Summary
Bu makalede, dermal fibroblastlardan hastaya özgü podositlerin epizomal yeniden programlanması yoluyla insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere (hiPSC'ler) ve ardından podositlere farklılaşması için iki aşamalı bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
Podositler, glomerüler filtrasyon bariyerinin idrar bölgesinde oturan ve glomerulusun seçici filtre fonksiyonuna katkıda bulunan epitel hücreleridir. Podosit spesifik genlerdeki mutasyonlar fokal segmental glomerüloskleroza (FSGS) neden olabilir ve podositler diğer birçok primer ve sekonder nefropatide de etkilenir. Farklılaşmış doğaları nedeniyle, birincil hücre kültürü modelleri podositler için sınırlıdır. Bu nedenle, yaygın olarak şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş hücreler kullanılır. Bununla birlikte, bu şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş podositlerin (siPodositler) birkaç sınırlaması vardır: hücreler, özellikle akıcılığa ulaştıklarında, kültürde farklılaşabilir ve birkaç podosit spesifik belirteç, ya sadece hafifçe ifade edilir ya da hiç ifade edilmez. Bu da siPodositlerin kullanımını ve fizyolojik, patofizyolojik ve klinik erişim için uygulanabilirliklerini sorgulamaktadır. Burada, dermal fibroblastların hiPSC'lere epizomal olarak yeniden programlanması ve ardından podositlere farklılaşması yoluyla deri punch biyopsisinden hastaya özgü podositler de dahil olmak üzere insan podositlerinin üretilmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Bu podositler, ayak süreçlerinin gelişimi ve podosit spesifik belirtecin ekspresyonu gibi morfolojik özellikler açısından in vivo podositlere çok daha iyi benzemektedir. Son olarak, ancak daha da önemlisi, bu hücreler hastaların mutasyonlarını korur ve podosit hastalıklarını ve potansiyel terapötik maddeleri bireyselleştirilmiş bir yaklaşımla incelemek için geliştirilmiş bir ex vivo model ile sonuçlanır.
Introduction
Podositler, glomerüler bazal membran (GBM), glomerüler endotel hücreleri ve glikokaliks ile birlikte böbreğin glomerüler filtrasyon bariyerini oluşturan özelleşmiş, post-mitotik renal epitel hücreleridir. Fenotipik olarak, podositler bir hücre gövdesi ve birincil, mikrotübül tahrikli membran uzantılarının yanı sıra ayak işlemleri 1,2 adı verilen ikincil uzantılardan oluşur. İdrarı kandan filtreleyen glomerüler filtrasyon bariyeri, fenestrated endotel, GBM ve podoktyes3'ün yarık diyaframı olarak adlandırılan komşu podosit ayak süreçlerini birbirine bağlayan özel bir hücreler arası kavşak türünden yapılmıştır. Sağlıklı koşullar altında, albüminden daha büyük proteinler, büyüklükleri ve yükleri4 nedeniyle filtrasyon bariyerinden tutulur.
Sitoiskelet veya podosit spesifik genlerdeki mutasyonların yanı sıra podosit sinyal yollarını etkileyen dolaşım faktörlerinin, podosit effacement, dekolmanı veya apoptozu indüklediği ve proteinüri ve glomerüler skleroz ile sonuçlandığı bilinmektedir. Özellikle, sitoiskeletin yeniden düzenlenmesi, podosit polaritesindeki değişiklikler veya yarık kavşakların kaybı ile ilişkili ayak süreçlerinin hasarı çok önemlidir5. Ölümcül olarak farklılaşmış durumları nedeniyle, podositler GBM'nin ayrılmasından sonra zorlukla değiştirilebilir. Bununla birlikte, podositler GBM'ye bağlanırsa, yine de efffacement'tan kurtulabilir veayak süreçlerini 6,7,8 ile değiştirebilirler. Çeşitli glomerüler bozukluklarda podosit hasarına yol açan olayların daha iyi anlaşılması, bu hastalıklar için tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olacak yeni terapötik hedefler sağlayabilir. Podosit hasarı, fokal segmental glomerüloskleroz (FSGS), diyabetik nefropati, minimal değişiklik hastalığı ve membranöz glomerülonefropati gibi farklı glomerüler hastalıkların ayırt edici özelliğidir ve bu hastalıkların patolojik mekanizmalarını ve potansiyel tedavi yaklaşımlarını incelemek için güvenilir podosit ex vivo modelleri gerektirir 9,10. Podositler, diferansiyel eleme ile glomerüllerin izolasyonuna dayanan klasik primer hücre kültürü ile ex vivo olarak incelenebilir11. Bununla birlikte, sınırlı proliferasyon kapasitesine sahip terminal olarak farklılaşmış durum nedeniyle, çoğu araştırmacı SV40 büyük T antijeninin sıcaklığa duyarlı varyantlarını eksprese eden fare veya insan siPodosit hücre hatlarını kullanır. Alternatif olarak, siPodositler, SV40 Tag ölümsüzleştirici gen 1,12'yi barındıran transgenik farelerden izole edilir.
SiPodositler 33 ° C'de çoğalır, ancak büyüme durmasına girer ve 37 ° C'de farklılaşmaya başlar13,14. Bu hücrelerle elde edilen deneysel verilerin, hücreler doğal olmayan bir gen yerleştirme15 kullanılarak üretildiğinden, belirli bir dikkatle yorumlanması gerektiği unutulmamalıdır. Bu hücreler ölümsüzleştirici bir gen barındırdığından, devam eden proliferasyon nedeniyle hücresel fizyoloji değişir12. Bu yaklaşımla üretilen podosit hücre hatları son zamanlarda sorgulanmıştır, çünkü fare, insan ve sıçan siPodositleri, protein düzeyinde sinaptopodin ve nefrinin% 5'inden azını, ayrıca glomerüler ekspresyon16'ya kıyasla mRNA seviyesinde NPHS1 ve NPHS2'yi ifade etmektedir. Dahası, çoğu podosit hücre çizgisi nefrin17,18 eksprese etmez. Chittiprol ve ark. ayrıca siPodositlerde hücre motilitesinde ve puromisin ve doksorubisin yanıtlarında anlamlı bir fark tanımlamışlardır16. Podositler, farklı glomerüler hastalıklarda GBM'den ayrıldıktan sonra idrarda bulunabilir 19,20,21,22. Canlı üriner podositler 2-3 haftaya kadar ex vivo olarak yetiştirilebilir, ancak çoğu hücre apoptoz23,24'e maruz kalır. İlginçtir ki, podositler sadece glomerüler hastalığı olan hastaların idrarında değil, aynı zamanda sağlıklı deneklerin idrarında, büyük olasılıkla yaşlandıklarında da bulunur - yine kültür24'te sınırlı bir replikasyon potansiyeline sahiptir. Ayrıca, idrar kaynaklı podosit sayısı sınırlıdır ve hücreler kültürde farklılaşır, daha az ayak süreci gösterir, morfolojiyi değiştirir ve en önemlisi sınırlı proliferasyon kapasitesine sahiptir. Podosit spesifik genlerin ekspresyonu yoktur, birkaç hafta içinde kaybolur veya bu hücre klonları arasında değişir. Podosit spesifik belirteç için pozitif olan bazı hücreler, tübüler epitel hücrelerinin veya miyofibroblastların ve mezangial hücrelerin belirtecini birlikte eksprese ettiler, bu da kültürlü üriner podositlerin dediferansiyasyonunu ve / veya transdiferansiyasyonunu düşündürmektedir24,25.
Son zamanlarda, hastaların ve sağlıklı gönüllülerin idrarından elde edilen siPodosit hücre hatlarının ısıya duyarlı SV40 büyük T antijeni ve hTERT ile transdüksiyon yoluyla üretilmesi tanımlanmıştır26. Sinaptopodin, nestin ve CD2 ile ilişkili protein için mRNA ekspresyonu tespit edildi, ancak podosin mRNA tüm klonlarda yoktu. İdrar podositleri ile ilgili sorunlara ek olarak, bu hücreler aynı zamanda yerleştirilen ölümsüzleştirici geni de içerir ve bu da yukarıda tartışılan dezavantajlara neden olur.
Buna karşılık, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler), uygun koşullar altında kendini yenilemek ve çoklu hücre tiplerine farklılaşmak için büyük bir kapasiteye sahiptir. HiPSC'lerin neredeyse sınırsız bir podosit kaynağı olarak hizmet edebileceği daha önce gösterilmiştir27,28.
Burada, deri punch biyopsilerinin dermal fibroblastlarından hastaya özgü podositler üretmek için iki aşamalı bir protokol, daha sonra hiPSC'lere epizomal yeniden programlama ve hiPSC türevi podositlere son bir farklılaşma açıklanmaktadır (Şekil 1).
Şekil 1: Hastaya özgü hiPSC türevi podositler üretmek için protokol. Bir deri biyopsisinin dermal fibroblastlarından hastaya özgü podositler üretmek için protokole grafiksel genel bakış, hiPSC'lere yeniden programlanarak ve podositlere farklılaşarak. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
İlk adım olarak, somatik dermal fibroblastlar deri punch biyopsisinden büyütüldü ve OCT3/4, KLF4, SOX2 ve c-MYC29,30,31 transkripsiyon faktörlerini eksprese eden plazmidlerle elektroporasyon yoluyla entegrasyonsuz bir yöntem kullanılarak hiPSC'lere yeniden programlandı. Ortaya çıkan hiPSC kolonileri daha sonra seçildi ve genişletildi. Farklılaşma, WNT sinyal yolunun aktivasyonu ile mezodermal soyun indüksiyonu ile başladı, bunu hala çoğalabilen nefron progenitör hücrelerin oluşumu izledi. Son olarak, hücreler podositlere farklılaştırıldı. Bu prosedürde, Bang ve ark.32 ve Okita ve ark.33 tarafından hiPSC'lerin oluşturulması için epizomal yeniden programlama için daha önce yayınlanmış protokolleri ve ayrıca Musah ve ark.28,34,35 tarafından hiPSC'lerin podositlere farklılaştırılması için bir protokolü değiştirdik ve birleştirdik.
Gerçekten de, protokolümüz tarafından üretilen podositler, primer ve sekonder ayak süreçlerinin ayrı bir ağının gelişimi ve sinaptopodin, podosin ve nefrin gibi podositlere özgü belirteçlerin ekspresyonu ile ilgili olarak in vivo podositlere daha yakın bir fenotipe sahipti. HiPSC türevi podositlerin kullanımıyla, hastanın genetik arka planı yeniden programlama ve farklılaşma sırasında korunur. Bu, hastaya özgü podosit hastalığının modellenmesini ve potansiyel terapötik maddelerin ex vivo olarak neredeyse sınırsız sayıda hücre sayısında keşfedilmesini sağlar. Dahası, bu protokol minimal invaziv, uygun maliyetli, etik olarak kabul edilebilir ve ilaç geliştirme için yeni yollar kolaylaştırabilir.
Protocol
Protokol, Friedrich-Alexander Üniversitesi Erlangen-Nuremberg (251_18B) etik kurulu tarafından onaylandı ve tüm hastalar ve probandlar yazılı onay verdi. Tüm deneyler ilgili kılavuz ilkelere ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Burada kullanılan tüm ortam ve çözeltilerin bileşimi için Tablo 1'e bakınız.
1. Deri punch biyopsisinden dermal fibroblastların büyümesi
- Cilt punch biyopsisini, 10 mL önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile steril bir 15 mL konik tüpe aktarın.
- Ortamı çıkarın ve cilt punch biyopsisini 5 mL steril, önceden ısıtılmış 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkayın. Steril forseps ile deri punch biyopsisini 10 cm'lik bir hücre kültürü plakasına aktarın ve steril bir neşterle üç veya dört parça halinde enine keserek epidermis ve dermisi terk edin.
- Her bir parçayı steril bir 35 mm plastik hücreli kültür kabına aktarın ve yavaşça kültür kabına bastırın. Biyopsi parçalarının etrafındaki fazla ortamı çıkarın. Sıvı buharlaşana ve biyopsi hücre kültürü plastiğine bağlanana kadar 5-10 dakika kurumaya bırakın.
- Biyopsi etrafına 1.000 μL pipet ile damla damla 1 mL fibroblast ortamı ekleyin ve 3 mL'lik son hacme dikkatlice doldurun. Kabı beslemeden ve hareket ettirmeden 7 gün boyunca 37 ° C,% 5 CO2'de yetiştirin. Ortamı dikkatlice taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamına değiştirin. 7 gün sonra, büyümüş iğ benzeri fibroblastlar, bir faz kontrast mikroskobu36 kullanılarak cilt biyopsisi etrafında izlenebilir.
NOT: Büyümüş fibroblastlar çanağın kenarına ulaştığında, başka bir fibroblast grubu oluşturmak için adım 1.3'ten tekrar ilerleyin. - Büyümüş fibroblastların genişlemesi için, 2 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın, fibroblastları 1 mL 1x tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile ayırın ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de 5 dakika inkübe edin. Ayrılan hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve hücre kültürü kabını 2 mL taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile yıkayın.
- Ayrışma maddesini nötralize etmek için yıkama ortamını tüp içinde havuzlayın ve 20 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 1 mL taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile yeniden askıya alın. Taze hücre kültürü şişelerindecm2 başına tripan mavisi ve tohum 2,5 x 10 3 ila 5 x 103 fibroblast kullanarak Neubauer odası veya otomatik hücre sayacı ile hücreleri sayın.
- Şişeleri inkübatöre geri yerleştirin ve şişeleri her yönde üç kez hareket ettirerek hücreleri eşit olarak dağıtın. Ertesi gün, ortamı taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile değiştirin. Ortamı haftada iki kez değiştirin ve fibroblastlar yaklaşık% 80 akıcılığa ulaştığında bölün.
2. Dondurucu dermal fibroblastlar
- Fibroblastları dondurmak için, 5 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve fibroblastları 4 mL 1x tripsin-EDTA ile ayırın. Şişeyi inkübatöre geri yerleştirin ve% 5 CO2'de 37 ° C'de 5-7 dakika inkübe edin. Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak ayrılmayı izleyin ve hücreleri ayırmak için şişenin yan tarafına dokunun.
- Ayrılan hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Hücre kültürü şişesini 5 mL taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile yıkayın. Yıkama ortamını konik tüp içinde havuzlayın ve 20 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 2 mL taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile yeniden askıya alın. Hücreleri sayın ve 1 x 106 hücreleri yeni bir konik tüpe aktarın. 20 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.
- Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini% 90 fetal buzağı serumu ve% 10 dimetil sülfoksitten (DMSO) oluşan 1 mL soğuk fibroblast dondurma ortamı ile yeniden askıya alın. Bir kriyoviyal içine aktarın, dondurucu bir kaba koyun ve gece boyunca -80 ° C'de dondurun. Uzun süreli depolama için, kriyoviyal ertesi gün bir sıvı azot tankına yerleştirin.
3. HiPSC'ler üretmek için fibroblastların epizomal olarak yeniden programlanması
- Epizomal yeniden programlama için, 4'ten 8'e kadar olan pasajlarda 1,5 x 106 fibroblast kullanın. Bu hücre sayısına ulaşmak için, yaklaşık% 70 akıcılığa sahip iki ila üç adet 250 mL şişe kullanın.
- Yeniden programlamadan bir gün önce, proliferatif durumlarını sağlamak için fibroblastları 1: 2 oranında bölün. Bu nedenle, ortamı aspire edin ve şişeleri şişe başına 5 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve fibroblastları 4 mL 1x tripsin-EDTA ile ayırın. Şişeleri inkübatöre geri yerleştirin ve 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 5-7 dakika inkübe edin. Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak ayrılmayı izleyin ve hücreleri plastik yüzeyden ayırmak için şişenin yan tarafına dokunun.
- Ayrılan hücreleri 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve hücre kültürü şişelerini 5 mL taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile yıkayın. Yıkama ortamını konik tüp içinde havuzlayın ve 20 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 6 mL taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamında yeniden askıya alın.
- Şişe başına 5 mL taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ekleyerek altı yeni hücre kültürü şişesi hazırlayın. Her şişeye 1 mL fibroblast hücre süspansiyonu ekleyin. Şişeleri inkübatöre geri yerleştirin ve şişeleri her yönde üç kez hareket ettirerek hücreleri eşit olarak dağıtın.
- Epizomal yeniden programlama için, hiPSC kültürüne uygun iki adet 10 cm'lik hücre kültürü plakasını, plaka başına 4 mL soğuk kaplama çözeltisi ile kaplayın. Plakaları 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
NOT: Kültür hiPSC'leri için, farklı hücre kültürü plastikleri ve ek hücre dışı matris kaplama gereklidir (bkz. - Ortamı fibroblastlardan çıkarın ve şişe başına 10 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 37 ° C'de 5-7 dakika inkübe ederek şişe başına 4 mL 1x tripsin-EDTA ile fibroblastları ayırın. Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak ayrılmayı izleyin ve gerekirse, hücreleri plastik yüzeyden ayırmak için şişenin yan tarafına dokunun.
- Ayrılan hücreleri 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Kalan hücreleri toplamak ve konik tüpte toplamak için boş şişeleri 6 mL önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile yıkayın. 20 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 3 mL taze, önceden ısıtılmış 1x PBS'de yeniden askıya alın.
- Hücreleri sayın ve 1.5 x 106 fibroblastları yeni bir konik tüpe aktarın. 20 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve hücre peletini 5 mL elektroporasyon ortamında yeniden askıya alın ve tekrar santrifüjleyin. Bu arada, kaplama çözeltisini kaplanmış 10 cm'lik hücre kültürü plakalarından aspire edin ve 7 mL önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ekleyin.
- Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve hücre peletini 250 μL'de 1.5 x 106 hücre konsantrasyonuyla elektroporasyon ortamında yeniden askıya alın. 250 μL hücre süspansiyonunu 4 mm boşluk mesafesine sahip bir elektroporasyon küvetine aktarın (bkz.
- Toplam 50 μL elektroporasyon ortamına her plazmidden 4 μg (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) ekleyerek bir plazmid transfeksiyon karışımı hazırlayın. Küvete aktarın ve hafifçe hafifçe vurarak karıştırın. 280 V'ta bir darbe ile elektroporat.
- Steril makas kullanarak bir pipet ucu kesin ve elektropore fibroblastların 125 μL'sini hazırlanan 10 cm'lik hücre kültürü plakalarının her birine aktarın. Plakaları her yöne üç kez çalkalayarak hücreleri dağıtın ve inkübatöre geri yerleştirin. Gece boyunca 37 °C'de %5 CO2 ile rahatsız edilmeden inkübe edin.
- Ölü hücreleri çıkarmak için, ertesi gün ortamı 7 mL taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile değiştirin. Elektroporasyondan 2 gün sonra ortamı hiPSC kültür ortamına değiştirin ve sonraki 20 gün boyunca her gün değiştirin.
4. Üretilen hiPSC'lerin seçimi, genişletilmesi ve kalite kontrolü
- Elektroporasyondan sonra hiPSC kolonilerinin oluşumunu gözlemlemek için 10x veya 20x hedefe sahip bir faz kontrast mikroskobu kullanarak hücreleri en az 20 gün boyunca günlük olarak izleyin. Eğer hiPSC kolonileri farklı sınırlara sahip yaklaşık 300 μm çapındaysa ve hiPSC'ler yüksek çekirdek-gövde oranı gösteriyorsa, hiPSC kolonileri toplanarak seçime hazırdır (Şekil 2B,C ve Şekil 3).
- Toplamadan önce, hiPSC kültürüne uygun 96 delikli bir plakayı kuyu başına 100 μL kaplama çözeltisi ile kaplayın ve 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin. Kuluçka sırasında, hücre kültürü kabının altındaki ilgi çekici kolonileri bir kalemle işaretleyin. 96 delikli plakanın son hazırlığı için, kaplama çözeltisini çıkarın ve her bir kuyucuğa 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 100 μL önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ekleyin.
- Hücreleri önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın ve ölü hücreleri çıkarmak için toplamadan önce 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren taze, önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ekleyin. HiPSC kolonilerini seçmek için, bir ölçü iğnesi kullanın ve her koloniye bir ızgara çizerek hiPSC kolonilerini küçük parçalara bölün.
- Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak, kolonilerin başarılı bir şekilde parçalara ayrıldığını kontrol edin. Bunları 100 μL pipetle hazırlanan 96 delikli plakaya aktarın. Koloninin çizilmesini ve kaybolmasını önlemek için pipeti hücrelere dokunmadan koloninin üzerinde dik tutun.
- 96 delikli plakayı inkübatöre %5 CO2 ile 37 °C'de yerleştirin ve hücrelerin gece boyunca rahatsız edilmeden yapışmasına izin verin. Toplamanın başarılı olmaması ihtimaline karşı bulaşıkları fibroblast ve hiPSC karışımı ile saklayın. Bu nedenle, ortamı hiPSC kültür ortamına değiştirerek ROCK inhibitörü Y27632'yi çıkarın ve plakaları inkübatöre geri yerleştirin.
- Ertesi gün, 96 delikli plakanın ortamını 200 μL taze hiPSC kültür ortamına değiştirin ve her geçen gün değiştirin. Ertesi gün 96 kuyucuklu plakayı izleyin ve kuyuları başarıyla seçilmiş klonlarla işaretleyin.
NOT: Toplanan hiPSC klonları ilk denemeden sonra tam olarak seçilmezse ve fibroblastlar kuyuda bulunabilirse, 96 kuyucuğundan toplamayı tekrarlayın veya fibroblastları plakadan kazıyın.
5. Seçilen hiPSC klonlarının genişletilmesi
- Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak hiPSC klonlarını izleyin. Seçilen hiPSC'ler yaklaşık %70 akıcılığa ulaşırsa, hiPSC klonları genişlemeye hazırdır.
- HiPSC kültürüne uygun 48 delikli bir plakayı, kuyu başına 250 μL kaplama çözeltisi ile 37 °C'de 1 saat boyunca kaplayın. Kaplama çözeltisini, 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 200 μL taze, önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ile değiştirin.
- HiPSC'leri 96 delikli plakadan ayırmak için plastik yüzeyi 1.000 μL pipet ucuyla kazıyın. Ayrılmış hiPSC'leri 96 delikli plakadan 48 delikli bir plakaya aktarın. Ölü hücreleri ve ROCK inhibitörü Y27632'yi çıkarmak için ertesi gün ortamı taze, önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamına değiştirin.
- HiPSC klonları yaklaşık% 70 akıcılığa ulaşırsa, hiPSC'leri 24 delikli bir plakaya aktarın. Bu nedenle, hiPSC kültürüne uygun 24 delikli bir plakayı, 37 ° C'de 1 saat boyunca kuyu başına 400 μL kaplama çözeltisi ile kaplayın. Kaplama çözeltisini, 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 400 μL taze, önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ile değiştirin. Ortamı 48 kuyucuktan aspire edin ve 500 μL önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın.
- PBS'yi 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 100 μL enzimatik hücre ayırma çözeltisi ile değiştirin ve 37 ° C'de 4 dakika boyunca inkübe edin. 1.000 μL pipet kullanarak hiPSC'leri plakadan durulayın. Ayrışmış hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Boş 48 delikli plakayı, 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren hiPSC kültür ortamı ile yıkayın ve konik tüp içinde biriktirin.
- 20 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve hiPSC'leri 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 1 mL hiPSC kültür ortamında yeniden askıya alın ve 24 delikli bir plakaya aktarın. Plakayı inkübatöre 37 ° C'de% 5 CO2'de yerleştirin ve plakayı her yöne üç kez çalkalayarak hücreleri dağıtın. Hücrelerin gece boyunca rahatsız edilmeden bağlanmasına izin verin.
- Ertesi gün, ortamı ROCK inhibitörü Y27632 olmadan hiPSC kültür ortamına değiştirin.
NOT: HiPSC klonları yaklaşık %70 akıcılığa ulaşırsa, 12 delikli formata uygun daha yüksek hacimlerle 5,4 ila 5,7 arasındaki adımları tekrarlayarak hiPSC'leri 12 delikli bir plakaya aktarın. 12 delikli plakadaki hiPSC'ler yaklaşık %70 akıcılığa ulaşırsa, hiPSC klonlarını 6 delikli bir format için hacimleri artırılmış 6 delikli bir plakaya aktarın.
6. Seçilen hiPSC klonlarının dondurulması
- Seçilen hiPSC klonlarını dondurmak için, ortamı 6 delikli bir plakadan aspire edin. Kuyucukları 2 mL 1x PBS ile yıkayın. HiPSC'leri 10 μM Y27632 içeren 1 mL enzimatik hücre ayrılma çözeltisi ile aspire edin ve ayırın. Plakayı inkübatöre geri yerleştirin ve 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 4 dakika inkübe edin.
- 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak hiPSC'leri plakadan durulayın ve ayrılan hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Plakayı, 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 2 mL taze, önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ile yıkayın. Konik tüp içinde havuzlayın ve 20 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 2 mL taze, önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ile yeniden askıya alın.
- Hücreleri sayın ve 1 x 106 hücreleri yeni bir konik tüpe aktarın. 20 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Süpernatanı aspire edin, hücre peletini 1 mL soğuk, serumsuz hiPSC dondurma ortamında yeniden askıya alın ve -80 ° C'de gece boyunca bir dondurma kabı kullanarak bir kriyoviyal içinde dondurun. Uzun süreli depolama için, kriyoviyal ertesi gün bir sıvı azot tankına yerleştirin.
7. HiPSC kalite kontrol
- HiPSC morfolojisinin karakterizasyonu
- Karakteristik hiPSC morfolojisini, 20x hedefe sahip bir faz kontrast mikroskobu kullanarak kontrol edin. Yeniden programlamadan sonra, hücre morfolojisi uzun, iğ benzeri fibroblastlardan küçük, yuvarlak hiPSC'lere dönüşür ve farklı sınırları olan kolonilerde büyüyen yüksek çekirdek-vücut oranı sunar (Şekil 2C).
- HiPSC kolonileri çok yoğunlaşırsa ve kendiliğinden farklılaşma meydana gelirse, farklılaşmış parçaları bir pipet ucu kullanarak plakadan kazıyın (Şekil 3). HiPSC'ler yüksek proliferasyon hızına sahip olduklarından, hiPSC kültürlerini her gün taze, önceden ısıtılmış hiPSC besleme ortamı ile besleyin.
- İmmünofloresan boyama ile pluripotens belirteçlerinin karakterizasyonu
- İmmünofloresan boyama yoluyla pluripotens marker için üretilen hiPSC'leri kontrol etmek için, plastik kapakları 24 delikli bir plakaya yerleştirin ve 37 ° C'de 1 saat ve% 5 CO2'de 250 μL kaplama çözeltisi ile kaplayın. Kaplama çözeltisini, 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 1 mL önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ile değiştirin.
- Tohum 1.9 x 1024 kuyucuk başına 4 ayrışmış hiPSC. HiPSC'lerin gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de bozulmadan takılmasına izin verin. HiPSC'lerin ayrışması için 5.4 ile 5.6 arasındaki adımlara bakın. Ertesi gün ortamı, ROCK inhibitörü Y27632 içermeyen hiPSC kültür ortamıyla değiştirin.
- Boyama için, hücreleri 1 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın ve daha sonra hiPSC'leri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Sabit hiPSC'leri 1x PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuyu başına 200 μL ön inkübasyon çözeltisi ile spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke edin. Primer antikorlar Ki67 (1:300), OCT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) antikor seyreltici içinde seyreltin.
- Plastik bir folyoyu% 70 etanol ile temizleyin ve bir su haznesi ile doldurulmuş bir boyama odasına yerleştirin. Folyo üzerine 30 μL primer antikor seyreltme damlacıkları yerleştirin. Sabit numuneleri seyreltmeye baş aşağı yerleştirin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, numuneleri 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın ve folyo üzerindeki temiz noktalara 30 μL ikincil antikor seyreltme damlacıkları (1:1.000) yerleştirin. Kapak kızaklarını seyreltmede baş aşağı yerleştirin. Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Kuluçkadan sonra, 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın. Numuneleri, DAPI içeren montaj ortamındaki cam kızaklara monte edin. Gece boyunca oda sıcaklığında ve karanlıkta kurumaya bırakın ve örnekleri konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin (Şekil 4).
- Bakteri ve mikoplazma kontaminasyonunun dışlanması
- Bakteri kontaminasyonunu dışlamak için, 500 μL ayrışmış hiPSC'leri 5 mL önceden ısıtılmış Luria-Bertani (LB) ortamına aktarın. HiPSC'lerin ayrışması için 5.4 ile 5.6 arasındaki adımlara bakın. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. LB ortamı bulanık görünüyorsa, bakteri kontaminasyonu muhtemelen meydana gelmiştir. Hücreleri atın.
- Mikoplazma kontaminasyonunu dışlamak için, yaklaşık% 90 akışkan hiPSC'lere sahip 6 kuyudan 2 gün boyunca değiştirilmemiş ortamları toplayın. Mikoplazma kontaminasyonunu tespit etmek için kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) kullanın. Bu amaçla birçok ticari mikoplazma tespit kiti mevcuttur.
8. HiPSC'lerin podositlere farklılaşması
- Büyüme faktörlerinin hazırlanması ve depolanması
- 10 mM Y27632'lik bir stok konsantrasyonu hazırlamak için, 3.12 mL steril suda 10 mg Y27632'yi (moleküler ağırlık 320.26 g / mol) yeniden oluşturun. -20 ° C'de 100 μL alikotları saklayın ve 10 μM'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için hücre kültürü ortamında 1:1.000 oranında seyreltin.
- 30 mM CHIR99021'lik bir stok konsantrasyonu hazırlamak için, 358.2 μL steril DMSO'da 5 mg CHIR99021'i (moleküler ağırlık 465.34 g / mol) yeniden oluşturun. -20 ° C'de 50 μL alikot saklayın ve 3 μM'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için hücre kültürü ortamında 1:10.000 oranında seyreltin.
- 100 μg/mL aktivin A'nın stok konsantrasyonunu hazırlamak için, %0.1 sığır serum albümini (BSA) içeren 1x PBS'nin 1 mL'sinde 100 μg aktivin A'yı yeniden oluşturun. -20 ° C'de 100 μL alikot saklayın ve 50 ng / mL'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için hücre kültürü ortamında 1: 2.000 seyreltin.
- 100 μg/mL kemik morfojenik protein 7 (BMP7) stok konsantrasyonunu hazırlamak için, %0,1 BSA içeren 1 mL steril suda 100 μg BMP7'yi yeniden oluşturur. -20 ° C'de 100 μL alikot saklayın ve 50 ng / mL'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için hücre kültürü ortamında 1: 2.000 seyreltin.
- 100 μg/mL vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) stok konsantrasyonu hazırlamak için, 1 mL steril suda 100 μg VEGF'yi yeniden oluşturur. -20 ° C'de 100 μL alikot saklayın ve 25 ng / mL'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için hücre kültürü ortamında 1: 4.000 seyreltin.
- 10 mM'lik bir all-trans retinoik asit stok konsantrasyonu hazırlamak için, 3.33 mL steril DMSO'da 10 mg all-trans retinoik asidi yeniden oluşturun. -20 ° C'de 100 μL alikot saklayın ve 0,5 μM'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için hücre kültürü ortamında 1:100 oranında seyreltin.
- Mezoderm soyunu indüklemek için WNT sinyal yolunun aktivasyonu
- HiPSC'lerin hiPSC türevi podositlere, kaplama hücre kültürü plakalarına veya hiPSC kültürüne uygun şişelere farklılaşması için, 37 ° C'de 1 saat ve %5 CO2'de kaplama çözeltisi ile. Kaplama çözeltisinin toplam hacmi, 6 delikli kültür plakası başına 1 mL veya 10 cm'lik hücre kültürü plakası başına 4 mL'dir.
- Ortamı aspire edin ve hiPSC'leri önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 6 delikli kültür plakası başına toplam 1 mL veya 10 cm hücre kültürü plakası başına 4 mL hacimde 10 μM Y27632 içeren enzimatik hücre ayrılma çözeltisi ekleyin.
- Plakayı inkübatöre geri yerleştirin ve 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 4 dakika inkübe edin. 1.000 μL pipet kullanarak hiPSC'leri plakadan durulayın. Ayrılan hücreleri konik bir tüpe aktarın.
- Plakayı 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren taze, önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ile yıkayın. Ayrışma reaktifini nötralize etmek için yıkama ortamını konik tüp içinde toplayın. 20 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 2 mL taze, önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ile yeniden askıya alın.
- Hücreleri ve tohumu sayın 1 x 104 hiPSC / cm2. Hücreleri her yöne üç kez çalkalayarak dağıtın. HiPSC'lerin 37 °C'de gece boyunca %5 CO2 ile bozulmadan takılmasına izin verin.
- Ertesi gün, ortamı 1x B27 takviyesi,% 1 penisilin-streptomisin, 3 μM CHIR99021, 50 ng / mL aktivin A ve 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 2 mL önceden ısıtılmış mezoderm farklılaşma ortamı ile değiştirin.
- Nefron progenitör hücrelere farklılaşma
- 2 gün sonra, mezoderm ortamını 1x B27 takviyesi,% 1 penisilin-streptomisin, 3 μM CHIR99021, 50 ng / mL aktivin A ve 6 kuyucuklu kültür plakası başına 50 ng / mL BMP7 veya 10 cm hücre kültürü plakası başına 6 mL içeren önceden ısıtılmış nefron progenitör farklılaşma ortamının 2 mL'sine değiştirin. Sonraki 14 gün boyunca ortamı her gün değiştirin.
NOT: Nefron progenitör hücreleri çoğalır ve nefron progenitör genişleme ortamında 7 günlük farklılaşmadan sonra pasajlanıp dondurulabilir. - Nefron progenitör hücrelerini bölmek için, hiPSC kültürüne uygun hücre kültürü plastiklerini 37 ° C'de 1 saat boyunca kaplama çözeltisi ile kaplayın. Kaplama solüsyonunu nefron progenitör genleşme ortamı ile değiştirin. Ortamı aspire edin ve hücreleri önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın. PBS'yi çıkarın ve hücreleri 1x tripsin-EDTA ile ayırın.
- 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 5 dakika inkübe edin. Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak hücrelerin ayrılmasını izleyin. Gerekirse, hücreleri yüzeyden ayırmak için plastiğin yan tarafına dokunun. Hücreleri plakadan durulayın ve konik bir tüpe aktarın. Boş şişeyi veya plakayı, ayrışma reaktifi ile aynı hacimde önceden ısıtılmış nefron progenitör genleşme ortamı ile yıkayın.
- Yıkama ortamını konik tüp içinde havuzlayın. 20 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 2 mL taze, önceden ısıtılmış nefron progenitör genişleme ortamı ile yeniden askıya alın. Daha fazla farklılaşma içincm2 başına hücreleri ve tohumu 1.5 x 104 nefron progenitör hücreleri sayın.
NOT: Nefron progenitör hücrelerini dondurmak için, 1 mL soğuk serumsuz kriyoprezervasyon ortamında 1 x 106 hücreyi yeniden askıya alın ve bir kriyoviyal içine aktarın. Gece boyunca -80 ° C'de dondurucu bir kapta dondurun ve uzun süreli depolama için bir sıvı azot tankına aktarın. - Plakaları inkübatöre geri yerleştirin ve hücreleri her yöne üç kez ajitasyonla eşit olarak dağıtın. Ertesi gün ortamı taze, önceden ısıtılmış nefron progenitör farklılaşma ortamına değiştirin. Nefron progenitör farklılaşma ortamında hücreler 14 gün boyunca farklılaşana kadar ortamı her gün değiştirin.
- 2 gün sonra, mezoderm ortamını 1x B27 takviyesi,% 1 penisilin-streptomisin, 3 μM CHIR99021, 50 ng / mL aktivin A ve 6 kuyucuklu kültür plakası başına 50 ng / mL BMP7 veya 10 cm hücre kültürü plakası başına 6 mL içeren önceden ısıtılmış nefron progenitör farklılaşma ortamının 2 mL'sine değiştirin. Sonraki 14 gün boyunca ortamı her gün değiştirin.
- HiPSC türevi podositlere terminal farklılaşması
- Ortamı aspire edin ve 1x B27 takviyesi,% 1 penisilin-streptomisin, 3 μM CHIR99021, 50 ng / mL aktivin A, 50 ng / mL BMP7, 25 ng / μL VEGF ve 6 kuyucuklu kültür plakası başına 0.5 μM all-trans retinoik asit veya 10 cm hücre kültürü plakası başına 6 mL içeren 2 mL önceden ısıtılmış podosit farklılaşma ortamı ekleyin. Plakaları inkübatöre 37 ° C'de ve% 5 CO2'de geri yerleştirin. Taze, önceden ısıtılmış podosit farklılaşma ortamı ile 4 gün boyunca her gün ortamı değiştirin.
- HiPSC-podositleri farklılaşmadan sonra kültürde tutmak için, hücreleri haftada iki kez% 10 fetal buzağı serumu,% 1 penisilin-streptomisin ve% 0.1 insülin-transferrin-selenyum içeren podosit bakım ortamı ile besleyin.
NOT: Terminal diferansiye hiPSC-podositler artık çoğalmaz. Bununla birlikte, onları hücre kültüründe 4 haftaya kadar tutmak mümkündür.
- Dondurulmuş nefron progenitör hücrelerin çözülmesi ve genişlemesi
- HiPSC kültürüne uygun yeni bir hücre kültürü plastik şişesini, 37 °C'de 1 saat ve %5 CO2'de kaplama çözeltisi ile kaplayın. Kaplama çözeltisini 5 mL nefron progenitör genleşme ortamı ile değiştirin.
- 7 mL önceden ısıtılmış nefron progenitör genleşme ortamına sahip 15 mL'lik bir konik tüp hazırlayın. Dondurulmuş hücreleri 37 ° C'de yaklaşık 20 s boyunca hareket etmeden bir su banyosunda çözün. Hücrelerin yarısı çözüldüğünde ve bir miktar buz kaldığında kriyoviyal su banyosundan çıkarın.
- Kriyoviyal% 70 etanol ile püskürtün ve bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Çözülmüş hücreleri, önceden ısıtılmış nefron progenitör genleşme ortamı ile konik tüpe aktarın. 1.000 μL'lik bir pipet kullanın ve hücrelerin tüpün duvarından çok yavaş akmasına izin verin.
- Kalan hücreleri toplamak ve konik tüpte biriktirmek için boş kriyoviyal 1 mL nefron progenitör genleşme ortamı ile yıkayın. 20 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın ve hücre peletini taze, önceden ısıtılmış nefron progenitör genleşme ortamında yeniden askıya alın.
- Çözülmüş hücreleri kaplanmış şişeye aktarın ve ertesi gün ortamı taze, önceden ısıtılmış nefron progenitör genleşme ortamına değiştirin. Daha fazla farklılaşmadan önce, hücrelerin her gün ortamı değiştirerek nefron progenitör genişleme ortamında çoğalmasına izin verin ve adım 8.3.5'ten devam edin.
9. HiPSC türevli podositlerin immünofloresan boyama ile karakterizasyonu
- İmmünofloresan boyama yoluyla podosit spesifik belirteç için farklılaşmış podositleri kontrol etmek için, plastik kapakları 24 delikli bir plakaya yerleştirin ve 37 ° C'de 1 saat ve% 5 CO2'de 250 μL kaplama çözeltisi ile kaplayın. Kaplama çözeltisini 1 mL önceden ısıtılmış nefron progenitör genleşme ortamı ile değiştirin. Tohum 2.5 x 104 ayrışmış nefron progenitör hücreleri 24 delikli plaka başına. Nefron progenitör hücrelerinin ayrışması için 8.3.2 ila 8.3.4 arasındaki adımlara bakın.
- Hücrelerin gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de bozulmadan bağlanmasına izin verin. Ertesi gün ortamı önceden ısıtılmış nefron progenitör farklılaşma ortamı ile değiştirin.
- Nefron progenitör diferansiyasyon ortamında toplam 14 gün ve podosit diferansiyasyon ortamında 5 gün daha hücreler farklılaşana kadar ortamı her gün değiştirerek farklılaşmayı bitirin.
- Son farklılaşmadan sonra, hücreleri 1 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın. HiPSC-podositleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Sabit hücreleri 1x PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuyu başına 200 μL ön inkübasyon çözeltisi ile spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke edin.
- Primer antikorlar sinaptopodin (1:200), podosin (1:100) ve nefrin (1:25) antikor seyreltici içinde seyreltin ve 30 μL primer antikor seyreltme damlacıklarını su haznesi içeren bir boyama odasında temiz bir plastik folyo üzerine yerleştirin.
- Sabit hiPSC-podositli kapak slaytlarını seyreltmeye baş aşağı yerleştirin. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Ertesi gün, 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın. İkincil antikorları (1:1.000) 1x PBS'de seyreltin ve folyo üzerindeki temiz noktalara 30 μL sekonder antikor seyreltme damlacıkları yerleştirin. Kapak kızaklarını seyreltmede baş aşağı yerleştirin.
- Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Kuluçkadan sonra, 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın. Numuneleri DAPI içeren montaj ortamındaki cam kızaklara monte edin. Gece boyunca oda sıcaklığında ve karanlıkta kurumaya bırakın. Örnekleri konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin.
Representative Results
Epizomal yeniden programlama ve farklılaşmayı birleştiren bu adım adım protokolle, podositle ilgili bir gende hastanın mutasyonunu taşıyan podositler üretmek mümkündür. Bu, hastalığa özgü podosit değişikliklerinin ex vivo analizini sağlar. Hastanın genetik arka planı, tüm farklı hücre aşamalarında protokol sırasında korunur. Ek olarak, terminal olarak farklılaşmış proliferasyon yapmayan podositlerin yetersiz hücre sayısı sınırlaması, hiPSC türevi podositler kullanılarak aşılabilir. HiPSC-podositlerin, hiPSC'lere yeniden programlama ve ardından podositlere farklılaşma yoluyla büyümüş dermal fibroblastlardan üretilmesi birkaç ay sürse de, protokolün üç farklı adımında hücreleri dondurmak mümkündür (Şekil 2). Fibroblastlar, hiPSC'ler ve nefron progenitör hücreleri için nefron progenitör diferansiyasyon ortamında 7 gün boyunca farklılaştıktan sonra donma mümkündür. Bu nedenle, çalışan hücre bankalarının ve büyük ölçekli deneylerin oluşturulması mümkündür.
Şekil 2: Bir faz kontrast mikroskobu ile protokolün bireysel adımları. (A) Büyümüş dermal fibroblastlar. (B) Yeniden programlamadan sonra hiPSC koloni oluşumu. (C) Seçilmiş hiPSC kültürü. (D) 2 günlük farklılaşmadan sonra mezoderm hücreleri. (E) Nefron progenitör farklılaşma ortamında 14 günlük farklılaşmadan sonra nefron progenitör hücreleri. (F) Terminal farklılaştırılmış hiPSC türevi podositler. Ölçek çubukları 300 μm (A,B,D-F) ve 150 μm'yi (C) temsil eder. Kar tanesi olası donma adımlarını vurgular. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Üretilen hiPSC türevli podositler, hücre tipi ve morfolojisi ile ilgili ciddi değişiklikler içeren uzun bir protokolden geçtiğinden, hücre karakterizasyonu zorunludur. Boyut ve hücre şekli gibi hücre morfolojisinin yanı sıra büyüme davranışı, bir faz kontrast mikroskobu kullanılarak izlenebilir. Fibroblastlar, 150 μm ila 300 μm boyutlarında uzun iğ benzeri bir fenotip sunar (Şekil 2A). Yeniden programlamadan sonra, 50 μm küçük hiPSC'lere sahip koloniler oluşur. Bu koloniler, yüksek çekirdek-vücut oranı ve artmış proliferasyon hızı ile ayırt edilen farklı sınırlar ve hiPSC'ler gösterir (Şekil 2C). Podositler terminal olarak farklılaşmış hücreler olduğundan, proliferasyon hızı ilerleyici farklılaşma ile azalır ve hücre morfolojisi belirgin ayak süreçlerine sahip 300 μm büyüklüğünde yıldız şeklindeki podositlere dönüşür (Şekil 2F).
Akıcılık, hiPSC kültürünün kritik bir noktasıdır ve koloniler çok yoğunlaştığında kendiliğinden farklılaşma ortaya çıkabilir (Şekil 3). Bu koloniler, kültür kabının etkilenen kısımlarını kazıyarak geçmeden önce çıkarılmalıdır.
Şekil 3: Farklı kalitedeki hiPSC'lere örnekler. Başarılı bir şekilde (A) yeniden programlanmış hiPSC kolonilerinin ve (B) seçilmiş hiPSC'lerin faz kontrast görüntülerinin yanı sıra (C) spontan farklılaşma, (D, E) hiPSC olmayan koloniler ve (F) çok yoğun bir hiPSC kültürü. Ölçek çubukları 300 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Bu protokolün farklı hücre tipleri, belirli bir işaretleyicinin ekspresyonu ile ilgili olarak doğrulanmalıdır. Yeniden programlamadan sonra, hiPSC'ler pluripotens kapasitesini yeniden kazanır ve SSEA4, OCT3/4 ve Ki67 gibi proliferasyon ve pluripotens belirteçlerini eksprese eder (Şekil 4)38,39,40. Yeniden programlamanın yanı sıra uzun süreli hiPSC kültürü ve farklılaşmanın anormal bir karyotipe yol açabileceği veya daha doğrusu mutasyonlara neden olabileceği bilinmektedir41. Bu nedenle, kültürlenmiş hücrelerin genetik arka planı zaman içinde ve farklı pasajlarda g-bandı ve tüm ekzom dizilimi ile izlenmelidir.
Şekil 4: İmmünofloresan boyama ile üretilen hiPSC'lerin karakterizasyonu. Üretilen hiPSC'lerin (A) proliferatif belirteç Ki67'nin yanı sıra pluripotens belirteçleri (B) OCT3/4 ve (C) SSEA4 için boyanarak karakterizasyonu. Ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Morfolojik olarak, hiPSC türevli podositler yıldız şeklinde görünür ve siPodositlere kıyasla uzun birincil ve ikincil ayak süreçlerinin farklı bir ağını ifade eder (Şekil 5). HiPSC türevi podositler, sinaptopodin, nefrin ve podosin gibi podosit spesifik belirteç proteinlerini eksprese eder (Şekil 6A-C)42.
Şekil 5: HiPSC türevli podositlerin siPodositlere kıyasla morfolojisi. Sağlıklı bir donörden alınan (A,B) hiPSC türevli podositlerin hücre morfolojisi ve filopodia açısından (A,D) siPodositlerle faz kontrast mikroskobu (A,C) ve taramalı elektron mikroskobu (B,D) kullanılarak karşılaştırılması. Ölçek çubukları 150 μm (A,C) ve 20 μm'yi (B,D) temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Bu nedenle, hiPSC türevli podositlerin sadece sağlıklı donörlerden değil, aynı zamanda podosit spesifik genlerde mutasyonları olan hastalardan da karşılaştırılması, hastanın mutasyonunun ex vivo olarak bireyselleştirilmiş karakterizasyonuna izin verir.
Şekil 6: HiPSC türevli podositlerde ve siPodositlerde podosit spesifik bir belirtecin karakterizasyonu. Sağlıklı bir donörden alınan (A-K) hiPSC türevi podositlerin podosit spesifik belirteç proteinleri sinaptopodin (A,D), nefrin (B,E) ve podosin (C,F) açısından (D-F) sipodositlerle karşılaştırılması. Ölçek çubukları 50 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1. Çalışmada kullanılan tüm hücre kültürü ortamlarının ve çözeltilerinin bileşimi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Bu hücre kültürü tabanlı protokol, insan dermal fibroblastlarının hastaya özgü hiPSC'lere epizomal yeniden programlanmasını ve daha sonra hiPSC türevli podositlere farklılaşmasını birleştirir. Bu, podosit hasarı ile ilgili genetik glomerüler hastalığı olan hastalardan podositlerin mutasyona bağlı değişikliklerini incelememizi sağlar. Dermal fibroblastları elektroporasyon yoluyla entegrasyonsuz bir yöntemle yeniden programlama protokolü, Bang ve ark.32 ve Okita ve ark.33'ün yayınlanmış çalışmalarından uyarlanmıştır. Podositleri hiPSC'lerden ayırma protokolü, Musah ve ark.28,34,35'in yayınlanan protokolünden uyarlanmıştır. HiPSC'lerdenpodosit üretimini açıklayan yayınlar zaten mevcuttur 27,34,35. Bununla birlikte, burada sağlanan protokol, hiPSC'lerin podositlere farklılaşması konusunda optimize edilmiş ve daha ucuzdur. Musah ve ark.'nın yayınladığı protokolle karşılaştırıldığında, bu protokolü vitronektin, laminin ipek-511 ve çözünür bazal membran matrisi gibi farklı kaplama reaktifleri üzerinde test ettik. Vitronektin ve laminin silk-511 konsantrasyonları 5 μg / mL 28,34,35 yerine 2,5 μg / mL'ye düşürülebilir. Ayrıca, BMP7 ve aktivin A-iki çok pahalı büyüme faktörü konsantrasyonlarını-% 50 oranında, 100 ng / mL'den 50 ng / mL'ye düşürmek mümkün olmuştur.
Bu, daha ucuz farklılaşma sağlar. 7. günden itibaren nefron progenitör hücreleri hala çoğalıyordu ve donma olasılığı daha önce gösterilmişti. Bu hücreleri çözüldükten sonra ve Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM) ve B27'yi içeren bazik ortamda son farklılaşmadan önce birkaç gün boyunca genişlettik ve maliyetleri daha da düşürdük. Farklılaşma adımlarına ek olarak, bu protokol fibroblastların deri biyopsilerinden sonraki nesil hastaya özgü hiPSC'lerle epizomal yeniden programlama yoluyla büyümesini tanımlar. Bu iki yöntemin kombinasyonu hastaya özgü podositlerin üretilmesini sağlar. Bu nedenle, hastaya özgü hiPSC türevli podositler üretmek için daha önce bu kadar ayrıntılı olarak tanımlanmamış eksiksiz bir adım adım protokol burada sağlanmıştır.
Genel protokol birkaç farklı hücre tipi içerdiğinden, üretilen hücre tiplerini farklı adımlarda karakterize etmek çok önemlidir. Hücreler uzun süre kültürdedir, bu nedenle kalite kontrol farklı pasajlarda yapılmalıdır. HiPSC'lerle çalışırken, günlük beslenmenin yanı sıra hücre davranışı ve morfoloji izlemesi de gereklidir. Farklılaştırma ortamının sterilitesi, 0,2 μm'lik bir filtre aracılığıyla filtre sterilizasyonu ile sağlanmalıdır. Cilt biyopsisinden hiPSC türevi podositlere kadar tüm protokol birkaç ay sürer, ancak hücreleri işlemin farklı aşamalarında dondurmak mümkündür. Nefron progenitör farklılaşma ortamında 7 gün sonra fibroblastlar, seçilmiş hiPSC klonları ve proliferatif nefron progenitör hücreleri dondurulabilir ve çalışan bir hücre bankası oluşturulabilir.
HiPSC türevli sağlıklı podositler ayrı bir birincil ve sekonder ayak süreçleri ağı geliştirse de (Şekil 5A,B) ve tipik podosit spesifik belirteci eksprese etse de (Şekil 6A-C), in vivo olarak görüldüğü gibi karakteristik yarık diyaframların klasik iki boyutlu hücre kültürü modellerinde taklit edilmesi zordur. Dahası, diğer glomerüler hücre tipleriyle hücreler arası iletişim bu mono-kültür ortamında mümkün değildir.
Terminal farklılaşmış durumları ve proliferasyon kapasitesinin olmaması nedeniyle, podositleri ex vivo olarak incelemek zordur. Koşullu olarak ölümsüzleştirilen birincil podositlerin yardımıyla, ısıya duyarlı bir anahtarın yerleştirilmesiyle bu sınırlamanın üstesinden gelmek mümkündür, bu da hücrelerin 33 ° C'de çoğaldığı ve 37 ° C'de farklılaştığı bir hücre kültürü modeli ile sonuçlanır13,14. Bu siPodositler podosit araştırması için yüksek potansiyele sahip olsalar da, belirteç ekspresyonunun eksikliği, farklılaşmamış morfoloji ve ayak süreçlerinin oluşturulamaması gibi sınırlamalar vardır15,16.
Podositlerin hasta kaynaklı somatik hücrelerden farklılaşması, hastalıklı podositlerin ex vivo sağlıklı kontrol hücreleri ile üretilmesini ve karşılaştırılmasını sağlar. Bu, podosit spesifik genlerdeki mutasyonlara bağlı podosit hasarını incelememizi sağlar. Ayrıca, hiPSC'lerle çalışmak, üç boyutlu hücre kültürü hastalık modelleri, daha doğrusu organoidler43,44 oluşturma potansiyeline sahiptir. HiPSC türevli podositlerin glomerüler endotel hücreleri veya mezangial hücreler gibi diğer glomerüler hücrelerle birlikte kültürlenmesi, sağlık ve glomerüler hastalıkta hücreler arası iletişim konusunda yeni anlayışlara yol açabilir.
Ayrıca, hastaya özgü podositlerin karakterizasyonu ve tedavisi yüksek verim analizinde ex vivo olarak gerçekleştirilebilir. Bireyselleştirilmiş yaklaşım, spesifik mutasyonlar için yeni terapötik hedefleri araştırma ve gelecekte bireyselleştirilmiş tıp yapma fırsatı sunmaktadır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Friedrich-Alexander Üniversitesi Erlangen-Nürnberg Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi (IZKF) tarafından Janina Müller-Deile'ye verilen M4-IZKF-F009 hibe numarası ve Janina Müller-Deile'ye verilen 01GM2202D hibe numarası ile STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS proje adı altında Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) tarafından finanse edilmiştir. Annalena Kraus'a SEM görüntülerinin çekilmesindeki desteği için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm sterile filter | Rotilab | P668.1 | for sterilization of differentiation medium |
| all-trans retinoic acid | Stem Cell Technologies | 72262 | supplement for differentiation |
| B27 supplement (50 x), serum free | Gibco | 17504044 | supplement for serum-free differentiation medium |
| BG iMatrix-511 Silk | biogems | RL511S | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| Bovine serum albumin (BSA) | Roth | 8076.4 | |
| CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL | Greiner bio-one | 82050-856 | cell culture plastics suitable for fibroblast culture |
| CHIR99021 (5 mg) | Sigma-Aldrich | 252917-06-9 | supplement for differentiation |
| Corning Matrigel hESC qualified matrix | Corning | 354277 | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix) |
| countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | to count cells |
| countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | to count cells | |
| cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white | Sarstedt | 72380 | cryovials for freezing of cells |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Roth | A994.1 | for fibroblast freezing medium |
| DMEM/F12 (1:1) (1 x) | Gibco | 11320074 | basic medium for differentiation |
| DMEM/F12 + Glutamax | Gibco | 10565018 | basic medium for fibroblast medium |
| EVOS M5000 Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | phase contrast microscope |
| fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) | PAN Biotech | P301902 | serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium |
| fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile | Fisherbrand | FB104 | cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap) |
| fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | mounting medium containing dapi |
| gauge needle (0.6 x 30 mm) | BD Microlance3 | 300700 | for separation of hiPSC colonies into small pieces |
| human Recombinant Activin A Protein | 78001.1 | Stem cell technologies | supplement for differentiation |
| human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) | Peprotech | 120-03P | supplement for differentiation |
| human VEGF-165 Recombinant Protein | Thermo Scientific | PHC9394 | supplement for differentiation |
| insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) | Gibco | 41400045 | supplement for podocyte maintenance medium |
| LB medium | Roth | X964.1 | for sterility test of hiPSC culture |
| lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit | Sigma Aldrich | MP0035-1KT | commercial mycoplasma detection kit |
| microscope slides | Diagonal GmbH & Co.KG | 21,102 | |
| microtube 1.5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| mTeSR1 Complete Kit | Stem Cell Technologies | 85850 | basic medium for serum-free hiPSC culture medium |
| nalgene freezing container Mr.Frosty | Roth | AC96.1 | to ensure optimal freezing conditions |
| normal goat serum | abcam | ab 7481 | for preincubation solution and antibody diluent |
| nunc 24 well plates | Thermo Scientific | 142485 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nunc 48 well plates | Thermo Scientific | 152640 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nunc 6 well plates | Thermo Scientific | 140685 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nunc EasYDish Dishes 100 mm | Thermo Scientific | 150466 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 167008 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nutriFreez D10 Cryopreservation Medium | Sartorius | 05-713-1E | serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells |
| Opti-MEM | Gibco | 11058021 | electroporation medium |
| pCXLE-hMLN | Addgene | #27079 | plasmid for episomal reprogramming |
| pCXLE-hOCT3/4 plasmid | Addgene | #27077 | plasmid for episomal reprogramming |
| pCXLE-hSK plasmid | Addgene | #27078 | plasmid for episomal reprogramming |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | to avoid bacterial contamination |
| plastic coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes |
| ROTI Histofix | Roth | P087.3 | commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells |
| RPMI 1640 + L-Glutamine | Gibco | 21875034 | basic medium for podocyte maintenance medium |
| staining chamber StainTray Black lid | Roth | HA51.1 | |
| stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs |
| sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) | Gibco | 14190094 | used for washing and coating |
| sterile water | Roth | T1432 | |
| syringe without needle 20 mL | BD Plastipak | 300629 | to filter sterilize differentiation medium |
| TC dish 100 mm | Sarstedt | 8,33,902 | sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture |
| TC dish 35 mm | Sarstedt | 8,33,900 | sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy |
| triton X 100 | Roth | 3051.3 | for preincubation solution |
| trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | to count cells |
| trypsin-EDTA (10 x) | Biowest | X0930-100 | dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells |
| tube 15 mL | Greiner bio-one | 188271-N | |
| tube 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| vitronectin ACF | Sartorius | 05-754-0002 | extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| Y-27632 dihydrochloride (10 mg) | Tocris | 1254 | to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting |
| Primary antibodies | |||
| OCT4 | Stem Cell Technologies | 60093.1 | pluripotency marker, dilution 1:200 |
| SSEA-4 | Stem Cell Technologies | 60062FI.1 | pluripotency marker, dilution 1:100 |
| Ki67 | Abcam | ab15580 | proliferation marker, dilution 1:300 |
| synaptopodin | Proteintech | 21064-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:200 |
| nephrin | Progen | GP-N2 | podocyte-specific marker, dilution 1:25 |
| podocin | proteintech | 20384-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:100 |
| Secondary antibodies | |||
| goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21435 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
| alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A31634 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
| donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
| goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
| goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
References
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Grgic, I., et al. Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).
- Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub. Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).
- Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D.
- Schell, C., Huber, T. B. The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).
- Muller-Deile, J., Schiffer, M. Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out. Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).
- Boehlke, C., et al. Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement. American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).
- Schiffer, M., et al. Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models. Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).
- Kopp, J. B., et al.
- Wiggins, R. C. The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases. Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).
- Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Saleem, M. A., et al. A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).
- Eto, N., et al. Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression. Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).
- Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T.
- Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).
- Shih, N. Y., et al. CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain. The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).
- Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).
- Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. Dipping your feet in the water: podocytes in urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).
- Camici, M.
- Muller-Deile, J., et al. Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 3621 (2018).
- Schenk, H., et al. Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb. Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).
- Petermann, A., Floege, J. Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity. Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).
- Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).
- Petermann, A. T., et al. Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable. Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).
- Sakairi, T., et al. Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).
- Rauch, C., et al. Differentiation of human iPSCs into functional podocytes. PLoS One. 13 (9), e0203869 (2018).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell. Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).
- Bang, J. S., et al. Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts. Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
- Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299 (2020).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).
- Hoffding, M. K., Hyttel, P. Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).
- Bharathan, S. P., et al. Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells. Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
- Vaz, I. M., et al. Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming. Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147 (2021).
- Reiser, J., Altintas, M. M.
- Ohmori, T., et al. Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells. Scientific Reports. 11 (1), 3982 (2021).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
