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Biology

Generazione di podociti derivati dal paziente da biopsie cutanee

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65364
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Nephrology and Hypertension, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University (FAU) Erlangen-Nürnberg, 2Research Center on Rare Kidney Diseases (RECORD), University Hospital Erlangen

Summary

Questo manoscritto descrive un protocollo in due fasi per generare podociti specifici del paziente dai fibroblasti dermici attraverso la riprogrammazione episomiale in cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) e la successiva differenziazione in podociti.

Abstract

I podociti sono cellule epiteliali situate sul sito urinario della barriera di filtrazione glomerulare che contribuiscono alla funzione di filtro selettivo del glomerulo. Le mutazioni nei geni podocita specifici possono causare glomerulosclerosi focale segmentale (FSGS) e i podociti sono colpiti anche in molte altre nefropatie primarie e secondarie. A causa della loro natura differenziata, i modelli di coltura cellulare primaria sono limitati per i podociti. Pertanto, vengono utilizzate comunemente cellule condizionatamente immortalate. Tuttavia, questi podociti condizionatamente immortalizzati (ciPodocytes) hanno diverse limitazioni: le cellule possono dedifferenziarsi in coltura, specialmente quando raggiungono la confluenza, e diversi marcatori specifici del podocita sono solo leggermente o non espressi affatto. Ciò mette in discussione l'uso dei ciPodociti e la loro applicabilità per la portata fisiologica, fisiopatologica e clinica. Qui, descriviamo un protocollo per la generazione di podociti umani, inclusi podociti specifici del paziente, da una biopsia cutanea mediante riprogrammazione episomiale dei fibroblasti dermici in hiPSC e successiva differenziazione in podociti. Questi podociti assomigliano molto meglio ai podociti in vivo in termini di caratteristiche morfologiche, come lo sviluppo dei processi del piede e l'espressione del marcatore specifico del podocita. Infine, ma ancora meno importante, queste cellule mantengono le mutazioni dei pazienti, risultando in un modello ex vivo migliorato per studiare le malattie dei podociti e le potenziali sostanze terapeutiche in un approccio individualizzato.

Introduction

I podociti sono cellule epiteliali renali post-mitotiche specializzate che formano la barriera di filtrazione glomerulare del rene insieme alla membrana basale glomerulare (GBM), alle cellule endoteliali glomerulari e al glicocalice. Fenotipicamente, i podociti sono costituiti da un corpo cellulare e da estensioni primarie della membrana guidate da microtubuli, nonché estensioni secondarie chiamate processi del piede 1,2. La barriera di filtrazione glomerulare che filtra l'urina dal sangue è costruita con endotelio fenestrato, GBM e un tipo specializzato di giunzione intercellulare che collega i processi del piede podocita vicini, chiamato diaframma a fessura dei podoctyes3. In condizioni di salute, le proteine più grandi dell'albumina vengono trattenute dalla barriera di filtrazione a causa delle loro dimensioni e carica4.

È noto che le mutazioni nei geni citoscheletrici o podociti specifici, così come i fattori circolanti che influenzano le vie di segnalazione dei podociti, inducono effacement, distacco o apoptosi del podocita con conseguente proteinuria e sclerosi glomerulare. In particolare, il riarrangiamento citoscheletrico, i cambiamenti nella polarità del podocita o il danneggiamento dei processi del piede con una perdita associata delle giunzioni a fessura sono fondamentali5. A causa del loro stato terminale differenziato, i podociti difficilmente possono essere sostituiti dopo il distacco del GBM. Tuttavia, se i podociti sono attaccati al GBM, possono ancora recuperare dall'effacement e riformare i processi interdigitati del piede 6,7,8. Un'ulteriore comprensione degli eventi che portano al danno da podocita in vari disturbi glomerulari può fornire nuovi obiettivi terapeutici che aiuteranno a sviluppare trattamenti per queste malattie. Il danno da podocita è un segno distintivo di diverse malattie glomerulari, tra cui la glomerulosclerosi focale segmentale (FSGS), la nefropatia diabetica, la malattia a cambiamento minimo e la glomerulonefropatia membranosa, che richiedono modelli affidabili di podocita ex vivo per studiare i meccanismi patologici e i potenziali approcci terapeutici per queste malattie 9,10. I podociti possono essere studiati ex vivo mediante coltura cellulare primaria classica basata sull'isolamento dei glomeruli mediante setacciatura differenziale11. Tuttavia, a causa dello stato terminalmente differenziato con limitata capacità di proliferazione, la maggior parte dei ricercatori utilizza linee cellulari di ciPodociti di topo o umani che esprimono varianti sensibili alla temperatura del grande antigene T SV40. In alternativa, i ciPodociti sono isolati da topi transgenici che ospitano il gene immortale SV40 Tag 1,12.

I cipotociti proliferano a 33 °C, ma entrano in arresto della crescita e iniziano a differenziarsi a 37 °C13,14. Va tenuto presente che i dati sperimentali ottenuti con queste cellule devono essere interpretati con una certa cautela, poiché le cellule sono generate utilizzando un'inserzione genica innaturale15. Poiché queste cellule ospitano un gene immortale, la fisiologia cellulare è alterata a causa della proliferazione in corso12. Le linee cellulari di podocite generate da questo approccio sono state recentemente messe in discussione, poiché i ciPodociti di topo, uomo e ratto esprimono meno del 5% di sinaptopodina e nefrrina a livello proteico, così come NPHS1 e NPHS2 a livello di mRNA rispetto all'espressione glomerulare16. Inoltre, la maggior parte delle linee cellulari di podocita non esprime nefrrina17,18. Chittiprol et al. hanno anche descritto una differenza significativa nella motilità cellulare e nelle risposte alla puromicina e alla doxorubicina nei ciPodocytes16. I podociti possono essere trovati nelle urine dopo il distacco dal GBM in diverse malattie glomerulari 19,20,21,22. I podociti urinari vitali possono essere coltivati ex vivo per un massimo di 2-3 settimane, ma la maggior parte delle cellule subisce l'apoptosi23,24. È interessante notare che i podociti non si trovano solo nelle urine di pazienti con malattia glomerulare ma anche nelle urine di soggetti sani, molto probabilmente quando sono senescenti, di nuovo con un limitato potenziale di replicazione in coltura24. Inoltre, il numero di podociti di derivazione urinaria è limitato e le cellule si dedifferenziano in coltura, mostrano meno processi del piede, cambiano morfologia e, soprattutto, hanno una capacità di proliferazione limitata. L'espressione dei geni podocit-specifici è assente, scompare entro poche settimane o varia tra questi cloni cellulari. Alcune cellule positive per il marcatore podocita specifico hanno co-espresso il marker di cellule epiteliali tubulari o miofibroblasti e cellule mesangiali, il che suggerisce la dedifferenziazione e/o la transdifferenziazione dei podociti urinari in coltura24,25.

Recentemente, è stata descritta la generazione di linee cellulari di ciPodociti derivate dall'urina di pazienti e volontari sani mediante trasduzione con un antigene T di grandi dimensioni SV40 termosensibile e hTERT26. È stata rilevata l'espressione di mRNA per sinaptopodina, nestina e proteina associata a CD2, ma l'mRNA della podocina era assente in tutti i cloni. Oltre ai problemi con i podociti urinari, queste cellule contengono anche il gene immortalizzante inserito, con conseguenti svantaggi discussi sopra.

Al contrario, le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) hanno un'enorme capacità di auto-rinnovarsi e differenziarsi in più tipi di cellule in condizioni appropriate. È stato dimostrato in precedenza che le hiPSC possono servire come fonte quasi illimitata di podociti27,28.

Qui viene descritto un protocollo in due fasi per generare podociti specifici per il paziente da fibroblasti dermici di biopsie cutanee con successiva riprogrammazione episomiale in hiPSC e una differenziazione finale in podociti derivati da hiPSC (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Protocollo per generare podociti derivati dall'hiPSC specifici per il paziente. Panoramica grafica del protocollo per generare podociti paziente-specifici da fibroblasti dermici di una biopsia cutanea mediante riprogrammazione in hiPSCs e differenziazione in podociti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Come primo passo, i fibroblasti dermici somatici sono stati superati da una biopsia cutanea e riprogrammati in hiPSCs utilizzando un metodo privo di integrazione mediante elettroporazione con plasmidi che esprimono i fattori di trascrizione OCT3/4, KLF4, SOX2 e c-MYC 29,30,31. Le colonie di hiPSC emergenti sono state successivamente selezionate ed ampliate. La differenziazione è iniziata con l'induzione della linea mesodermica mediante l'attivazione della via di segnalazione WNT, seguita dalla generazione di cellule progenitrici del nefrone che erano ancora in grado di proliferare. Infine, le cellule sono state differenziate in podociti. In questa procedura, abbiamo modificato e combinato protocolli precedentemente pubblicati per la riprogrammazione episomiale per la generazione di hiPSCs da Bang et al.32 e Okita et al.33, così come un protocollo per la differenziazione di hiPSCs in podociti di Musah et al.28,34,35.

Infatti, i podociti generati dal nostro protocollo avevano un fenotipo più vicino ai podociti in vivo, per quanto riguarda lo sviluppo di una rete distinta di processi primari e secondari del piede e l'espressione di marcatori podocita specifici, come sinaptopodina, podocina e nefrina. Con l'uso di podociti derivati da hiPSC, il background genetico del paziente viene mantenuto durante la riprogrammazione e la differenziazione. Ciò consente la modellizzazione della malattia podocita specifica del paziente e la scoperta di potenziali sostanze terapeutiche ex vivo in un numero di cellule quasi illimitato. Inoltre, questo protocollo è minimamente invasivo, economico, eticamente accettabile e può facilitare nuove strade per lo sviluppo di farmaci.

Protocol

Il protocollo è stato approvato dal comitato etico dell'Università Friedrich-Alexander di Erlangen-Norimberga (251_18B) e tutti i pazienti e i probandi hanno dato il consenso scritto. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti. Per la composizione di tutti i supporti e le soluzioni qui utilizzate, vedere la tabella 1.

1. Escrescenza di fibroblasti dermici da una biopsia di pugno cutaneo

  1. Trasferire la biopsia cutanea in un tubo conico sterile da 15 ml con 10 ml di terreno fibroblastico preriscaldato.
  2. Rimuovere il terreno e lavare la biopsia cutanea tre volte con 5 ml di soluzione salina sterile e preriscaldata tampone fosfato (PBS). Trasferire la biopsia cutanea con una pinza sterile su una piastra di coltura cellulare di 10 cm e tagliarla in larghezza in tre o quattro pezzi con un bisturi sterile, lasciando l'epidermide e il derma.
  3. Trasferire ogni pezzo in un piatto di coltura cellulare sterile da 35 mm e premerlo delicatamente sul piatto di coltura. Rimuovere il mezzo in eccesso intorno ai pezzi di biopsia. Lasciare asciugare per 5-10 minuti fino a quando il liquido evapora e la biopsia è attaccata alla plastica della coltura cellulare.
  4. Aggiungere 1 mL di fibroblasto medio a goccia con una pipetta da 1.000 μL intorno alla biopsia e riempire accuratamente fino a un volume finale di 3 ml. Coltivare a 37 °C, 5% CO2 per 7 giorni senza nutrire e spostare il piatto. Cambiare con attenzione il mezzo in terreno di fibroblasti fresco e preriscaldato. Dopo 7 giorni, i fibroblasti simili a fusi possono essere monitorati intorno alla biopsia cutanea utilizzando un microscopio a contrasto di fase36.
    NOTA: Quando i fibroblasti troppo cresciuti raggiungono il bordo del piatto, procedere nuovamente dal punto 1.3 per generare un altro lotto di fibroblasti.
  5. Per l'espansione dei fibroblasti superati, lavare con 2 mL di 1x PBS preriscaldato, dissociare i fibroblasti con 1 mL di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare per 5 minuti a 37 °C, 5% CO2. Trasferire le cellule staccate in un tubo conico da 15 mL e lavare il piatto di coltura cellulare con 2 mL di terreno di fibroblasti fresco preriscaldato.
  6. Mettere il mezzo di lavaggio nel tubo per neutralizzare l'agente di dissociazione e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 20 °C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1 mL di terreno fibroblastico fresco e preriscaldato. Contare le cellule con una camera Neubauer o un contatore automatico di cellule usando il blu di tripano e seme 2,5 x 10da 3 a 5 x 103 fibroblasti per cm2 in palloni di coltura cellulare fresca.
  7. Riporre i palloni nell'incubatrice e distribuire uniformemente le celle spostando i palloni tre volte in ciascuna direzione. Il giorno successivo, sostituire il terreno con un terreno di fibroblasti fresco e preriscaldato. Cambiare il terreno due volte a settimana e dividere quando i fibroblasti raggiungono circa l'80% di confluenza.

2. Congelamento dei fibroblasti dermici

  1. Per congelare i fibroblasti, lavarli con 5 ml di 1x PBS preriscaldato. Aspirare il PBS e dissociare i fibroblasti con 4 ml di 1x tripsina-EDTA. Riporre il matraccio nell'incubatrice e incubare per 5-7 minuti a 37 °C al 5% di CO2. Monitorare il distacco utilizzando un microscopio a contrasto di fase e picchiettare contro il lato del pallone per staccare le cellule.
  2. Trasferire le cellule staccate in un tubo conico da 15 ml. Lavare il matraccio di coltura cellulare con 5 ml di terreno fresco preriscaldato per fibroblasti. Mettere in ghiaccio il mezzo di lavaggio nel tubo conico e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 20 °C.
  3. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 2 ml di terreno fibroblastico fresco e preriscaldato. Contare le celle e trasferire 1 x 106 celle in un nuovo tubo conico. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 20 °C.
  4. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1 ml di terreno di congelamento freddo per fibroblasti costituito per il 90% da siero fetale per vitelli e per il 10% da dimetilsolfossido (DMSO). Trasferire in un crioviale, porre in un contenitore frigorifero e congelare per una notte a -80 °C. Per la conservazione a lungo termine, posizionare il crioviale in un serbatoio di azoto liquido il giorno successivo.

3. Riprogrammazione episomiale dei fibroblasti per generare hiPSCs

  1. Per la riprogrammazione episomiale, utilizzare 1,5 x 106 fibroblasti dal passaggio 4 all'8. Per raggiungere questo numero di cellule, utilizzare da due a tre palloni da 250 ml con una confluenza di circa il 70%.
  2. Il giorno prima della riprogrammazione, dividere i fibroblasti in un rapporto 1: 2 per garantire il loro stato proliferativo. Pertanto, aspirare il mezzo e lavare i palloni con 5 ml di 1x PBS preriscaldato per pallone. Aspirare il PBS e dissociare i fibroblasti con 4 ml di 1x tripsina-EDTA. Riporre i palloni nell'incubatrice e incubare per 5-7 minuti a 37 °C e al 5% di CO2. Monitorare il distacco utilizzando un microscopio a contrasto di fase e picchiettare contro il lato del pallone per staccare le cellule dalla superficie plastica.
  3. Trasferire le cellule distaccate in un tubo conico da 50 mL e lavare i palloni di coltura cellulare con 5 mL di terreno fresco preriscaldato per fibroblasti. Mettere in ghiaccio il mezzo di lavaggio nel tubo conico e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 20 °C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 6 ml di terreno fibroblastico fresco e preriscaldato.
  4. Preparare sei nuovi palloni di coltura cellulare aggiungendo 5 ml di terreno fresco di fibroblasti preriscaldato per pallone. Aggiungere 1 mL di sospensione di cellule di fibroblasti a ciascun pallone. Riporre i palloni nell'incubatrice e distribuire uniformemente le celle spostando i palloni tre volte in ciascuna direzione.
  5. Per la riprogrammazione episomiale, rivestire due piastre di coltura cellulare da 10 cm adatte alla coltura hiPSC con 4 ml di soluzione di rivestimento a freddo per piastra. Incubare le piastre per 1 h a 37 °C.
    NOTA: Per la coltura di hiPSC, sono necessarie diverse plastiche di coltura cellulare e un rivestimento aggiuntivo della matrice extracellulare (vedere Tabella dei materiali).
  6. Rimuovere il terreno dai fibroblasti e lavare con 10 ml di 1x PBS preriscaldato per pallone. Aspirare il PBS e dissociare i fibroblasti con 4 mL di 1x tripsina-EDTA per matraccio incubando per 5-7 minuti a 37 °C. Monitorare il distacco utilizzando un microscopio a contrasto di fase e, se necessario, picchiettare contro il lato del pallone per staccare le cellule dalla superficie plastica.
  7. Trasferire le cellule staccate in un tubo conico da 50 ml. Lavare i palloni vuoti con 6 ml di terreno fibroblastico preriscaldato per raccogliere le cellule rimanenti e raggruppare nel tubo conico. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 20 °C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 ml di PBS fresco e preriscaldato 1x.
  8. Contare le cellule e trasferire 1,5 x 106 fibroblasti in un nuovo tubo conico. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 20 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di mezzo di elettroporazione e centrifugare nuovamente. Nel frattempo, aspirare la soluzione di rivestimento dalle piastre di coltura cellulare rivestite da 10 cm e aggiungere 7 ml di terreno di fibroblasti preriscaldato.
  9. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo di elettroporazione con una concentrazione di 1,5 x 106 celle in 250 μL. Trasferire la sospensione della cella da 250 μL in una cuvetta di elettroporazione con una distanza di 4 mm (vedere Tabella dei materiali).
  10. Preparare una miscela di trasfezione plasmidica aggiungendo 4 μg di ciascun plasmide (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) a un volume totale di 50 μL di mezzo di elettroporazione. Trasferire nella cuvetta e mescolare sfiorando delicatamente. Elettroporate con un impulso a 280 V.
  11. Tagliare la punta di una pipetta con forbici sterili e trasferire 125 μL dei fibroblasti elettroporati a ciascuna delle piastre di coltura cellulare da 10 cm preparate. Distribuire le cellule agitando le piastre tre volte in tutte le direzioni e rimetterle nell'incubatore. Incubare per una notte a 37 °C con il 5% di CO2 senza disturbi.
  12. Per rimuovere le cellule morte, sostituire il terreno il giorno successivo con 7 ml di terreno di fibroblasti fresco e preriscaldato. Cambiare il terreno di coltura in hiPSC 2 giorni dopo l'elettroporazione e sostituirlo a giorni alterni per i successivi 20 giorni.

4. Selezione, espansione e controllo di qualità delle hiPSC generate

  1. Monitorare le cellule quotidianamente per almeno 20 giorni utilizzando un microscopio a contrasto di fase con un obiettivo 10x o 20x per osservare la formazione di colonie hiPSC dopo l'elettroporazione. Se le colonie hiPSC hanno un diametro di circa 300 μm con bordi distinti e le hiPSC mostrano un elevato rapporto nuclei-corpo, le colonie hiPSC sono pronte per la selezione mediante prelievo (Figura 2B, C e Figura 3).
  2. Prima della raccolta, rivestire una piastra da 96 pozzetti adatta per la coltura hiPSC con 100 μL di soluzione di rivestimento per pozzetto e incubare per 1 ora a 37 °C. Durante l'incubazione, contrassegnare le colonie di interesse sul fondo del piatto di coltura cellulare con una penna. Per la preparazione finale della piastra a 96 pozzetti, rimuovere la soluzione di rivestimento e aggiungere 100 μL di terreno di coltura hiPSC preriscaldato contenente 10 μM di inibitore ROCK Y27632 a ciascun pozzetto.
  3. Lavare le cellule con 1x PBS preriscaldato e aggiungere terreno di coltura hiPSC fresco e preriscaldato contenente 10 μM di inibitore ROCK Y27632 prima di prelevare per rimuovere le cellule morte. Per scegliere le colonie hiPSC, utilizzare un ago di misurazione e dividere le colonie hiPSC in piccoli pezzi disegnando una griglia in ciascuna colonia.
  4. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase, verificare che le colonie siano divise correttamente in pezzi. Trasferirli con una pipetta da 100 μL sulla piastra da 96 pozzetti preparata. Tenere la pipetta in posizione verticale sopra la colonia senza toccare le cellule per evitare graffi e perdita della colonia.
  5. Posizionare la piastra a 96 pozzetti nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 e lasciare che le cellule si attacchino durante la notte senza disturbi. Conservare i piatti con la miscela di fibroblasti e hiPSC, nel caso in cui la raccolta non abbia successo. Pertanto, rimuovere l'inibitore ROCK Y27632 cambiando il terreno di coltura in hiPSC e riposizionare le piastre nell'incubatore.
  6. Il giorno successivo, cambiare il terreno della piastra da 96 pozzetti con 200 μL di terreno di coltura fresco di hiPSC e cambiarlo a giorni alterni. Monitorare la piastra da 96 pozzetti il giorno successivo e contrassegnare i pozzetti con cloni scelti con successo.
    NOTA: Se i cloni hiPSC raccolti non sono completamente selezionati dopo il primo tentativo e i fibroblasti possono essere trovati nel pozzetto, ripetere la raccolta dal pozzetto 96 o raschiare i fibroblasti dalla piastra.

5. Espansione di cloni hiPSC selezionati

  1. Monitorare i cloni hiPSC utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Se le hiPSC selezionate raggiungono circa il 70% di confluenza, i cloni hiPSC sono pronti per l'espansione.
  2. Rivestire una piastra da 48 pozzetti adatta per la coltura hiPSC con 250 μL di soluzione di rivestimento per pozzetto per 1 ora a 37 °C. Sostituire la soluzione di rivestimento con 200 μL di terreno di coltura hiPSC fresco preriscaldato contenente 10 μM di inibitore ROCK Y27632.
  3. Per staccare gli hiPSC dalla piastra a 96 pozzetti, raschiare la superficie di plastica con una punta per pipetta da 1.000 μL. Trasferire gli hiPSC staccati dalla piastra a 96 pozzetti a una piastra a 48 pozzetti. Cambiare il terreno il giorno successivo con terreno di coltura hiPSC fresco e preriscaldato per rimuovere le cellule morte e l'inibitore ROCK Y27632.
  4. Se i cloni hiPSC raggiungono circa il 70% di confluenza, trasferire gli hiPSC in una piastra a 24 pozzetti. Pertanto, rivestire una piastra da 24 pozzetti adatta per la coltura di hiPSC con 400 μL di soluzione di rivestimento per pozzetto per 1 ora a 37 °C. Sostituire la soluzione di rivestimento con 400 μL di terreno di coltura hiPSC fresco preriscaldato contenente 10 μM di inibitore ROCK Y27632. Aspirare il mezzo dai 48 pozzetti e lavare con 500 μL di 1x PBS preriscaldato.
  5. Sostituire il PBS con 100 μL di soluzione enzimatica di distacco cellulare contenente 10 μM di inibitore ROCK Y27632 e incubare a 37 °C per 4 minuti. Risciacquare gli hiPSC dalla piastra con una pipetta da 1.000 μL. Trasferire le cellule dissociate in un tubo conico da 15 ml. Lavare la piastra vuota a 48 pozzetti con terreno di coltura hiPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK Y27632 e raggruppare nel tubo conico.
  6. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 20 °C. Aspirare il surnatante e risospendere le hiPSC in 1 mL di terreno di coltura hiPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK Y27632 e trasferirle in una piastra da 24 pozzetti. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C al 5% di CO2 e distribuire le celle agitando la piastra tre volte in tutte le direzioni. Lascia che le cellule si attacchino durante la notte senza disturbi.
  7. Il giorno successivo, cambiare il terreno di coltura in hiPSC senza inibitore ROCK Y27632.
    NOTA: se i cloni hiPSC raggiungono circa il 70% di confluenza, trasferire gli hiPSC su una piastra a 12 pozzetti ripetendo i passaggi da 5,4 a 5,7 con volumi aumentati adatti a un formato a 12 pozzetti. Se gli hiPSC della piastra a 12 pozzetti raggiungono circa il 70% di confluenza, trasferire i cloni hiPSC su una piastra a 6 pozzetti con volumi aumentati per un formato a 6 pozzetti.

6. Congelamento di cloni hiPSC selezionati

  1. Per congelare i cloni hiPSC selezionati, aspirare il mezzo da una piastra a 6 pozzetti. Lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS. Aspirare e dissociare le hiPSCs con 1 mL di soluzione enzimatica di distacco cellulare contenente 10 μM Y27632. Riporre la piastra nell'incubatore e incubare per 4 minuti a 37 °C e al 5% di CO2.
  2. Risciacquare gli hiPSC dalla piastra con una pipetta da 1.000 μL e trasferire le cellule staccate in un tubo conico da 15 ml. Lavare la piastra con 2 ml di terreno di coltura hiPSC fresco e preriscaldato contenente 10 μM di inibitore ROCK Y27632. Immergersi nel tubo conico e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 20 °C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 2 ml di terreno di coltura hiPSC fresco e preriscaldato contenente 10 μM di inibitore ROCK Y27632.
  3. Contare le celle e trasferire 1 x 106 celle in un nuovo tubo conico. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 20 °C. Aspirare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo di congelamento hiPSC freddo e privo di siero e congelare in un crioviale utilizzando un contenitore di congelamento per una notte a -80 °C. Per la conservazione a lungo termine, posizionare il crioviale in un serbatoio di azoto liquido il giorno successivo.

7. Controllo qualità HiPSC

  1. Caratterizzazione della morfologia hiPSC
    1. Controllare la caratteristica morfologia hiPSC utilizzando un microscopio a contrasto di fase con un obiettivo 20x. Dopo la riprogrammazione, la morfologia cellulare cambia da fibroblasti lunghi simili a fusi a piccole hiPSC rotonde, presentando un elevato rapporto nuclei-corpo che cresce in colonie con bordi distinti (Figura 2C).
    2. Se le colonie di hiPSC diventano troppo dense e si verifica una differenziazione spontanea, raschiare le parti differenziate dalla piastra usando una punta di pipetta (Figura 3). Poiché le hiPSC hanno un alto tasso di proliferazione, nutrire le colture hiPSC ogni giorno con un mezzo di alimentazione hiPSC fresco e preriscaldato.
  2. Caratterizzazione di marcatori di pluripotenza mediante colorazione con immunofluorescenza
    1. Per verificare la presenza di marcatori di pluripotenza nelle hiPSC generate tramite colorazione a immunofluorescenza, posizionare i vetrini di plastica in una piastra a 24 pozzetti e rivestire con 250 μL di soluzione di rivestimento per 1 ora a 37 °C e 5% di CO2. Sostituire la soluzione di rivestimento con 1 mL di terreno di coltura hiPSC preriscaldato contenente 10 μM di inibitore ROCK Y27632.
    2. Seme 1,9 x 104 hiPSC dissociati per 24-pozzetto. Lasciare che gli hiPSC si attacchino per una notte a 37 °C e al 5% di CO2 senza disturbo. Vedere i punti da 5.4 a 5.6 per la dissociazione delle hiPSC. Sostituire il terreno il giorno successivo con terreno di coltura hiPSC senza inibitore ROCK Y27632.
    3. Per la colorazione, lavare le cellule con 1 mL di 1x PBS preriscaldato e successivamente fissare gli hiPSC con paraformaldeide al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare le hiPSC fisse con 1x PBS e bloccare i siti di legame non specifici con 200 μL di soluzione di preincubazione per pozzetto per 1 ora a temperatura ambiente. Diluire gli anticorpi primari Ki67 (1:300), OCT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) nel diluente anticorpale.
    4. Pulire un foglio di plastica con etanolo al 70% e metterlo in una camera di colorazione riempita con un serbatoio d'acqua. Posizionare le goccioline di 30 μL di diluizioni di anticorpi primari sulla lamina. Porre i campioni fissi capovolti nella diluizione e incubare per una notte a 4 °C.
    5. Il giorno successivo, lavare i campioni tre volte con 1x PBS per 5 minuti e posizionare 30 μL di goccioline di diluizioni anticorpali secondarie (1:1.000) su punti puliti sulla pellicola. Posizionare i vetrini del coperchio capovolti nella diluizione. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
    6. Dopo l'incubazione, lavare tre volte con 1x PBS per 5 minuti. Montare i campioni su vetrini nel supporto di montaggio contenente DAPI. Lasciare asciugare per una notte a temperatura ambiente e al buio e visualizzare i campioni utilizzando un microscopio confocale (Figura 4).
  3. Esclusione della contaminazione da batteri e micoplasma
    1. Per escludere la contaminazione batterica, trasferire 500 μL di hiPSC dissociate a 5 ml di terreno Luria-Bertani (LB) preriscaldato. Vedere i punti da 5.4 a 5.6 per la dissociazione delle hiPSC. Incubare per una notte a 37 °C. Se il mezzo LB appare torbido, è probabile che si sia verificata una contaminazione batterica. Scartare le celle.
    2. Per escludere la contaminazione da micoplasma, raccogliere il terreno che non è stato sostituito per 2 giorni da 6 pozzetti con circa il 90% di hiPSC confluenti. Utilizzare la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) per rilevare la contaminazione da micoplasma. A tale scopo sono disponibili molti kit di rilevamento del micoplasma commerciali.

8. Differenziazione delle hiPSCs in podociti

  1. Preparazione e conservazione dei fattori di crescita
    1. Per preparare una concentrazione madre di 10 mM Y27632, ricostituire 10 mg di Y27632 (peso molecolare di 320,26 g/mol) in 3,12 mL di acqua sterile. Conservare 100 μL di aliquote a -20 °C e diluire 1:1.000 in terreno di coltura cellulare fino a raggiungere una concentrazione finale di 10 μM.
    2. Per preparare una concentrazione madre di 30 mM CHIR99021, ricostituire 5 mg di CHIR99021 (peso molecolare di 465,34 g/mol) in 358,2 μL di DMSO sterile. Conservare 50 μL di aliquote a -20 °C e diluire 1:10.000 in terreno di coltura cellulare per raggiungere una concentrazione finale di 3 μM.
    3. Per preparare una concentrazione stock di 100 μg/mL di activina A, ricostituire 100 μg di activina A in 1 mL di 1x PBS contenente lo 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA). Conservare 100 μL di aliquote a -20 °C e diluire 1:2.000 in terreno di coltura cellulare fino a raggiungere una concentrazione finale di 50 ng/mL.
    4. Per preparare una concentrazione stock di 100 μg/mL di proteina morfogenetica ossea 7 (BMP7), ricostituire 100 μg di BMP7 in 1 mL di acqua sterile contenente lo 0,1% di BSA. Conservare 100 μL di aliquote a -20 °C e diluire 1:2.000 in terreno di coltura cellulare fino a raggiungere una concentrazione finale di 50 ng/mL.
    5. Per preparare una concentrazione di stock di 100 μg/mL di fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), ricostituire 100 μg di VEGF in 1 mL di acqua sterile. Conservare 100 μL di aliquote a -20 °C e diluire 1:4.000 in terreno di coltura cellulare fino a raggiungere una concentrazione finale di 25 ng/ml.
    6. Per preparare una concentrazione stock di 10 mM di acido retinoico all-trans, ricostituire 10 mg di acido retinoico all-trans in 3,33 mL di DMSO sterile. Conservare 100 μL di aliquote a -20 °C e diluire 1:100 in terreno di coltura cellulare fino a raggiungere una concentrazione finale di 0,5 μM.
  2. Attivazione della via di segnalazione WNT per indurre la linea del mesoderma
    1. Per la differenziazione delle hiPSC in podociti derivati dall'hiPSC, rivestire piastre o palloni per colture cellulari adatti per la coltura di hiPSC con soluzione di rivestimento per 1 ora a 37 °C e 5% di CO2. Il volume totale della soluzione di rivestimento è di 1 ml per piastra di coltura a 6 pozzetti o 4 ml per piastra di coltura cellulare da 10 cm.
    2. Aspirare il mezzo e lavare gli hiPSC con 1x PBS preriscaldato. Aspirare il PBS e aggiungere una soluzione enzimatica di distacco cellulare contenente 10 μM di Y27632 ad un volume totale di 1 mL per piastra di coltura a 6 pozzetti o 4 mL per piastra di coltura cellulare da 10 cm.
    3. Riporre la piastra nell'incubatore e incubare per 4 minuti a 37 °C e al 5% di CO2. Risciacquare gli hiPSC dalla piastra con una pipetta da 1.000 μL. Trasferire le celle staccate in un tubo conico.
    4. Lavare la piastra con terreno di coltura hiPSC fresco e preriscaldato contenente 10 μM di inibitore ROCK Y27632. Raggruppare il mezzo di lavaggio nel tubo conico per neutralizzare il reagente di dissociazione. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 20 °C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 2 ml di terreno di coltura hiPSC fresco e preriscaldato contenente 10 μM di inibitore ROCK Y27632.
    5. Contare le cellule e seminare 1 x 104 hiPSCs/cm2. Distribuire le cellule agitando tre volte in tutte le direzioni. Lasciare che gli hiPSC si attacchino per una notte a 37 °C con il 5% di CO2 senza disturbo.
    6. Il giorno successivo, sostituire il terreno con 2 ml di terreno di differenziazione del mesoderma preriscaldato contenente 1x integratore B27, 1% penicillina-streptomicina, 3 μM CHIR99021, 50 ng/mL activina A e 10 μM ROCK inibitore Y27632.
  3. Differenziazione in cellule progenitrici del nefrone
    1. Dopo 2 giorni, cambiare il mezzo del mesoderma a 2 ml di terreno di differenziazione progenitore del nefrone preriscaldato contenente 1x integratore B27, 1% penicillina-streptomicina, 3 μM CHIR99021, 50 ng / mL activina A e 50 ng / mL BMP7 per piastra di coltura a 6 pozzetti o 6 ml per piastra di coltura cellulare da 10 cm. Cambia il mezzo a giorni alterni per i prossimi 14 giorni.
      NOTA: Le cellule progenitrici del nefrone proliferano e possono essere fatte passare e congelare dopo 7 giorni di differenziazione nel mezzo di espansione del progenitore del nefrone.
    2. Per dividere le cellule progenitrici del nefrone, rivestire le plastiche di coltura cellulare adatte alla coltura hiPSC con una soluzione di rivestimento per 1 ora a 37 °C. Sostituire la soluzione di rivestimento con il mezzo di espansione progenitore del nefrone. Aspirare il supporto e lavare le celle con 1x PBS preriscaldato. Rimuovere il PBS e dissociare le cellule con 1x tripsina-EDTA.
    3. Incubare per 5 minuti a 37 °C e 5% di CO2. Monitorare il distacco delle cellule utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Se necessario, picchiettare contro il lato della plastica per staccare le celle dalla superficie. Risciacquare le cellule dalla piastra e trasferirle su un tubo conico. Lavare il matraccio o la piastra vuota con lo stesso volume di mezzo di espansione progenitore del nefrone preriscaldato del reagente di dissociazione.
    4. Raggruppare il mezzo di lavaggio nel tubo conico. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 20 °C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 2 ml di terreno di espansione progenitore del nefrone fresco e preriscaldato. Contare le cellule e seminare 1,5 x 104 cellule progenitrici del nefrone per cm2 per un'ulteriore differenziazione.
      NOTA: Per congelare le cellule progenitrici del nefrone, risospendere 1 x 106 cellule in 1 ml di mezzo di crioconservazione senza siero freddo e trasferirle in un crioviale. Congelare in un contenitore frigorifero a -80 °C per una notte e trasferire in un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
    5. Riposizionare le piastre nell'incubatore e distribuire uniformemente le celle agitando tre volte in tutte le direzioni. Cambiare il terreno il giorno successivo in un mezzo di differenziazione progenitore del nefrone fresco e preriscaldato. Sostituire il terreno a giorni alterni fino a quando le cellule sono differenziate per 14 giorni nel mezzo di differenziazione progenitore del nefrone.
  4. Differenziazione terminale in podociti derivati da hiPSC
    1. Aspirare il terreno e aggiungere 2 ml di terreno di differenziazione podocita preriscaldato contenente 1x integratore di B27, 1% di penicillina-streptomicina, 3 μM CHIR99021, 50 ng/mL di activina A, 50 ng/mL BMP7, 25 ng/μL VEGF e 0,5 μM di acido retinoico all-trans per piastra di coltura a 6 pozzetti o 6 mL per piastra di coltura cellulare da 10 cm. Riporre le piastre nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2. Cambiare il terreno a giorni alterni per 4 giorni con un mezzo di differenziazione dei podociti fresco e preriscaldato.
    2. Per mantenere i podociti hiPSC in coltura dopo la differenziazione, nutrire le cellule due volte alla settimana con terreno di mantenimento podocita contenente il 10% di siero fetale di vitello, l'1% di penicillina-streptomicina e lo 0,1% di insulina-transferrina-selenio.
      NOTA: I podociti hiPSC differenziati terminali non proliferano più. Tuttavia, è possibile tenerli in coltura cellulare per un massimo di 4 settimane.
  5. Scongelamento ed espansione delle cellule progenitrici del nefrone congelate
    1. Rivestire un nuovo pallone di plastica per coltura cellulare adatto per coltura hiPSC con soluzione di rivestimento per 1 h a 37 °C e 5% di CO2. Sostituire la soluzione di rivestimento con 5 ml di mezzo di espansione progenitore del nefrone.
    2. Preparare un tubo conico da 15 mL con 7 mL di mezzo di espansione progenitore del nefrone preriscaldato. Scongelare le celle congelate a 37 °C a bagnomaria senza movimento per circa 20 s. Togliere il crioviale dal bagno d'acqua quando metà delle cellule sono scongelate e rimane del ghiaccio.
    3. Spruzzare il crioviale con etanolo al 70% e metterlo in un armadio di biosicurezza. Trasferire le cellule scongelate nel tubo conico con il mezzo di espansione progenitore del nefrone preriscaldato. Utilizzare una pipetta da 1.000 μL e lasciare che le cellule scorrano lungo la parete del tubo molto lentamente.
    4. Lavare il crioviale vuoto con 1 mL di mezzo di espansione progenitore del nefrone per raccogliere le cellule rimanenti e raggrupparsi nel tubo conico. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 20 °C e risospendere il pellet cellulare in un mezzo di dilatazione progenitore del nefrone fresco e preriscaldato.
    5. Trasferire le cellule scongelate nel pallone rivestito e cambiare il terreno il giorno successivo in un mezzo di espansione progenitore del nefrone fresco e preriscaldato. Prima di un'ulteriore differenziazione, lasciare che le cellule proliferino nel mezzo di espansione progenitore del nefrone cambiando il terreno a giorni alterni e procedere dal punto 8.3.5.

9. Caratterizzazione di podociti derivati da hiPSC mediante colorazione con immunofluorescenza

  1. Per controllare i podociti differenziati per il marcatore podocita specifico tramite colorazione a immunofluorescenza, posizionare i vetrini di plastica in una piastra a 24 pozzetti e rivestire con 250 μL di soluzione di rivestimento per 1 ora a 37 °C e 5% di CO2. Sostituire la soluzione di rivestimento con 1 ml di mezzo di espansione progenitore del nefrone preriscaldato. Seme 2,5 x 104 cellule progenitrici del nefrone dissociate per piastra a 24 pozzetti. Vedere i punti da 8.3.2 a 8.3.4 per la dissociazione delle cellule progenitrici del nefrone.
  2. Lasciare che le cellule si attacchino durante la notte a 37 °C e al 5% di CO2 senza disturbo. Sostituire il terreno il giorno successivo con un mezzo di differenziazione progenitore del nefrone preriscaldato.
  3. Completare la differenziazione cambiando il terreno a giorni alterni fino a quando le cellule sono differenziate per un totale di 14 giorni nel mezzo di differenziazione dei progenitori nefroni e altri 5 giorni nel mezzo di differenziazione dei podociti.
  4. Dopo la differenziazione finale, lavare le cellule con 1 mL di 1x PBS preriscaldato. Fissare i podociti hiPSC con paraformaldeide al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle fisse con 1x PBS e bloccare i siti di legame non specifici con 200 μL di soluzione di preincubazione per pozzetto per 1 ora a temperatura ambiente.
  5. Diluire gli anticorpi primari sinaptopodina (1:200), podocina (1:100) e nefrrina (1:25) nel diluente anticorpale e posizionare le goccioline di 30 μL di diluizione degli anticorpi primari su un foglio di plastica pulito in una camera di colorazione contenente un serbatoio d'acqua.
  6. Posizionare i vetrini di copertura con i podociti hiPSC fissi capovolti nella diluizione. Incubare per una notte a 4 °C. Il giorno successivo, lavare tre volte con 1x PBS per 5 minuti. Diluire gli anticorpi secondari (1:1.000) in 1x PBS e posizionare goccioline di diluizione di anticorpi secondari da 30 μL su punti puliti sulla lamina. Posizionare i vetrini del coperchio capovolti nella diluizione.
  7. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio. Dopo l'incubazione, lavare tre volte con 1x PBS per 5 minuti. Montare i campioni su vetrini in un supporto di montaggio contenente DAPI. Lasciare asciugare per una notte a temperatura ambiente e al buio. Immagina i campioni usando un microscopio confocale.

Representative Results

Con questo protocollo passo-passo che combina la riprogrammazione episomiale e la differenziazione, è possibile generare podociti portatori della mutazione di un paziente in un gene rilevante per il podocita. Ciò consente l'analisi ex vivo delle alterazioni dei podociti specifici della malattia. Il background genetico del paziente viene preservato durante il protocollo durante tutte le diverse fasi cellulari. Inoltre, la limitazione del numero insufficiente di cellule di podociti non proliferanti differenziati terminalmente può essere superata utilizzando podociti derivati da hiPSC. Sebbene siano necessari diversi mesi prima che i podociti hiPSC siano generati da fibroblasti dermici superati attraverso la riprogrammazione in hiPSC e la successiva differenziazione in podociti, è possibile congelare le cellule in tre diverse fasi del protocollo (Figura 2). Il congelamento è possibile per fibroblasti, hiPSCs e cellule progenitrici del nefrone dopo la differenziazione nel mezzo di differenziazione dei progenitori del nefrone per 7 giorni. Pertanto, è possibile la generazione di banche cellulari funzionanti e esperimenti su larga scala.

Figure 2
Figura 2: Singoli passaggi del protocollo attraverso un microscopio a contrasto di fase. (A) Fibroblasti dermici troppo grandi. (B) formazione di colonie hiPSC dopo riprogrammazione. (C) Cultura hiPSC selezionata. (D) Cellule del mesoderma dopo 2 giorni di differenziazione. (E) Cellule progenitrici di nefrone dopo 14 giorni di differenziazione nel mezzo di differenziazione dei progenitori del nefrone. (F) Podociti terminali differenziati derivati da hiPSC. Le barre della scala rappresentano 300 μm (A,B,D-F) e 150 μm (C). Il fiocco di neve evidenzia possibili passaggi di congelamento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Poiché i podociti derivati dall'hiPSC generati attraversano un lungo protocollo con drastici cambiamenti riguardanti il tipo e la morfologia cellulare, la caratterizzazione cellulare è obbligatoria. La morfologia cellulare, come le dimensioni e la forma delle cellule, così come il comportamento di crescita, possono essere monitorati utilizzando un microscopio a contrasto di fase. I fibroblasti presentano un lungo fenotipo simile a un fuso con una dimensione da 150 μm a 300 μm (Figura 2A). Dopo la riprogrammazione, si verificano colonie con piccole hiPSC da 50 μm. Queste colonie mostrano bordi distinti e hiPSC distinti con un elevato rapporto nuclei-corpo e un aumento del tasso di proliferazione (Figura 2C). Poiché i podociti sono cellule differenziate terminalmente, il tasso di proliferazione diminuisce con la differenziazione progressiva e la morfologia cellulare cambia in podociti a forma di stella di 300 μm con processi del piede prominenti (Figura 2F).

La confluenza è un punto critico della coltura hiPSC e la differenziazione spontanea può apparire quando le colonie diventano troppo dense (Figura 3). Queste colonie devono essere rimosse prima di passare raschiando le parti interessate del piatto di coltura.

Figure 3
Figura 3: Esempi di hiPSC di diversa qualità. Immagini a contrasto di fase di (A) colonie hiPSC riprogrammate con successo e (B) hiPSC selezionate, nonché (C) differenziazione spontanea, (D,E) colonie non-hiPSC e (F) una coltura hiPSC troppo densa. Le barre della scala rappresentano 300 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

I diversi tipi di cellule di questo protocollo devono essere validati per quanto riguarda l'espressione di un marcatore specifico. Dopo la riprogrammazione, le hiPSC riacquistano la capacità di pluripotenza ed esprimono marcatori di proliferazione e pluripotenza come SSEA4, OCT3/4 e Ki67 (Figura 4)38,39,40. È noto che la riprogrammazione, così come la lunga coltura di hiPSCs e la differenziazione, possono portare ad un cariotipo anomalo, o meglio indurre mutazioni41. Pertanto, il background genetico delle cellule in coltura deve essere monitorato nel tempo e in diversi passaggi mediante g-banding e sequenziamento dell'intero esoma.

Figure 4
Figura 4: Caratterizzazione delle hiPSC generate mediante colorazione con immunofluorescenza. Caratterizzazione delle hiPSC generate mediante colorazione per (A) il marcatore proliferativo Ki67, così come i marcatori di pluripotenza (B) OCT3/4 e (C) SSEA4. Le barre della scala rappresentano 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Morfologicamente, i podociti derivati dall'hiPSC appaiono a forma di stella ed esprimono una rete distinta di lunghi processi primari e secondari del piede rispetto ai ciPodciti (Figura 5). I podociti derivati da HiPSC esprimono proteine marcatrici specifiche del podocita come sinaptopodina, nefrina e podocina (Figura 6A-C)42.

Figure 5
Figura 5: Morfologia dei podociti derivati dall'hiPSC rispetto ai ciPodociti. Confronto tra podociti derivati da (A,B) hiPSC da un donatore sano a (C,D) ciPodocytes per quanto riguarda la morfologia cellulare e la filopodia utilizzando un microscopio a contrasto di fase (A,C) e un microscopio elettronico a scansione (B,D). Le barre della scala rappresentano 150 μm (A,C) e 20 μm (B,D). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Pertanto, il confronto dei podociti derivati dall'hiPSC non solo da donatori sani, ma anche da pazienti con mutazioni in geni podocita specifici, consente una caratterizzazione individualizzata della mutazione ex vivo del paziente.

Figure 6
Figura 6: Caratterizzazione di un marcatore podocita specifico in podociti e ciPodciti derivati da hiPSC. Confronto tra i podociti derivati da (A-C) hiPSC da un donatore sano con i ciPodociti (D-F) per quanto riguarda le proteine marcatrici podocite specifiche sinaptopodina (A,D), nefrrina (B,E) e podocina (C,F). Le barre della scala rappresentano 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Composizione di tutti i terreni di coltura cellulare e delle soluzioni utilizzate nello studio. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Questo protocollo basato su colture cellulari combina la riprogrammazione episomiale dei fibroblasti dermici umani in hiPSC specifiche del paziente e la successiva differenziazione in podociti derivati dall'hiPSC. Questo ci permette di studiare le alterazioni correlate alla mutazione dei podociti di pazienti con malattia glomerulare genetica per quanto riguarda il danno da podocita. Il protocollo per riprogrammare i fibroblasti dermici con un metodo privo di integrazione mediante elettroporazione è adattato dal lavoro pubblicato di Bang et al.32 e Okita et al.33. Il protocollo per differenziare i podociti dalle hiPSC è adattato dal protocollo pubblicato da Musah et al.28,34,35. Sono già disponibili pubblicazioni che descrivono la generazione di podociti da hiPSCs 27,34,35. Tuttavia, il protocollo fornito qui è ottimizzato e meno costoso per quanto riguarda la differenziazione delle hiPSC in podociti. Rispetto al protocollo pubblicato da Musah et al., abbiamo testato questo protocollo su diversi reagenti di rivestimento, come vitronectina, laminina seta-511 e matrice di membrana basale solubilizzata. Le concentrazioni di vitronectina e laminina seta-511 potrebbero essere ridotte a 2,5 μg/mL invece di 5 μg/mL 28,34,35. Inoltre, è stato possibile ridurre le concentrazioni di BMP7 e activina A, due fattori di crescita molto costosi, del 50%, da 100 ng / mL a 50 ng / mL.

Ciò consente una differenziazione meno costosa. Le cellule progenitrici del nefrone dal giorno 7 stavano ancora proliferando e la possibilità di congelamento era stata mostrata prima. Abbiamo espanso queste celle dopo lo scongelamento e prima della differenziazione finale in terreno di base contenente il mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) e B27 per diversi giorni, riducendo ulteriormente i costi. Oltre alle fasi di differenziazione, questo protocollo descrive la crescita dei fibroblasti dalle biopsie cutanee con successiva generazione di hiPSC paziente-specifiche tramite riprogrammazione episomiale. La combinazione di questi due metodi consente la generazione di podociti specifici per il paziente. Pertanto, qui viene fornito un protocollo passo-passo completo per generare podociti derivati dall'hiPSC specifici per il paziente che non è stato descritto prima in modo così dettagliato.

Poiché il protocollo generale include diversi tipi di cellule, è fondamentale caratterizzare i tipi di cellule generate in diversi passaggi. Le cellule sono in coltura per un lungo periodo di tempo, quindi il controllo di qualità dovrebbe essere eseguito in diversi passaggi. Quando si lavora con hiPSC, è necessaria l'alimentazione quotidiana, nonché il monitoraggio del comportamento cellulare e della morfologia. La sterilità dei mezzi di differenziazione deve essere garantita dalla sterilizzazione del filtro attraverso un filtro da 0,2 μm. L'intero protocollo, dalla biopsia cutanea ai podociti derivati dall'hiPSC, richiede diversi mesi, ma è possibile congelare le cellule in fasi distinte del processo. I fibroblasti, i cloni hiPSC selezionati e le cellule progenitrici proliferative del nefrone dopo 7 giorni nel mezzo di differenziazione dei progenitori del nefrone possono essere congelati e può essere generata una banca cellulare funzionante.

Anche se i podociti sani derivati dall'hiPSC sviluppano una rete distinta di processi primari e secondari del piede (Figura 5A,B) ed esprimono il tipico marcatore specifico del podocita (Figura 6A-C), i caratteristici diaframmi a fessura, come si vedono in vivo, sono difficili da imitare nei classici modelli di coltura cellulare bidimensionale. Inoltre, la comunicazione intercellulare con altri tipi di cellule glomerulari non è possibile in questo contesto di monocoltura.

A causa del loro stato differenziato terminale e della mancanza di capacità di proliferazione, è difficile studiare i podociti ex vivo. Con l'aiuto di podociti primari condizionatamente immortalanti, è possibile superare questa limitazione con l'inserimento di un interruttore termosensibile, risultando in un modello di coltura cellulare in cui le cellule proliferano a 33 °C e si differenziano a 37 °C13,14. Sebbene questi ciPodociti abbiano un alto potenziale per la ricerca sui podociti, ci sono limitazioni, come la mancanza di espressione dei marcatori, la morfologia sdifferenziata e la mancata formazione dei processi del piede15,16.

La differenziazione dei podociti da cellule somatiche derivate dal paziente consente la generazione e il confronto di podociti malati con cellule di controllo sane ex vivo. Questo ci permette di studiare il danno podocita dovuto a mutazioni nei geni specifici del podocita. Inoltre, lavorare con le hiPSC ha il potenziale per creare modelli tridimensionali di malattia da coltura cellulare, o meglio organoidi43,44. La co-coltura di podociti derivati dall'hiPSC con altre cellule glomerulari, come le cellule endoteliali glomerulari o le cellule mesangiali, potrebbe portare a nuove intuizioni sulla comunicazione intercellulare nella salute e nella malattia glomerulare.

Inoltre, la caratterizzazione e il trattamento dei podociti paziente-specifici possono essere eseguiti ex vivo in analisi ad alta produttività. L'approccio individualizzato apre l'opportunità di studiare nuovi bersagli terapeutici per mutazioni specifiche e di eseguire la medicina individualizzata in futuro.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dal Centro interdisciplinare per la ricerca clinica (IZKF) dell'Università Friedrich-Alexander Erlangen-Nürnberg con il numero di sovvenzione M4-IZKF-F009 assegnato a Janina Müller-Deile, e dal Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) con il nome di progetto STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, numero di sovvenzione 01GM2202D assegnato a Janina Müller-Deile. Ringraziamo Annalena Kraus per il supporto nello scattare immagini SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm sterile filter Rotilab P668.1 for sterilization of differentiation medium
all-trans retinoic acid Stem Cell Technologies 72262 supplement for differentiation
B27 supplement (50 x), serum free Gibco 17504044 supplement for serum-free differentiation medium
BG iMatrix-511 Silk biogems RL511S additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Bovine serum albumin (BSA)  Roth 8076.4
CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL Greiner bio-one 82050-856 cell culture plastics suitable for fibroblast culture
CHIR99021 (5 mg) Sigma-Aldrich 252917-06-9  supplement for differentiation
Corning Matrigel hESC qualified matrix  Corning 354277 additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix)
countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283 to count cells
countess II FL  Automated Cell Counter Invitrogen to count cells
cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white Sarstedt 72380 cryovials for freezing of cells
dimethyl sulfoxide (DMSO)  Roth A994.1 for fibroblast freezing medium
DMEM/F12 (1:1) (1 x) Gibco 11320074 basic medium for differentiation
DMEM/F12 + Glutamax Gibco 10565018 basic medium for fibroblast medium
EVOS M5000 Imaging System Thermo Fisher Scientific AMF5000 phase contrast microscope
fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) PAN Biotech P301902 serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium
fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile Fisherbrand FB104 cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap)
fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI Invitrogen 00-4959-52 mounting medium containing dapi
gauge needle (0.6 x 30 mm) BD Microlance3 300700 for separation of hiPSC colonies into small pieces
human Recombinant Activin A Protein 78001.1 Stem cell technologies supplement for differentiation
human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) Peprotech 120-03P supplement for differentiation
human VEGF-165 Recombinant Protein Thermo Scientific PHC9394 supplement for differentiation
insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) Gibco 41400045 supplement for podocyte maintenance medium
LB medium Roth X964.1 for sterility test of hiPSC culture
lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma Aldrich MP0035-1KT commercial mycoplasma detection kit
microscope slides Diagonal GmbH & Co.KG 21,102
microtube 1.5 mL  Sarstedt 72706400
mTeSR1 Complete Kit Stem Cell Technologies 85850 basic medium for serum-free hiPSC culture medium
nalgene freezing container Mr.Frosty Roth AC96.1  to ensure optimal freezing conditions
normal goat serum abcam ab 7481 for preincubation solution and antibody diluent
nunc 24 well plates Thermo Scientific 142485 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 48 well plates  Thermo Scientific 152640 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 6 well plates  Thermo Scientific 140685 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc EasYDish Dishes 100 mm Thermo Scientific 150466 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 167008 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nutriFreez D10 Cryopreservation Medium Sartorius 05-713-1E  serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells
Opti-MEM Gibco 11058021 electroporation medium 
pCXLE-hMLN Addgene #27079 plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hOCT3/4 plasmid Addgene #27077 plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hSK plasmid Addgene #27078 plasmid for episomal reprogramming
penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100ML to avoid bacterial contamination
plastic coverslips Sarstedt   83.1840.002 for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes
ROTI Histofix Roth P087.3 commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells
RPMI 1640 + L-Glutamine Gibco 21875034 basic medium for podocyte maintenance medium
staining chamber StainTray Black lid Roth HA51.1
stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501 enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs
sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) Gibco 14190094 used for washing and coating
sterile water Roth T1432
syringe without needle 20 mL BD Plastipak 300629 to filter sterilize differentiation medium
TC dish 100 mm Sarstedt 8,33,902 sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture
TC dish 35 mm Sarstedt 8,33,900 sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy
triton X 100 Roth 3051.3 for preincubation solution 
trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter Invitrogen T10282 to count cells
trypsin-EDTA (10 x)  Biowest X0930-100 dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells
tube 15 mL Greiner bio-one 188271-N
tube 50 mL Greiner bio-one 227261
vitronectin ACF Sartorius 05-754-0002 extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Y-27632 dihydrochloride (10 mg) Tocris 1254 to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting
Primary antibodies
OCT4  Stem Cell Technologies 60093.1 pluripotency marker, dilution 1:200
SSEA-4 Stem Cell Technologies 60062FI.1 pluripotency marker, dilution 1:100
Ki67 Abcam ab15580 proliferation marker, dilution 1:300
synaptopodin Proteintech 21064-1-AP podocyte-specific marker, dilution 1:200
nephrin Progen GP-N2 podocyte-specific marker, dilution 1:25
podocin proteintech 20384-1-AP podocyte-specific marker, dilution 1:100
Secondary antibodies
goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21435 secondary anditbody, dilution 1:1000
alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed Invitrogen A31634 secondary anditbody, dilution 1:1000
donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21422 secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 secondary anditbody, dilution 1:1000

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References

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Biologia Numero 195
Generazione di podociti derivati dal paziente da biopsie cutanee
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Rose, V., Müller-Deile, J.… More

Rose, V., Müller-Deile, J. Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies. J. Vis. Exp. (195), e65364, doi:10.3791/65364 (2023).

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