Summary
Bu protokol, perfüzyonda kan damarlarının ex vivo kültürü için yeni geliştirilen, 3D baskılı bir biyoreaktörün kurulumunu ve çalıştırılmasını sunar. Sistem, diğer kullanıcılar tarafından kolayca benimsenebilecek, pratik, uygun fiyatlı ve temel biyoloji ve farmakolojik çalışmalar gibi farklı deneysel uygulamalara uyarlanabilir şekilde tasarlanmıştır.
Abstract
Vasküler hastalıklar, tüm dünyada mortalite ve morbiditenin birincil nedeni olmaya devam eden çoğu kardiyovasküler hastalığın (KVH) temelini oluşturur. Vasküler hastalıkları önlemek ve tedavi etmek için etkili cerrahi ve farmakolojik müdahalelere acilen ihtiyaç vardır. Kısmen, translasyonel modellerin eksikliği, vasküler hastalıkta yer alan hücresel ve moleküler süreçlerin anlaşılmasını sınırlamaktadır. Ex vivo perfüzyon kültürü biyoreaktörleri, in vitro kültürün kolaylığını ve canlı dokunun karmaşıklığını birleştirerek, kontrollü dinamik bir ortamda büyük hayvan damarlarının (insanlar dahil) incelenmesi için ideal bir platform sağlar. Bununla birlikte, çoğu biyoreaktör özel olarak üretilir ve bu nedenle sonuçların tekrarlanabilirliğini sınırlayarak benimsenmesi zordur. Bu makale, herhangi bir biyolojik laboratuvarda kolayca üretilebilen ve uygulanabilen 3D baskılı bir sistem sunar ve kurulumu için ayrıntılı bir protokol sağlayarak kullanıcıların çalışmasını sağlar. Bu yenilikçi ve tekrarlanabilir ex vivo perfüzyon kültür sistemi, fizyolojik koşullarda 7 güne kadar kan damarlarının kültürlenmesini sağlar. Standartlaştırılmış bir perfüzyon biyoreaktörünün benimsenmesinin, büyük hayvan kan damarlarındaki fizyolojik ve patolojik süreçlerin daha iyi anlaşılmasını destekleyeceğini ve yeni terapötiklerin keşfini hızlandıracağını umuyoruz.
Introduction
Vasküler duvar, hem dış uyaranlara (yani basınç değişikliği, vazokonstriktörler) hem de kan pıhtılaşmasını ve enflamatuar hücre infiltrasyonunu önleyen tutarlı bir aktive olmayan yüzey sağlayan reaktif sabit bir durumda bulunur1. Yaşlanmaya ve yaşam tarzına bağlı uyaranlara yanıt olarak ve doğrudan hasar üzerine vasküler duvar, iskemik inme ve miyokard enfarktüsü gibi yaygın kardiyovasküler hastalıklara (KVH'ler) katkıda bulunduğu bilinen restenoz ve ateroskleroz gibi yeniden şekillenme süreçlerini aktive eder2. Vasküler hastalığın ilerlemiş bulgularının üstesinden gelmek için perkütan revaskülarizasyon ve stentleme gibi girişimsel yaklaşımlar mevcut olsa da, bunların daha fazla vasküler hasara neden olduğu ve sıklıkla nükslere yol açtığı bilinmektedir. Ek olarak, yalnızca sınırlı önleyici ve erken aşama çözümler mevcuttur. Vasküler duvar homeostazını sürdüren ve işlev bozukluğunu yönlendiren mekanizmaları anlamak, yeni tedaviler geliştirmenin merkezinde yer alır3.
Moleküler biyoloji ve doku mühendisliğindeki sürekli gelişme ve ilerlemelere rağmen, hayvan çalışmaları vasküler biyoloji çalışmalarının çok önemli bir bileşeni olmaya devam etmektedir. İn vivo hayvan çalışmaları, vasküler homeostaz ve patoloji mekanizmaları hakkında muazzam bir fikir vermiştir; Bununla birlikte, bu prosedürler maliyetlidir, nispeten düşük verime sahiptir ve önemli etik sorunlar ortaya çıkarır. Ek olarak, küçük hayvanlar insan vasküler fizyolojisini zayıf bir şekilde temsil eder ve daha büyük hayvan deneyleri çok daha pahalıdır ve daha fazla etik husus yaratır 4,5. Hızla yaşlanan bir nüfus için farmasötik ve tıbbi çözümlere yönelik artan taleple birlikte, hayvan kullanımının olumsuz yönleri büyütülmekte ve sonuçların tekrarlanabilirliğini, güvenilirliğini ve hasta bakımına aktarılabilirliğini etkilemektedir6.
İn vitro sistemler, temel mekanizmaları incelemek için basitleştirilmiş bir platform sunar, ancak tüm dokunun karmaşıklığını, hücreler ve hücre dışı matris arasındaki etkileşimleri ve vasküler hastalıkların gelişiminde kritik belirleyiciler olan mekanik kuvvetleri özetlemekte başarısız olur7.
Yapay olarak kontrol edilen ortamlarda tutulan tüm dokular üzerinde gerçekleştirilen ex vivo çalışmalar, nispeten yüksek verimli araştırmalara olanak tanırken in vivo karmaşıklığı taklit eder8. Kültür koşullarını ve çevreyi yakından kontrol etme yeteneği göz önüne alındığında, ex vivo modeller çok çeşitli karmaşık çalışmalara izin verir ve vasküler biyolojide hayvan prosedürlerinin kullanımını azaltmak için uygun bir alternatif sunar. Statik vasküler halka kültürleri ilginç bilgiler sundu, ancak önemli hemodinamik unsuru dahil etmede başarısızoldu 9. Gerçekten de, vasküler sistemin ex vivo çalışması, kan damarı duvarındaki hücrelere uygulanan birçok dinamik kuvvetle ilgili belirli zorluklar ortaya koymaktadır. Luminal akış, türbülans, kayma gerilmesi, basınç ve duvar deformasyonu gibi uyaranlar doku patofizyolojisini önemli ölçüde etkiler10,11,12.
Perfüzyon biyoreaktörleri, yaralanma veya hemodinamik değişikliklere yanıt olarak vasküler homeostazı ve yeniden şekillenmeyi incelemek için gereklidir13. Ayrıca, perfüzyon kültürü, doku mühendisliği kan damarlarının (TEBV'ler) olgunlaşmasını ve dayanıklılığını artırmak için kullanılabilir ve vasküler greftler için uygun alternatifler sağlar14.
Ticari olarak temin edilebilen perfüzyon biyoreaktörleri esneklik ve uyarlanabilirlik açısından sınırlıdır ve maliyetlidir. Mevcut şirket içinde geliştirilen biyoreaktörlerin çoğunun, sınırlı açıklamalar ve özel olarak yapılmışbileşenlerin 7,8,9,10,11,12 bulunmaması nedeniyle diğer laboratuvarlarda çoğaltılması zordur. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, yakın zamanda üretimi ekonomik olan, bir dizi dokuyu barındıran ve farklı araştırma taleplerine uyum sağlamak için nispeten basit modifikasyonlara olanak tanıyan yeni bir biyoreaktör (EasyFlow) geliştirdik13. Ek parça 3D baskılıdır ve standart 50 mL santrifüj tüpünün kapağına oturur. Modüler tasarımı ve 3D baskı üretimi, farklı laboratuvarlarda erişilebilir ve tekrarlanabilir olmasının yanı sıra farklı bilimsel ihtiyaçlara uyum sağlamak için kolayca değiştirilebilir olmasını sağlar. Bu protokol, biyoreaktör sisteminin bir arteriyel perfüzyon ortamında montajını ve temel çalışmasını açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, iki EasyFlow (biyoreaktör) ekinden oluşan bir sistemin montajını ve kullanımını açıklar: biri perfüze arter örneğini içeren reaksiyon odasını (C) temsil eder ve diğeri orta rezervuar (R) olarak işlev görür (Şekil 1 ve Şekil 2A). Karotis arterler, İngiltere'deki Pirbright Enstitüsü'nde 4-6 haftalık erkek ve dişi domuz yavrularından (6-12 kg) elde edildi. Hayvan prosedürleri, İçişleri Bakanlığı Hayvanları (Bilimsel Prosedürler) Yasası (1986) (ASPA) kapsamında gerçekleştirildi ve Pirbright Enstitüsü'ndeki Hayvan Refahı ve Etik İnceleme Kurulu (AWERB) tarafından onaylandı. Hayvanlar, Yetiştirilen Hayvanların Barındırılması ve Bakımı Uygulama Kurallarına uygun olarak barındırıldı. Tüm prosedürler, PPL70/8852 Proje Lisansı kapsamında eğitimli ve yetkin olan Kişisel Lisans sahipleri tarafından yürütülmüştür. Domuz yavruları, ASPA kapsamındaki birinci yönteme göre itlaf edildi.
1. İmalatı yerleştirin
- Sağlanan 3D modeli kullanarak kesici ucu 3D baskı ile üretin (Ek Dosya 1).
NOT: 3D modelleme, yeni uygulamalara uyum sağlamak için tasarımda kolay değişiklikler yapılmasını sağlar. Kesici ucu üretmek için alternatif malzemeler ve alternatif üretim teknikleri de kullanılabilir. Karmaşık iç yapısı nedeniyle, seçici lazer sinterleme ve stereolitografi uygun alternatiflerdir15. Poliamid 12 (PA12; Malzeme Tablosuna bakınız), sıvı tutma ve tekrarlanan ısı sterilizasyon döngülerine karşı direnç açısından üstün performansı nedeniyle iyi bir malzeme adayıdır16. - Silikon contaları ve polikarbonat rondelaları, Ek Dosya 2'de sağlanan tasarımları kullanarak lazer kesim17 ile üretin.
NOT: Lazer kesim kolayca dış kaynaklıdır ve ucuz bir üretim yöntemidir. Pullar paslanmaz çelikten üretilebilir ve tekrarlanan kullanım için daha dayanıklı bir bileşen sağlar. Diğer tüm bileşenler ticari olarak temin edilebilen öğelerdir. Gerekli malzemelerin tam listesi Tablo 1'de verilmiştir. Öğelerin ticari detayları Malzeme Tablosunda yer almaktadır.
2. Cihaz sterilizasyonu, montajı ve astarlanması
- Tablo 1'deki talimatları izleyerek tüm bileşenleri sterilize edin.
- Laminer akış koşulları altında, Şekil 1A'da gösterildiği gibi iki fabrikasyon kesici ucu (adım 1) birleştirin.
- Aşağıdaki adımları izleyerek perfüzyon sistemini Şekil 2'deki gibi monte edin:
- Rezervuarın R1 portuna (medya değişim portu) bağlı iki üç vana takın.
- Ortaya çıkan çıkışı, tek yönlü valf (tek yönlü valf borusu) ile donatılmış bir tüp kullanarak peristaltik pompanın kafasına bağlayın.
- Tek yönlü bir valf ile donatılmış sistem borusunu kullanarak pompa kafasını reaksiyon odasının C4 portuna bağlayın.
NOT: Bu branşman isteğe bağlı olarak sürekli izleme sağlayan bir basınç sensörü ile donatılabilir. - Reaksiyon odası portu C1'i yumuşak duvarlı boruya ve bunu direnç kanalına (küçük iç çap) bağlayın.
NOT: Direnç borusunun uzunluğu, sistemde bulunan basıncı büyük ölçüde etkileyecektir. Yeterli perfüzyon koşullarını sağlamak için bu daha fazla araştırılmalıdır. - Direnç kanalını sistem borusu ile uzatın, bir dönüş kanalı oluşturun ve R5'teki rezervuara bağlanarak luminal sirkülasyon döngüsünü kapatın (Şekil 2C).
- Reaksiyon odası C3'ü sistem hortumu ile rezervuar R3'e bağlayarak bir taşma kanalı oluşturun.
- R2'den bir havalandırma filtresi takın.
- Hava ve ortam içeren bir şırıngayı reaksiyon odası C6'ya bağlayarak bir basınç sönümleyici oluşturun.
NOT: Doğru hava-ortam oranı, gerekli basınç sönümlemesine bağlı olacaktır.
- Sistemi perfüzyon ortamı ile hazırlayın (Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı [DMEM] +% 10 [v / v] fetal sığır serumu [FBS] +% 1 [v / v] penisilin-streptomisin +% 1 [v / v] amfoterisin B +% 30 [v / v] dekstran; Malzeme Tablosuna bakınız) medya değişim portları ve rezervuar aracılığıyla.
NOT: Sistemin doldurulması, sistemde kabarcık sıkışması riskini azaltır ve olası sızıntıları tespit eder. Önerilen ortam hacmi yaklaşık 100-120 mL'dir. Kullanılan hacim, deney için kullanılan borunun ölü hacmine bağlı olacaktır.
3. Numune toplama ve hazırlama
- Arteriyel dokunun doğrudan taşınmasını en aza indirerek sol ve sağ ortak karotis arterleri toplayın13.
- Dokuyu transfer için soğuk taşıma ortamına (DMEM +% 20 [v / v] FBS +% 2 [v / v] penisilin-streptomisin +% 1 [v / v] amfoterisin B, Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
- Laminer akış kabininde, fazla bağ dokusunu çıkarın ve bir neşter bıçağı kullanarak dokunun uçlarını kesin. Mendili soğuk taşıma ortamında iki kez yıkayın.
- Kapsamlı yıkama için mendili en az 30 dakika boyunca taşıma ortamında bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
- İki dikenli luer konektörü kullanarak arterin dallanmayan bir segmentini biyoreaktör sistemine bağlayın ve bir damar bağı (vasküler silikon bağlar; Tablo 1).
NOT: Damar bağı, gemiyi sabitlemek için uygun gerginliği ve geri çekmeyi sağlar. Oval bölüm doku hasarını önler. - Açıklığı doğrulamak için medyayı arterden yavaşça akıtın.
- Arteri fabrikasyon eke sabitledikten sonra, reaksiyon alanını perfüzyon ortamı ile doldurun (adım 2.4). Son olarak, sistemde kalan havayı ortadan kaldırmak için luminal sirkülasyon döngüsünü yavaşça ortamla doldurun.
- Reaksiyon alanını önceden monte edilmiş perfüzyon sistemine (bölüm 2) bağlayarak dolaşımı tamamlayın.
NOT: İşlenen dokunun immünohistokimyası ile kalite kontrolü yapılması önerilir. Bu, hazırlık sırasında aşırı kullanımdan kaynaklanan herhangi bir hasarı tanımlar.
4. Perfüzyon kültürü ve besiyeri değişimi
- Perfüzyon sistemini %5CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve ardından peristaltik bir pompaya bağlayın (Malzeme Tablosuna bakınız)
- Basınç sensörleri gibi ek (fakültatif) toplama sistemlerini bağlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
- ~10-15 mL/dk'lık düşük bir ortam akış hızıyla sistemi gece boyunca dengede bırakın.
NOT: Pompa ayarlarını, ortam akışını, sistem basıncını ve optimum basınç sönümleyicileri/cl'yi belirlemek için ilk deneylerampuygun koşulların karşılandığından emin olmak için ayarlar gereklidir. - Ertesi gün, nihai akış hızına (35 mL/dak) ulaşılana kadar akışı kademeli olarak (her saat +1 rpm, mevcut sistemde her saat ~2,5 mL/dk'lık bir artışa eşdeğer) artırın. Sistemi sızıntılara karşı periyodik olarak izleyin.
NOT: Peristaltik pompa hızına göre doğru akış hızını hesaplamak için, kullanıcıların önce yeterli pompa kalibrasyonu18 yapması gerekir. Formül (1) kullanılarak, hacimsel akış hızı (Q), belirli bir süre (t) içinde dağıtılan hacme (V) göre hesaplanabilir. Tahmini akış hızını () hesaplamak için, denklem (2)'de açıklanan önceden hesaplanmış akış hızını (Q) ve kap kesit alanını (
A) kullanabiliriz.
(1)
(2) - Her 3 günde bir, kullanılmış ortamı toplamak için taze ortamla dolu bir şırıngayı pompaya daha yakın ortam değişim portuna ve boş bir şırıngayı rezervuara daha yakın porta bağlayarak ortamın %50'sini (~50 mL) değiştirin (Şekil 2).
NOT: Medya değişim portları olarak iki adet üç vananın kullanılması, ortam değişimi sırasında perfüzyonun sürekli çalışmasını kolaylaştırır. - Deneyin sonunda, steril cerrahi makas kullanarak biyoreaktöre bağlı uçları keserek reaksiyon odasından doku toplayın.
- Daha sonra kullanmak üzere sistemi sökün, temizleyin ve sterilize edin.
A) kullanabiliriz.
(1)
(2)5. Numune analizi
- Hasat edilen numuneyi gece boyunca 4 °C'de %4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin.
- Dokuyu optimum kesme sıcaklığına (OCT; Malzeme Tablosuna bakınız)19 gömün ve sıvı nitrojen içinde soğutulmuş izo-pentan içine daldırarak dondurun.
- Bir kriyostat kullanarak 3-5 mm kalınlığında kriyo kesitler elde edin.
- İmmünohistokimya (hematoksilen ve eozin [H&E]) ve/veya immünofloresan uygulayın. Tipik immünofloresan protokolünü izleyin:
- Dilimleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca fosfat tamponlu salin içinde% 20 [h / h] keçi serumu ile bloke edin (PBS; bkz.
- Dilimleri gece boyunca 4 ° C'de, PBS'de 1:50 oranında seyreltilmiş CD31'e karşı birincil tavşan antikoru ile inkübe edin (bkz.
- PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- PBS'de 1:200 oranında seyreltilmiş floresan etiketli keçi anti-tavşan ikincil antikoru ve PBS'de 1:200 oranında seyreltilmiş α-düz kas aktini (SMA) doğrudan konjuge floresan antikoru ile 37 ° C'de 1 saat inkübe edin (bkz.
- PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Çekirdekleri, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de 1: 1.000 oranında seyreltilmiş DAPI ile boyayın.
- Doku otofloresansını azaltmak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 70 (h / h) etanol içinde% 0.1 (a / h) Sudan Siyahı (Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
- Dokuyu bol deiyonize su ile yıkayın. Kızakları montaj ortamına monte edin.
- Numuneleri konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntüleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışma, çok yönlü ve uygun fiyatlı bir perfüzyon sistemi (EasyFlow) oluşturmuştur13. Sistemin 3D baskılı tasarımı, sistemin diğer laboratuvarlar tarafından benimsenmesini kolaylaştırır ve bu nedenle tekrarlanabilirliği teşvik eder.
Fabrikasyon perfüzyon eki, izole bir ortam yaratarak 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirilmiştir. İki perfüzyon eki kullanılarak, biyolojik numunenin inkübe edildiği bir rezervuar ve bir reaksiyon odası içeren bir perfüzyon döngüsü oluşturulabilir. Perfüzyon sistemi daha sonra kültür koşullarını izlemek için peristaltik bir pompaya ve basınç sensörleri ve ultrason cihazları gibi isteğe bağlı toplama sistemlerine bağlanır (Şekil 2).
Domuz karotis arter örnekleri toplandı ve 7 gün boyunca perfüzyonda kültürlenmeden önce işlendi. Kültürden önce dokunun kalitesini sağlamak için, örneklerin eksizyon sırasında, doku hazırlığından sonra ve perfüzyondan sonra sabitlendiği ön deneyler yapıldı. Doku bütünlüğünün korunmasını değerlendirmek için endotelyal (CD31) ve düz kas (αSMA) belirteçleri için floresan boyama kullanıldı. İyi korunmuş ve hasar görmüş doku örnekleri karşılaştırma için Şekil 3'te sunulmuştur. Görüntüler, eksizyon sırasında dokunun nazikçe ele alınmasının önemini göstermektedir, çünkü yanlış işleme (aşırı gerilme, ezilme vb.) kültürden önce endotel kaybına neden olabilir. Sonuçlar ayrıca luminal hasarı önlemek için perfüzyonun kademeli olarak kurulmasının önemini göstermektedir.
H&E boyama, 7 günlük kültürden sonra damar duvarındaki hücrelerin morfolojisinin ve genel dağılımının korunmasını göstermek için immünofloresan (IF) boyaması ile birlikte gerçekleştirildi (Şekil 4). Cihazda fizyolojik kültür koşullarının uygulanması, lümenin endotel kapsamının korunmasını, ortamdaki düz kas hücrelerinin hizalanmasını ve adventitiada vasa vasorum'un korunmasını sağlar.
Biyoreaktör sisteminin kompakt ve modüler tasarımı, çok çeşitli sistem kurulumlarına da olanak tanır. Daha küçük kurulum, tek bir biyoreaktör içerir ve farmakolojik ve düşük hacimli çalışmalar için idealdir (devridaim perfüzyonu20, toplam hacim 50-70 mL). Kültürün uzunluğunu artırmak ve ortam değişikliklerinin sayısını azaltmak için, bu protokolde tarif edilene benzer tek bir rezervuar sirkülasyon sistemi veya sabit bir besleme sistemi, dolaşımda daha büyük bir ortam hacmine sahip oldukları için daha idealdir. Uyaranların lokalizasyonunun kritik olduğu deneysel ortamları keşfetmek için bir çift dolaşım21 kurulumu kurulabilir. Mevcut cihaz, pH ve çözünmüş oksijen gibi parametrelerin hassas geri besleme kontrolünü sağlamak için daha gelişmiş kontrol sistemleriyle de birleştirilebilir (Şekil 5).
Şekil 1: EasyFlow montaj şemaları. (A) Perfüzyon ekinin montajına yardımcı olan 3D işlenmiş şemalar. (B) Bağlantı yerlerinin montajını kolaylaştırmak için ayrıntılı şemalar sağlanmıştır. (C) Reaksiyon alanının enine kesit görünümü, EasyFlow kesici ucun temel bileşenlerini ve dokunun kesici uca bağlantısını vurgular. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Perfüzyon sistemi düzeneğinin şematik gösterimi. (A) Tüm önemli bileşenleri içeren, 3D olarak oluşturulmuş bir ortamdaki göreceli konumlarını vurgulayan monte edilmiş perfüzyon sistemi. Tüm bileşenler ölçeklendirilemez. (B) Bileşenlerin bireysel izometrik görünümleri de sunulmaktadır. (C) Farklı bileşenlerin montajına ve bağlantısına yardımcı olmak için monte edilmiş perfüzyon sisteminin üstten görünümü gösterilmiştir. Portlar, perfüzyon sistemi boyunca çeşitli bağlantı yerlerinde gezinmek için saat yönünün tersine etiketlendi ve numaralandırıldı. Bu prensip rezervuara (R) ve reaksiyon odasına (C) uygulanmıştır. İki odayı birbirine bağlayan çeşitli kanallara da referans için isimler verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İşleme sırasında doku bakımı. (A) Konfokal görüntüler, hasat sırasında, (B) temizleme ve işlemden sonra ve (C) perfüzyon kültüründen sonra bir arterin normal yapısını gösterir ve iyi korunmuş bir morfolojinin korunmasını gösterir. (D) İşleme sırasında aşırı veya yanlış kullanım nedeniyle veya (E) fizyolojik olmayan kültür koşullarının uygulanması (yani, yüksek akışın aniden başlaması) nedeniyle hasar görmüş doku örnekleri, lümen kapsamının tükendiğini ve ortamın bozulmasını gösterir. (F) Negatif kontrol, boyamanın özgüllüğünü gösterir. CD31: yeşil; αSMA: kırmızı; DAPI: mavi. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Perfüzyon kültürü öncesi ve sonrası dokunun histolojik değerlendirmesi. (A ve B) Arteriyel doku, hasat sırasında histoloji ile ve biyoreaktör sistemi ile 7 günlük kültürden sonra (C ve D) değerlendirildi. (A ve C) H & E boyama, arteriyel duvar yapısının ve organizasyonunun korunmasını ortaya çıkarır. (B ve D) Aynı dokunun immünofloresan boyanması, adventitiada endotel kapsamı, düz kas hücresi dizilimi ve vasa vasorum kanıtıdır. CD31: yeşil; SMA: kırmızı; DAPI: mavi. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Olası perfüzyon kurulumlarının şematik gösterimi. Farklı deneysel çalışmalara olanak sağlamak için perfüzyon eki ile çeşitli alternatif kurulumlar yerleştirilebilir. (A) Devridaim perfüzyon kurulumu, gerekli ortam hacmini en aza indirir. (B) Sabit besleme kurulumu, dokuya sabit bir ortam beslemesi sağlar. (C) Tek rezervuar sirkülasyonu (bu yazıda açıklandığı gibi), uzun süreli inkübasyonlar için daha büyük bir ortam hacmi sağlar ve hava değişimi ve basınç dengelemesi için bir tampon bölge içerir. (D) Çift dolaşım düzeni, iç (arter içi) ve dış (reaksiyon alanı) dolaşımları bağımsız olarak besleyen iki ayrı döngü sağlar. (E) Dinamik perfüzyon kurulumu, orantılı-integral-türev (PID) kontrolörü tarafından sürekli gazları ve pH kontrolünü içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Kesici uçların imalatı için bileşenler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: 3D baskı üretimi için EasyFlow insert'in 3D modeli. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 2: İnşa edilen cihazın tasarım şemaları, kesit görünümü, çıktı ve sızdırmazlık bileşenleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo vasküler perfüzyon sistemleri, kontrollü koşullar altında doğal dokularındaki vasküler hücrelerin işlev ve davranışlarını incelemek için benzersiz bir platform oluşturur ve bu da yaralanma sonrası vasküler yeniden şekillenme gibi karmaşık süreçlerin diseksiyonunu sağlar22. Bununla birlikte, rapor edilen biyoreaktörlerin çoğu, ısmarlama bileşenlere dayalı şirket içi sistemlerdir ve genellikle başkaları tarafından kopyalanması zordur23. Alternatif ticari çözümler mevcuttur, ancak tasarımda esneklikten yoksundur ve nispeten maliyetli olabilir24.
Açık kaynaklı 3D baskı teknikleri kullanılarak üretilebilen kolay, ucuz ve tekrarlanabilir bir platform sağlayan alternatif bir sistem geliştirdik13. Bu makalede, son kullanıcılar tarafından tekrarlanabilir uygulamaları etkinleştirmek için sistemin kurulumu açıklanmaktadır. Bu kurulum, fizyolojik ve patolojik basınç (40-180 mmHg), akış hızı (6-30 mL/dak) koşullarının ve değişen derecelerde kayma gerilimi ile kan viskozitesini taklit eden ortamla kombinasyon halinde uygulanmasını sağlar.
Tekrarlanabilirlik, araştırmacıların başkalarının bulgularını doğrulamasına ve vasküler hastalıklar hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için bunları geliştirmesine izin verdiği için bilimsel sürecin önemli bir yönüdür. Ayrıca, gruplar arasında işbirliğini mümkün kılan ve teşvik eden araçlar, bilimsel bilgiyi ilerletmek için gereklidir. EasyFlow, vasküler bilimler alanında ve ötesinde çok çeşitli projeler üzerinde çalışan laboratuvarlar tarafından kolayca üretilebilen ve benimsenebilen bu tür açık kaynaklı, erişilebilir çözümlerin bir örneğini temsil eder.
Bu cihaz kültürünün en az 7 gün boyunca arteriyel doku canlılığını koruduğunu ve vasküler hastalığın belirli basamaklarını modellemek için kullanılabileceğini bildiriyoruz. Bunu kullanarak, fizyolojik akış hızları ve basınç koşullarımodellenebilir 13. Daha da önemlisi, bu perfüzyon kültürü, düşük üretim maliyetleri ve sistemi çalıştırmak için gerekli olan düşük ortam hacmi nedeniyle uygun maliyetlidir.
3D tasarım ayrıca yeni uygulamalara uyarlanabilir ve baskı için yeni malzemeler test edilebilir. Mevcut formatında bile, numune yerleştirme alanı, bağlantı parçalarının uzunluğu veya luer konektörlerinin deliği değiştirilerek farklı boyutlardaki numunelere kolayca uyarlanabilir. Cihazın modüler yapısı ve küçük boyutları göz önüne alındığında, bu biyoreaktörün birkaç kurulumda kullanılabileceğini (Şekil 5) ve birkaç numunenin aynı anda farklı koşullara maruz bırakılabileceği multipleks kültürlere uygulanabileceğini belirtmek önemlidir.
Sistemin kullanımının, farklı kökenlerden (örneğin, farklı türler) ve farklı doğalardan (örneğin, damarlar, lenfatik) kan damarlarının kültürünü desteklemek için gelecekte genişletilmesi ve belki de diğer içi boş dokuların (örneğin, trakea, bağırsak) kültürüne uygulanması öngörülmektedir. Özellikle, araştırmalar, doku mühendisliği iskelelerinin sürekli perfüzyonda kültürlenmesinin, hücrelerin yapı içinde homojen dağılımına ve elde edilen dokunun olgunlaşmasına yardımcı olduğunu göstermektedir25,26. Ek olarak, vasküler greftlerin perfüzyonda ekilmesi, statik yöntemlere kıyasla daha düzgün bir hücreselleştirilmiş vasküler lümen elde edilmesine katkıda bulunur27. Bu nedenle, sistemin mevcut zorlukların üstesinden gelmeye yardımcı olmak için doku mühendisliğine uygulanmasını ve tekrarlanabilir sentetik kan damarı ikamelerinin gelecekte geliştirilmesine izin vermesini öngörüyoruz28.
Burada açıklanan protokol, akış kültürünün başarısı için kritik olan bazı önemli adımları sunar. Uygun akış koşullarının oluşturulması ve izlenmesi önemsiz değildir ve kültür koşullarının fizyolojik olduğundan emin olmak için ilk kez kurulduğunda her sistemde gerçekleştirilmesi gerekir. Akış ve basınç, basınç sensörleri ve ultrason görüntüleme kullanılarak izlendi. Bir diğer kritik nokta ise kültürün başlangıcında dokunun canlı ve sağlam olmasını sağlamaktır. Bu, yeni bir kaynak, dikkatli kullanım gerektirir ve histolojik analizle doğrulanabilir. Ek olarak, herhangi bir potansiyel bakteriyel kontaminasyonu veya ortam sızıntısı kaynağını belirlemek için her deneyin başında sorun giderme yapılmalıdır.
Açıklanan perfüzyon sisteminin, fizyolojik basınç ve akış koşulları sağlarken, in vivo olarak kaydedilen karmaşık basınç dalgası modellerini tamamen taklit edemediğini vurgulamak önemlidir. Bu sınırlama, peristaltik bir pompa kullanımına atfedilebilir ve ileri hemodinamik koşulları yeniden üretmek için daha özel ekipman kullanılarak çözülebilir. Bir biyoreaktördeki kan damarlarının kültürü, bağışıklık sisteminin veya diğer organlarla etkileşimin kritik olduğu çalışmaları da ele alamaz.
Sonuç olarak, ex vivo kan damarı kültürlerinin standardizasyonuna katkıda bulunması beklenen, fizyolojik hemodinamik ortamı taklit edebilen basit bir 3D baskılı perfüzyon sistemi sunulmuştur. Özelleştirme ve uzun vadeli kültüre uygulama potansiyeli, onu fizyoloji ve patolojik koşullarda bu karmaşık biyolojik sistemlerin anlaşılmasını ilerletmek için önemli bir araç haline getirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, histoloji hizmetleri için Surrey Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi'ndeki Veteriner Patoloji Merkezi'ne teşekkür etmek istiyor. Ayrıca Pirbright Enstitüsü'nden (Pirbright, İngiltere) Dr. L. Dixon, A. Reis ve M. Henstock'a hayvan dokularının teminindeki destekleri için ve Surrey Üniversitesi Biyokimyasal Bilimler Bölümü'ne, özellikle de teknik ekibe sürekli destekleri için teşekkür ederiz. RSM, Doktora Koleji öğrenci ödülü (Surrey Üniversitesi) tarafından desteklenmiştir, DM ve PC, Araştırmada Hayvanların Değiştirilmesi, İyileştirilmesi ve Azaltılması Ulusal Merkezi tarafından desteklenmiştir (hibe numaraları: NC / R001006 / 1 ve NC / T001216 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasyFlow | - | - | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 - 3D printing | Protolabs | - | - |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound - OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt - 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | - | - | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels - Size 23 - Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
References
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: Endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Gugliandolo, E., et al. Palmitoylethanolamide and Polydatin combination reduces inflammation and oxidative stress in vascular injury. Pharmacological Research. 123, 83-92 (2017).
- Anselmino, M., et al. Catheter ablation of atrial fibrillation in patients with left ventricular systolic dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Circulation, Arrhythmia, and Electrophysiology. 7 (6), 1011-1018 (2014).
- Viola, M., et al. Subcutaneous delivery of monoclonal antibodies: How do we get there. Journal of Controlled Release. 286, 301-314 (2018).
- Kim, D. D. In vitro cellular models for nasal drug absorption studies. Drug Absorption Studies: In Situ, In Vitro and In Silico Models. , 216-234 (2008).
- Lewis, D. I. Animal experimentation: Implementation and application of the 3Rs. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (6), 675-679 (2019).
- Rouwkema, J., et al. In vitro platforms for tissue engineering: Implications for basic research and clinical translation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e164-167 (2011).
- Xu, Y., Shrestha, N., Préat, V., Beloqui, A. An overview of in vitro, ex vivo and in vivo models for studying the transport of drugs across intestinal barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113795 (2021).
- Vaghela, R., et al. Vessel grafts for tissue engineering revisited-Vessel segments show location-specific vascularization patterns in ex vivo ring assay. Microcirculation. 29 (2), e12742 (2022).
- Håkansson, J., et al. Individualized tissue-engineered veins as vascular grafts: A proof of concept study in pig. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 15 (10), 818-830 (2021).
- Saucy, F., et al. Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1. European Surgical Research. 45 (1), 50-59 (2010).
- Tosun, Z., McFetridge, P. S. Variation in cardiac pulse frequencies modulates vSMC phenotype switching during vascular remodeling. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (1), 59-70 (2015).
- Matos, R. S., Maselli, D., McVey, J. H., Heiss, C., Campagnolo, P. 3D printed bioreactor enabling the pulsatile culture of native and angioplastied large arteries. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 864580 (2022).
- Neff, L. P., et al. Vascular smooth muscle enhances functionality of tissue-engineered blood vessels in vivo. Journal of Vascular Surgery. 53 (2), 426-434 (2011).
- Boparai, K. S., Singh, R. Advances in Fused Deposition Modeling. In: Module. Refrence in Materials Science and Materials Engineering. , Elsevier. (2017).
- McKeen, L. W. Chapter 6 - Polyamides (Nylons). The Effect of Creep and Other Time Related Factors on Plastics and Elastomers (Second Edition). McKeen, L. W. , William Andrew Publishing. 197-262 (2012).
- Moradi, M., Mehrabi, O., Azdast, T., Benyounis, K. Y. Enhancement of low power CO2 laser cutting process for injection molded polycarbonate). Optics & Laser Technology. 96, 208-218 (2017).
- Ghasem, N. Computer Methods in Chemical Engineering. , CRC Press. (2021).
- Lying, F., Gazi, F., Gardner, E. Preparation of tissues and cells for infrared and raman spectroscopy and imaging. Biomedical Applications of Synchrotron Infrared Microspectroscopy.RSC Analytical Spectroscopy Monographs. (11), 147-185 (2011).
- Sassi, L., et al. A perfusion bioreactor for longitudinal monitoring of bioengineered liver constructs. Nanomaterials. 11 (2), 275 (2021).
- Haykal, S., et al. Double-chamber rotating bioreactor for dynamic perfusion cell seeding of large-segment tracheal allografts: Comparison to conventional static methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (8), 681-692 (2014).
- Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplant. 27 (9), 1375-1389 (2018).
- Wong, M. M., Hong, X., Karamariti, E., Hu, Y., Xu, Q. Generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (97), 52565 (2015).
- Alvino, V. V., et al. In vitro and in vivo preclinical testing of pericyte-engineered grafts for the correction of congenital heart defects. Journal of the American Heart Association. 9 (4), e014214 (2020).
- Nerurkar, N. L., Sen, S., Baker, B. M., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Dynamic culture enhances stem cell infiltration and modulates extracellular matrix production on aligned electrospun nanofibrous scaffolds. Acta Biomaterialia. 7 (2), 485-491 (2011).
- Engebretson, B., Mussett, Z. R., Sikavitsas, V. I. The effects of varying frequency and duration of mechanical stimulation on a tissue-engineered tendon construct. Connective Tissue Research. 59 (2), 167-177 (2018).
- Saunders, S. K., et al. Evaluation of perfusion-driven cell seeding of small diameter engineered tissue vascular grafts with a custom-designed seed-and-culture bioreactor. PLoS One. 17 (6), e0269499 (2022).
- Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Research. 7, (2018).
