Summary
פרוטוקול זה מציג את ההתקנה והתפעול של ביוריאקטור מודפס תלת-ממדי שפותח לאחרונה עבור תרבית ex vivo של כלי דם בזילוח. המערכת תוכננה להיות מאומצת בקלות על ידי משתמשים אחרים, מעשית, במחיר סביר וניתנת להתאמה ליישומים ניסיוניים שונים, כגון ביולוגיה בסיסית ומחקרים פרמקולוגיים.
Abstract
מחלות כלי דם מהוות את הבסיס לרוב מחלות הלב וכלי הדם (CVD), אשר נותרו הגורם העיקרי לתמותה ותחלואה ברחבי העולם. יש צורך דחוף בהתערבויות כירורגיות ופרמקולוגיות יעילות למניעה וטיפול במחלות כלי דם. בין השאר, המחסור במודלים תרגומיים מגביל את הבנת התהליכים התאיים והמולקולריים המעורבים במחלות כלי דם. ביוריאקטורים של תרביות זילוח Ex vivo מספקים פלטפורמה אידיאלית לחקר כלי דם גדולים של בעלי חיים (כולל בני אדם) בסביבה דינמית מבוקרת, המשלבים את הקלות של תרבית חוץ גופית ואת המורכבות של הרקמה החיה. עם זאת, רוב הביוריאקטורים מיוצרים בהתאמה אישית ולכן קשה לאמץ אותם, מה שמגביל את יכולת השחזור של התוצאות. מאמר זה מציג מערכת מודפסת בתלת ממד שניתן לייצר וליישם בקלות בכל מעבדה ביולוגית, ומספק פרוטוקול מפורט להקמתה, המאפשר את פעולת המשתמשים. מערכת תרבית זילוח ex vivo חדשנית וניתנת לשחזור מאפשרת תרבית של כלי דם עד 7 ימים בתנאים פיזיולוגיים. אנו מצפים כי אימוץ ביוריאקטור זילוח סטנדרטי יתמוך בהבנה טובה יותר של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים בכלי דם גדולים של בעלי חיים ויאיץ את הגילוי של טיפולים חדשים.
Introduction
דופן כלי הדם קיימת במצב יציב תגובתי, המבטיח הן תגובה לגירויים חיצוניים (כלומר, שינוי לחץ, מכווצי כלי דם) והן משטח עקבי שאינו מפעיל המונע קרישת דם וחדירת תאים דלקתיים1. בתגובה לגירויים תלויי הזדקנות ואורח חיים ועל נזק ישיר, דופן כלי הדם מפעילה תהליכי עיצוב מחדש כגון רסטנוזיס וטרשת עורקים, אשר ידועים כתורמים למחלות לב וכלי דם נפוצות (CVD), כגון שבץ איסכמי ואוטם שריר הלב2. בעוד גישות התערבותיות כגון revascularisation מלעורית stenting זמינים כדי להתמודד עם ביטויים מתקדמים של מחלות כלי דם, אלה ידועים לעורר נזק נוסף כלי הדם, לעתים קרובות המוביל להישנות. בנוסף, קיימים רק פתרונות מניעה ושלבים מוקדמים מוגבלים. הבנת המנגנונים השומרים על הומאוסטזיס דופן כלי הדם ומניעים את תפקודו הלקוי נמצאת בלב פיתוח תרופות חדשות3.
למרות ההתפתחות וההתקדמות המתמדת בביולוגיה מולקולרית ובהנדסת רקמות, מחקרים בבעלי חיים נותרו מרכיב מכריע במחקרים בביולוגיה של כלי הדם. מחקרי In vivo בבעלי חיים סיפקו תובנה עצומה לגבי המנגנונים של הומאוסטזיס כלי דם ופתולוגיה; עם זאת, הליכים אלה יקרים, בעלי תפוקה נמוכה יחסית, ומציבים בעיות אתיות מהותיות. בנוסף, בעלי חיים קטנים אינם מייצגים כראוי את הפיזיולוגיה של כלי הדם האנושיים, וניסויים גדולים יותר בבעלי חיים יקרים בהרבה ויוצרים שיקולים אתיים נוספים 4,5. עם הביקוש הגובר לפתרונות פרמצבטיים ורפואיים עבור אוכלוסייה המזדקנת במהירות, החסרונות של שימוש בבעלי חיים גדלים, ומשפיעים על יכולת השחזור, האמינות ויכולת ההעברה של התוצאות לטיפול בחולים6.
מערכות במבחנה מציעות פלטפורמה פשוטה לחקר מנגנונים בסיסיים, אך אינן מצליחות לשחזר את מורכבות הרקמה כולה, את יחסי הגומלין בין התאים למטריצה החוץ תאית ואת הכוחות המכניים, שהם גורמים קריטיים בהתפתחות מחלות כלי דם7.
מחקרי Ex vivo המבוצעים על רקמות שלמות המתוחזקות בסביבות מבוקרות באופן מלאכותי מחקים את מורכבות in vivo תוך שהם מאפשרים חקירות בעלות תפוקה גבוהה יחסית8. בהינתן היכולת לשלוט מקרוב בתנאי התרבות והסביבה, מודלים של ex vivo מאפשרים מגוון רחב של מחקרים מורכבים ומספקים חלופה הולמת להפחתת השימוש בפרוצדורות של בעלי חיים בביולוגיה של כלי הדם. תרביות טבעתיות כלי דם סטטיות הציעו תובנות מעניינות אך לא הצליחו לשלב את היסוד ההמודינמיהמכריע 9. ואכן, חקר מערכת כלי הדם ex vivo מציב אתגרים ספציפיים הקשורים לכוחות הדינמיים הרבים החלים על התאים בתוך דופן כלי הדם. גירויים כגון זרימה לומינלית, מערבולות, לחץ גזירה, לחץ ועיוות דופן משפיעים באופן משמעותי על פתופיזיולוגיה של רקמות10,11,12.
ביוריאקטורים של זילוח חיוניים לחקר הומאוסטזיס וסקולרי ולעיצוב מחדש בתגובה לפציעה או לשינויים המודינמיים13. יתר על כן, תרבית זילוח יכולה לשמש לשיפור ההבשלה והעמידות של כלי דם מהונדסים רקמות (TEBVs), מתן חלופות מתאימות להשתלות כלי דם14.
ביוריאקטורים של זילוח הזמינים מסחרית מוגבלים בגמישות וביכולת הסתגלות ויקרים. במקום זאת, רבים מהביוריאקטורים הקיימים שפותחו בתוך החברה קשים לשכפול במעבדות אחרות, בשל התיאורים המוגבלים וחוסר הזמינות של רכיבים שיוצרו במיוחד 7,8,9,10,11,12. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו לאחרונה ביוריאקטור חדש (EasyFlow), חסכוני לייצור, מתאים למגוון רקמות, ומאפשר שינויים פשוטים יחסית כדי להתאים לדרישות מחקר שונות13. העלון מודפס בתלת-ממד ומתאים כמו במכסה של צינור צנטריפוגה סטנדרטי של 50 מ"ל. העיצוב המודולרי שלה וייצור ההדפסה בתלת-ממד הופכים אותה לנגישה וניתנת לשכפול במעבדות שונות, כמו גם ניתנת לשינוי בקלות כדי להתאים לצרכים מדעיים שונים. פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והפעולה הבסיסית של מערכת הביוריאקטור בסביבת זילוח עורקי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והשימוש במערכת המורכבת משתי תוספות EasyFlow (ביוריאקטור): אחת המייצגת את תא התגובה (C), המכילה את דגימת העורק המחורר, ואחת המתפקדת כמאגר בינוני (R) (איור 1 ואיור 2A). עורקי התרדמה התקבלו מחזירונים זכרים ונקבות בני 4-6 שבועות (6-12 ק"ג) במכון פירברייט, בריטניה. ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי חוק בעלי החיים במשרד הפנים (הליכים מדעיים) (1986) (ASPA) ואושרו על ידי המועצה לרווחת בעלי חיים ואתיקה (AWERB) במכון פירברייט. בעלי החיים שוכנו בהתאם לקוד הנוהג לשיכון וטיפול בבעלי חיים שגדלו. כל ההליכים בוצעו על ידי בעלי רישיון אישי שהוכשרו והוסמכו תחת רישיון פרויקט PPL70/8852. חזירונים טופלו על פי לוח הזמנים בשיטה אחת תחת ASPA.
1. הכנס ייצור
- צור את העלון על-ידי הדפסה תלת-ממדית, באמצעות המודל התלת-ממדי המצורף (קובץ משלים 1).
הערה: מידול תלת-ממדי מאפשר שינויים קלים בעיצוב כדי להתאים ליישומים חדשים. ניתן להשתמש גם בחומרים חלופיים ובטכניקות ייצור חלופיות כדי לייצר את העלון. בשל המבנה הפנימי המורכב, סינטור לייזר סלקטיבי וסטריאוליתוגרפיה הם חלופות מתאימות15. פוליאמיד 12 (PA12; ראה טבלת חומרים) הוא חומר מועמד טוב בשל ביצועיו המעולים במונחים של שימור נוזלים ועמידות בפני מחזורי עיקור חום חוזרים16. - ייצור אטמי הסיליקון ומכונות הכביסה מפוליקרבונט על ידי חיתוךלייזר 17, תוך שימוש בעיצובים המופיעים בקובץ משלים 2.
הערה: חיתוך בלייזר ניתן בקלות למיקור חוץ ושיטת ייצור זולה. מכונות כביסה יכולות להיות מיוצרות מפלדת אל-חלד, ומספקות רכיב עמיד יותר לשימוש חוזר. כל שאר הרכיבים הם פריטים זמינים מסחרית. רשימה מלאה של החומרים הנדרשים מובאת בטבלה 1. הפרטים המסחריים של הפריטים כלולים בטבלת החומרים.
2. עיקור, הרכבה ופריימינג של המכשיר
- יש לעקר את כל הרכיבים בהתאם להוראות בטבלה 1.
- בתנאי זרימה למינרית, הרכיבו שתי תוספות מפוברקות (שלב 1), כפי שמוצג באיור 1A.
- הרכיבו את מערכת הזילוח כמו באיור 2, לפי השלבים הבאים:
- חבר שני שסתומים תלת-כיווניים מחוברים ליציאת R1 של המאגר (יציאת חילופי מדיה).
- חבר את השקע שנוצר לראש המשאבה הפריסטלטית באמצעות צינור המצויד בשסתום חד-כיווני (צינור שסתום חד-כיווני).
- חבר את ראש המשאבה ליציאת C4 של תא התגובה באמצעות צינורות מערכת המצוידים בשסתום חד-כיווני.
הערה: ענף זה יכול להיות מצויד באופן אופציונלי בחיישן לחץ המאפשר ניטור מתמיד. - חבר את יציאת תא התגובה C1 לצינורות קיר רכים, וזאת לתעלת ההתנגדות (קוטר פנימי קטן).
הערה: אורך צינורות ההתנגדות ישפיע מאוד על הלחץ הקיים במערכת. יש להמשיך ולחקור זאת כדי להבטיח תנאי זילוח נאותים. - הרחיבו את תעלת ההתנגדות באמצעות צינורות המערכת, צרו ערוץ חוזר וסגרו את לולאת הסירקולציה הלומינלית על-ידי התחברות למאגר ב-R5 (איור 2C).
- צור ערוץ גלישה על ידי חיבור תא התגובה C3 למאגר R3 עם צינורות מערכת.
- חבר מסנן אוורור דרך R2.
- צור מדמם לחץ על ידי חיבור מזרק המכיל אוויר ומדיה לתא התגובה C6.
הערה: יחס האוויר-מדיה הנכון יהיה תלוי בשיכוך הלחץ הנדרש.
- הפעל את המערכת עם מדיום זילוח (מדיום הנשר המעובד של דולבקו [DMEM] + 10% [v/v] נסיוב בקר עוברי [FBS] + 1% [v/v] פניצילין-סטרפטומיצין + 1% [v/v] אמפוטריצין B + 30% [v/v] דקסטרן; ראה טבלת חומרים) דרך יציאות חילופי המדיה והמאגר.
הערה: פרימת המערכת מפחיתה את הסיכון לבועות לכודות במערכת ומזהה דליפות פוטנציאליות. נפח המדיה המומלץ הוא כ 100-120 מ"ל. הנפח המשמש יהיה תלוי בנפח המת של הצינור המשמש לניסויים.
3. קטיף דגימות והכנתן
- לאסוף את עורקי התרדמה המשותפים השמאלי והימני, תוך מזעור הטיפול הישיר ברקמת העורקים13.
- הניחו את הרקמה באמצעי הובלה קרה (DMEM+ 20% [v/v] FBS + 2% [v/v] פניצילין-סטרפטומיצין + 1% [v/v] אמפוטריצין B, ראו טבלת חומרים) להעברה.
- בארון זרימה למינרית, הסר את רקמת החיבור העודפת וחתוך את קצות הרקמה באמצעות להב אזמל. לשטוף את הרקמה פעמיים באמצעי תחבורה קר.
- הניחו את הממחטה על שייקר אורביטלי באמצעי תחבורה למשך 30 דקות לפחות לשטיפה יסודית.
- חבר קטע לא מסתעף של העורק למערכת הביוריאקטור באמצעות שני מחברי פיתוי דוקרניים וקבע אותו במקומו באמצעות קשר כלי דם (קשרי סיליקון וסקולריים; טבלה 1).
הערה: קשר כלי השיט מספק את המתח והמשיכה המתאימים כדי לאבטח את כלי השיט. החלק הסגלגל מונע נזק לרקמות. - הזרימו בעדינות מדיה דרך העורק כדי לוודא את הפטנט.
- לאחר אבטחת העורק לתוספת המפוברקת, מלא את חלל התגובה באמצעי זילוח (שלב 2.4). לבסוף, מלא בעדינות את לולאת הסירקולציה הלומינלית במדיה כדי לסלק את האוויר שנותר מהמערכת.
- חבר את מרחב התגובה עם מערכת הזילוח שהורכבה בעבר (סעיף 2), ומשלים את זרימת הדם.
הערה: מומלץ לבצע בדיקת איכות על ידי אימונוהיסטוכימיה של רקמה מעובדת. פעולה זו מזהה כל נזק עקב טיפול מוגזם במהלך ההכנה.
4. תרבות הזילוח ושינוי התקשורת
- הניחו את מערכת הזילוח באינקובטור של 37°C עם 5%CO2 ולאחר מכן חברו אותה למשאבה פריסטלטית (ראו טבלת חומרים)
- חבר כל מערכות רכישה (פקולטטיביות) נוספות, כגון חיישני לחץ (ראה טבלת חומרים).
- השאר את המערכת לאיזון בן לילה עם קצב זרימת מדיה נמוך של ~10-15 מ"ל/דקה.
הערה: נדרשים ניסויים ראשוניים לקביעת הגדרות המשאבה, זרימת המדיה, לחץ המערכת והגדרות אופטימליות של משככי לחץ/מלחציים כדי להבטיח עמידה בתנאים המתאימים. - למחרת, הגדל את הזרימה בהדרגה (+1 סל"ד בכל שעה, שווה ערך לעלייה של ~ 2.5 מ"ל לדקה בכל שעה, במערכת הנוכחית) עד להשגת קצב הזרימה הסופי (35 מ"ל לדקה). עקוב אחר המערכת מעת לעת לאיתור דליפות.
הערה: כדי לחשב את קצב הזרימה המדויק בהתבסס על מהירות המשאבה הפריסטלטית, על המשתמשים לבצע תחילה כיול משאבה הולם18. באמצעות הנוסחה (1), ניתן לחשב את קצב הזרימה הנפחי (Q) בהתבסס על הנפח שהופק (V) בזמן נתון (t). כדי לחשב את מהירות הזרימה המשוערת () אנו יכולים להשתמש בקצב הזרימה שחושב קודם לכן (Q) ובשטח חתך כלי השיט (A), המתואר במשוואה (
2).
(1)
(2) - כל 3 ימים, החליפו 50% מהמדיה (~50 מ"ל) על-ידי חיבור מזרק אחד מלא במדיה טרייה ליציאת חילופי המדיה הקרובה יותר למשאבה ומזרק ריק לנמל הקרוב יותר למאגר כדי לאסוף את המדיום המשומש (איור 2).
הערה: שימוש בשני שסתומים תלת-כיווניים כיציאות חילופי מדיה מאפשר פעולה רציפה של הזלוף במהלך חילופי המדיום. - בסוף הניסוי, קצרו את הרקמה מתא התגובה על ידי חיתוך הקצוות המחוברים לביוריאקטור באמצעות מספריים כירורגיים סטריליים.
- לפרק, לנקות ולעקר את המערכת לשימוש נוסף.
2).
(1)
(2)5. ניתוח מדגמי
- תקן את הדגימה שנקטפה ב 4% paraformaldehyde (PFA) למשך הלילה ב 4 ° C.
- יש להטמיע את הרקמה בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT; ראו טבלת חומרים)19 ולהקפיא אותה על ידי טבילה באיזו-פנטאן מקורר בחנקן נוזלי.
- השג חתכי קריו-חתך בעובי 3-5 מ"מ באמצעות קריוסטט.
- ביצוע אימונוהיסטוכימיה (המטוקסילין ואוזין [H&E]) ו/או אימונופלואורסצנציה. עקוב אחר פרוטוקול immunofluorescence טיפוסי:
- חסמו את הפרוסות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם סרום עיזים 20% [v/v] במי מלח חוצצי פוספט (PBS; ראו טבלת חומרים).
- לדגור על הפרוסות במשך הלילה ב 4 ° C עם נוגדן ארנב ראשוני נגד CD31 מדולל 1:50 ב PBS (ראה טבלה של חומרים).
- שטפו שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות.
- יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C עם נוגדן משני נגד ארנב בעל תווית פלואורסצנטית מדולל 1:200 ב-PBS ונוגדן פלואורסצנטי מצומד α (SMA) ב-1:200 ב-PBS (ראו טבלת חומרים).
- שטפו שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות.
- הכתימו את הגרעינים עם DAPI מדולל 1:1,000 ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- יש לדגור עם 0.1% (w/v) סודן שחור (ראו טבלת חומרים) באתנול 70% (v/v) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להפחית את הפלואורסצנטיות של הרקמות.
- לשטוף את הרקמה עם מים deionized בשפע. הרכיבו את המגלשות באמצעי ההרכבה.
- דמיינו את הדגימות במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מחקר זה ביסס מערכת זילוח רב-תכליתית ובמחיר סביר (EasyFlow)13. התכנון המודפס בתלת מימד של המערכת מאפשר אימוץ המערכת על ידי מעבדות אחרות ולכן מעודד שחזור.
תוספת הזילוח המפוברקת שוכנת בצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל, ויוצרת סביבה מבודדת. באמצעות שתי תוספות זילוח ניתן ליצור לולאת זילוח המכילה מאגר ותא תגובה, שם מודגרת הדגימה הביולוגית. לאחר מכן מערכת הזילוח מחוברת למשאבה פריסטלטית ולמערכות רכישה אופציונליות, כגון חיישני לחץ והתקני אולטרסאונד, כדי לנטר את תנאי התרבית (איור 2).
דגימות עורק התרדמה נאספו ועובדו לפני שתורבתו בזילוח במשך 7 ימים. כדי להבטיח את איכות הרקמה לפני התרבית, בוצעו ניסויים ראשוניים שבהם הדגימות נקבעו בזמן הכריתה, לאחר הכנת הרקמה ולאחר זילוח. צביעה פלואורסצנטית עבור סמני אנדותל (CD31) ושריר חלק (αSMA) שימשה להערכת השמירה על שלמות הרקמות. דוגמאות לרקמות שהשתמרו היטב ופגועות מוצגות באיור 3 לצורך השוואה. התמונות מראות את החשיבות של טיפול עדין ברקמה בזמן הכריתה, שכן עיבוד לא נכון (מתיחה מוגזמת, ריסוק וכו ') עלול לגרום לאובדן האנדותל לפני התרבית. התוצאות מראות גם את החשיבות של התבססות הדרגתית של זילוח כדי למנוע נזק לומינלי.
צביעת H&E בוצעה לצד צביעת אימונופלואורסנציה (IF) כדי להראות שמירה על המורפולוגיה והפיזור הכולל של התאים בדופן כלי הדם לאחר 7 ימי תרבית (איור 4). יישום תנאי התרבית הפיזיולוגית במכשיר מבטיח שמירה על כיסוי האנדותל של הלומן, יישור תאי השריר החלק בתקשורת ושימור כלי הדם באדוונטיטיה.
התכנון הקומפקטי והמודולרי של מערכת הביוריאקטור מאפשר גם מגוון רחב של הגדרות מערכת. המבנה הקטן יותר מורכב מביוריאקטור יחיד והוא אידיאלי למחקרים פרמקולוגיים ובעלי נפח נמוך (זילוח מחזור20, נפח כולל של 50-70 מ"ל). כדי להגדיל את אורך התרבית ולהפחית את מספר השינויים במדיה, מערכת מחזור מאגר יחידה, כמו זו המתוארת בפרוטוקול זה, או מערכת הזנה קבועה היא אידיאלית יותר, שכן יש להם נפח גדול יותר של מדיום במחזור. ניתן להקים מערך מחזור כפול21 כדי לחקור הגדרות ניסיוניות שבהן הלוקליזציה של הגירויים היא קריטית. המכשיר הנוכחי יכול גם להיות משולב עם מערכות בקרה מתוחכמות יותר כדי לאפשר בקרת משוב מדויקת של פרמטרים כגון pH וחמצן מומס (איור 5).
איור 1: סכמות הרכבה של EasyFlow. (A) שרטוטים תלת-ממדיים שניתנו המסייעים להרכבת תוספת הזלוף. (ב) סכמות מפורטות מסופקות כדי להקל על הרכבת אתרי החיבור. (C) מבט חתך רוחב של מרחב התגובה מדגיש את המרכיבים החיוניים של עלון EasyFlow ואת החיבור של הרקמה לתוספת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ייצוג סכמטי של הרכבת מערכת הזלוף. (A) מערכת זילוח מורכבת המכילה את כל המרכיבים החשובים, המדגישה את מיקומם היחסי בסביבה תלת-ממדית. לא כל הרכיבים הם בקנה מידה. (B) מוצגות גם תצוגות איזומטריות בודדות של רכיבים. (C) מבט מלמעלה על מערכת הזילוח המורכבת מוצג כמסייע להרכבה ולחיבור של הרכיבים השונים. היציאות סומנו ומוספרו נגד כיוון השעון כדי לנווט באתרי החיבור השונים על פני מערכת הזילוח. עיקרון זה יושם על המאגר (R) ועל תא התגובה (C). גם לערוצים השונים המחברים בין שני החדרים הוקצו שמות לעיון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תחזוקת רקמות במהלך העיבוד. (A) תמונות קונפוקליות מראות את המבנה הנורמלי של עורק בזמן הקציר, (B) לאחר ניקוי ועיבוד, ו-(C) לאחר תרבית זילוח, המדגימות שמירה על מורפולוגיה שהשתמרה היטב. (D) דוגמאות של רקמה פגומה עקב טיפול מוגזם או שגוי במהלך העיבוד או (E) עקב יישום של תנאי תרבית לא פיזיולוגיים (כלומר, התחלה פתאומית של זרימה גבוהה) מראים דלדול של כיסוי האור ושיבוש של התקשורת. (F) בקרה שלילית מציינת את הספציפיות של הצביעה. CD31: ירוק; αSMA: אדום; DAPI: כחול. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הערכה היסטולוגית של רקמה לפני ואחרי תרבית זילוח. (א' ו-ב') רקמת העורקים הוערכה על ידי היסטולוגיה בזמן הקציר ו (C ו- D) לאחר 7 ימים של תרבית עם מערכת bioreactor. (א' ו-ג') צביעת H&E חושפת שימור מבנה וארגון דופן העורק. (ב ו-ד) צביעה אימונופלואורסצנטית של אותה רקמה מעידה על כיסוי אנדותל, יישור תאי שריר חלק ווזורה באדוונטיטיה. CD31: ירוק; SMA: אדום; DAPI: כחול. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ייצוג סכמטי של מערכי זילוח אפשריים. ניתן להתאים מערכים חלופיים שונים עם תוספת הזלוף כדי לאפשר מחקרים ניסיוניים שונים. (A) מערך הזלוף המחזורי ממזער את נפח התווך הנדרש. (B) מערך ההזנה הקבוע מספק אספקה קבועה של תווך לרקמה. (C) מחזור מאגר יחיד (כמתואר במאמר זה) מספק נפח גדול יותר של מדיה לדגירות ארוכות טווח וכולל אזור חיץ לחילופי אוויר ושיווי משקל לחץ. (D) מערך הסירקולציה הכפולה מספק שתי לולאות נפרדות המזינות את הסירקולציה הפנימית (בתוך העורק) והחיצונית (חלל התגובה) באופן עצמאי. (E) מערך הזילוח הדינמי כולל גזים רציפים ובקרת pH על ידי בקר פרופורציונלי-אינטגרלי-נגזרת (PID). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: רכיבים לייצור התוספות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
קובץ משלים 1: דגם תלת-ממדי של עלון EasyFlow לייצור הדפסה תלת-ממדית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: סכמות תכנון של ההתקן המובנה, תצוגת מקטעים, תדפיס ורכיבי איטום. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכות זילוח כלי דם Ex vivo מהוות פלטפורמה ייחודית לחקר תפקודם והתנהגותם של תאי כלי הדם ברקמות הטבעיות שלהם בתנאים מבוקרים, המאפשרת דיסקציה של תהליכים מורכבים כגון עיצוב מחדש של כלי דם לאחר פציעה22. עם זאת, רוב הביוריאקטורים המדווחים הם מערכות מתוצרת פנימית המבוססות על רכיבים בהתאמה אישית, ולעתים קרובות קשה לשכפל אותם על ידי אחרים23. קיימים פתרונות מסחריים חלופיים, אך חסרים גמישות בתכנון ויכולים להיות יקרים יחסית24.
פיתחנו מערכת חלופית המספקת פלטפורמה קלה, זולה וניתנת לשכפול שניתן לייצר באמצעות טכניקות הדפסה תלת ממדית בקוד פתוח13. המאמר הנוכחי מתאר את הגדרת המערכת כדי לאפשר יישומים הניתנים לשחזור על-ידי משתמשי קצה. מערך זה מאפשר הפעלת מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים של לחץ (40-180 מ"מ כספית), קצב זרימה (6-30 מ"ל/דקה), ובשילוב עם מדיה המחקה את צמיגות הדם, בדרגות שונות של לחץ גזירה.
שחזור הוא היבט חיוני של התהליך המדעי, שכן הוא מאפשר לחוקרים לאמת את הממצאים של אחרים ולבנות עליהם כדי לקדם את הבנתנו של מחלות כלי דם. כמו כן, כלים המאפשרים ומקדמים שיתופי פעולה בין קבוצות חיוניים לקידום הידע המדעי. EasyFlow מייצגת דוגמה לפתרונות קוד פתוח ונגישים כאלה, שניתן לייצר ולאמץ בקלות על ידי מעבדות העובדות על מגוון רחב של פרויקטים בתחום מדעי כלי הדם ומעבר לו.
אנו מדווחים כי תרבית מכשיר זו שומרת על כדאיות רקמת העורקים למשך 7 ימים לפחות, וניתן להשתמש בה כדי למדל שלבים ספציפיים של מחלת כלי דם. באמצעות זה ניתן למדל קצבי זרימה פיזיולוגיים ותנאי לחץ13. חשוב לציין, תרבות זילוח זו היא חסכונית בשל עלויות הייצור הנמוכות ונפח התווך הנמוך הדרוש להפעלת המערכת.
ניתן להתאים את העיצוב התלת-ממדי גם ליישומים חדשים, וניתן לבדוק חומרים חדשים להדפסה. גם במתכונתו הנוכחית, ניתן להתאים בקלות את חלל הלינה לדוגמה לדוגמאות בגדלים שונים על ידי שינוי אורך האביזרים או משעמם מחברי הלואר. חשוב לציין שבהתחשב באופי המודולרי של המכשיר ובממדים הקטנים שלו, ניתן להשתמש בביוריאקטור הזה בכמה תצורות (איור 5) וניתן ליישם אותו על תרביות מולטיפלקס, שבהן מספר דגימות יכולות להיחשף לתנאים שונים בו זמנית בביוריאקטורים נפרדים.
על פי החזון, השימוש במערכת יורחב בעתיד כדי לתמוך בתרבית של כלי דם ממקורות שונים (למשל, מינים שונים) ומבעלי אופי שונה (למשל, ורידים, לימפה), ואולי ליישם אותו על תרבית של רקמות חלולות אחרות (למשל, קנה הנשימה, המעי). בפרט, מחקרים מראים כי תרבית פיגומים מהונדסים רקמה בזילוח קבוע מסייעת להתפלגות הומוגנית של תאים בתוך המבנה וההבשלה של הרקמה המתקבלת25,26. בנוסף, זריעת שתלי כלי דם בזילוח תורמת להשגת לומן כלי דם אחיד יותר, בהשוואה לשיטות סטטיות27. מסיבה זו, אנו רואים את המערכת מיושמת בהנדסת רקמות כדי לסייע בהתמודדות עם האתגרים הנוכחיים, ולאפשר פיתוח עתידי של תחליפי כלי דם סינתטיים הניתנים לשחזור28.
הפרוטוקול המתואר כאן מציג כמה צעדים חשובים קריטיים להצלחת תרבות הזרימה. קביעת תנאי זרימה מתאימים ומעקב אחריהם אינם דבר של מה בכך ויש לבצע אותם בכל מערכת בעת הקמתה לראשונה, כדי לוודא שתנאי התרבית הם פיזיולוגיים. הזרימה והלחץ נוטרו באמצעות חיישני לחץ והדמיית אולטרסאונד. נקודה קריטית נוספת היא לוודא שהרקמה בת קיימא ושלמה בתחילת התרבית. זה דורש מקור חדש, טיפול זהיר וניתן לאמת על ידי ניתוח היסטולוגי. בנוסף, יש לבצע פתרון בעיות בתחילת כל ניסוי כדי לזהות כל זיהום חיידקי פוטנציאלי או מקור דליפת מדיה.
חשוב להדגיש כי מערכת הזילוח המתוארת, תוך מתן לחץ פיזיולוגי ותנאי זרימה, אינה מסוגלת לחקות לחלוטין את דפוסי גלי הלחץ המורכבים שנרשמו in vivo. מגבלה זו ניתנת לייחוס לשימוש במשאבה פריסטלטית וניתן לפתור אותה באמצעות ציוד מיוחד יותר לשחזור תנאים המודינמיים מתקדמים. תרבית כלי הדם בביוריאקטור גם אינה מסוגלת להתייחס למחקרים שבהם מערכת החיסון או האינטראקציה עם איברים אחרים היא קריטית.
לסיכום, מוצגת מערכת זילוח פשוטה המודפסת בתלת ממד המסוגלת לחקות את הסביבה ההמודינמית הפיזיולוגית, אשר צפויה לתרום לסטנדרטיזציה של תרביות כלי דם ex vivo . הפוטנציאל שלו להתאמה אישית ויישום בתרבות ארוכת טווח הופך אותו לכלי חיוני לקידום ההבנה של מערכות ביולוגיות מורכבות אלה בפיזיולוגיה ובמצבים פתולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות למרכז לפתולוגיה וטרינרית בבית הספר לרפואה וטרינרית באוניברסיטת סארי על שירותי ההיסטולוגיה. אנו מודים גם לד"ר ל. דיקסון, א. רייס ומ. הנסטוק ממכון פירברייט (פירברייט, בריטניה) על תמיכתם ברכישת רקמות בעלי החיים, ולמחלקה למדעים ביוכימיים באוניברסיטת סארי, במיוחד לצוות הטכני, על תמיכתם המתמשכת. RSM נתמך על ידי פרס הסטודנטים של מכללת הדוקטורט (אוניברסיטת סארי), DM ו- PC נתמכו על ידי המרכז הלאומי להחלפה, עידון והפחתה של בעלי חיים במחקר (מספרי מענקים: NC / R001006 / 1 ו- NC / T001216 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasyFlow | - | - | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 - 3D printing | Protolabs | - | - |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound - OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt - 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | - | - | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels - Size 23 - Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
References
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: Endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Gugliandolo, E., et al. Palmitoylethanolamide and Polydatin combination reduces inflammation and oxidative stress in vascular injury. Pharmacological Research. 123, 83-92 (2017).
- Anselmino, M., et al. Catheter ablation of atrial fibrillation in patients with left ventricular systolic dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Circulation, Arrhythmia, and Electrophysiology. 7 (6), 1011-1018 (2014).
- Viola, M., et al. Subcutaneous delivery of monoclonal antibodies: How do we get there. Journal of Controlled Release. 286, 301-314 (2018).
- Kim, D. D. In vitro cellular models for nasal drug absorption studies. Drug Absorption Studies: In Situ, In Vitro and In Silico Models. , 216-234 (2008).
- Lewis, D. I. Animal experimentation: Implementation and application of the 3Rs. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (6), 675-679 (2019).
- Rouwkema, J., et al. In vitro platforms for tissue engineering: Implications for basic research and clinical translation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e164-167 (2011).
- Xu, Y., Shrestha, N., Préat, V., Beloqui, A. An overview of in vitro, ex vivo and in vivo models for studying the transport of drugs across intestinal barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113795 (2021).
- Vaghela, R., et al. Vessel grafts for tissue engineering revisited-Vessel segments show location-specific vascularization patterns in ex vivo ring assay. Microcirculation. 29 (2), e12742 (2022).
- Håkansson, J., et al. Individualized tissue-engineered veins as vascular grafts: A proof of concept study in pig. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 15 (10), 818-830 (2021).
- Saucy, F., et al. Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1. European Surgical Research. 45 (1), 50-59 (2010).
- Tosun, Z., McFetridge, P. S. Variation in cardiac pulse frequencies modulates vSMC phenotype switching during vascular remodeling. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (1), 59-70 (2015).
- Matos, R. S., Maselli, D., McVey, J. H., Heiss, C., Campagnolo, P. 3D printed bioreactor enabling the pulsatile culture of native and angioplastied large arteries. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 864580 (2022).
- Neff, L. P., et al. Vascular smooth muscle enhances functionality of tissue-engineered blood vessels in vivo. Journal of Vascular Surgery. 53 (2), 426-434 (2011).
- Boparai, K. S., Singh, R. Advances in Fused Deposition Modeling. In: Module. Refrence in Materials Science and Materials Engineering. , Elsevier. (2017).
- McKeen, L. W. Chapter 6 - Polyamides (Nylons). The Effect of Creep and Other Time Related Factors on Plastics and Elastomers (Second Edition). McKeen, L. W. , William Andrew Publishing. 197-262 (2012).
- Moradi, M., Mehrabi, O., Azdast, T., Benyounis, K. Y. Enhancement of low power CO2 laser cutting process for injection molded polycarbonate). Optics & Laser Technology. 96, 208-218 (2017).
- Ghasem, N. Computer Methods in Chemical Engineering. , CRC Press. (2021).
- Lying, F., Gazi, F., Gardner, E. Preparation of tissues and cells for infrared and raman spectroscopy and imaging. Biomedical Applications of Synchrotron Infrared Microspectroscopy.RSC Analytical Spectroscopy Monographs. (11), 147-185 (2011).
- Sassi, L., et al. A perfusion bioreactor for longitudinal monitoring of bioengineered liver constructs. Nanomaterials. 11 (2), 275 (2021).
- Haykal, S., et al. Double-chamber rotating bioreactor for dynamic perfusion cell seeding of large-segment tracheal allografts: Comparison to conventional static methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (8), 681-692 (2014).
- Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplant. 27 (9), 1375-1389 (2018).
- Wong, M. M., Hong, X., Karamariti, E., Hu, Y., Xu, Q. Generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (97), 52565 (2015).
- Alvino, V. V., et al. In vitro and in vivo preclinical testing of pericyte-engineered grafts for the correction of congenital heart defects. Journal of the American Heart Association. 9 (4), e014214 (2020).
- Nerurkar, N. L., Sen, S., Baker, B. M., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Dynamic culture enhances stem cell infiltration and modulates extracellular matrix production on aligned electrospun nanofibrous scaffolds. Acta Biomaterialia. 7 (2), 485-491 (2011).
- Engebretson, B., Mussett, Z. R., Sikavitsas, V. I. The effects of varying frequency and duration of mechanical stimulation on a tissue-engineered tendon construct. Connective Tissue Research. 59 (2), 167-177 (2018).
- Saunders, S. K., et al. Evaluation of perfusion-driven cell seeding of small diameter engineered tissue vascular grafts with a custom-designed seed-and-culture bioreactor. PLoS One. 17 (6), e0269499 (2022).
- Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Research. 7, (2018).
