раствором покрытия в течение 1 ч при 37 °C. Замените раствор покрытия расширительной средой-предшественником нефрона. Аспирируйте носитель и промойте клетки предварительно разогретым 1x PBS. Удалите PBS и диссоциируйте клетки с помощью 1x трипсина-ЭДТА.
    3. Инкубировать в течение 5 мин при 37 °C и 5% CO2. Контролируют отрыв клеток с помощью фазово-контрастного микроскопа. При необходимости постучите по боковой стороне пластика, чтобы отделить ячейки от поверхности. Промойте клетки с пластины и переложите в коническую трубку. Промойте пустую колбу или тарелку тем же объемом предварительно разогретой среды для расширения предшественника нефрона, что и диссоциирующий реагент.
    4. Слейте моющее средство в коническую трубку. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу 2 мл свежей, предварительно разогретой среды для расширения предшественника нефрона. Подсчитайте клетки и семена 1,5 х 104 клеток-предшественников нефрона насм2 для дальнейшей дифференцировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы заморозить клетки-предшественники нефрона, ресуспендируйте 1 x 106 клеток в 1 мл холодной среды для криоконсервации без сыворотки и перенесите в криотерапию. Заморозьте в морозильной емкости при температуре -80 °C на ночь и переложите в резервуар с жидким азотом для длительного хранения.
    5. Поместите пластины обратно в инкубатор и равномерно распределите ячейки, трижды перемешивая во все стороны. На следующий день смените среду на свежую, предварительно подогретую среду для дифференцировки предшественников нефронов. Замените среду через день до тех пор, пока клетки не будут дифференцированы в течение 14 дней в среде для дифференцировки предшественников нефрона.
  4. Терминальная дифференцировка в подоциты, полученные из hiPSC
    1. Аспирируйте среду и добавьте 2 мл предварительно подогретой среды для дифференцировки подоцитов, содержащей 1x добавку B27, 1% пенициллин-стрептомицин, 3 мкМ CHIR99021, 50 нг/мл активина A, 50 нг/мл BMP7, 25 нг/мкл VEGF и 0,5 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты на 6-луночную культуральную пластину или 6 мл на 10-сантиметровую клеточную культуральную пластину. Поместите планшеты обратно в инкубатор при температуре 37 °C и 5% CO2. Меняйте среду через день в течение 4 дней свежей, предварительно подогретой средой для дифференцировки подоцитов.
    2. Чтобы сохранить hiPSC-подоциты в культуре после дифференцировки, два раза в неделю кормите клетки поддерживающей средой подоцитов, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% пенициллина-стрептомицина и 0,1% инсулин-трансферрин-селена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Терминальные дифференцированные hiPSC-подоциты больше не размножаются. Однако можно держать их в клеточной культуре до 4 недель.
  5. Размораживание и расширение замороженных клеток-предшественников нефрона
    1. Покройте новую пластиковую колбу для клеточной культуры, подходящую для культивирования hiPSC, раствором покрытия в течение 1 ч при 37 °C и 5% CO2. Замените раствор покрытия 5 мл среды для расширения предшественника нефрона.
    2. Подготовьте коническую пробирку объемом 15 мл с 7 мл предварительно разогретой среды для расширения предшественника нефрона. Разморозьте замороженные клетки при температуре 37 °C на водяной бане без движения в течение примерно 20 с. Выньте криовиал из водяной бани, когда половина клеток оттает, и останется немного льда.
    3. Опрыскайте криовиал 70% этанолом и поместите в шкаф биобезопасности. Переносят размороженные клетки в коническую трубку с предварительно подогретой средой для расширения предшественника нефрона. Используйте пипетку объемом 1000 мкл и дайте клеткам очень медленно стекать по стенке трубки.
    4. Промойте пустой криовиал 1 мл среды-предшественника нефрона, чтобы собрать оставшиеся клетки и собрать в коническую пробирку. Центрифугу при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C и ресуспендировать гранулу клетки в свежей, предварительно разогретой среде для расширения предшественника нефрона.
    5. Перенесите размороженные клетки в колбу с покрытием и на следующий день смените среду на свежую, предварительно подогретую среду для расширения предшественника нефрона. Перед дальнейшей дифференцировкой дайте клеткам размножиться в среде расширения предшественника нефрона, меняя среду через день, и приступайте к шагу 8.3.5.

9. Характеристика подоцитов, полученных из hiPSC, методом иммунофлуоресцентного окрашивания

  1. Чтобы проверить дифференцированные подоциты на подоцит-специфический маркер с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания, поместите пластиковые покровные стекла в 24-луночную пластину и покройте 250 мкл раствора покрытия в течение 1 часа при 37 ° C и 5% CO2. Замените раствор покрытия 1 мл предварительно подогретой среды для расширения предшественника нефрона. Семя: 2,5 x 104 диссоциированных клеток-предшественников нефрона на 24-луночную пластину. См. шаги 8.3.2 - 8.3.4 для диссоциации клеток-предшественников нефрона.
  2. Дайте клеткам прикрепиться на ночь при 37 ° C и 5% CO2 без помех. Замените среду на следующий день предварительно подогретой средой для дифференцировки предшественников нефронов.
  3. Завершите дифференцировку, меняя среду через день, пока клетки не будут дифференцированы в общей сложности 14 дней в среде для дифференцировки предшественников нефрона и еще 5 дней в среде для дифференцировки подоцитов.
  4. После окончательной дифференцировки промойте клетки 1 мл предварительно разогретого 1x PBS. Зафиксируйте hiPSC-подоциты 4% параформальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре. Неподвижные клетки промывают 1x PBS и блокируют неспецифические места связывания 200 мкл прединкубационного раствора на лунку в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Разбавьте первичные антитела синаптоподин (1:200), подоцин (1:100) и нефрин (1:25) в разбавителе антител и поместите капли разведения первичных антител 30 мкл на чистую пластиковую фольгу в камеру окрашивания, содержащую резервуар для воды.
  6. Поместите предметные стекла с фиксированными hiPSC-подоцитами вверх дном в разбавление. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C. На следующий день трижды смойте 1x PBS в течение 5 минут. Разбавьте вторичные антитела (1:1,000) в 1x PBS и поместите капли разведения вторичных антител 30 мкл на чистые места на фольге. Поместите крышку вверх дном в разбавление.
  7. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. После инкубации промыть три раза 1x PBS в течение 5 мин. Установите образцы на предметные стекла в монтажной среде, содержащей DAPI. Дайте высохнуть в течение ночи при комнатной температуре и в темноте. Визуализируйте образцы с помощью конфокального микроскопа.

Representative Results

С помощью этого пошагового протокола, сочетающего эписомальное перепрограммирование и дифференцировку, можно генерировать подоциты, несущие мутацию пациента в гене, соответствующем подоцитам. Это позволяет анализировать специфические для заболевания изменения подоцитов ex vivo. Генетический фон пациента сохраняется во время протокола на всех различных клеточных стадиях. Кроме того, ограничение недостаточного количества клеток терминально дифференцированных непролиферирующих подоцитов может быть преодолено с помощью подоцитов, полученных из hiPSC. Несмотря на то, что требуется несколько месяцев, прежде чем hiPSC-подоциты будут сгенерированы из переросших дермальных фибробластов путем перепрограммирования в ИПСК и последующей дифференцировки в подоциты, можно заморозить клетки на трех разных этапах протокола (рис. 2). Замораживание фибробластов, ИПСК и клеток-предшественников нефронов возможно после дифференцировки в среде для дифференцировки предшественников нефронов в течение 7 дней. Поэтому возможна генерация рабочих банков клеток и масштабные эксперименты.

Figure 2
Рисунок 2: Отдельные этапы протокола через фазово-контрастный микроскоп. (А) Переросшие дермальные фибробласты. (B) образование колоний hiPSC после перепрограммирования. (C) Выбранная культура hiPSC. (D) Клетки мезодермы после 2 дней дифференцировки. (E) Клетки-предшественники нефрона после 14 дней дифференцировки в среде дифференцировки предшественников нефронов. (F) Терминальные дифференцированные подоциты, полученные из hiPSC. Масштабные линейки представляют 300 мкм (A, B, D-F) и 150 мкм (C). Снежинка подчеркивает возможные этапы замораживания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Поскольку сгенерированные подоциты, полученные из hiPSC, проходят длинный протокол с радикальными изменениями в отношении типа и морфологии клеток, характеристика клеток является обязательной. Морфологию клеток, такую как размер и форма клеток, а также поведение роста, можно контролировать с помощью фазово-контрастного микроскопа. Фибробласты представляют собой длинный веретенообразный фенотип размером от 150 мкм до 300 мкм (рис. 2А). После перепрограммирования возникают колонии с небольшими ИПСК размером 50 мкм. Эти колонии имеют четкие границы, а ИПСК отличаются высоким отношением ядер к телу и повышенной скоростью пролиферации (рис. 2C). Поскольку подоциты являются терминально дифференцированными клетками, скорость пролиферации уменьшается с прогрессирующей дифференцировкой, и морфология клеток изменяется на 300 мкм крупных звездчатых подоцитов с выступающими отростками стопы (рис. 2F).

Слияние является критической точкой культуры hiPSC, и спонтанная дифференциация может появиться, когда колонии становятся слишком плотными (рис. 3). Эти колонии необходимо удалить перед прохождением, соскоблив пораженные части посуды с культурой.

Figure 3
Рисунок 3: Примеры ИПСК разного качества. Фазово-контрастные изображения успешно (A) перепрограммированных колоний hiPSC и (B) отдельных hiPSCs, а также (C) спонтанной дифференцировки, (D, E) колоний, не относящихся к hiPSC, и (F) слишком плотной культуры hiPSC. Масштабные линейки представляют 300 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Различные типы клеток этого протокола должны быть проверены на экспрессию определенного маркера. После перепрограммирования ИПСК восстанавливают плюрипотентную способность и экспрессируют маркеры пролиферации и плюрипотентности, такие как SSEA4, OCT3/4 и Ki67 (рис. 4)38,39,40. Известно, что перепрограммирование, а также длительная культура ИПСК и дифференцировка могут приводить к аномальному кариотипу, а точнее индуцировать мутации41. Следовательно, генетический фон культивируемых клеток следует контролировать с течением времени и в разных местах с помощью g-полос и секвенирования всего экзома.

Figure 4
Рисунок 4: Характеристика генерируемых ИПСК методом иммунофлуоресцентного окрашивания. Характеристика генерируемых ИПСК путем окрашивания на (A) пролиферативный маркер Ki67, а также маркеры плюрипотентности (B) OCT3/4 и (C) SSEA4. Масштабные линейки представляют 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Морфологически подоциты, полученные из hiPSC, имеют звездообразную форму и экспрессируют отчетливую сеть длинных первичных и вторичных отростков стопы по сравнению с циподоцитами (рис. 5). Подоциты, полученные из HiPSC, экспрессируют специфические для подоцитов маркерные белки, такие как синаптоподин, нефрин и подоцин (рис. 6A-C)42.

Figure 5
Рисунок 5: Морфология подоцитов, полученных из hiPSC, в сравнении с циподоцитами. Сравнение (A,B) подоцитов, полученных из hiPSC, от здорового донора с (C,D) циподоцитами в отношении морфологии клеток и филоподий с использованием фазово-контрастного микроскопа (A,C) и сканирующего электронного микроскопа (B,D). Масштабные линейки представляют 150 мкм (A, C) и 20 мкм (B, D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таким образом, сравнение подоцитов, полученных из hiPSC, не только от здоровых доноров, но и от пациентов с мутациями в генах, специфичных для подоцитов, позволяет индивидуализировать характеристику мутации пациента ex vivo.

Figure 6
Рисунок 6: Характеристика подоцитарно-специфического маркера в подоцитах и циподоцитах, полученных из hiPSC. Сравнение (A-C) hiPSC-полученных подоцитов от здорового донора с (D-F) циподоцитами в отношении подоцитарно-специфических маркерных белков синаптоподина (A, D), нефрина (B, E) и подокина (C, F). Масштабные линейки представляют 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1. Состав всех сред для культивирования клеток и растворов, использованных в исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Discussion

Этот протокол, основанный на клеточных культурах, сочетает в себе эписомальное перепрограммирование дермальных фибробластов человека в специфические для пациента ИПСК и последующую дифференцировку в подоциты, полученные из ИПСК. Это позволяет изучать мутационные изменения подоцитов у пациентов с генетическим гломерулярным заболеванием в отношении повреждения подоцитов. Протокол перепрограммирования дермальных фибробластов методом без интеграции путем электропорации адаптирован из опубликованных работ Bang et al.32 и Okita et al.33. Протокол дифференциации подоцитов от ИПСК адаптирован из опубликованного протокола Musah et al.28,34,35. Уже имеются публикации, описывающие генерацию подоцитов из ИПСК 27,34,35. Тем не менее, представленный здесь протокол оптимизирован и менее дорог в отношении дифференцировки ИПСК в подоциты. По сравнению с опубликованным протоколом Musah et al., мы протестировали этот протокол на различных реагентах покрытия, таких как витронектин, ламининовый шелк-511 и солюбилизированная матрица базальной мембраны. Концентрации витронектина и ламинина шелк-511 могут быть снижены до 2,5 мкг/мл вместо 5 мкг/мл 28,34,35. Кроме того, удалось снизить концентрацию BMP7 и активина А - двух очень дорогих факторов роста - на 50%, со 100 нг/мл до 50 нг/мл.

Это позволяет снизить затраты на дифференциацию. Клетки-предшественники нефрона с 7-го дня все еще размножались, и ранее была показана возможность замораживания. Мы расширили эти клетки после оттаивания и перед окончательной дифференцировкой в основной среде, содержащей модифицированную среду Dulbecco Eagle (DMEM) и B27, в течение нескольких дней, что еще больше снизило затраты. В дополнение к этапам дифференцировки, этот протокол описывает рост фибробластов из биопсии кожи с последующей генерацией специфических для пациента ИПСК посредством эписомального перепрограммирования. Комбинация этих двух методов позволяет генерировать специфические для пациента подоциты. Таким образом, здесь представлен полный пошаговый протокол для создания специфических для пациента подоцитов, полученных из hiPSC, который ранее не был описан так подробно.

Поскольку общий протокол включает в себя несколько различных типов клеток, крайне важно охарактеризовать генерируемые типы клеток на разных этапах. Клетки находятся в культуре в течение длительного периода времени, поэтому контроль качества должен проводиться на разных проходах. При работе с ИПСК необходимо ежедневное кормление, а также мониторинг поведения и морфологии клеток. Стерильность дифференциационных сред должна быть обеспечена стерилизацией фильтра через фильтр 0,2 мкм. Весь протокол, от биопсии кожи до подоцитов, полученных из hiPSC, занимает несколько месяцев, но можно заморозить клетки на разных этапах процесса. Фибробласты, отобранные клоны hiPSC и пролиферативные клетки-предшественники нефрона через 7 дней в среде дифференцировки предшественников нефронов могут быть заморожены, и может быть создан рабочий банк клеток.

Несмотря на то, что здоровые подоциты, полученные из hiPSC, развивают четкую сеть первичных и вторичных отростков стопы (рис. 5A, B) и экспрессируют типичный маркер, специфичный для подоцитов (рис. 6A-C), характерные щелевые диафрагмы, как видно in vivo, трудно имитировать в классических двумерных моделях клеточных культур. Более того, межклеточная связь с другими типами клубочковых клеток невозможна в условиях монокультуры.

Из-за их терминального дифференцированного состояния и недостаточной способности к пролиферации трудно изучать подоциты ex vivo. С помощью условно иммортализации первичных подоцитов можно преодолеть это ограничение путем введения термочувствительного переключателя, в результате чего получается модель клеточной культуры, в которой клетки размножаются при 33 °C и дифференцируются при 37 °C13,14. Хотя эти циподоциты обладают высоким потенциалом для исследования подоцитов, существуют ограничения, такие как отсутствие экспрессии маркеров, дедифференцированная морфология и неспособность формировать отростки стопы15,16.

Дифференцировка подоцитов от соматических клеток, полученных от пациента, позволяет генерировать и сравнивать больные подоциты со здоровыми контрольными клетками ex vivo. Это позволяет изучать повреждение подоцитов из-за мутаций в специфических для подоцитов генах. Кроме того, работа с ИПСК имеет потенциал для создания трехмерных моделей заболеваний клеточных культур, или, скорее, органоидов43,44. Совместное культивирование подоцитов, полученных из hiPSC, с другими клубочковыми клетками, такими как клубочковые эндотелиальные клетки или мезангиальные клетки, может привести к новому пониманию межклеточной коммуникации в здоровье и клубочковых заболеваниях.

Кроме того, характеристика и лечение специфических для пациента подоцитов могут быть выполнены ex vivo в высокопроизводительном анализе. Индивидуальный подход открывает возможность исследовать новые терапевтические мишени для конкретных мутаций и выполнять индивидуализированную медицину в будущем.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Эта работа была профинансирована Междисциплинарным центром клинических исследований (IZKF) Университета Фридриха-Александра в Эрлангене-Нюрнберге с номером гранта M4-IZKF-F009, предоставленным Янине Мюллер-Дейле, и Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) под названием проекта STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treatment FSGS, грант No 01GM2202D, предоставленный Янине Мюллер-Дейле. Мы благодарим Анналену Краус за поддержку в создании снимков SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm sterile filter Rotilab P668.1 for sterilization of differentiation medium
all-trans retinoic acid Stem Cell Technologies 72262 supplement for differentiation
B27 supplement (50 x), serum free Gibco 17504044 supplement for serum-free differentiation medium
BG iMatrix-511 Silk biogems RL511S additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Bovine serum albumin (BSA)  Roth 8076.4
CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL Greiner bio-one 82050-856 cell culture plastics suitable for fibroblast culture
CHIR99021 (5 mg) Sigma-Aldrich 252917-06-9  supplement for differentiation
Corning Matrigel hESC qualified matrix  Corning 354277 additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix)
countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283 to count cells
countess II FL  Automated Cell Counter Invitrogen to count cells
cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white Sarstedt 72380 cryovials for freezing of cells
dimethyl sulfoxide (DMSO)  Roth A994.1 for fibroblast freezing medium
DMEM/F12 (1:1) (1 x) Gibco 11320074 basic medium for differentiation
DMEM/F12 + Glutamax Gibco 10565018 basic medium for fibroblast medium
EVOS M5000 Imaging System Thermo Fisher Scientific AMF5000 phase contrast microscope
fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) PAN Biotech P301902 serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium
fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile Fisherbrand FB104 cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap)
fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI Invitrogen 00-4959-52 mounting medium containing dapi
gauge needle (0.6 x 30 mm) BD Microlance3 300700 for separation of hiPSC colonies into small pieces
human Recombinant Activin A Protein 78001.1 Stem cell technologies supplement for differentiation
human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) Peprotech 120-03P supplement for differentiation
human VEGF-165 Recombinant Protein Thermo Scientific PHC9394 supplement for differentiation
insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) Gibco 41400045 supplement for podocyte maintenance medium
LB medium Roth X964.1 for sterility test of hiPSC culture
lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma Aldrich MP0035-1KT commercial mycoplasma detection kit
microscope slides Diagonal GmbH & Co.KG 21,102
microtube 1.5 mL  Sarstedt 72706400
mTeSR1 Complete Kit Stem Cell Technologies 85850 basic medium for serum-free hiPSC culture medium
nalgene freezing container Mr.Frosty Roth AC96.1  to ensure optimal freezing conditions
normal goat serum abcam ab 7481 for preincubation solution and antibody diluent
nunc 24 well plates Thermo Scientific 142485 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 48 well plates  Thermo Scientific 152640 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 6 well plates  Thermo Scientific 140685 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc EasYDish Dishes 100 mm Thermo Scientific 150466 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 167008 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nutriFreez D10 Cryopreservation Medium Sartorius 05-713-1E  serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells
Opti-MEM Gibco 11058021 electroporation medium 
pCXLE-hMLN Addgene #27079 plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hOCT3/4 plasmid Addgene #27077 plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hSK plasmid Addgene #27078 plasmid for episomal reprogramming
penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100ML to avoid bacterial contamination
plastic coverslips Sarstedt   83.1840.002 for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes
ROTI Histofix Roth P087.3 commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells
RPMI 1640 + L-Glutamine Gibco 21875034 basic medium for podocyte maintenance medium
staining chamber StainTray Black lid Roth HA51.1
stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501 enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs
sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) Gibco 14190094 used for washing and coating
sterile water Roth T1432
syringe without needle 20 mL BD Plastipak 300629 to filter sterilize differentiation medium
TC dish 100 mm Sarstedt 8,33,902 sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture
TC dish 35 mm Sarstedt 8,33,900 sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy
triton X 100 Roth 3051.3 for preincubation solution 
trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter Invitrogen T10282 to count cells
trypsin-EDTA (10 x)  Biowest X0930-100 dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells
tube 15 mL Greiner bio-one 188271-N
tube 50 mL Greiner bio-one 227261
vitronectin ACF Sartorius 05-754-0002 extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Y-27632 dihydrochloride (10 mg) Tocris 1254 to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting
Primary antibodies
OCT4  Stem Cell Technologies 60093.1 pluripotency marker, dilution 1:200
SSEA-4 Stem Cell Technologies 60062FI.1 pluripotency marker, dilution 1:100
Ki67 Abcam ab15580 proliferation marker, dilution 1:300
synaptopodin Proteintech 21064-1-AP podocyte-specific marker, dilution 1:200
nephrin Progen GP-N2 podocyte-specific marker, dilution 1:25
podocin proteintech 20384-1-AP podocyte-specific marker, dilution 1:100
Secondary antibodies
goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21435 secondary anditbody, dilution 1:1000
alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed Invitrogen A31634 secondary anditbody, dilution 1:1000
donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21422 secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 secondary anditbody, dilution 1:1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
  2. Grgic, I., et al. Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).
  3. Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub. Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).
  4. Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. Structural determinants of glomerular permeability. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).
  5. Schell, C., Huber, T. B. The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).
  6. Muller-Deile, J., Schiffer, M. Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out. Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).
  7. Boehlke, C., et al. Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement. American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).
  8. Schiffer, M., et al. Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models. Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).
  9. Kopp, J. B., et al. Podocytopathies. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68 (2020).
  10. Wiggins, R. C. The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases. Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).
  11. Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
  12. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).
  13. Saleem, M. A., et al. A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).
  14. Eto, N., et al. Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression. Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).
  15. Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).
  16. Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).
  17. Shih, N. Y., et al. CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain. The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).
  18. Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).
  19. Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. Dipping your feet in the water: podocytes in urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).
  20. Camici, M. Urinary detection of podocyte injury. Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).
  21. Muller-Deile, J., et al. Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 3621 (2018).
  22. Schenk, H., et al. Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb. Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).
  23. Petermann, A., Floege, J. Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity. Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).
  24. Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).
  25. Petermann, A. T., et al. Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable. Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).
  26. Sakairi, T., et al. Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).
  27. Rauch, C., et al. Differentiation of human iPSCs into functional podocytes. PLoS One. 13 (9), e0203869 (2018).
  28. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
  29. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  30. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  31. Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell. Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).
  32. Bang, J. S., et al. Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts. Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).
  33. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  34. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
  35. Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299 (2020).
  36. Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).
  37. Hoffding, M. K., Hyttel, P. Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).
  38. Bharathan, S. P., et al. Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells. Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).
  39. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
  40. Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
  41. Vaz, I. M., et al. Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming. Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147 (2021).
  42. Reiser, J., Altintas, M. M. Podocytes. F1000Research. 5, 114 (2016).
  43. Ohmori, T., et al. Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells. Scientific Reports. 11 (1), 3982 (2021).
  44. Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).

Tags

Биология выпуск 195
Генерация подоцитов, полученных от пациента, из биопсии кожи
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rose, V., Müller-Deile, J.… More

Rose, V., Müller-Deile, J. Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies. J. Vis. Exp. (195), e65364, doi:10.3791/65364 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter