Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Generering av patient-härledda podocyter från hudbiopsier

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65364
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Nephrology and Hypertension, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University (FAU) Erlangen-Nürnberg, 2Research Center on Rare Kidney Diseases (RECORD), University Hospital Erlangen

Summary

Detta manuskript beskriver ett tvåstegsprotokoll för att generera patientspecifika podocyter från dermala fibroblaster via episomal omprogrammering till humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) och efterföljande differentiering till podocyter.

Abstract

Podocyter är epitelceller som sitter på urinplatsen i den glomerulära filtreringsbarriären som bidrar till glomerulus selektiva filterfunktion. Mutationer i podocytspecifika gener kan orsaka fokal segmentell glomeruloskleros (FSGS), och podocyter påverkas också i många andra primära och sekundära nefropatier. På grund av deras differentierade natur är primära cellodlingsmodeller begränsade för podocyter. Därför används vanligen villkorligt odödliga celler. Dessa villkorligt odödliga podocyter (ciPodocyter) har emellertid flera begränsningar: cellerna kan dedifferentiera i odling, särskilt när de når sammanflöde, och flera podocytspecifika markörer uttrycks antingen bara lite eller inte alls. Detta ifrågasätter användningen av ciPodocyter och deras tillämplighet för fysiologisk, patofysiologisk och klinisk räckvidd. Här beskriver vi ett protokoll för generering av humana podocyter - inklusive patientspecifika podocyter - från en hudstansbiopsi genom episomal omprogrammering av dermala fibroblaster till hiPSC och efterföljande differentiering till podocyter. Dessa podocyter liknar in vivo-podocyter mycket bättre när det gäller morfologiska egenskaper, som utvecklingen av fotprocesser och uttrycket av den podocytspecifika markören. Slutligen, men ändå viktigare, upprätthåller dessa celler patienternas mutationer, vilket resulterar i en förbättrad ex vivo-modell för att studera podocytsjukdomar och potentiella terapeutiska substanser i ett individualiserat tillvägagångssätt.

Introduction

Podocyter är specialiserade, postmitotiska njurepitelceller som bildar njurens glomerulära filtreringsbarriär tillsammans med det glomerulära basalmembranet (GBM), glomerulära endotelceller och glykokalyx. Fenotypiskt består podocyter av en cellkropp och primära, mikrotubulidrivna membranförlängningar, liksom sekundära förlängningar som kallas fotprocesser 1,2. Den glomerulära filtreringsbarriären som filtrerar urin från blodet är byggd av fenestrerat endotel, GBM och en specialiserad typ av intercellulär korsning som förbinder närliggande podocytfotprocesser, kallad slitsmembranet av podoctyes3. Under friska förhållanden behålls proteiner större än albumin från filtreringsbarriären på grund av deras storlek och laddning4.

Mutationer i cytoskeletala eller podocytspecifika gener, såväl som cirkulerande faktorer som påverkar podocytsignalvägar, är kända för att inducera podocytefacement, avlossning eller apoptos, vilket resulterar i proteinuri och glomerulär skleros. I synnerhet är cytoskeletal omläggning, förändringar i podocytpolaritet eller skada på fotprocesser med tillhörande förlust av slitskorsningar avgörande5. På grund av deras terminalt differentierade status kan podocyter knappast ersättas efter avlägsnande av GBM. Men om podocyter är fästa vid GBM kan de fortfarande återhämta sig från utplåning och reformera interdigiterande fotprocesser 6,7,8. Ytterligare förståelse av de händelser som leder till podocytskador vid olika glomerulära sjukdomar kan ge nya terapeutiska mål som kommer att hjälpa till att utveckla behandlingar för dessa sjukdomar. Podocytskador är ett kännetecken för olika glomerulära sjukdomar, inklusive fokal segmentell glomeruloskleros (FSGS), diabetesnefropati, minimal förändringssjukdom och membranös glomerulonefropati, vilket kräver tillförlitliga podocyte ex vivo-modeller för att studera de patologiska mekanismerna och potentiella behandlingsmetoder för dessa sjukdomar 9,10. Podocyter kan studeras ex vivo genom klassisk primär cellodling baserat på isolering av glomeruli genom differentialsiktning11. På grund av det terminalt differentierade tillståndet med begränsad spridningskapacitet använder de flesta forskare mus- eller humana ciPodocytcellinjer som uttrycker temperaturkänsliga varianter av SV40 large T-antigenet. Alternativt isoleras ciPodocyter från transgena möss som har SV40 Tag immortalizing gen 1,12.

CiPodocyter förökar sig vid 33 °C, men går in i tillväxtstopp och börjar differentiera vid 37 °C13,14. Man måste komma ihåg att experimentella data som erhållits med dessa celler bör tolkas med viss försiktighet, eftersom cellerna genereras med hjälp av en onaturlig geninsättning15. Eftersom dessa celler har en odödlig gen förändras den cellulära fysiologin på grund av pågående proliferation12. Podocytcellinjer genererade av detta tillvägagångssätt har nyligen ifrågasatts, eftersom mus-, human- och rått-ciPodocyter uttrycker mindre än 5% av synaptopodin och nefrin på proteinnivå, liksom NPHS1 och NPHS2 på mRNA-nivå jämfört med glomerulärt uttryck16. Dessutom uttrycker de flesta podocytcellinjer inte nefrin17,18. Chittiprol et al. beskrev också en signifikant skillnad i cellmotilitet och svar på puromycin och doxorubicin i ciPodocyter16. Podocyter finns i urinen efter avlägsnande från GBM i olika glomerulära sjukdomar 19,20,21,22. Livskraftiga urinpodocyter kan odlas ex vivo i upp till 2-3 veckor, men de flesta celler genomgår apoptos23,24. Intressant är att podocyter inte bara finns i urinen hos patienter med glomerulär sjukdom utan också i urinen hos friska försökspersoner, troligen när de är senescent-igen med en begränsad potential för replikation i kultur24. Dessutom är det urin-härledda podocytantalet begränsat, och cellerna dedifferentierar i odling, visar mindre fotprocesser, förändrar morfologi och viktigast av allt har begränsad spridningskapacitet. Uttrycket av podocytspecifika gener saknas, försvinner inom några veckor eller varierar mellan dessa cellkloner. Vissa celler som är positiva för den podocytspecifika markören uttryckte markören för tubulära epitelceller eller myofibroblaster och mesangiala celler, vilket tyder på dedifferentiering och/eller transdifferentiering av de odlade urinpodocyterna24,25.

Nyligen har genereringen av ciPodocytcellinjer härrörande från urinen hos patienter och friska frivilliga genom transduktion med ett värmekänsligt SV40 stort T-antigen och hTERT beskrivits26. mRNA-uttryck för synaptopodin, nestin och CD2-associerat protein detekterades, men podocin mRNA saknades i alla kloner. Förutom problemen med urinpodocyter innehåller dessa celler också den införda odödliga genen, vilket resulterar i de nackdelar som diskuterats ovan.

Däremot har humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) en enorm kapacitet att självförnya och differentiera till flera celltyper under lämpliga förhållanden. Det har tidigare visats att hiPSC kan fungera som en nästan obegränsad källa till podocyter27,28.

Här beskrivs ett tvåstegsprotokoll för att generera patientspecifika podocyter från dermala fibroblaster av hudstansbiopsier med efterföljande episomal omprogrammering till hiPSC och en slutlig differentiering till hiPSC-härledda podocyter (figur 1).

Figure 1
Figur 1: Protokoll för att generera patientspecifika hiPSC-härledda podocyter. Grafisk översikt över protokollet för att generera patientspecifika podocyter från dermala fibroblaster av en hudbiopsi genom omprogrammering till hiPSC och differentiering till podocyter. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Som ett första steg växte somatiska dermala fibroblaster ut från en hudstansbiopsi och omprogrammerades till hiPSC med hjälp av en integrationsfri metod genom elektroporering med plasmider som uttrycker transkriptionsfaktorerna OCT3/4, KLF4, SOX2 och c-MYC 29,30,31. Uppkomna hiPSC-kolonier valdes därefter ut och utvidgades. Differentiering började med induktionen av den mesodermala linjen genom aktivering av WNT-signalvägen, följt av generering av nefronprogenitorceller som fortfarande kunde föröka sig. Slutligen differentierades cellerna i podocyter. I denna procedur modifierade och kombinerade vi tidigare publicerade protokoll för episomal omprogrammering för generering av hiPSC av Bang et al.32 och Okita et al.33, samt ett protokoll för differentiering av hiPSC till podocyter av Musah et al.28,34,35.

Faktum är att podocyter genererade av vårt protokoll hade en fenotyp närmare podocyter in vivo, avseende utvecklingen av ett distinkt nätverk av primära och sekundära fotprocesser och uttrycket av podocytspecifika markörer, som synaptopodin, podocin och nefrin. Med användning av hiPSC-härledda podocyter bibehålls patientens genetiska bakgrund under omprogrammering och differentiering. Detta möjliggör patientspecifik podocytsjukdomsmodellering och upptäckt av potentiella terapeutiska substanser ex vivo i ett nästan obegränsat cellantal. Dessutom är detta protokoll minimalt invasivt, kostnadseffektivt, etiskt acceptabelt och kan underlätta nya vägar för läkemedelsutveckling.

Protocol

Protokollet godkändes av etikkommittén vid Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg (251_18B), och alla patienter och proband gav skriftligt samtycke. Alla experiment utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter. För sammansättning av alla medier och lösningar som används här, se tabell 1.

1. Utväxt av dermala fibroblaster från en hudstansbiopsi

  1. Överför hudstansbiopsin till ett sterilt 15 ml koniskt rör med 10 ml förvärmt fibroblastmedium.
  2. Ta bort mediet och tvätta hudstansbiopsin tre gånger med 5 ml steril, förvärmd 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Överför hudstansbiopsin med sterila pincett till en 10 cm cellodlingsplatta och skär den på bredden i tre eller fyra bitar med en steril skalpell och lämna epidermis och dermis.
  3. Överför varje bit till en steril 35 mm plastcellodlingsform och tryck den försiktigt mot odlingsskålen. Ta bort överflödigt medium runt biopsibitarna. Låt torka i 5-10 min tills vätskan avdunstar och biopsin fästs på cellodlingsplasten.
  4. Tillsätt 1 ml fibroblastmedium droppvis med en 1000 μL pipett runt biopsin och fyll försiktigt till en slutlig volym på 3 ml. Odla vid 37 °C, 5%CO2 i 7 dagar utan att mata och flytta skålen. Byt försiktigt mediet till färskt, förvärmt fibroblastmedium. Efter 7 dagar kan utvuxna spindelliknande fibroblaster övervakas runt hudbiopsin med hjälp av ett faskontrastmikroskop36.
    OBS: När utvuxna fibroblaster når skålens kant, fortsätt igen från steg 1.3 för att generera ytterligare en sats fibroblaster.
  5. För expansion av de utvuxna fibroblasterna, tvätta med 2 ml förvärmd 1x PBS, dissociera fibroblasterna med 1 ml 1x trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och inkubera i 5 minuter vid 37 °C, 5%CO2. Överför de fristående cellerna till ett 15 ml koniskt rör och tvätta cellodlingsskålen med 2 ml färskt, förvärmt fibroblastmedium.
  6. Slå samman tvättmediet i röret för att neutralisera dissociationsmedlet och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid 20 °C. Aspirera supernatanten och suspendera cellpelleten med 1 ml färskt, förvärmt fibroblastmedium. Räkna cellerna med en Neubauer-kammare eller automatiserad cellräknare med trypanblått och frö 2,5 x 10 3 till 5 x 103 fibroblaster per cm2 i färskcellodlingskolvar.
  7. Sätt tillbaka kolvarna i inkubatorn och fördela cellerna jämnt genom att flytta kolvarna tre gånger i varje riktning. Nästa dag, byt ut mediet med färskt, förvärmt fibroblastmedium. Byt medium två gånger i veckan och dela när fibroblasterna når cirka 80% sammanflöde.

2. Frysning av dermala fibroblaster

  1. För att frysa fibroblasterna, tvätta dem med 5 ml förvärmd 1x PBS. Aspirera PBS och dissociera fibroblasterna med 4 ml 1x trypsin-EDTA. Sätt tillbaka kolven i inkubatorn och inkubera i 5–7 minuter vid 37 °C vid 5 % CO2. Övervaka lossningen med hjälp av ett faskontrastmikroskop och knacka mot kolvens sida för att lossa cellerna.
  2. Överför de fristående cellerna till ett 15 ml koniskt rör. Tvätta cellodlingskolven med 5 ml färskt, förvärmt fibroblastmedium. Slå samman tvättmediet i det koniska röret och centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 20 °C.
  3. Aspirera supernatanten och suspendera cellpelleten med 2 ml färskt, förvärmt fibroblastmedium. Räkna cellerna och överför 1 x 106 celler till ett nytt koniskt rör. Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 20 °C.
  4. Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten med 1 ml kallt fibroblastfrysmedium bestående av 90% fosterkalvserum och 10% dimetylsulfoxid (DMSO). Överför till en kryovial, placera i en frysbehållare och frys över natten vid -80 ° C. För långvarig lagring, placera kryovialen i en tank med flytande kväve nästa dag.

3. Episomal omprogrammering av fibroblaster för att generera hiPSC

  1. För episomal omprogrammering, använd 1,5 x 106 fibroblaster från passage 4 till 8. För att nå detta cellnummer, använd två till tre 250 ml kolvar med cirka 70% sammanflöde.
  2. Dagen före omprogrammering, dela fibroblasterna i ett 1: 2-förhållande för att säkerställa deras proliferativa tillstånd. Aspirera därför mediet och tvätta kolvarna med 5 ml förvärmd 1x PBS per kolv. Aspirera PBS och dissociera fibroblasterna med 4 ml 1x trypsin-EDTA. Sätt tillbaka kolvarna i inkubatorn och inkubera i 5–7 minuter vid 37 °C och 5 %CO2. Övervaka lossningen med hjälp av ett faskontrastmikroskop och knacka mot kolvens sida för att lossa cellerna från plastytan.
  3. Överför de löstagna cellerna till ett 50 ml koniskt rör och tvätta cellodlingskolvarna med 5 ml färskt, förvärmt fibroblastmedium. Slå samman tvättmediet i det koniska röret och centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 20 °C. Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 6 ml färskt, förvärmt fibroblastmedium.
  4. Bered sex nya cellodlingskolvar genom att tillsätta 5 ml färskt, förvärmt fibroblastmedium per kolv. Tillsätt 1 ml fibroblastcellssuspension till varje kolv. Sätt tillbaka kolvarna i inkubatorn och fördela cellerna jämnt genom att flytta kolvarna tre gånger i varje riktning.
  5. För episomal omprogrammering, täck två 10 cm cellodlingsplattor lämpliga för hiPSC-odling med 4 ml kall beläggningslösning per platta. Inkubera plattorna i 1 timme vid 37 °C.
    OBS: För att odla hiPSC krävs olika cellodlingsplaster och ytterligare extracellulär matrisbeläggning (se materialtabell).
  6. Ta bort mediet från fibroblasterna och tvätta med 10 ml förvärmd 1x PBS per kolv. Aspirera PBS och dissociera fibroblasterna med 4 ml 1x trypsin-EDTA per kolv genom att inkubera i 5–7 minuter vid 37 °C. Övervaka lossningen med hjälp av ett faskontrastmikroskop och knacka vid behov mot kolvens sida för att lossa cellerna från plastytan.
  7. Överför de fristående cellerna till ett 50 ml koniskt rör. Tvätta de tomma kolvarna med 6 ml förvärmt fibroblastmedium för att samla upp de återstående cellerna och slå samman dem i det koniska röret. Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 20 °C. Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 3 ml färsk, förvärmd 1x PBS.
  8. Räkna cellerna och överför 1,5 x 106 fibroblaster i ett nytt koniskt rör. Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 20 °C. Kassera supernatanten och suspendera cellpelleten igen i 5 ml elektroporeringsmedium och centrifugera igen. Under tiden aspirerar du beläggningslösningen från de belagda 10 cm cellodlingsplattorna och tillsätter 7 ml förvärmt fibroblastmedium.
  9. Efter centrifugering, kassera supernatanten och suspendera cellpelleten i elektroporeringsmedium med en koncentration av 1,5 x 106 celler i 250 μl. Överför 250 μL cellsuspensionen till en elektroporeringskyvett med 4 mm mellanrumsavstånd (se materialtabell).
  10. Bered en blandning av plasmidtransfektion genom att tillsätta 4 μg av varje plasmid (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) till en total volym av 50 μl elektroporeringsmedium. Överför till kyvetten och blanda genom att snärta försiktigt. Elektroporat med en puls vid 280 V.
  11. Klipp en pipettspets med steril sax och överför 125 μL elektroporerade fibroblaster till var och en av de beredda 10 cm cellodlingsplattorna. Fördela cellerna genom att agitera plattorna tre gånger i alla riktningar och placera dem tillbaka i inkubatorn. Inkubera över natten vid 37 °C med 5 % CO2 utan störningar.
  12. För att ta bort döda celler, byt ut mediet nästa dag med 7 ml färskt, förvärmt fibroblastmedium. Byt mediet till hiPSC-odlingsmediet 2 dagar efter elektroporering och byt ut det varannan dag under de kommande 20 dagarna.

4. Urval, expansion och kvalitetskontroll av genererade hiPSC

  1. Övervaka cellerna dagligen i minst 20 dagar med hjälp av ett faskontrastmikroskop med ett 10x eller 20x mål för att observera bildandet av hiPSC-kolonier efter elektroporering. Om hiPSC-kolonierna är cirka 300 μm i diameter med tydliga gränser och hiPSC:erna uppvisar ett högt förhållande mellan kärnor och kropp, är hiPSC-kolonierna redo att väljas genom plockning (figur 2B, C och figur 3).
  2. Före plockning, täck en platta med 96 brunnar som är lämplig för hiPSC-odling med 100 μL beläggningslösning per brunn och inkubera i 1 timme vid 37 °C. Under inkubation, markera kolonier av intresse längst ner i cellodlingsskålen med en penna. För slutlig beredning av 96-brunnsplattan, avlägsna beläggningslösningen och tillsätt 100 μL förvärmt hiPSC-odlingsmedium innehållande 10 μM ROCK-hämmare Y27632 till varje brunn.
  3. Tvätta cellerna med förvärmd 1x PBS och tillsätt färskt, förvärmt hiPSC-odlingsmedium innehållande 10 μM ROCK-hämmare Y27632 innan du plockar för att avlägsna döda celler. För att välja hiPSC-kolonier, använd en mätnål och dela hiPSC-kolonierna i små bitar genom att dra ett rutnät i varje koloni.
  4. Använd ett faskontrastmikroskop, kontrollera att kolonierna är framgångsrikt uppdelade i bitar. Överför dem med en 100 μL pipett till den förberedda 96-brunnsplattan. Håll pipetten upprätt över kolonin utan att röra cellerna för att undvika repor och förlust av kolonin.
  5. Placera 96-brunnsplattan i inkubatorn vid 37 °C med 5% CO2 och låt cellerna fästa över natten utan störningar. Håll diskarna med fibroblast- och hiPSC-blandningen, om plockningen inte lyckas. Ta därför bort ROCK-hämmare Y27632 genom att byta medium till hiPSC-odlingsmedium och placera plattorna tillbaka i inkubatorn.
  6. Nästa dag, byt medium på 96-brunnsplattan till 200 μL färskt hiPSC-odlingsmedium och byt det varannan dag. Övervaka plattan med 96 brunnar nästa dag och markera brunnarna med framgångsrikt plockade kloner.
    OBS: Om de plockade hiPSC-klonerna inte är helt utvalda efter första försöket och fibroblasterna kan hittas i brunnen, upprepa plockningen från 96-brunnen eller skrapa fibroblasterna från plattan.

5. Expansion av utvalda hiPSC-kloner

  1. Övervaka hiPSC-klonerna med hjälp av ett faskontrastmikroskop. Om de valda hiPSC:erna når cirka 70 % sammanflöde är hiPSC-klonerna redo för expansion.
  2. Belägg en platta med 48 brunnar lämplig för hiPSC-odling med 250 μL beläggningslösning per brunn i 1 timme vid 37 °C. Ersätt beläggningslösningen med 200 μL färskt, förvärmt hiPSC-odlingsmedium innehållande 10 μM ROCK-hämmare Y27632.
  3. För att lossa hiPSC:erna från 96-brunnsplattan, skrapa plastytan med en 1 000 μL pipettspets. Överför de fristående hiPSC:erna från plattan med 96 brunnar till en platta med 48 brunnar. Byt medium nästa dag till färskt, förvärmt hiPSC-odlingsmedium för att avlägsna döda celler och ROCK-hämmaren Y27632.
  4. Om hiPSC-klonerna når cirka 70% sammanflöde, överför hiPSC till en 24-brunnsplatta. Belägg därför en platta med 24 brunnar som är lämplig för hiPSC-odling med 400 μL beläggningslösning per brunn i 1 timme vid 37 °C. Ersätt beläggningslösningen med 400 μL färskt, förvärmt hiPSC-odlingsmedium innehållande 10 μM ROCK-hämmare Y27632. Aspirera mediet från de 48 brunnarna och tvätta med 500 μL förvärmd 1x PBS.
  5. Byt ut PBS mot 100 μl enzymatisk cellavskiljningslösning innehållande 10 μM ROCK-hämmare Y27632 och inkubera vid 37 °C i 4 minuter. Skölj bort hiPSC:erna från plattan med en 1 000 μl pipett. Överför de dissocierade cellerna till ett 15 ml koniskt rör. Tvätta den tomma plattan med 48 brunnar med hiPSC-odlingsmedium innehållande 10 μM ROCK-hämmare Y27632 och slå samman den i det koniska röret.
  6. Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 20 °C. Aspirera supernatanten och suspendera hiPSC igen i 1 ml hiPSC-odlingsmedium innehållande 10 μM ROCK-hämmare Y27632 och överför till en platta med 24 brunnar. Placera plattan i inkubatorn vid 37 °C vid 5 %CO2 och fördela cellerna genom att skaka om plattan tre gånger i alla riktningar. Låt cellerna fästa över natten utan störningar.
  7. Nästa dag, byt medium till hiPSC-odlingsmedium utan ROCK-hämmare Y27632.
    Om hiPSC-kloner når cirka 70 % sammanflöde, överför hiPSC:erna till en platta med 12 brunnar genom att upprepa steg 5.4 till 5.7 med ökade volymer som är lämpliga för ett 12-brunnsformat. Om hiPSC:erna från 12-brunnsplattan når cirka 70 % sammanflöde, överför hiPSC-klonerna till en 6-brunnsplatta med ökade volymer för ett 6-brunnsformat.

6. Frysning av utvalda hiPSC-kloner

  1. För att frysa utvalda hiPSC-kloner, aspirera mediet från en 6-brunnsplatta. Tvätta brunnarna med 2 ml 1x PBS. Aspirera och dissociera hiPSCs med 1 ml enzymatisk celldetacheringslösning innehållande 10 μM Y27632. Sätt tillbaka plattan i inkubatorn och inkubera i 4 minuter vid 37 °C och 5 %CO2.
  2. Skölj bort hiPSC:erna från plattan med en 1 000 μl pipett och överför de fristående cellerna till ett 15 ml koniskt rör. Tvätta plattan med 2 ml färskt, förvärmt hiPSC-odlingsmedium innehållande 10 μM ROCK-hämmare Y27632. Slå samman i det koniska röret och centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 20 °C. Aspirera supernatanten och suspendera cellpelleten igen med 2 ml färskt, förvärmt hiPSC-odlingsmedium innehållande 10 μM ROCK-hämmare Y27632.
  3. Räkna cellerna och överför 1 x 106 celler till ett nytt koniskt rör. Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 20 °C. Aspirera supernatanten, suspendera cellpelleten igen i 1 ml kallt, serumfritt hiPSC-frysmedium och frys i en kryovial med en frysbehållare över natten vid -80 °C. För långvarig lagring, placera kryovialen i en flytande kvävetank nästa dag.

7. HiPSC kvalitetskontroll

  1. Karakterisering av hiPSC-morfologi
    1. Kontrollera den karakteristiska hiPSC-morfologin med hjälp av ett faskontrastmikroskop med ett 20x-objektiv. Efter omprogrammering ändras cellmorfologin från långa, spindelliknande fibroblaster till små, runda hiPSC, vilket ger ett högt förhållande mellan kärnor och kropp som växer i kolonier med distinkta gränser (figur 2C).
    2. Om hiPSC-kolonierna blir för täta och spontan differentiering sker, skrapa bort de differentierade delarna från plattan med en pipettspets (figur 3). Eftersom hiPSC har en hög spridningshastighet, mata hiPSC-kulturerna varje dag med färskt, förvärmt hiPSC-matningsmedium.
  2. Karakterisering av pluripotensmarkörer genom immunofluorescensfärgning
    1. För att kontrollera de genererade hiPSC: erna för pluripotensmarkör via immunofluorescensfärgning, placera plasttäckglas i en platta med 24 brunnar och täck med 250 μL beläggningslösning i 1 timme vid 37 °C och 5%CO2. Byt ut beläggningslösningen mot 1 ml förvärmt hiPSC-odlingsmedium innehållande 10 μM ROCK-hämmare Y27632.
    2. Frö 1,9 x 104 dissocierade hiPSC per 24-brunn. Låt hiPSC:erna fästa över natten vid 37 °C och 5 %CO2 utan störningar. Se steg 5.4 till 5.6 för dissociation av hiPSC:erna. Byt ut mediet nästa dag mot hiPSC-odlingsmedium utan ROCK-hämmare Y27632.
    3. För färgning, tvätta cellerna med 1 ml förvärmd 1x PBS och fixera därefter hiPSCs med 4% paraformaldehyd i 10 minuter vid rumstemperatur. Tvätta de fasta hiPSC:erna med 1x PBS och blockera ospecifika bindningsställen med 200 μL förinkubationslösning per brunn i 1 h vid rumstemperatur. Utspädda primära antikroppar Ki67 (1:300), OKT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) i antikroppsspädningsmedel.
    4. Rengör en plastfolie med 70% etanol och placera den i en färgningskammare fylld med en vattenbehållare. Placera droppar med 30 μL primära antikroppsutspädningar på folien. Placera de fasta proverna upp och ned i spädningen och inkubera över natten vid 4 °C.
    5. Nästa dag, tvätta proverna tre gånger med 1x PBS i 5 minuter och placera 30 μL droppar sekundära antikroppsutspädningar (1:1 000) på rena fläckar på folien. Placera lockglasen upp och ner i utspädningen. Inkubera i 1 h vid rumstemperatur i mörkret.
    6. Efter inkubation, tvätta tre gånger med 1x PBS i 5 min. Montera provexemplaren på glasskivor i monteringsmediet som innehåller DAPI. Låt torka över natten vid rumstemperatur och i mörker och avbilda proverna med hjälp av ett konfokalmikroskop (figur 4).
  3. Uteslutning av bakterier och mykoplasmakontaminering
    1. För att utesluta bakteriekontaminering, överför 500 μL dissocierade hiPSC till 5 ml förvärmt Luria-Bertani (LB) medium. Se steg 5.4 till 5.6 för dissociation av hiPSC:erna. Inkubera över natten vid 37 °C. Om LB-mediet verkar grumligt har bakteriekontaminering sannolikt inträffat. Kassera cellerna.
    2. För att utesluta mykoplasmakontaminering, samla in medium som inte har ersatts på 2 dagar från 6 brunnar med cirka 90% konfluenta hiPSC. Använd kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) för att detektera mykoplasmakontaminering. Många kommersiella mykoplasmadetekteringssatser finns tillgängliga för detta ändamål.

8. Differentiering av hiPSC i podocyter

  1. Förberedelse och lagring av tillväxtfaktorer
    1. För beredning av en lagerkoncentration på 10 mM Y27632, rekonstituera 10 mg Y27632 (molekylvikt 320,26 g/mol) i 3,12 ml sterilt vatten. Förvara 100 μl alikvoter vid -20 °C och späd 1:1 000 i cellodlingsmedium så att en slutlig koncentration på 10 μM uppnås.
    2. För beredning av en lagerkoncentration på 30 mM CHIR99021, rekonstituera 5 mg CHIR99021 (molekylvikt 465,34 g/mol) i 358,2 μl steril DMSO. Förvara 50 μl alikvoter vid -20 °C och späd 1:10 000 i cellodlingsmedium så att en slutlig koncentration på 3 μM uppnås.
    3. För att bereda en stamkoncentration på 100 μg/ml aktivin A, rekonstituera 100 μg aktivin A i 1 ml 1x PBS innehållande 0,1 % bovint serumalbumin (BSA). Förvara 100 μl alikvoter vid -20 °C och späd 1:2 000 i cellodlingsmedium så att en slutlig koncentration på 50 ng/ml uppnås.
    4. För att bereda en stamkoncentration på 100 μg/ml benmorfogent protein 7 (BMP7), rekonstituera 100 μg BMP7 i 1 ml sterilt vatten innehållande 0,1 % BSA. Förvara 100 μl alikvoter vid -20 °C och späd 1:2 000 i cellodlingsmedium så att en slutlig koncentration på 50 ng/ml uppnås.
    5. För beredning av en stamkoncentration på 100 μg/ml vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), rekonstituera 100 μg VEGF i 1 ml sterilt vatten. Förvara 100 μl alikvoter vid -20 °C och späd 1:4 000 i cellodlingsmedium så att en slutlig koncentration på 25 ng/ml uppnås.
    6. För att bereda en lagerkoncentration på 10 mM av all-trans retinsyra, rekonstituera 10 mg all-trans retinsyra i 3,33 ml steril DMSO. Förvara 100 μl alikvoter vid -20 °C och späd 1:100 i cellodlingsmedium så att en slutlig koncentration på 0,5 μM uppnås.
  2. Aktivering av WNT-signalväg för att inducera mesodermhärstamning
    1. För differentiering av hiPSC i podocyter som härrör från hiPSC, beläggningscellodlingsplattor eller kolvar lämpliga för hiPSC-odling med beläggningslösning i 1 timme vid 37 °C och 5 %CO2. Den totala volymen beläggningslösning är 1 ml per 6-brunnsodlingsplatta eller 4 ml per 10 cm cellodlingsplatta.
    2. Aspirera mediet och tvätta hiPSC: erna med förvärmd 1x PBS. Aspirera PBS och tillsätt enzymatisk cellavskiljningslösning innehållande 10 μM Y27632 vid en total volym av 1 ml per 6-brunnsodlingsplatta eller 4 ml per 10 cm cellodlingsplatta.
    3. Sätt tillbaka plattan i inkubatorn och inkubera i 4 minuter vid 37 °C och 5 %CO2. Skölj bort hiPSC:erna från plattan med en 1 000 μl pipett. Överför de fristående cellerna till ett koniskt rör.
    4. Tvätta plattan med färskt, förvärmt hiPSC-odlingsmedium innehållande 10 μM ROCK-hämmare Y27632. Slå samman tvättmediet i det koniska röret för att neutralisera dissociationsreagenset. Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 20 °C. Aspirera supernatanten och suspendera cellpelleten igen med 2 ml färskt, förvärmt hiPSC-odlingsmedium innehållande 10 μM ROCK-hämmare Y27632.
    5. Räkna cellerna och frö 1 x 104 hiPSCs / cm2. Fördela cellerna genom att agitera tre gånger i alla riktningar. Låt hiPSC:erna fästa över natten vid 37 °C med 5 %CO2 utan störningar.
    6. Nästa dag, ersätt mediet med 2 ml förvärmt mesodermdifferentieringsmedium innehållande 1x B27-tillskott, 1% penicillin-streptomycin, 3 μM CHIR99021, 50 ng / ml aktivin A och 10 μM ROCK-hämmare Y27632.
  3. Differentiering i nefronprogenitorceller
    1. Efter 2 dagar, byt mesodermmediet till 2 ml förvärmt nefronprogenitordifferentieringsmedium innehållande 1x B27-tillskott, 1% penicillin-streptomycin, 3 μM CHIR99021, 50 ng / ml aktivin A och 50 ng / ml BMP7 per 6-brunnsodlingsplatta eller 6 ml per 10 cm cellodlingsplatta. Byt medium varannan dag under de kommande 14 dagarna.
      OBS: Nefronprogenitorceller prolifererar och kan passeras och frysas efter 7 dagars differentiering i nefronprogenitorexpansionsmedium.
    2. För att dela nefronprogenitorcellerna, belägg cellodlingsplasten som är lämplig för hiPSC-odling med beläggningslösning i 1 timme vid 37 °C. Byt ut beläggningslösningen mot nefronprogenitorexpansionsmedium. Aspirera media och tvätta cellerna med förvärmd 1x PBS. Ta bort PBS och dissociera cellerna med 1x trypsin-EDTA.
    3. Inkubera i 5 minuter vid 37 °C och 5 %CO2. Övervaka avlägsnandet av cellerna med hjälp av ett faskontrastmikroskop. Om det behövs, knacka mot sidan av plasten för att lossa cellerna från ytan. Skölj cellerna från plattan och överför till ett koniskt rör. Tvätta den tomma kolven eller plattan med samma volym förvärmt expansionsmedium för nefronprogenitorer som dissociationsreagenset.
    4. Samla tvättmediet i det koniska röret. Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 20 °C. Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten med 2 ml färskt, förvärmt nefronprogenitorexpansionsmedium. Räkna cellerna och fröet 1,5 x 104 nefron stamceller per cm2 för ytterligare differentiering.
      OBS: För att frysa nefronprogenitorcellerna, resuspendera 1 x 106 celler i 1 ml kallt serumfritt kryokonserveringsmedium och överför till en kryovial. Frys i en frysbehållare vid -80 °C över natten och överför till en tank med flytande kväve för långtidsförvaring.
    5. Placera plattorna tillbaka i inkubatorn och fördela cellerna jämnt genom omrörning tre gånger i alla riktningar. Byt mediet nästa dag till färskt, förvärmt nefronprogenitordifferentieringsmedium. Byt ut mediet varannan dag tills cellerna differentieras i 14 dagar i nefronprogenitordifferentieringsmedium.
  4. Terminal differentiering till hiPSC-härledda podocyter
    1. Aspirera mediet och tillsätt 2 ml förvärmt podocytdifferentieringsmedium innehållande 1x B27-tillskott, 1% penicillin-streptomycin, 3 μM CHIR99021, 50 ng / ml aktivin A, 50 ng / ml BMP7, 25 ng / μL VEGF och 0,5 μM all-trans retinsyra per 6-brunnsodlingsplatta eller 6 ml per 10 cm cellodlingsplatta. Sätt tillbaka plattorna i inkubatorn vid 37 °C och 5 %CO2. Byt medium varannan dag i 4 dagar med färskt, förvärmt podocytdifferentieringsmedium.
    2. För att hålla hiPSC-podocyterna i kultur efter differentiering, mata cellerna två gånger i veckan med podocytunderhållsmedium innehållande 10% fosterkalvserum, 1% penicillin-streptomycin och 0,1% insulin-transferrin-selen.
      OBS: Terminal differentierade hiPSC-podocyter prolifererar inte längre. Det är dock möjligt att hålla dem i cellodling i upp till 4 veckor.
  5. Upptining och expansion av frysta nefronprogenitorceller
    1. Belägg en ny cellodlingsplastkolv lämplig för hiPSC-odling med beläggningslösning i 1 timme vid 37 °C och 5 %CO2. Byt ut beläggningslösningen mot 5 ml expansionsmedium för nefronprogenitor.
    2. Förbered ett 15 ml koniskt rör med 7 ml förvärmt nefronprogenitorexpansionsmedium. Tina de frysta cellerna vid 37 °C i ett vattenbad utan rörelse i cirka 20 timmar. Ta kryovialen ur vattenbadet när hälften av cellerna tinas och lite is kvarstår.
    3. Spraya kryovialen med 70% etanol och lägg i ett biosäkerhetsskåp. Överför tinade celler till det koniska röret med det förvärmda nefronprogenitorexpansionsmediet. Använd en 1 000 μL pipett och låt cellerna rinna ner längs rörets vägg mycket långsamt.
    4. Tvätta den tomma kryovialen med 1 ml nefron stamfader expansionsmedium för att samla de återstående cellerna och poolen i det koniska röret. Centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid 20 °C och suspendera cellpelleten på nytt i färskt, förvärmt expansionsmedium för nefronprogenitor.
    5. Överför de tinade cellerna till den belagda kolven och byt mediet nästa dag till färskt, förvärmt nefronprogenitorexpansionsmedium. Innan ytterligare differentiering, låt cellerna proliferera i nefronprogenitorexpansionsmedium genom att byta medium varannan dag och fortsätt från steg 8.3.5.

9. Karakterisering av hiPSC-härledda podocyter genom immunofluorescensfärgning

  1. För att kontrollera de differentierade podocyterna för den podocytspecifika markören via immunofluorescensfärgning, placera plasttäckglas i en platta med 24 brunnar och täck med 250 μL beläggningslösning i 1 timme vid 37 °C och 5% CO2. Byt ut beläggningslösningen mot 1 ml förvärmt expansionsmedium för nefronprogenitor. Frö 2,5 x 104 dissocierade nefronstamceller per 24-brunnsplatta. Se steg 8.3.2 till 8.3.4 för dissociation av nefronprogenitorceller.
  2. Låt cellerna fästa över natten vid 37 °C och 5% CO2 utan störningar. Byt ut mediet nästa dag med förvärmt nefronprogenitordifferentieringsmedium.
  3. Avsluta differentieringen genom att byta medium varannan dag tills cellerna differentieras i totalt 14 dagar i nefronprogenitordifferentieringsmedium och ytterligare 5 dagar i podocytdifferentieringsmedium.
  4. Efter den slutliga differentieringen, tvätta cellerna med 1 ml förvärmd 1x PBS. Fixera hiPSC-podocyterna med 4% paraformaldehyd i 10 minuter vid rumstemperatur. Tvätta de fasta cellerna med 1x PBS och blockera ospecifika bindningsställen med 200 μL preinkubationslösning per brunn i 1 timme vid rumstemperatur.
  5. Späd de primära antikropparna synaptopodin (1:200), podocin (1:100) och nefrin (1:25) i antikroppsspädningsmedel och placera droppar med 30 μL primär antikroppsutspädning på en ren plastfolie i en färgningskammare innehållande en vattenbehållare.
  6. Placera lockglas med fasta hiPSC-podocyter upp och ner i utspädningen. Inkubera över natten vid 4 °C. Nästa dag, tvätta tre gånger med 1x PBS i 5 min. Späd de sekundära antikropparna (1:1 000) i 1x PBS och placera droppar med 30 μL sekundär antikroppsutspädning på rena fläckar på folien. Placera lockglasen upp och ner i utspädningen.
  7. Inkubera i 1 h vid rumstemperatur i mörkret. Efter inkubation, tvätta tre gånger med 1x PBS i 5 min. Montera proverna på glasskivor i monteringsmedium som innehåller DAPI. Låt torka över natten i rumstemperatur och i mörker. Avbilda proverna med hjälp av ett konfokalmikroskop.

Representative Results

Med detta steg-för-steg-protokoll som kombinerar episomal omprogrammering och differentiering är det möjligt att generera podocyter som bär en patients mutation i en podocytrelevant gen. Detta möjliggör analys av sjukdomsspecifika podocytförändringar ex vivo. Patientens genetiska bakgrund bevaras under protokollet under alla de olika cellstadierna. Dessutom kan begränsningen av otillräckligt cellantal av terminalt differentierade icke-prolifererande podocyter övervinnas genom att använda hiPSC-härledda podocyter. Även om det tar flera månader tills hiPSC-podocyter genereras från urvuxna dermala fibroblaster via omprogrammering till hiPSC och efterföljande differentiering till podocyter, är det möjligt att frysa celler i tre olika steg i protokollet (figur 2). Frysning är möjlig för fibroblaster, hiPSC och nefronprogenitorceller efter differentiering i nefronprogenitordifferentieringsmedium i 7 dagar. Därför är generering av fungerande cellbanker och storskaliga experiment möjliga.

Figure 2
Figur 2: Enskilda steg i protokollet genom ett faskontrastmikroskop. a) Ur huden utvuxna fibroblaster. (B) hiPSC-kolonibildning efter omprogrammering. (C) Utvald hiPSC-kultur. (D) Mesodermceller efter 2 dagars differentiering. (E) Nephron stamceller efter 14 dagars differentiering i nefron stamfader differentieringsmedium. (F) Terminaldifferentierade hiPSC-härledda podocyter. Skalstaplarna representerar 300 μm (A,B,D-F) och 150 μm (C). Snöflingan belyser möjliga fryssteg. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Eftersom de genererade hiPSC-härledda podocyterna passerar ett långt protokoll med drastiska förändringar avseende celltyp och morfologi är cellkarakterisering obligatorisk. Cellmorfologi, som storlek och cellform, samt tillväxtbeteende, kan övervakas med hjälp av ett faskontrastmikroskop. Fibroblaster uppvisar en lång spindelliknande fenotyp med en storlek på 150 μm till 300 μm (figur 2A). Efter omprogrammering uppstår kolonier med 50 μm små hiPSC. Dessa kolonier uppvisar distinkta gränser och hiPSC som kännetecknas av ett högt förhållande mellan kärnor och kropp och ökad spridningshastighet (figur 2C). Eftersom podocyter är terminalt differentierade celler minskar proliferationshastigheten med progressiv differentiering och cellmorfologin ändras till 300 μm stora stjärnformade podocyter med framträdande fotprocesser (figur 2F).

Konfluens är en kritisk punkt i hiPSC-kulturen, och spontan differentiering kan uppstå när kolonier växer för täta (figur 3). Dessa kolonier måste avlägsnas innan de passerar genom att skrapa de drabbade delarna av odlingsskålen.

Figure 3
Figur 3: Exempel på hiPSC av olika kvalitet. Faskontrastbilder av framgångsrikt (A) omprogrammerade hiPSC-kolonier och (B) utvalda hiPSC, såväl som (C) spontan differentiering, (D,E) icke-hiPSC-kolonier och (F) en alltför tät hiPSC-kultur. Skalstrecken representerar 300 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

De olika celltyperna i detta protokoll måste valideras med avseende på uttrycket av en specifik markör. Efter omprogrammering återfår hiPSC pluripotenskapacitet och uttrycker proliferations- och pluripotensmarkörer som SSEA4, OCT3/4 och Ki67 (figur 4)38,39,40. Det är känt att omprogrammering, liksom den långa kulturen av hiPSC och differentiering, kan leda till en onormal karyotyp, eller snarare inducera mutationer41. Därför bör den genetiska bakgrunden hos de odlade cellerna övervakas över tid och vid olika passager genom g-banding och helexomsekvensering.

Figure 4
Figur 4: Karakterisering av genererade hiPSC genom immunofluorescensfärgning. Karakterisering av genererade hiPSC genom färgning för (A) proliferativ markör Ki67, samt pluripotensmarkörerna (B) OCT3/4 och (C) SSEA4. Skalstrecken representerar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Morfologiskt verkar hiPSC-härledda podocyter stjärnformade och uttrycker ett distinkt nätverk av långa primära och sekundära fotprocesser jämfört med ciPodocyter (figur 5). HiPSC-härledda podocyter uttrycker podocytspecifika markörproteiner som synaptopodin, nefrin och podocin (figur 6A-C)42.

Figure 5
Figur 5: Morfologi hos hiPSC-härledda podocyter jämfört med ciPodocyter. Jämförelse av (A,B) hiPSC-härledda podocyter från en frisk donator till (C,D) ciPodocyter avseende cellmorfologi och filopodi med hjälp av ett faskontrastmikroskop (A,C) och svepelektronmikroskop (B,D). Skalstaplarna representerar 150 μm (A,C) och 20 μm (B,D). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Därför möjliggör jämförelsen av hiPSC-härledda podocyter, inte bara från friska donatorer utan också från patienter med mutationer i podocytspecifika gener, individualiserad karakterisering av patientens mutation ex vivo.

Figure 6
Figur 6: Karakterisering av en podocytspecifik markör i hiPSC-härledda podocyter och ciPodocyter. Jämförelse av (AC) hiPSC-härledda podocyter från en frisk givare till (D-F) ciPodocyter avseende podocytspecifika markörproteiner synaptopodin (A,D), nefrin (B,E) och podocin (C,F). Skalstrecken representerar 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1. Sammansättning av alla cellodlingsmedier och lösningar som användes i studien. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Discussion

Detta cellodlingsbaserade protokoll kombinerar episomal omprogrammering av humana dermala fibroblaster till patientspecifika hiPSC och efterföljande differentiering till hiPSC-härledda podocyter. Detta gör det möjligt för oss att studera mutationsrelaterade förändringar av podocyter från patienter med genetisk glomerulär sjukdom avseende podocytskada. Protokollet för att omprogrammera dermala fibroblaster med en integrationsfri metod genom elektroporering är anpassat från det publicerade arbetet av Bang et al.32 och Okita et al.33. Protokollet för att skilja podocyter från hiPSC är anpassat från det publicerade protokollet från Musah et al.28,34,35. Det finns redan publikationer tillgängliga som beskriver genereringen av podocyter från hiPSCs 27,34,35. Protokollet som tillhandahålls här är dock optimerat och billigare när det gäller differentiering av hiPSC till podocyter. Jämfört med det publicerade protokollet från Musah et al. testade vi detta protokoll på olika beläggningsreagens, som vitronektin, lamininsilke-511 och solubiliserad basalmembranmatris. Koncentrationerna av vitronektin och lamininsilke-511 kan minskas till 2,5 μg/ml istället för 5 μg/ml 28,34,35. Dessutom var det möjligt att minska koncentrationerna av BMP7 och aktivin A-två mycket dyra tillväxtfaktorer - med 50%, från 100 ng / ml till 50 ng / ml.

Detta möjliggör billigare differentiering. Nefronprogenitorceller från dag 7 förökade sig fortfarande, och möjligheten till frysning visades tidigare. Vi expanderade dessa celler efter upptining och före slutlig differentiering i basmedium innehållande Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) och B27 i flera dagar, vilket minskade kostnaderna ytterligare. Förutom differentieringsstegen beskriver detta protokoll utväxten av fibroblaster från hudbiopsier med efterföljande generation av patientspecifika hiPSC via episomal omprogrammering. Kombinationen av dessa två metoder möjliggör generering av patientspecifika podocyter. Därför tillhandahålls här ett komplett steg-för-steg-protokoll för att generera patientspecifika hiPSC-härledda podocyter som inte beskrivits tidigare så detaljerat.

Eftersom det övergripande protokollet innehåller flera olika celltyper är det viktigt att karakterisera de genererade celltyperna i olika steg. Celler är i odling under en längre tid, så kvalitetskontroll bör utföras vid olika passager. Vid arbete med hiPSC är daglig utfodring samt cellbeteende och morfologiövervakning nödvändig. Differentieringsmediets sterilitet måste säkerställas genom sterilisering av filter genom ett 0,2 μm filter. Hela protokollet, från hudbiopsi till hiPSC-härledda podocyter, tar flera månader, men det är möjligt att frysa cellerna i olika stadier av processen. Fibroblaster, utvalda hiPSC-kloner och proliferativa nefronprogenitorceller efter 7 dagar i nefronprogenitordifferentieringsmedium kan frysas och en fungerande cellbank kan genereras.

Även om hiPSC-härledda friska podocyter utvecklar ett distinkt nätverk av primära och sekundära fotprocesser (figur 5A, B) och uttrycker typisk podocytspecifik markör (figur 6A-C), är karakteristiska slitsmembran, som ses in vivo, svåra att efterlikna i klassiska tvådimensionella cellodlingsmodeller. Dessutom är intercellkommunikation med andra glomerulära celltyper inte möjlig i denna monokulturinställning.

På grund av deras terminaldifferentierade tillstånd och brist på spridningskapacitet är det svårt att studera podocyter ex vivo. Med hjälp av villkorligt odödliggörande primära podocyter är det möjligt att övervinna denna begränsning genom införandet av en värmekänslig omkopplare, vilket resulterar i en cellodlingsmodell där celler prolifererar vid 33 ° C och differentierar vid 37 ° C13,14. Även om dessa ciPodocyter har hög potential för podocytforskning, finns det begränsningar, som bristen på marköruttryck, dedifferentierad morfologi och misslyckande med att bilda fotprocesser15,16.

Differentieringen av podocyter från patienthärledda somatiska celler möjliggör generering och jämförelse av sjuka podocyter med friska kontrollceller ex vivo. Detta gör det möjligt för oss att studera podocytskador på grund av mutationer i podocytspecifika gener. Dessutom har arbetet med hiPSC potential att skapa tredimensionella cellodlingssjukdomsmodeller, eller snarare organoider43,44. Samodling av hiPSC-härledda podocyter med andra glomerulära celler, som glomerulära endotelceller eller mesangiala celler, kan leda till nya insikter om intercellkommunikation vid hälsa och glomerulär sjukdom.

Dessutom kan karakterisering och behandling av de patientspecifika podocyterna utföras ex vivo i high-throughput-analys. Det individualiserade tillvägagångssättet öppnar möjligheten att undersöka nya terapeutiska mål för specifika mutationer och att utföra individualiserad medicin i framtiden.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) vid Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg med bidragsnummer M4-IZKF-F009 som gavs till Janina Müller-Deile, och av Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) under projektnamnet STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, bidragsnummer 01GM2202D som gavs till Janina Müller-Deile. Vi tackar Annalena Kraus för stödet med att ta SEM-bilder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm sterile filter Rotilab P668.1 for sterilization of differentiation medium
all-trans retinoic acid Stem Cell Technologies 72262 supplement for differentiation
B27 supplement (50 x), serum free Gibco 17504044 supplement for serum-free differentiation medium
BG iMatrix-511 Silk biogems RL511S additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Bovine serum albumin (BSA)  Roth 8076.4
CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL Greiner bio-one 82050-856 cell culture plastics suitable for fibroblast culture
CHIR99021 (5 mg) Sigma-Aldrich 252917-06-9  supplement for differentiation
Corning Matrigel hESC qualified matrix  Corning 354277 additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix)
countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283 to count cells
countess II FL  Automated Cell Counter Invitrogen to count cells
cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white Sarstedt 72380 cryovials for freezing of cells
dimethyl sulfoxide (DMSO)  Roth A994.1 for fibroblast freezing medium
DMEM/F12 (1:1) (1 x) Gibco 11320074 basic medium for differentiation
DMEM/F12 + Glutamax Gibco 10565018 basic medium for fibroblast medium
EVOS M5000 Imaging System Thermo Fisher Scientific AMF5000 phase contrast microscope
fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) PAN Biotech P301902 serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium
fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile Fisherbrand FB104 cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap)
fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI Invitrogen 00-4959-52 mounting medium containing dapi
gauge needle (0.6 x 30 mm) BD Microlance3 300700 for separation of hiPSC colonies into small pieces
human Recombinant Activin A Protein 78001.1 Stem cell technologies supplement for differentiation
human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) Peprotech 120-03P supplement for differentiation
human VEGF-165 Recombinant Protein Thermo Scientific PHC9394 supplement for differentiation
insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) Gibco 41400045 supplement for podocyte maintenance medium
LB medium Roth X964.1 for sterility test of hiPSC culture
lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma Aldrich MP0035-1KT commercial mycoplasma detection kit
microscope slides Diagonal GmbH & Co.KG 21,102
microtube 1.5 mL  Sarstedt 72706400
mTeSR1 Complete Kit Stem Cell Technologies 85850 basic medium for serum-free hiPSC culture medium
nalgene freezing container Mr.Frosty Roth AC96.1  to ensure optimal freezing conditions
normal goat serum abcam ab 7481 for preincubation solution and antibody diluent
nunc 24 well plates Thermo Scientific 142485 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 48 well plates  Thermo Scientific 152640 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 6 well plates  Thermo Scientific 140685 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc EasYDish Dishes 100 mm Thermo Scientific 150466 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 167008 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nutriFreez D10 Cryopreservation Medium Sartorius 05-713-1E  serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells
Opti-MEM Gibco 11058021 electroporation medium 
pCXLE-hMLN Addgene #27079 plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hOCT3/4 plasmid Addgene #27077 plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hSK plasmid Addgene #27078 plasmid for episomal reprogramming
penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100ML to avoid bacterial contamination
plastic coverslips Sarstedt   83.1840.002 for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes
ROTI Histofix Roth P087.3 commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells
RPMI 1640 + L-Glutamine Gibco 21875034 basic medium for podocyte maintenance medium
staining chamber StainTray Black lid Roth HA51.1
stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501 enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs
sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) Gibco 14190094 used for washing and coating
sterile water Roth T1432
syringe without needle 20 mL BD Plastipak 300629 to filter sterilize differentiation medium
TC dish 100 mm Sarstedt 8,33,902 sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture
TC dish 35 mm Sarstedt 8,33,900 sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy
triton X 100 Roth 3051.3 for preincubation solution 
trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter Invitrogen T10282 to count cells
trypsin-EDTA (10 x)  Biowest X0930-100 dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells
tube 15 mL Greiner bio-one 188271-N
tube 50 mL Greiner bio-one 227261
vitronectin ACF Sartorius 05-754-0002 extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Y-27632 dihydrochloride (10 mg) Tocris 1254 to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting
Primary antibodies
OCT4  Stem Cell Technologies 60093.1 pluripotency marker, dilution 1:200
SSEA-4 Stem Cell Technologies 60062FI.1 pluripotency marker, dilution 1:100
Ki67 Abcam ab15580 proliferation marker, dilution 1:300
synaptopodin Proteintech 21064-1-AP podocyte-specific marker, dilution 1:200
nephrin Progen GP-N2 podocyte-specific marker, dilution 1:25
podocin proteintech 20384-1-AP podocyte-specific marker, dilution 1:100
Secondary antibodies
goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21435 secondary anditbody, dilution 1:1000
alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed Invitrogen A31634 secondary anditbody, dilution 1:1000
donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21422 secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 secondary anditbody, dilution 1:1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
  2. Grgic, I., et al. Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).
  3. Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub. Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).
  4. Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. Structural determinants of glomerular permeability. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).
  5. Schell, C., Huber, T. B. The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).
  6. Muller-Deile, J., Schiffer, M. Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out. Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).
  7. Boehlke, C., et al. Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement. American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).
  8. Schiffer, M., et al. Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models. Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).
  9. Kopp, J. B., et al. Podocytopathies. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68 (2020).
  10. Wiggins, R. C. The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases. Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).
  11. Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
  12. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).
  13. Saleem, M. A., et al. A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).
  14. Eto, N., et al. Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression. Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).
  15. Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).
  16. Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).
  17. Shih, N. Y., et al. CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain. The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).
  18. Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).
  19. Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. Dipping your feet in the water: podocytes in urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).
  20. Camici, M. Urinary detection of podocyte injury. Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).
  21. Muller-Deile, J., et al. Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 3621 (2018).
  22. Schenk, H., et al. Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb. Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).
  23. Petermann, A., Floege, J. Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity. Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).
  24. Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).
  25. Petermann, A. T., et al. Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable. Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).
  26. Sakairi, T., et al. Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).
  27. Rauch, C., et al. Differentiation of human iPSCs into functional podocytes. PLoS One. 13 (9), e0203869 (2018).
  28. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
  29. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  30. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  31. Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell. Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).
  32. Bang, J. S., et al. Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts. Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).
  33. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  34. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
  35. Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299 (2020).
  36. Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).
  37. Hoffding, M. K., Hyttel, P. Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).
  38. Bharathan, S. P., et al. Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells. Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).
  39. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
  40. Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
  41. Vaz, I. M., et al. Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming. Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147 (2021).
  42. Reiser, J., Altintas, M. M. Podocytes. F1000Research. 5, 114 (2016).
  43. Ohmori, T., et al. Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells. Scientific Reports. 11 (1), 3982 (2021).
  44. Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).

Tags

Biologi nummer 195
Generering av patient-härledda podocyter från hudbiopsier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rose, V., Müller-Deile, J.… More

Rose, V., Müller-Deile, J. Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies. J. Vis. Exp. (195), e65364, doi:10.3791/65364 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter