Summary
Denne protokol præsenterer opsætningen og driften af en nyudviklet, 3D-printet bioreaktor til ex vivo-dyrkning af blodkar i perfusion. Systemet er designet til let at blive vedtaget af andre brugere, praktisk, overkommeligt og kan tilpasses forskellige eksperimentelle applikationer, såsom grundlæggende biologi og farmakologiske undersøgelser.
Abstract
Vaskulær sygdom danner grundlaget for de fleste hjerte-kar-sygdomme (CVD'er), som fortsat er den primære årsag til dødelighed og sygelighed på verdensplan. Der er et presserende behov for effektive kirurgiske og farmakologiske indgreb til forebyggelse og behandling af vaskulær sygdom. Til dels begrænser manglen på translationelle modeller forståelsen af de cellulære og molekylære processer, der er involveret i vaskulær sygdom. Ex vivo perfusionskultur bioreaktorer giver en ideel platform for undersøgelse af store dyrekar (herunder mennesker) i et kontrolleret dynamisk miljø, der kombinerer letheden ved in vitro-kultur og kompleksiteten af det levende væv. De fleste bioreaktorer er imidlertid specialfremstillede og derfor vanskelige at vedtage, hvilket begrænser resultaternes reproducerbarhed. Dette papir præsenterer et 3D-printet system, der let kan produceres og anvendes i ethvert biologisk laboratorium, og giver en detaljeret protokol til dets opsætning, hvilket muliggør brugernes drift. Dette innovative og reproducerbare ex vivo perfusionskultursystem muliggør dyrkning af blodkar i op til 7 dage under fysiologiske forhold. Vi forventer, at vedtagelsen af en standardiseret perfusionsbioreaktor vil understøtte en bedre forståelse af fysiologiske og patologiske processer i store dyrs blodkar og fremskynde opdagelsen af nye behandlinger.
Introduction
Den vaskulære væg eksisterer i en reaktiv stabil tilstand, som sikrer både responsivitet over for eksterne stimuli (dvs. trykændring, vasokonstriktorer) og en konsekvent ikke-aktiverende overflade, der forhindrer blodkoagulation og inflammatorisk celleinfiltration1. Som reaktion på aldrings- og livsstilsafhængige stimuli og ved direkte skade aktiverer vaskulærvæggen ombygningsprocesser såsom restenose og aterosklerose, som er kendte bidragydere til almindelige hjerte-kar-sygdomme (CVD'er), såsom iskæmisk slagtilfælde og myokardieinfarkt2. Mens interventionelle tilgange såsom perkutan revaskularisering og stent er tilgængelige til at tackle avancerede manifestationer af vaskulær sygdom, er disse kendt for at fremkalde yderligere vaskulær skade, hvilket ofte fører til tilbagefald. Derudover findes der kun begrænsede forebyggende og tidlige løsninger. Forståelse af mekanismerne, der opretholder vaskulær væghomeostase og driver dens dysfunktion, er kernen i udviklingen af nye kure3.
På trods af den konstante udvikling og fremskridt inden for molekylærbiologi og vævsteknik forbliver dyreforsøg en afgørende komponent i vaskulære biologiske undersøgelser. In vivo dyreforsøg har givet enorm indsigt i mekanismerne bag vaskulær homeostase og patologi; Disse procedurer er imidlertid dyre, har relativt lav gennemstrømning og udgør betydelige etiske spørgsmål. Desuden er små dyr dårligt repræsentative for menneskets vaskulære fysiologi, og større dyreforsøg er langt dyrere og skaber yderligere etiske overvejelser 4,5. Med den stigende efterspørgsel efter farmaceutiske og medicinske løsninger til en hurtigt aldrende befolkning forstørres ulemperne ved dyrebrug, hvilket påvirker reproducerbarheden, pålideligheden og overførbarheden af resultater til patientpleje6.
In vitro-systemer tilbyder en forenklet platform til at studere grundlæggende mekanismer, men undlader at rekapitulere kompleksiteten af hele vævet, interaktionerne mellem celler og den ekstracellulære matrix og de mekaniske kræfter, som er kritiske determinanter i udviklingen af vaskulære sygdomme7.
Ex vivo-undersøgelser udført på hele væv i kunstigt kontrollerede miljøer efterligner in vivo-kompleksiteten, samtidig med at de muliggør undersøgelser med relativt høj kapacitet8. I betragtning af evnen til nøje at kontrollere dyrkningsforholdene og miljøet giver ex vivo-modeller mulighed for en bred vifte af komplekse undersøgelser og giver et passende alternativ til at reducere brugen af dyreforsøg i vaskulær biologi. Statiske vaskulære ringkulturer gav interessant indsigt, men undlod at inkorporere det afgørende hæmodynamiske element9. Faktisk udgør undersøgelsen af det vaskulære system ex vivo specifikke udfordringer relateret til de mange dynamiske kræfter, der gælder for cellerne i blodkarvæggen. Stimuli såsom luminal flow, turbulens, forskydningsspænding, tryk og vægdeformation påvirker signifikant vævspatofysiologi10,11,12.
Perfusionsbioreaktorer er afgørende for at studere vaskulær homeostase og ombygning som reaktion på skade eller hæmodynamiske ændringer13. Desuden kan perfusionskultur bruges til at forbedre modningen og holdbarheden af vævsmanipulerede blodkar (TEBV'er), hvilket giver egnede alternativer til vaskulære transplantater14.
Kommercielt tilgængelige perfusionsbioreaktorer er begrænsede i fleksibilitet og tilpasningsevne og er dyre. Mange af de eksisterende internt udviklede bioreaktorer er i stedet vanskelige at replikere i andre laboratorier på grund af de begrænsede beskrivelser og utilgængelighed af specialfremstillede komponenter 7,8,9,10,11,12. For at overvinde disse begrænsninger har vi for nylig udviklet en ny bioreaktor (EasyFlow), som er økonomisk at producere, rummer en række væv og muliggør relativt enkle ændringer for at tilpasse sig forskellige forskningskrav13. Indsatsen er 3D-printet og passer som i et låg på et standard 50 ml centrifugerør. Dens modulære design og 3D-printfremstilling gør den tilgængelig og reproducerbar på tværs af forskellige laboratorier samt let modificerbar for at tilpasse sig forskellige videnskabelige behov. Denne protokol beskriver samlingen og den grundlæggende drift af bioreaktorsystemet i en arteriel perfusionsindstilling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol beskriver samlingen og brugen af et system bestående af to EasyFlow-indsatser (bioreaktorer): en, der repræsenterer reaktionskammeret (C), der indeholder den perfunderede arterieprøve, og en, der fungerer som et mediumreservoir (R) (figur 1 og figur 2A). Carotidarterier blev opnået fra 4-6 uger gamle mandlige og kvindelige grise (6-12 kg) på The Pirbright Institute, UK. Dyreforsøg blev udført i henhold til Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986) (ASPA) og godkendt af Animal Welfare and Ethical Review Board (AWERB) ved The Pirbright Institute. Dyrene blev opstaldet i overensstemmelse med adfærdskodeksen for opstaldning og pasning af opdrættede dyr. Alle procedurer blev udført af personlige licensindehavere, der var uddannet og kompetente under projektlicens PPL70/8852. Smågrise blev aflivet i henhold til skema et-metoden under ASPA.
1. Indsæt fremstilling
- Skæret fremstilles ved 3D-udskrivning ved hjælp af den medfølgende 3D-model (supplerende fil 1).
BEMÆRK: 3D-modellering muliggør nemme ændringer i designet for at tilpasse sig nye applikationer. Alternative materialer og alternative fremstillingsteknikker kan også bruges til at fremstille skæret. På grund af den komplekse indre struktur er selektiv lasersintring og stereolitografi passende alternativer15. Polyamid 12 (PA12; se materialetabel) er en god materialekandidat på grund af dets overlegne ydeevne med hensyn til væskeretention og modstandsdygtighed over for gentagne varmesteriliseringscyklusser16. - Foliiciumpakningerne og polykarbonatskiverne fremstilles ved laserskæring17 ved hjælp af de design, der findes i supplerende fil 2.
BEMÆRK: Laserskæring er let outsourcet og en billig fremstillingsmetode. Skiver kan fremstilles af rustfrit stål, hvilket giver en mere modstandsdygtig komponent til gentagen brug. Alle andre komponenter er kommercielt tilgængelige varer. En komplet liste over de krævede materialer findes i tabel 1. De kommercielle detaljer om varerne er inkluderet i materialefortegnelsen.
2. Sterilisering, samling og priming af enheden
- Steriliser alle komponenter ved at følge instruktionerne i tabel 1.
- Under laminære strømningsforhold samles to fremstillede skær (trin 1) som vist i figur 1A.
- Saml perfusionssystemet som i figur 2 ved at følge nedenstående trin:
- Fastgør to tilsluttede trevejsventiler til reservoirets R1-port (medieudvekslingsport).
- Tilslut det resulterende udløb til den peristaltiske pumpes hoved ved hjælp af et rør udstyret med en envejsventil (envejs ventilrør).
- Tilslut pumpehovedet til reaktionskammerets C4-port ved hjælp af systemrør udstyret med en envejsventil.
BEMÆRK: Denne gren kan valgfrit udstyres med en tryksensor, der muliggør konstant overvågning. - Tilslut reaktionskammerporten C1 til bløde vægrør, og dette til modstandskanalen (lille indvendig diameter).
BEMÆRK: Længden af modstandsslangen vil i høj grad påvirke trykket i systemet. Dette bør undersøges yderligere for at sikre passende perfusionsbetingelser. - Forlæng modstandskanalen med systemslangen, skab en returkanal og luk den luminale cirkulationssløjfe ved at forbinde til reservoiret ved R5 (figur 2C).
- Opret en overløbskanal ved at forbinde reaktionskammeret C3 til reservoiret R3 med systemrør.
- Fastgør et ventilationsfilter gennem R2.
- Opret et trykspjæld ved at forbinde en sprøjte indeholdende luft og medier til reaktionskammeret C6.
BEMÆRK: Det korrekte luft-til-medie-forhold afhænger af den krævede trykdæmpning.
- Prim systemet med perfusionsmedium (Dulbeccos modificerede ørnemedium [DMEM] + 10% [v/v] føtalt bovint serum [FBS] + 1% [v/v] penicillin-streptomycin + 1% [v/v] amphotericin B + 30% [v/v] dextran; se materialetabel) gennem medieudvekslingsportene og reservoiret.
BEMÆRK: Priming af systemet reducerer risikoen for fangede bobler i systemet og identificerer eventuelle lækager. Den anbefalede mængde medier er ca. 100-120 ml. Det anvendte volumen afhænger af det døde volumen af slangen, der bruges til forsøg.
3. Prøvehøst og klargøring
- Saml venstre og højre fælles halspulsårer, minimere direkte håndtering af arterielt væv13.
- Anbring vævet i koldtransportmedier (DMEM + 20% [v / v] FBS + 2% [v / v] penicillin-streptomycin + 1% [v / v] amphotericin B, se materialetabel) til overførsel.
- I et laminært flowskab skal du fjerne overskydende bindevæv og trimme enderne af vævet ved hjælp af et skalpelblad. Servietten vaskes to gange i koldtransportmedier.
- Anbring væv på en orbitalryster i transportmedier i mindst 30 minutter for grundig vask.
- Tilslut et ikke-forgrenende segment af arterien til bioreaktorsystemet ved hjælp af to piggede luer-stik og fastgør det på plads ved hjælp af en karbinding (vaskulære silikonebånd; Tabel 1).
BEMÆRK: Fartøjsbindingen giver den korrekte spænding og tilbagetrækning for at sikre fartøjet. Den ovale sektion forhindrer vævsskade. - Flow forsigtigt medier gennem arterien for at verificere patency.
- Efter fastgørelse af arterien til den fremstillede indsats skal reaktionsrummet fyldes med perfusionsmedier (trin 2.4). Til sidst skal du forsigtigt fylde lyscirkulationssløjfen med medier for at fjerne eventuel resterende luft fra systemet.
- Tilslut reaktionsrummet med det tidligere monterede perfusionssystem (sektion 2), og fuldfør cirkulationen.
BEMÆRK: Det anbefales at udføre en kvalitetskontrol ved immunhistokemi af forarbejdet væv. Dette identificerer eventuelle skader på grund af overdreven håndtering under forberedelsen.
4. Perfusionskultur og medieændring
- Perfusionssystemet anbringes i en 37 °C inkubator med 5% CO2 og forbindes derefter til en peristaltisk pumpe (se materialetabellen)
- Tilslut eventuelle yderligere (fakultative) anskaffelsessystemer, såsom tryksensorer (se materialetabel).
- Lad systemet ekvilibrere natten over med en lav mediestrømningshastighed på ~10-15 ml/min.
BEMÆRK: Indledende eksperimenter til bestemmelse af pumpeindstillinger, medieflow, systemtryk og optimale trykdæmpere/klemmeindstillinger er nødvendige for at sikre, at passende betingelser er opfyldt. - Den næste dag øges flowet trinvist (+1 rpm hver time, svarende til en ~ 2,5 ml / min stigning hver time i det aktuelle system), indtil den endelige strømningshastighed (35 ml / min) er opnået. Overvåg systemet med jævne mellemrum for lækager.
BEMÆRK: For at beregne den nøjagtige strømningshastighed baseret på den peristaltiske pumpehastighed skal brugerne først udføre tilstrækkelig pumpekalibrering18. Ved hjælp af formlen (1) kan volumetrisk strømningshastighed (Q) beregnes ud fra det dispenserede volumen (V) inden for en given tid (t). For at beregne den estimerede strømningshastighed () kan vi bruge den tidligere beregnede strømningshastighed (Q) og arealet af fartøjets tværsnit (A), beskrevet i ligning (
2).
(1)
(2) - Hver 3. dag udskiftes 50 % af mediet (~50 ml) ved at tilslutte en sprøjte fyldt med friske medier til medieudvekslingsporten tættere på pumpen og en tom sprøjte til porten tættere på beholderen for at opsamle det brugte medium (figur 2).
BEMÆRK: Brug af to trevejsventiler som medieudvekslingsporte letter den kontinuerlige drift af perfusionen under medieudvekslingen. - Ved afslutningen af eksperimentet høstes vævet fra reaktionskammeret ved at trimme enderne forbundet med bioreaktoren ved hjælp af steril kirurgisk saks.
- Demonter, rengør og steriliser systemet til videre brug.
2).
(1)
(2)5. Analyse af prøver
- Den udtagne prøve anbringes i 4% paraformaldehyd (PFA) natten over ved 4 °C.
- Vævet indlejres i optimal skæretemperatur (OCT; se materialetabel)19 og fryses ved nedsænkning i isopentan afkølet i flydende nitrogen.
- Der opnås kryosektioner med en tykkelse på 3-5 mm ved hjælp af en kryostat.
- Udføre immunhistokemi (hæmatoxylin og eosin [H&E]) og/eller immunfluorescens. Følg den typiske immunfluorescensprotokol:
- Bloker skiverne i 1 time ved stuetemperatur med 20% [v/v] gedeserum i fosfatbufret saltvand (PBS; se materialetabel).
- Skiverne inkuberes natten over ved 4 °C med primært kaninantistof mod CD31 fortyndet 1:50 i PBS (se materialetabel).
- Vask tre gange med PBS i 5 min.
- Der inkuberes i 1 time ved 37 °C fluorescerende mærket sekundært gedeantistof fortyndet 1:200 i PBS og α-glat muskelaktin (SMA) direkte konjugeret fluorescerende antistof fortyndet 1:200 i PBS (se materialetabel).
- Vask tre gange med PBS i 5 min.
- Plet kernerne med DAPI fortyndet 1:1.000 i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuber med 0,1% (w/v) Sudan Black (se materialetabel) i 70% (v/v) ethanol i 10 minutter ved stuetemperatur for at reducere vævets autofluorescens.
- Vask vævet med rigeligt deioniseret vand. Monter gliderne i monteringsmediet.
- Billede prøverne med et konfokal laserscanningsmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne undersøgelse har etableret et alsidigt og økonomisk overkommeligt perfusionssystem (EasyFlow)13. Det 3D-printede design af systemet letter vedtagelsen af systemet i andre laboratorier og tilskynder derfor til reproducerbarhed.
Den fremstillede perfusionsindsats er anbragt i et 50 ml centrifugerør, hvilket skaber et isoleret miljø. Ved anvendelse af to perfusionsindsatser kan der etableres en perfusionssløjfe indeholdende et reservoir og et reaktionskammer, hvor den biologiske prøve inkuberes. Perfusionssystemet forbindes derefter til en peristaltisk pumpe og valgfrie opkøbssystemer, såsom tryksensorer og ultralydsenheder, for at overvåge dyrkningsforholdene (figur 2).
Svin halspulsåre prøver blev indsamlet og behandlet, før de blev dyrket i perfusion i 7 dage. For at sikre vævets kvalitet før dyrkning blev der udført indledende forsøg, hvor prøverne blev fastgjort på tidspunktet for udskæring, efter vævsforberedelse og efter perfusion. Fluorescerende farvning for endotelmarkører (CD31) og glatte muskler (αSMA) blev anvendt til at vurdere opretholdelsen af vævsintegritet. Eksempler på velbevarede og beskadigede væv er vist i figur 3 til sammenligning. Billederne viser vigtigheden af skånsom håndtering af vævet på udskæringstidspunktet, da forkert behandling (overdreven strækning, knusning osv.) kan resultere i tab af endotelet forud for kulturen. Resultaterne viser også vigtigheden af den gradvise etablering af perfusion for at undgå luminal skade.
H&E-farvning blev udført sammen med immunofluorescens (IF) farvning for at vise vedligeholdelse af morfologien og den samlede fordeling af cellerne i karvæggen efter 7 dages dyrkning (figur 4). Anvendelsen af fysiologiske kulturbetingelser i enheden sikrer vedligeholdelse af lumens endoteldækning, justering af glatte muskelceller i medierne og bevarelse af vasa vasorum i adventitia.
Bioreaktorsystemets kompakte og modulære design giver også mulighed for en bred vifte af systemopsætninger. Den mindre opsætning består af en enkelt bioreaktor og er ideel til farmakologiske og lavvolumenundersøgelser (recirkulerende perfusion20, samlet volumen på 50-70 ml). For at øge kulturens længde og reducere antallet af medieændringer er et enkelt reservoircirkulationssystem, som det, der er beskrevet i denne protokol, eller et konstant fodringssystem mere ideelt, da de har et større volumen medium i omløb. En dobbelt cirkulation21 opsætning kan etableres for at udforske eksperimentelle indstillinger, hvor lokaliseringen af stimuli er kritisk. Den aktuelle enhed kan også kombineres med mere sofistikerede styresystemer for at muliggøre præcis feedbackkontrol af parametre som pH og opløst ilt (figur 5).
Figur 1: EasyFlow-samlingsskemaer. (A) 3D-gengivne skemaer, der hjælper samlingen af perfusionsindsatsen. (B) Der findes detaljerede skemaer for at lette samlingen af forbindelsesstederne. (C) Et tværsnit af reaktionsrummet fremhæver de væsentlige komponenter i EasyFlow-indsatsen og vævets forbindelse til insertet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk gengivelse af perfusionssystemenheden. (A) Samlet perfusionssystem, der indeholder alle vigtige komponenter, der fremhæver deres relative position i et 3D-gengivet miljø. Ikke alle komponenter skal skaleres. (B) Individuelle isometriske visninger af komponenter præsenteres også. (C) Et overbillede af det samlede perfusionssystem vises for at lette samlingen og forbindelsen af de forskellige komponenter. Portene er mærket og nummereret mod uret for at navigere på de forskellige forbindelsessteder på tværs af perfusionssystemet. Dette princip er blevet anvendt på reservoiret (R) og reaktionskammeret (C). De forskellige kanaler, der forbinder de to kamre, er også blevet tildelt navne som reference. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vedligeholdelse af væv under behandling. (A) Konfokale billeder viser den normale struktur af en arterie på høsttidspunktet, (B) efter rengøring og forarbejdning og (C) efter perfusionskultur, hvilket viser opretholdelsen af en velbevaret morfologi. (D) Eksempler på beskadiget væv på grund af overdreven eller forkert håndtering under behandlingen eller (E) på grund af anvendelse af ikke-fysiologiske dyrkningsbetingelser (dvs. pludselig initiering af høj strømning) viser udtømning af luminaldækningen og forstyrrelse af mediet. (F) Negativ kontrol angiver farvningens specificitet. CD31: grøn; αSMA: rød; DAPI: blå. Skalabjælker: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Histologisk vurdering af væv før og efter perfusionskultur. (A og B) Arterielt væv blev evalueret ved histologi på høsttidspunktet og (C og D) efter 7 dages dyrkning med bioreaktorsystemet. (A og C) H&E-farvning afslører bevarelse af arterievæggens struktur og organisation. (B og D) Immunofluorescensfarvning af det samme væv beviser endoteldækning, glatte muskelcellejustering og vasa vasorum i adventitia. CD31: grøn; SMA: rød; DAPI: blå. Skalabjælker: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Skematisk repræsentation af mulige perfusionsopsætninger. Forskellige alternative opsætninger kan rummes med perfusionsindsatsen for at muliggøre forskellige eksperimentelle undersøgelser. (A) Den recirkulerende perfusionsopsætning minimerer det krævede medievolumen. (B) Den konstante fodringsopsætning giver en jævn tilførsel af medium til vævet. (C) Cirkulation af et enkelt reservoir (som beskrevet i dette papir) giver et større volumen medier til langtidsinkubationer og inkluderer en bufferzone til luftudveksling og trykligevægt. (D) Den dobbelte cirkulationsopsætning giver to forskellige sløjfer, der fodrer den indre (inde i arterien) og den ydre (reaktionsrum) cirkulation uafhængigt. (E) Den dynamiske perfusionsopsætning omfatter kontinuerlige gasser og pH-kontrol ved hjælp af en proportional-integral-derivat (PID) regulator. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Komponenter til fremstilling af skærene. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende fil 1: 3D-model af EasyFlow-indsatsen til fremstilling af 3D-print. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Designskemaer for den konstruerede enhed, sektionsvisning, udskrift og forseglingskomponenter. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo vaskulære perfusionssystemer udgør en unik platform til at studere vaskulære cellers funktion og opførsel i deres oprindelige væv under kontrollerede forhold, hvilket muliggør dissektion af komplekse processer såsom vaskulær remodelleringefter skade 22. De fleste rapporterede bioreaktorer er imidlertid internt fremstillede systemer baseret på specialfremstillede komponenter og er ofte vanskelige at replikere af andre23. Der findes alternative kommercielle løsninger, men mangler fleksibilitet i designet og kan være relativt dyre24.
Vi har udviklet et alternativt system, der giver en nem, billig og reproducerbar platform, der kan fremstilles ved hjælp af open source 3D-printteknikker13. Denne artikel beskriver systemets opsætning for at muliggøre reproducerbare applikationer af slutbrugere. Denne opsætning muliggør anvendelse af fysiologiske og patologiske tilstande af tryk (40-180 mmHg), strømningshastighed (6-30 ml / min) og i kombination med medier, der efterligner blodviskositeten med varierende grader af forskydningsspænding.
Reproducerbarhed er et væsentligt aspekt af den videnskabelige proces, da det giver forskere mulighed for at validere andres resultater og bygge videre på dem for at fremme vores forståelse af vaskulære sygdomme. Desuden er værktøjer, der muliggør og fremmer samarbejde mellem grupper, afgørende for at fremme videnskabelig viden. EasyFlow repræsenterer et eksempel på sådanne open source, tilgængelige løsninger, der let kan produceres og vedtages af laboratorier, der arbejder på en bred vifte af projekter inden for vaskulær videnskab og videre.
Vi rapporterer, at denne enhedskultur opretholder arteriel vævslevedygtighed i mindst 7 dage og kan bruges til at modellere specifikke trin i vaskulær sygdom. Ved hjælp af dette kunne man modellere fysiologiske strømningshastigheder og trykforhold13. Det er vigtigt, at denne perfusionskultur er omkostningseffektiv på grund af de lave produktionsomkostninger og den lave mængde medium, der er nødvendig for at betjene systemet.
3D-designet kan også tilpasses nye applikationer, og nye materialer til print kan testes. Selv i sit nuværende format kan prøveopbevaringsrummet let tilpasses prøver af forskellig størrelse ved at ændre længden af beslagene eller boringen af luer-konnektorerne. Det er vigtigt at bemærke, at i betragtning af enhedens modulære karakter og dens små dimensioner kan denne bioreaktor anvendes i flere opsætninger (figur 5) og kan anvendes på multiplexkulturer, hvor flere prøver kan udsættes for forskellige forhold på samme tid i separate bioreaktorer.
Det forventes, at brugen af systemet udvides i fremtiden til at understøtte dyrkning af blodkar fra forskellige oprindelser (f.eks. Forskellige arter) og af forskellig art (f.eks. Vener, lymfatiske) og måske anvendes til dyrkning af andre hule væv (f.eks. Luftrør, tarm). Forskning viser især, at dyrkning af vævsmanipulerede stilladser i konstant perfusion hjælper den homogene fordeling af celler inden for konstruktion og modning af det resulterende væv25,26. Derudover bidrager såning af vaskulære transplantater i perfusion til at opnå et mere ensartet cellulariseret vaskulært lumen sammenlignet med statiske metoder27. Af denne grund forestiller vi os, at systemet anvendes til vævsteknik for at hjælpe med at løse de nuværende udfordringer, hvilket giver mulighed for fremtidig udvikling af reproducerbare syntetiske blodkarerstatninger28.
Den her beskrevne protokol præsenterer nogle vigtige trin, der er afgørende for flowkulturens succes. Etablering og overvågning af passende strømningsforhold er ikke trivielt og skal udføres på hvert system, når det opstilles for første gang, for at sikre, at dyrkningsbetingelserne er fysiologiske. Flow og tryk blev overvåget ved hjælp af tryksensorer og ultralydsbilleddannelse. Et andet kritisk punkt er at sikre, at vævet er levedygtigt og intakt i begyndelsen af kulturen. Dette kræver en frisk kilde, omhyggelig håndtering og kan verificeres ved histologisk analyse. Derudover skal fejlfinding udføres i starten af hvert eksperiment for at identificere enhver potentiel bakteriel kontaminering eller medielækagekilde.
Det er vigtigt at fremhæve, at det beskrevne perfusionssystem, samtidig med at det giver fysiologiske tryk- og strømningsbetingelser, ikke er i stand til helt at efterligne de komplekse trykbølgemønstre, der er registreret in vivo. Denne begrænsning kan tilskrives brugen af en peristaltisk pumpe og kan løses ved hjælp af mere specialiseret udstyr til at reproducere avancerede hæmodynamiske forhold. Kulturen af blodkar i en bioreaktor er heller ikke i stand til at behandle undersøgelser, hvor immunsystemet eller interaktionen med andre organer er kritisk.
Afslutningsvis præsenteres et simpelt 3D-printet perfusionssystem, der kan efterligne det fysiologiske hæmodynamiske miljø, som forventes at bidrage til standardisering af ex vivo blodkarkulturer. Dens potentiale for tilpasning og anvendelse til langsigtet kultur gør det til et vigtigt redskab til at fremme forståelsen af disse komplekse biologiske systemer i fysiologi og patologiske tilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke Veterinary Pathology Centre ved University of Surrey School of Veterinary Medicine for histologitjenester. Vi takker også Dr. L. Dixon, A. Reis og M. Henstock fra The Pirbright Institute (Pirbright, UK) for deres støtte til at udtage animalsk væv og Institut for Biokemiske Videnskaber ved University of Surrey, især det tekniske team, for deres fortsatte støtte. RSM blev støttet af Doctoral College studentship award (University of Surrey), DM og PC blev støttet af National Center for Replacement, Refinement &; Reduction of Animals in Research (bevillingsnumre: NC / R001006 / 1 og NC / T001216 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasyFlow | - | - | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 - 3D printing | Protolabs | - | - |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound - OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt - 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | - | - | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels - Size 23 - Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
References
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: Endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Gugliandolo, E., et al. Palmitoylethanolamide and Polydatin combination reduces inflammation and oxidative stress in vascular injury. Pharmacological Research. 123, 83-92 (2017).
- Anselmino, M., et al. Catheter ablation of atrial fibrillation in patients with left ventricular systolic dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Circulation, Arrhythmia, and Electrophysiology. 7 (6), 1011-1018 (2014).
- Viola, M., et al. Subcutaneous delivery of monoclonal antibodies: How do we get there. Journal of Controlled Release. 286, 301-314 (2018).
- Kim, D. D. In vitro cellular models for nasal drug absorption studies. Drug Absorption Studies: In Situ, In Vitro and In Silico Models. , 216-234 (2008).
- Lewis, D. I. Animal experimentation: Implementation and application of the 3Rs. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (6), 675-679 (2019).
- Rouwkema, J., et al. In vitro platforms for tissue engineering: Implications for basic research and clinical translation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e164-167 (2011).
- Xu, Y., Shrestha, N., Préat, V., Beloqui, A. An overview of in vitro, ex vivo and in vivo models for studying the transport of drugs across intestinal barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113795 (2021).
- Vaghela, R., et al. Vessel grafts for tissue engineering revisited-Vessel segments show location-specific vascularization patterns in ex vivo ring assay. Microcirculation. 29 (2), e12742 (2022).
- Håkansson, J., et al. Individualized tissue-engineered veins as vascular grafts: A proof of concept study in pig. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 15 (10), 818-830 (2021).
- Saucy, F., et al. Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1. European Surgical Research. 45 (1), 50-59 (2010).
- Tosun, Z., McFetridge, P. S. Variation in cardiac pulse frequencies modulates vSMC phenotype switching during vascular remodeling. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (1), 59-70 (2015).
- Matos, R. S., Maselli, D., McVey, J. H., Heiss, C., Campagnolo, P. 3D printed bioreactor enabling the pulsatile culture of native and angioplastied large arteries. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 864580 (2022).
- Neff, L. P., et al. Vascular smooth muscle enhances functionality of tissue-engineered blood vessels in vivo. Journal of Vascular Surgery. 53 (2), 426-434 (2011).
- Boparai, K. S., Singh, R. Advances in Fused Deposition Modeling. In: Module. Refrence in Materials Science and Materials Engineering. , Elsevier. (2017).
- McKeen, L. W. Chapter 6 - Polyamides (Nylons). The Effect of Creep and Other Time Related Factors on Plastics and Elastomers (Second Edition). McKeen, L. W. , William Andrew Publishing. 197-262 (2012).
- Moradi, M., Mehrabi, O., Azdast, T., Benyounis, K. Y. Enhancement of low power CO2 laser cutting process for injection molded polycarbonate). Optics & Laser Technology. 96, 208-218 (2017).
- Ghasem, N. Computer Methods in Chemical Engineering. , CRC Press. (2021).
- Lying, F., Gazi, F., Gardner, E. Preparation of tissues and cells for infrared and raman spectroscopy and imaging. Biomedical Applications of Synchrotron Infrared Microspectroscopy.RSC Analytical Spectroscopy Monographs. (11), 147-185 (2011).
- Sassi, L., et al. A perfusion bioreactor for longitudinal monitoring of bioengineered liver constructs. Nanomaterials. 11 (2), 275 (2021).
- Haykal, S., et al. Double-chamber rotating bioreactor for dynamic perfusion cell seeding of large-segment tracheal allografts: Comparison to conventional static methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (8), 681-692 (2014).
- Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplant. 27 (9), 1375-1389 (2018).
- Wong, M. M., Hong, X., Karamariti, E., Hu, Y., Xu, Q. Generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (97), 52565 (2015).
- Alvino, V. V., et al. In vitro and in vivo preclinical testing of pericyte-engineered grafts for the correction of congenital heart defects. Journal of the American Heart Association. 9 (4), e014214 (2020).
- Nerurkar, N. L., Sen, S., Baker, B. M., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Dynamic culture enhances stem cell infiltration and modulates extracellular matrix production on aligned electrospun nanofibrous scaffolds. Acta Biomaterialia. 7 (2), 485-491 (2011).
- Engebretson, B., Mussett, Z. R., Sikavitsas, V. I. The effects of varying frequency and duration of mechanical stimulation on a tissue-engineered tendon construct. Connective Tissue Research. 59 (2), 167-177 (2018).
- Saunders, S. K., et al. Evaluation of perfusion-driven cell seeding of small diameter engineered tissue vascular grafts with a custom-designed seed-and-culture bioreactor. PLoS One. 17 (6), e0269499 (2022).
- Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Research. 7, (2018).
