Summary
यह प्रोटोकॉल छिड़काव में रक्त वाहिकाओं की पूर्व विवो संस्कृति के लिए एक नव विकसित, 3 डी मुद्रित बायोरिएक्टर की स्थापना और संचालन प्रस्तुत करता है। प्रणाली को अन्य उपयोगकर्ताओं द्वारा आसानी से अपनाया जाने के लिए डिज़ाइन किया गया है, व्यावहारिक, सस्ती, और विभिन्न प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों, जैसे बुनियादी जीव विज्ञान और औषधीय अध्ययन के लिए अनुकूलनीय।
Abstract
संवहनी रोग अधिकांश कार्डियोवैस्कुलर बीमारियों (सीवीडी) का आधार बनता है, जो दुनिया भर में मृत्यु दर और रुग्णता का प्राथमिक कारण बना हुआ है। संवहनी रोग को रोकने और इलाज के लिए प्रभावी शल्य चिकित्सा और औषधीय हस्तक्षेप की तत्काल आवश्यकता है। आंशिक रूप से, ट्रांसलेशनल मॉडल की कमी संवहनी रोग में शामिल सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं की समझ को सीमित करती है। एक्स विवो छिड़काव संस्कृति बायोरिएक्टर एक नियंत्रित गतिशील वातावरण में बड़े पशु वाहिकाओं (मनुष्यों सहित) के अध्ययन के लिए एक आदर्श मंच प्रदान करते हैं, जो इन विट्रो संस्कृति की आसानी और जीवित ऊतक की जटिलता का संयोजन करते हैं। हालांकि, अधिकांश बायोरिएक्टर कस्टम निर्मित होते हैं और इसलिए परिणामों की प्रजनन क्षमता को सीमित करते हुए इसे अपनाना मुश्किल होता है। यह पेपर एक 3 डी मुद्रित प्रणाली प्रस्तुत करता है जिसे किसी भी जैविक प्रयोगशाला में आसानी से उत्पादित और लागू किया जा सकता है, और इसके सेटअप के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है, जो उपयोगकर्ताओं के संचालन को सक्षम करता है। यह अभिनव और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ईएक्स विवो छिड़काव संस्कृति प्रणाली शारीरिक स्थितियों में 7 दिनों तक रक्त वाहिकाओं की संस्कृति को सक्षम बनाती है। हम उम्मीद करते हैं कि एक मानकीकृत छिड़काव बायोरिएक्टर को अपनाने से बड़े पशु रक्त वाहिकाओं में शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं की बेहतर समझ का समर्थन होगा और नए चिकित्सीय की खोज में तेजी आएगी।
Introduction
संवहनी दीवार एक प्रतिक्रियाशील स्थिर अवस्था में मौजूद होती है, जो बाहरी उत्तेजनाओं (यानी, दबाव में परिवर्तन, वासोकॉन्स्ट्रिक्टर्स) और रक्त जमावट और भड़काऊ कोशिका घुसपैठ को रोकने वाली एक सुसंगत गैर-सक्रिय सतह दोनों को सुनिश्चित करतीहै। उम्र बढ़ने और जीवन शैली पर निर्भर उत्तेजनाओं के जवाब में और प्रत्यक्ष क्षति पर, संवहनी दीवार रेस्टेनोसिस और एथेरोस्क्लेरोसिस जैसी रीमॉडेलिंग प्रक्रियाओं को सक्रिय करती है, जो इस्केमिक स्ट्रोक और मायोकार्डियल रोधगलन2 जैसे सामान्य हृदय रोगों (सीवीडी) के लिए जाने जाते हैं। जबकि संवहनी रोग की उन्नत अभिव्यक्तियों से निपटने के लिए परक्यूटेनियस रिवस्कुलराइजेशन और स्टेंटिंग जैसे पारंपरिक दृष्टिकोण उपलब्ध हैं, ये आगे संवहनी क्षति को भड़काने के लिए जाने जाते हैं, जिससे अक्सर पुनरावृत्ति होती है। इसके अलावा, केवल सीमित निवारक और प्रारंभिक चरण के समाधान उपलब्ध हैं। संवहनी दीवार होमियोस्टैसिस को बनाए रखने और इसकी शिथिलता को चलाने वाले तंत्र को समझना नए इलाज विकसित करने के केंद्र मेंहै।
आणविक जीव विज्ञान और ऊतक इंजीनियरिंग में निरंतर विकास और प्रगति के बावजूद, पशु अध्ययन संवहनी जीव विज्ञान अध्ययन का एक महत्वपूर्ण घटक बना हुआ है। विवो पशु अध्ययन में संवहनी होमियोस्टैसिस और पैथोलॉजी के तंत्र में भारी अंतर्दृष्टि प्रदान की है; हालांकि, ये प्रक्रियाएं महंगी हैं, अपेक्षाकृत कम थ्रूपुट हैं, और पर्याप्त नैतिक मुद्दे पैदा करते हैं। इसके अलावा, छोटे जानवर मानव संवहनी शरीर विज्ञान के खराब प्रतिनिधि हैं, और बड़े पशु प्रयोग बहुत अधिक महंगे हैं और आगे नैतिक विचार पैदा करते हैं। तेजी से उम्र बढ़ने वाली आबादी के लिए दवा और चिकित्सा समाधानों की बढ़ती मांग के साथ, पशु उपयोग के डाउनसाइड्स बढ़ रहे हैं, जोरोगी देखभाल के परिणामों की प्रजनन क्षमता, विश्वसनीयता और हस्तांतरणीयता को प्रभावित करते हैं।
इन विट्रो सिस्टम बुनियादी तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक सरलीकृत मंच प्रदान करते हैं, लेकिन पूरे ऊतक की जटिलता, कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स के बीच बातचीत और यांत्रिक बलों को पुन: परिभाषित करने में विफल रहते हैं, जोसंवहनी रोगों के विकास में महत्वपूर्ण निर्धारक हैं।
कृत्रिम रूप से नियंत्रित वातावरण में बनाए गए पूरे ऊतकों पर किए गए पूर्व विवो अध्ययन अपेक्षाकृत उच्च-थ्रूपुटजांच को सक्षम करते हुए विवो जटिलता की नकल करते हैं। संस्कृति की स्थिति और पर्यावरण को बारीकी से नियंत्रित करने की क्षमता को देखते हुए, पूर्व विवो मॉडल जटिल अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला की अनुमति देते हैं और संवहनी जीव विज्ञान में पशु प्रक्रियाओं के उपयोग को कम करने के लिए एक उपयुक्त विकल्प प्रदान करते हैं। स्थैतिक संवहनी रिंग संस्कृतियों ने दिलचस्प अंतर्दृष्टि प्रदान की लेकिन महत्वपूर्ण हेमोडायनामिक तत्व9 को शामिल करने में विफल रहे। दरअसल, संवहनी प्रणाली एक्स विवो का अध्ययन कई गतिशील बलों से संबंधित विशिष्ट चुनौतियां पैदा करता है जो रक्त वाहिका की दीवार के भीतर कोशिकाओं पर लागू होते हैं। ल्यूमिनल प्रवाह, अशांति, कतरनी तनाव, दबाव और दीवार विरूपण जैसी उत्तेजनाएं ऊतक पैथोफिज़ियोलॉजी10,11,12 को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करती हैं।
चोट या हेमोडायनामिकपरिवर्तनों के जवाब में संवहनी होमियोस्टैसिस और रीमॉडेलिंग का अध्ययन करने के लिए छिड़काव बायोरिएक्टर आवश्यक हैं। इसके अलावा, छिड़काव संस्कृति का उपयोग ऊतक-इंजीनियर रक्त वाहिकाओं (टीईबीवी) की परिपक्वता और स्थायित्व में सुधार के लिए किया जा सकता है, जो संवहनी ग्राफ्ट14 के लिए उपयुक्त विकल्प प्रदान करता है।
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छिड़काव बायोरिएक्टर लचीलेपन और अनुकूलनशीलता में सीमित हैं और महंगे हैं। मौजूदा इन-हाउस विकसित बायोरिएक्टरों में से कई को अन्य प्रयोगशालाओं में दोहराना मुश्किल है, क्योंकि सीमित विवरण और विशेष रूप से बनाएगए घटकों 7,8,9,10,11,12 की अनुपलब्धता है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में एक नया बायोरिएक्टर (ईज़ीफ्लो) विकसित किया है, जो उत्पादन करने के लिए किफायती है, ऊतकों की एक श्रृंखला को समायोजित करता है, और विभिन्नशोध मांगों के अनुकूल होने के लिए अपेक्षाकृत सरल संशोधनों को सक्षम बनाता है। सम्मिलित 3 डी मुद्रित है और मानक 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के ढक्कन के रूप में फिट बैठता है। इसका मॉड्यूलर डिजाइन और 3 डी प्रिंटिंग निर्माण इसे विभिन्न प्रयोगशालाओं में सुलभ और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाता है, साथ ही विभिन्न वैज्ञानिक आवश्यकताओं के अनुकूल होने के लिए आसानी से संशोधित करता है। यह प्रोटोकॉल धमनी छिड़काव सेटिंग में बायोरिएक्टर प्रणाली की असेंबली और बुनियादी संचालन का वर्णन करता है।
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Protocol
यह प्रोटोकॉल दो ईज़ीफ्लो (बायोरिएक्टर) इंसर्ट से बनी एक प्रणाली के संयोजन और उपयोग का वर्णन करता है: एक प्रतिक्रिया कक्ष (सी) का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें संक्रमित धमनी का नमूना होता है, और एक मध्यम जलाशय (आर) (चित्रा 1 और चित्रा 2 ए) के रूप में कार्य करता है। ब्रिटेन के पीरब्राइट इंस्टीट्यूट में 4-6 सप्ताह के नर और मादा पिगलेट (6-12 किलोग्राम) से कैरोटिड धमनियां प्राप्त की गईं। पशु प्रक्रियाओं को गृह कार्यालय पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम (1986) (एएसपीए) के तहत किया गया था और पीरब्राइट संस्थान में पशु कल्याण और नैतिक समीक्षा बोर्ड (एडब्ल्यूईआरबी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। जानवरों को जानवरों के आवास और देखभाल के लिए अभ्यास संहिता के अनुसार रखा गया था। सभी प्रक्रियाओं को व्यक्तिगत लाइसेंस धारकों द्वारा आयोजित किया गया था जो परियोजना लाइसेंस पीपीएल 70/8852 के तहत प्रशिक्षित और सक्षम थे। एएसपीए के तहत अनुसूची एक विधि के अनुसार पिगलेट को मारा गया था।
1. विनिर्माण सम्मिलित करें
- प्रदान किए गए 3 डी मॉडल (पूरक फ़ाइल 1) का उपयोग करके 3 डी प्रिंटिंग द्वारा सम्मिलित करें।
नोट: 3 डी मॉडलिंग नए अनुप्रयोगों के अनुकूल होने के लिए डिजाइन में आसान परिवर्तन सक्षम बनाता है। डालने का उत्पादन करने के लिए वैकल्पिक सामग्री और वैकल्पिक विनिर्माण तकनीकों का भी उपयोग किया जा सकता है। जटिल आंतरिक संरचना के कारण, चयनात्मक लेजर सिंटरिंग और स्टीरियोलिथोग्राफी उपयुक्त विकल्पहैं। पॉलियामाइड 12 (पीए 12; सामग्री की तालिका देखें) तरल प्रतिधारण और बार-बार गर्मी नसबंदी चक्रों के प्रतिरोध के मामले में अपने बेहतर प्रदर्शन के कारण एक अच्छा सामग्री उम्मीदवारहै। - पूरक फ़ाइल 2 में प्रदान किए गए डिजाइनों का उपयोग करके, लेजर कटिंग17 द्वारा सिलिकॉन गैसकेट और पॉली कार्बोनेट वॉशर बनाएं।
नोट: लेजर काटने आसानी से आउटसोर्स और एक सस्ता विनिर्माण विधि है। वॉशर स्टेनलेस स्टील से निर्मित किया जा सकता है, जो बार-बार उपयोग के लिए अधिक प्रतिरोधी घटक प्रदान करता है। अन्य सभी घटक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आइटम हैं। आवश्यक सामग्रियों की एक पूरी सूची तालिका 1 में प्रदान की गई है। मदों के वाणिज्यिक विवरण सामग्री तालिका में शामिल हैं।
2. डिवाइस नसबंदी, असेंबली और प्राइमिंग
- तालिका 1 में दिए गए निर्देशों का पालन करते हुए सभी घटकों को निष्फल करें।
- लामिनर प्रवाह स्थितियों के तहत, दो निर्मित आवेषण (चरण 1) को इकट्ठा करें, जैसा कि चित्र 1 ए में दिखाया गया है।
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए, चित्रा 2 में छिड़काव प्रणाली को इकट्ठा करें:
- जलाशय के आर 1 पोर्ट (मीडिया एक्सचेंज पोर्ट) से दो जुड़े तीन-तरफा वाल्व संलग्न करें।
- परिणामी आउटलेट को एक-तरफ़ा वाल्व (वन-वे वाल्व ट्यूब) से लैस ट्यूब का उपयोग करके पेरिस्टालिक पंप के सिर से कनेक्ट करें।
- एक-तरफा वाल्व से लैस सिस्टम ट्यूबिंग का उपयोग करके पंप हेड को प्रतिक्रिया कक्ष के सी 4 पोर्ट से कनेक्ट करें।
नोट: यह शाखा वैकल्पिक रूप से निरंतर निगरानी को सक्षम करने वाले दबाव सेंसर से लैस हो सकती है। - प्रतिक्रिया कक्ष पोर्ट सी 1 को नरम दीवार टयूबिंग से कनेक्ट करें, और इसे प्रतिरोध चैनल (छोटे आंतरिक व्यास) से जोड़ें।
नोट: प्रतिरोध टयूबिंग की लंबाई सिस्टम में मौजूद दबाव को बहुत प्रभावित करेगी। पर्याप्त छिड़काव की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए इसकी आगे जांच की जानी चाहिए। - सिस्टम ट्यूबिंग के साथ प्रतिरोध चैनल का विस्तार करें, एक रिटर्न चैनल बनाएं और आर 5 (चित्रा 2 सी) पर जलाशय से जुड़कर ल्यूमिनल परिसंचरण लूप को बंद करें।
- सिस्टम ट्यूबिंग के साथ जलाशय आर 3 से प्रतिक्रिया कक्ष सी 3 को जोड़कर एक अतिप्रवाह चैनल बनाएं।
- आर 2 के माध्यम से एक वेंटिलेशन फ़िल्टर संलग्न करें।
- हवा और मीडिया युक्त सिरिंज को प्रतिक्रिया कक्ष सी 6 से जोड़कर दबाव कम करने वाला बनाएं।
नोट: सही एयर-टू-मीडिया अनुपात आवश्यक दबाव को कम करने पर निर्भर करेगा।
- मीडिया एक्सचेंज पोर्ट और जलाशय के माध्यम से छिड़काव माध्यम (डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम [डीएमईएम] + 10% [वी / वी] भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस] + 1% [वी / वी] पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन + 1% [वी / वी] एम्फोटेरिसिन बी + 30% [वी / वी] डेक्सट्रान; सामग्री की तालिका देखें) के साथ सिस्टम को प्राइम करें।
नोट: सिस्टम को भड़काना सिस्टम में फंसे बुलबुले के जोखिम को कम करता है और किसी भी संभावित लीक की पहचान करता है। मीडिया की अनुशंसित मात्रा लगभग 100-120 एमएल है। उपयोग की जाने वाली मात्रा प्रयोग के लिए उपयोग की जाने वाली टयूबिंग की मृत मात्रा पर निर्भर करेगी।
3. नमूना कटाई और तैयारी
- बाएं और दाएं आम कैरोटिड धमनियों को इकट्ठा करें, धमनी ऊतक13 के प्रत्यक्ष संचालन को कम करें।
- ऊतक को स्थानांतरण के लिए ठंडे परिवहन मीडिया (डीएमईएम + 20% [वी / वी] एफबीएस + 2% [वी / वी] पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन + 1% [वी / वी] एम्फोटेरिसिन बी, सामग्री की तालिका देखें) में रखें।
- एक लामिनर प्रवाह कैबिनेट में, अतिरिक्त संयोजी ऊतक को हटा दें और स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके ऊतक के सिरों को ट्रिम करें। ठंडे परिवहन मीडिया में ऊतक को दो बार धोएं।
- पूरी तरह से धोने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए परिवहन मीडिया में एक कक्षीय शेकर पर ऊतक रखें।
- धमनी के एक गैर-शाखा खंड को दो कांटेदार ल्यूर कनेक्टर का उपयोग करके बायोरिएक्टर सिस्टम से कनेक्ट करें और इसे पोत बंधन (संवहनी सिलिकॉन संबंध) का उपयोग करके ठीक करें। तालिका 1)।
नोट: पोत बंधन पोत को सुरक्षित करने के लिए उचित तनाव और वापसी प्रदान करता है। अंडाकार खंड ऊतक क्षति को रोकता है। - पैटेंसी को सत्यापित करने के लिए धमनी के माध्यम से धीरे से मीडिया का प्रवाह करें।
- धमनी को गढ़े गए सम्मिलित करने के लिए सुरक्षित करने के बाद, छिड़काव मीडिया (चरण 2.4) के साथ प्रतिक्रिया स्थान भरें। अंत में, सिस्टम से किसी भी शेष हवा को खत्म करने के लिए मीडिया के साथ ल्यूमिनल परिसंचरण लूप को धीरे से भरें।
- परिसंचरण को पूरा करते हुए, पहले से इकट्ठे छिड़काव प्रणाली (अनुभाग 2) के साथ प्रतिक्रिया स्थान को कनेक्ट करें।
नोट: संसाधित ऊतक के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा गुणवत्ता की जांच करने की सिफारिश की जाती है। यह तैयारी के दौरान अत्यधिक हैंडलिंग के कारण किसी भी नुकसान की पहचान करता है।
4. छिड़काव संस्कृति और मीडिया परिवर्तन
- छिड़काव प्रणाली को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें और फिर इसे पेरिस्टालिक पंप से कनेक्ट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- किसी भी अतिरिक्त (संकाय) अधिग्रहण प्रणालियों को कनेक्ट करें, जैसे कि दबाव सेंसर ( सामग्री की तालिका देखें)।
- सिस्टम को ~ 10-15 एमएल / मिनट की कम मीडिया प्रवाह दर के साथ रात भर बराबर करने के लिए छोड़ दें।
नोट: उचित शर्तों को पूरा करने के लिए पंप सेटिंग्स, मीडिया प्रवाह, सिस्टम दबाव, और इष्टतम दबाव कम करने वालों / क्लैंप सेटिंग्स को निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक प्रयोगों की आवश्यकता होती है। - अगले दिन, प्रवाह को वृद्धिशील रूप से बढ़ाएं (+1 आरपीएम हर घंटे, वर्तमान प्रणाली में हर घंटे ~ 2.5 एमएल / मिनट की वृद्धि के बराबर) जब तक कि अंतिम प्रवाह दर (35 एमएल / मिनट) प्राप्त न हो जाए। लीक के लिए समय-समय पर सिस्टम की निगरानी करें।
नोट: पेरिस्टाल्टिक पंप गति के आधार पर सटीक प्रवाह दर की गणना करने के लिए, उपयोगकर्ताओं को पहले पर्याप्त पंप अंशांकन18 करना होगा। सूत्र (1) का उपयोग करके, वॉल्यूमेट्रिक प्रवाह दर (क्यू) की गणना एक निश्चित समय (टी) के भीतर वितरित मात्रा (वी) के आधार पर की जा सकती है। अनुमानित प्रवाह वेग () की गणना करने के लिए हम समीकरण (2) में वर्णित पहले गणना की गई प्रवाह दर (क्यू) और पोत क्रॉस-सेक्शन (
ए) के क्षेत्र का उपयोग कर सकते हैं।
(1)
(2) - हर 3 दिनों में, ताजा मीडिया से भरे एक सिरिंज को पंप के करीब मीडिया एक्सचेंज पोर्ट से जोड़कर 50% मीडिया (~ 50 एमएल) का आदान-प्रदान करें और खर्च किए गए माध्यम को इकट्ठा करने के लिए जलाशय के करीब बंदरगाह के लिए एक खाली सिरिंज (चित्रा 2)।
नोट: मीडिया एक्सचेंज पोर्ट के रूप में दो तीन-तरफा वाल्वों का उपयोग मध्यम विनिमय के दौरान छिड़काव के निरंतर संचालन की सुविधा प्रदान करता है। - प्रयोग के अंत में, बाँझ सर्जिकल कैंची का उपयोग करके बायोरिएक्टर से जुड़े सिरों को ट्रिम करके प्रतिक्रिया कक्ष से ऊतक की कटाई करें।
- आगे के उपयोग के लिए सिस्टम को विघटित, साफ और निष्फल करें।
ए) के क्षेत्र का उपयोग कर सकते हैं।
(1)
(2)5. नमूना विश्लेषण
- कटाई किए गए नमूने को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें।
- ऊतक को इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी; सामग्री की तालिका देखें) 19 में एम्बेड करें और तरल नाइट्रोजन में ठंडा आइसो-पेंटेन में विसर्जन करके फ्रीज करें।
- क्रायोस्टैट का उपयोग करके 3-5 मिमी मोटाई के क्रायो-सेक्शन प्राप्त करें।
- इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन [एच एंड ई]) और / या इम्यूनोफ्लोरेसेंस करें। विशिष्ट इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का पालन करें:
- फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस; सामग्री की तालिका देखें) में 20% [वी / वी] बकरी सीरम के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए स्लाइस को अवरुद्ध करें।
- पीबीएस में सीडी 31 पतला 1:50 के खिलाफ प्राथमिक खरगोश एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्लाइस को इनक्यूबेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
- पीबीएस में 1:200 पतला फ्लोरोसेंटली लेबल बकरी एंटी-खरगोश द्वितीयक एंटीबॉडी और पीबीएस में 1:200 पतला α-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए) सीधे संयुग्मित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
- कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में डीएपीआई पतला 1: 1,000 के साथ नाभिक को दाग दें।
- ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 70% (वी / वी) इथेनॉल में 0.1% (डब्ल्यू / वी) सूडान ब्लैक (सामग्री की तालिका देखें) के साथ इनक्यूबेट करें।
- ऊतक को प्रचुर मात्रा में विआयनीकृत पानी से धोएं। स्लाइड्स को माउंटिंग माध्यम में माउंट करें।
- एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के साथ नमूने की छवि।
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Representative Results
इस अध्ययन ने एक बहुमुखी और सस्ती छिड़काव प्रणाली (ईज़ीफ्लो) 13 स्थापित की है। सिस्टम का 3 डी मुद्रित डिजाइन अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा सिस्टम को अपनाने की सुविधा प्रदान करता है और इसलिए प्रजनन क्षमता को प्रोत्साहित करता है।
गढ़े गए छिड़काव सम्मिलित को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखा जाता है, जिससे एक अलग वातावरण बनता है। दो छिड़काव आवेषण का उपयोग करके, एक छिड़काव लूप स्थापित किया जा सकता है जिसमें एक जलाशय और एक प्रतिक्रिया कक्ष होता है, जहां जैविक नमूना इनक्यूबेट किया जाता है। छिड़काव प्रणाली को तब संस्कृति की स्थिति की निगरानी के लिए एक पेरिस्टालिक पंप और वैकल्पिक अधिग्रहण प्रणालियों, जैसे दबाव सेंसर और अल्ट्रासाउंड उपकरणों से जोड़ा जाता है (चित्रा 2)।
पोर्सिन कैरोटिड धमनी के नमूने एकत्र किए गए और 7 दिनों के लिए छिड़काव में सुसंस्कृत होने से पहले संसाधित किए गए। कल्चर से पहले ऊतक की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, प्रारंभिक प्रयोग किए गए थे जहां नमूने छांटने के समय, ऊतक की तैयारी के बाद और छिड़काव के बाद तय किए गए थे। एंडोथेलियल (सीडी 31) और चिकनी मांसपेशी (एएसएमए) मार्करों के लिए फ्लोरोसेंट स्टेनिंग का उपयोग ऊतक अखंडता के रखरखाव का आकलन करने के लिए किया गया था। अच्छी तरह से संरक्षित और क्षतिग्रस्त ऊतकों के उदाहरण तुलना के लिए चित्रा 3 में प्रस्तुत किए गए हैं। छवियां छांटने के समय ऊतक के कोमल हैंडलिंग के महत्व को दर्शाती हैं, क्योंकि गलत प्रसंस्करण (अत्यधिक खिंचाव, कुचलना, आदि) के परिणामस्वरूप संस्कृति से आगे एंडोथेलियम का नुकसान हो सकता है। परिणाम ल्यूमिनल क्षति से बचने के लिए छिड़काव की क्रमिक स्थापना के महत्व को भी दिखाते हैं।
7 दिनों की संस्कृति के बाद पोत की दीवार में कोशिकाओं के आकारिकी और समग्र वितरण के रखरखाव को दिखाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) धुंधला होने के साथ एच एंड ई धुंधला किया गया था (चित्रा 4)। डिवाइस में शारीरिक संस्कृति की स्थिति का अनुप्रयोग लुमेन के एंडोथेलियल कवरेज के रखरखाव, मीडिया में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के संरेखण और एडवेंटिया में वासा वासोरम के संरक्षण को सुनिश्चित करता है।
बायोरिएक्टर सिस्टम का कॉम्पैक्ट और मॉड्यूलर डिज़ाइन सिस्टम सेटअप की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए भी अनुमति देता है। छोटे सेटअप में एक एकल बायोरिएक्टर शामिल है और औषधीय और कम मात्रा वाले अध्ययनों के लिए आदर्श है (छिड़काव20, 50-70 एमएल की कुल मात्रा)। संस्कृति की लंबाई बढ़ाने और मीडिया परिवर्तनों की संख्या को कम करने के लिए, एक एकल जलाशय परिसंचरण प्रणाली, जैसे कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, या एक निरंतर भोजन प्रणाली अधिक आदर्श है, क्योंकि उनके पास परिसंचरण में माध्यम की एक बड़ी मात्रा है। प्रयोगात्मक सेटिंग्स का पता लगाने के लिए एक डबल परिसंचरण21 सेटअप स्थापित किया जा सकता है जहां उत्तेजनाओं का स्थानीयकरण महत्वपूर्ण है। वर्तमान डिवाइस को पीएच और घुलित ऑक्सीजन जैसे मापदंडों के सटीक प्रतिक्रिया नियंत्रण को सक्षम करने के लिए अधिक परिष्कृत नियंत्रण प्रणालियों के साथ भी जोड़ा जा सकता है (चित्रा 5)।
चित्रा 1: ईज़ीफ्लो असेंबली योजनाबद्ध। (ए) 3 डी ने छिड़काव डालने की असेंबली में सहायता करने वाले योजनाबद्ध तरीके प्रदान किए। (ख) कनेक्शन स्थलों के संयोजन को सुकर बनाने के लिए विस्तृत स्कीमैटिक्स प्रदान किए जाते हैं। (सी) प्रतिक्रिया स्थान का एक क्रॉस-सेक्शन दृश्य ईज़ीफ्लो इंसर्ट के आवश्यक घटकों और इंसर्ट के लिए ऊतक के कनेक्शन पर प्रकाश डालता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: छिड़काव प्रणाली विधानसभा का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) इकट्ठे छिड़काव प्रणाली जिसमें सभी महत्वपूर्ण घटक होते हैं, जो 3 डी-प्रदत्त वातावरण में उनकी सापेक्ष स्थिति को उजागर करते हैं। सभी घटकों को स्केल नहीं किया जाता है। (बी) घटकों के व्यक्तिगत आइसोमेट्रिक विचार भी प्रस्तुत किए गए हैं। (सी) विभिन्न घटकों के संयोजन और कनेक्शन में सहायता के लिए इकट्ठे छिड़काव प्रणाली का एक शीर्ष दृश्य दिखाया गया है। छिड़काव प्रणाली में विभिन्न कनेक्शन साइटों को नेविगेट करने के लिए बंदरगाहों को लेबल और क्रमांकित किया गया है। यह सिद्धांत जलाशय (आर) और प्रतिक्रिया कक्ष (सी) पर लागू किया गया है। दोनों कक्षों को जोड़ने वाले विभिन्न चैनलों को भी संदर्भ के लिए नाम दिए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: प्रसंस्करण के दौरान ऊतक रखरखाव। (ए) कॉन्फोकल छवियां फसल के समय धमनी की सामान्य संरचना दिखाती हैं, (बी) सफाई और प्रसंस्करण के बाद, और (सी) छिड़काव संस्कृति के बाद, एक अच्छी तरह से संरक्षित आकृति विज्ञान के रखरखाव का प्रदर्शन करती हैं। (डी) प्रसंस्करण के दौरान अत्यधिक या गलत हैंडलिंग के कारण क्षतिग्रस्त ऊतक के उदाहरण या (ई) गैर-शारीरिक संस्कृति स्थितियों (यानी, उच्च प्रवाह की अचानक शुरूआत) के कारण ल्यूमिनल कवरेज की कमी और मीडिया के विघटन को दर्शाते हैं। (एफ) नकारात्मक नियंत्रण धुंधलापन की विशिष्टता को इंगित करता है। सीडी 31: हरा; एसएमए: लाल; DAPI: नीला. स्केल सलाखों: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: छिड़काव संस्कृति से पहले और बाद में ऊतक का हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन। (A और B) धमनी ऊतक का मूल्यांकन फसल के समय हिस्टोलॉजी द्वारा किया गया था और बायोरिएक्टर प्रणाली के साथ 7 दिनों की संस्कृति के बाद (सी और डी) किया गया था। (A और C) एच एंड ई धुंधला होने से धमनी दीवार संरचना और संगठन के संरक्षण का पता चलता है। (B और D) एक ही ऊतक का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना एंडोथेलियल कवरेज, चिकनी मांसपेशी कोशिका संरेखण, और एडवेंटिटी में वासा वासोरम का प्रमाण देता है। सीडी 31: हरा; एसएमए: लाल; DAPI: नीला. स्केल सलाखों: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: संभावित छिड़काव सेटअप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। विभिन्न प्रयोगात्मक अध्ययनों को सक्षम करने के लिए छिड़काव सम्मिलित के साथ विभिन्न वैकल्पिक सेटअप ों को समायोजित किया जा सकता है। (ए) पुन: परिसंचारी छिड़काव सेटअप आवश्यक माध्यम की मात्रा को कम करता है। (बी) निरंतर भोजन सेटअप ऊतक को माध्यम की एक स्थिर आपूर्ति प्रदान करता है। (ग) एकल जलाशय परिसंचरण (जैसा कि इस पत्र में वर्णित है) दीर्घकालिक ऊष्मायन के लिए बड़ी मात्रा में मीडिया प्रदान करता है और इसमें वायु विनिमय और दबाव संतुलन के लिए एक बफर जोन शामिल है। (डी) डबल परिसंचरण सेटअप आंतरिक (धमनी के अंदर) और बाहरी (प्रतिक्रिया स्थान) परिसंचरण को स्वतंत्र रूप से खिलाने वाले दो अलग-अलग लूप प्रदान करता है। (ई) गतिशील छिड़काव सेटअप में आनुपातिक-अभिन्न-व्युत्पन्न (पीआईडी) नियंत्रक द्वारा निरंतर गैसें और पीएच नियंत्रण शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 1: आवेषण को गढ़ने के लिए घटक। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
पूरक फ़ाइल 1: 3 डी प्रिंटिंग निर्माण के लिए ईज़ीफ्लो सम्मिलित का 3 डी मॉडल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक फ़ाइल 2: निर्मित डिवाइस, अनुभाग दृश्य, प्रिंटआउट, और सीलिंग घटकों के डिजाइन योजनाबद्धता। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
एक्स विवो संवहनी छिड़काव प्रणाली नियंत्रित परिस्थितियों में अपने मूल ऊतकों के भीतर संवहनी कोशिकाओं के कार्य और व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा मंच बनाती है, जो चोट के बाद संवहनी रीमॉडेलिंग22 जैसी जटिल प्रक्रियाओं के विच्छेदन को सक्षम बनाता है। हालांकि, अधिकांश रिपोर्ट किए गए बायोरिएक्टर कस्टम-निर्मित घटकों के आधार पर इन-हाउस मेड सिस्टम हैं औरअक्सर दूसरों द्वारा दोहराना मुश्किल होता है। वैकल्पिक वाणिज्यिक समाधान मौजूद हैं, लेकिन डिजाइन में लचीलेपन की कमी है और अपेक्षाकृत महंगा होसकता है।
हमने एक वैकल्पिक प्रणाली विकसित की है जो एक आसान, सस्ता और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मंच प्रदान करती है जिसे ओपन-सोर्स 3 डीप्रिंटिंग तकनीकों का उपयोग करके निर्मित किया जा सकता है। वर्तमान आलेख अंतिम-उपयोगकर्ताओं द्वारा प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अनुप्रयोगों को सक्षम करने के लिए सिस्टम के सेटअप का वर्णन करता है। यह सेटअप दबाव (40-180 मिमीएचजी), प्रवाह दर (6-30 एमएल / मिनट) की शारीरिक और पैथोलॉजिकल स्थितियों के आवेदन को सक्षम बनाता है, और कतरनी तनाव की अलग-अलग डिग्री के साथ रक्त चिपचिपाहट की नकल करने वाले मीडिया के साथ संयोजन में।
प्रजनन क्षमता वैज्ञानिक प्रक्रिया का एक अनिवार्य पहलू है, क्योंकि यह शोधकर्ताओं को दूसरों के निष्कर्षों को मान्य करने और संवहनी रोगों की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए उन पर निर्माण करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, वैज्ञानिक ज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए समूहों के बीच सहयोग को सक्षम और बढ़ावा देने वाले उपकरण आवश्यक हैं। ईज़ीफ्लो ऐसे ओपन-सोर्स, सुलभ समाधानों का एक उदाहरण प्रस्तुत करता है जिन्हें संवहनी विज्ञान और उससे परे के क्षेत्र में परियोजनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला पर काम करने वाली प्रयोगशालाओं द्वारा आसानी से उत्पादित और अपनाया जा सकता है।
हम रिपोर्ट करते हैं कि यह डिवाइस संस्कृति कम से कम 7 दिनों के लिए धमनी ऊतक व्यवहार्यता बनाए रखती है, और इसका उपयोग संवहनी रोग के विशिष्ट चरणों को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है। इसका उपयोग करके, कोई शारीरिक प्रवाह दर और दबाव की स्थिति13 को मॉडल कर सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, यह छिड़काव संस्कृति कम उत्पादन लागत और सिस्टम को संचालित करने के लिए आवश्यक माध्यम की कम मात्रा के कारण लागत प्रभावी है।
3 डी डिजाइन को नए अनुप्रयोगों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, और मुद्रण के लिए नई सामग्री का परीक्षण किया जा सकता है। यहां तक कि अपने वर्तमान प्रारूप में, नमूना आवास स्थान को फिटिंग की लंबाई या ल्यूर कनेक्टर के बोर को बदलकर विभिन्न आकारों के नमूनों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, डिवाइस की मॉड्यूलर प्रकृति और इसके छोटे आयामों को देखते हुए, इस बायोरिएक्टर का उपयोग कई सेटअपों (चित्रा 5) में किया जा सकता है और इसे मल्टीप्लेक्स संस्कृतियों पर लागू किया जा सकता है, जहां कई नमूने अलग-अलग बायोरिएक्टर में एक ही समय में विभिन्न स्थितियों के संपर्क में आ सकते हैं।
यह कल्पना की जाती है कि भविष्य में विभिन्न मूल (जैसे, विभिन्न प्रजातियों) और विभिन्न प्रकृति (जैसे, नसों, लसीका) से रक्त वाहिकाओं की संस्कृति का समर्थन करने के लिए प्रणाली के उपयोग का विस्तार किया जाए, और शायद अन्य खोखले ऊतकों (जैसे, श्वासनली, आंत) की संस्कृति पर लागू किया जाए। विशेष रूप से, अनुसंधान से पता चलता है कि निरंतर छिड़काव में ऊतक-इंजीनियर मचानों की खेती करने से परिणामी ऊतक25,26 के निर्माण और परिपक्वता के भीतर कोशिकाओं के समरूप वितरण में मदद मिलती है। इसके अलावा, छिड़काव में संवहनी ग्राफ्ट को सीडिंग स्थैतिकविधियों की तुलना में अधिक समान रूप से सेलुलर संवहनी लुमेन प्राप्त करने में योगदान देता है। इस कारण से, हम वर्तमान चुनौतियों का समाधान करने में मदद करने के लिए ऊतक इंजीनियरिंग पर लागू होने वाली प्रणाली की कल्पना करते हैं, जिससे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सिंथेटिक रक्त वाहिका विकल्प28 के भविष्य के विकास की अनुमति मिलती है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्रवाह संस्कृति की सफलता के लिए महत्वपूर्ण कुछ महत्वपूर्ण कदम प्रस्तुत करता है। उचित प्रवाह स्थितियों की स्थापना और निगरानी करना तुच्छ नहीं है और प्रत्येक प्रणाली पर प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है जब इसे पहली बार स्थापित किया जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि संस्कृति की स्थिति शारीरिक है। दबाव सेंसर और अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का उपयोग करके प्रवाह और दबाव की निगरानी की गई। एक और महत्वपूर्ण बिंदु यह सुनिश्चित करना है कि संस्कृति की शुरुआत में ऊतक व्यवहार्य और बरकरार है। इसके लिए एक नए स्रोत, सावधानीपूर्वक हैंडलिंग की आवश्यकता होती है और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा सत्यापित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, किसी भी संभावित जीवाणु संदूषण या मीडिया रिसाव स्रोत की पहचान करने के लिए हर प्रयोग की शुरुआत में समस्या निवारण किया जाना चाहिए।
यह उजागर करना महत्वपूर्ण है कि वर्णित छिड़काव प्रणाली, शारीरिक दबाव और प्रवाह की स्थिति प्रदान करते हुए, विवो में दर्ज जटिल दबाव तरंग पैटर्न की पूरी तरह से नकल करने में असमर्थ है। यह सीमा पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करने के लिए अवर्णनीय है और उन्नत हेमोडायनामिक स्थितियों को पुन: उत्पन्न करने के लिए अधिक विशेष उपकरणों का उपयोग करके हल किया जा सकता है। एक बायोरिएक्टर में रक्त वाहिकाओं की संस्कृति भी उन अध्ययनों को संबोधित करने में असमर्थ है जहां प्रतिरक्षा प्रणाली या अन्य अंगों के साथ बातचीत महत्वपूर्ण है।
निष्कर्ष में, एक सरल 3 डी मुद्रित छिड़काव प्रणाली प्रस्तुत की जाती है जो शारीरिक हेमोडायनामिक वातावरण की नकल कर सकती है, जिससे पूर्व विवो रक्त वाहिका संस्कृतियों के मानकीकरण में योगदान करने की उम्मीद है। दीर्घकालिक संस्कृति के लिए अनुकूलन और आवेदन की इसकी क्षमता इसे शरीर विज्ञान और रोग स्थितियों में इन जटिल जैविक प्रणालियों की समझ को आगे बढ़ाने के लिए एक आवश्यक उपकरण बनाती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
लेखक हिस्टोलॉजी सेवाओं के लिए यूनिवर्सिटी ऑफ सरे स्कूल ऑफ वेटरनरी मेडिसिन में पशु चिकित्सा पैथोलॉजी सेंटर को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम जानवरों के ऊतकों की खरीद में उनके समर्थन के लिए द पीरब्राइट इंस्टीट्यूट (पीरब्राइट, यूके) के डॉ एल डिक्सन, ए रीस और एम हेनस्टॉक और सरे विश्वविद्यालय में जैव रासायनिक विज्ञान विभाग, विशेष रूप से तकनीकी टीम को उनके निरंतर समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। आरएसएम को डॉक्टरेट कॉलेज के छात्र पुरस्कार (सरे विश्वविद्यालय) द्वारा समर्थित किया गया था, डीएम और पीसी को अनुसंधान में जानवरों के प्रतिस्थापन, शोधन और कमी के लिए राष्ट्रीय केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान संख्या: एनसी / R001006 / 1 और एनसी / T001216 / 1)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasyFlow | - | - | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 - 3D printing | Protolabs | - | - |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound - OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt - 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | - | - | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels - Size 23 - Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
References
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