Summary
Detta protokoll presenterar installationen och driften av en nyutvecklad, 3D-printad bioreaktor för ex vivo-odling av blodkärl i perfusion. Systemet är utformat för att enkelt kunna användas av andra användare, praktiskt, prisvärt och anpassningsbart till olika experimentella tillämpningar, såsom grundläggande biologi och farmakologiska studier.
Abstract
Kärlsjukdomar utgör grunden för de flesta hjärt- och kärlsjukdomar, som fortfarande är den främsta orsaken till dödlighet och sjuklighet i världen. Det finns ett akut behov av effektiva kirurgiska och farmakologiska ingrepp för att förebygga och behandla kärlsjukdomar. Bristen på translationella modeller begränsar delvis förståelsen av de cellulära och molekylära processer som är involverade i kärlsjukdomar. Bioreaktorer med perfusionsodling ex vivo utgör en idealisk plattform för studier av stora djurkärl (inklusive människor) i en kontrollerad dynamisk miljö, som kombinerar enkelheten med in vitro-odling och komplexiteten hos den levande vävnaden. De flesta bioreaktorer är dock specialtillverkade och därför svåra att ta i bruk, vilket begränsar resultatens reproducerbarhet. Detta dokument presenterar ett 3D-printat system som enkelt kan produceras och tillämpas i alla biologiska laboratorier, och ger ett detaljerat protokoll för dess installation, vilket möjliggör användarnas drift. Detta innovativa och reproducerbara ex vivo perfusionsodlingssystem möjliggör odling av blodkärl i upp till 7 dagar under fysiologiska förhållanden. Vi förväntar oss att införandet av en standardiserad perfusionsbioreaktor kommer att stödja en bättre förståelse av fysiologiska och patologiska processer i stora djurs blodkärl och påskynda upptäckten av nya terapier.
Introduction
Kärlväggen existerar i ett reaktivt stabilt tillstånd, vilket säkerställer både respons på yttre stimuli (dvs. tryckförändring, vasokonstriktorer) och en konsekvent icke-aktiverande yta som förhindrar blodkoagulation och inflammatorisk cellinfiltration1. Som svar på ålders- och livsstilsberoende stimuli och vid direkt skada aktiverar kärlväggen ombyggnadsprocesser som restenos och åderförkalkning, som är kända bidragsgivare till vanliga kardiovaskulära sjukdomar (CVD), såsom ischemisk stroke och hjärtinfarkt2. Även om interventionella metoder som perkutan revaskularisering och stentning finns tillgängliga för att hantera avancerade manifestationer av kärlsjukdom, är dessa kända för att framkalla ytterligare kärlskador, vilket ofta leder till återfall. Dessutom finns endast begränsade förebyggande lösningar och lösningar i ett tidigt skede. Att förstå mekanismerna för att upprätthålla vaskulär vägghomeostas och driva dess dysfunktion är kärnan i att utveckla nya botemedel3.
Trots den ständiga utvecklingen och framstegen inom molekylärbiologi och vävnadsteknik är djurstudier fortfarande en viktig del av vaskulärbiologiska studier. In vivo djurstudier har gett enorma insikter i mekanismerna för vaskulär homeostas och patologi; Dessa procedurer är dock kostsamma, har relativt låg genomströmning och utgör betydande etiska problem. Dessutom är smådjur dåligt representativa för människans vaskulära fysiologi, och större djurförsök är mycket dyrare och ger upphov till ytterligare etiska överväganden 4,5. Med den ökande efterfrågan på farmaceutiska och medicinska lösningar för en snabbt åldrande befolkning förstärks nackdelarna med djuranvändning, vilket påverkar resultatens reproducerbarhet, tillförlitlighet och överförbarhet till patientvård6.
In vitro-system erbjuder en förenklad plattform för att studera grundläggande mekanismer men misslyckas med att rekapitulera komplexiteten hos hela vävnaden, interaktionerna mellan celler och den extracellulära matrisen och de mekaniska krafterna, som är kritiska bestämningsfaktorer i utvecklingen av kärlsjukdomar7.
Ex vivo-studier som utförs på hela vävnader som upprätthålls i artificiellt kontrollerade miljöer efterliknar in vivo-komplexiteten samtidigt som de möjliggör undersökningar med relativt hög genomströmning8. Med tanke på förmågan att noggrant kontrollera odlingsförhållandena och miljön möjliggör ex vivo-modeller ett brett spektrum av komplexa studier och utgör ett lämpligt alternativ för att minska användningen av djurförsök inom vaskulärbiologi. Statiska vaskulära ringkulturer gav intressanta insikter men misslyckades med att införliva det avgörande hemodynamiska elementet9. Studiet av kärlsystemet ex vivo innebär specifika utmaningar relaterade till de många dynamiska krafter som gäller för cellerna i blodkärlsväggen. Stimuli som luminalt flöde, turbulens, skjuvspänning, tryck och väggdeformation påverkar vävnadens patofysiologiavsevärt 10,11,12.
Perfusionsbioreaktorer är viktiga för att studera vaskulär homeostas och remodellering som svar på skada eller hemodynamiska förändringar13. Dessutom kan perfusionsodling användas för att förbättra mognaden och hållbarheten hos vävnadskonstruerade blodkärl (TEBV), vilket ger lämpliga alternativ för vaskulära transplantat14.
Kommersiellt tillgängliga perfusionsbioreaktorer är begränsade i flexibilitet och anpassningsförmåga och är kostsamma. Många av de befintliga egenutvecklade bioreaktorerna är istället svåra att replikera i andra laboratorier, på grund av de begränsade beskrivningarna och bristen på tillgång till specialtillverkade komponenter 7,8,9,10,11,12. För att övervinna dessa begränsningar har vi nyligen utvecklat en ny bioreaktor (EasyFlow), som är ekonomisk att producera, rymmer en rad olika vävnader och möjliggör relativt enkla modifieringar för att anpassa sig till olika forskningskrav13. Insatsen är 3D-printad och passar som i ett lock på ett vanligt 50 ml centrifugrör. Dess modulära design och tillverkning av 3D-utskrifter gör den tillgänglig och reproducerbar i olika laboratorier, samt lätt att modifiera för att anpassa sig till olika vetenskapliga behov. Detta protokoll beskriver montering och grundläggande drift av bioreaktorsystemet i en arteriell perfusionsmiljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll beskriver montering och användning av ett system som består av två EasyFlow-insatser (bioreaktorer): en som representerar reaktionskammaren (C), som innehåller det perfunderade artärprovet, och en som fungerar som en mediumreservoar (R) (figur 1 och figur 2A). Halspulsådern erhölls från 4-6 veckor gamla han- och hongrisar (6-12 kg) vid The Pirbright Institute, Storbritannien. Djurförsök utfördes enligt Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986) (ASPA) och godkändes av Animal Welfare and Ethical Review Board (AWERB) vid The Pirbright Institute. Djuren har hållits i enlighet med uppförandekoden för inhysning och skötsel av uppfödda djur. Alla procedurer utfördes av personliga licensinnehavare som var utbildade och kompetenta enligt projektlicens PPL70/8852. Smågrisar avlivades enligt schema ett-metoden enligt ASPA.
1. Skär tillverkning
- Tillverka insatsen genom 3D-utskrift med hjälp av den medföljande 3D-modellen (tilläggsfil 1).
OBS: 3D-modellering möjliggör enkla ändringar i designen för att anpassa sig till nya applikationer. Alternativa material och alternativa tillverkningstekniker kan också användas för att tillverka skäret. På grund av den komplexa inre strukturen är selektiv lasersintring och stereolitografi lämpliga alternativ15. Polyamid 12 (PA12; se materialförteckning) är en bra materialkandidat på grund av dess överlägsna prestanda när det gäller vätskeretention och motståndskraft mot upprepade värmesteriliseringscykler16. - Tillverka silikonpackningarna och polykarbonatbrickorna genom laserskärning17, med hjälp av de mönster som anges i tilläggsfil 2.
OBS: Laserskärning är lätt att outsourca och en billig tillverkningsmetod. Brickor kan tillverkas av rostfritt stål, vilket ger en mer motståndskraftig komponent för upprepad användning. Alla andra komponenter är kommersiellt tillgängliga artiklar. En fullständig lista över de material som krävs finns i tabell 1. De kommersiella detaljerna för artiklarna finns i materialförteckningen.
2. Sterilisering, montering och grundning av enheten
- Sterilisera alla komponenter enligt instruktionerna i tabell 1.
- Under laminära flödesförhållanden, montera två tillverkade insatser (steg 1), som visas i figur 1A.
- Montera perfusionssystemet som i figur 2, följ stegen nedan:
- Fäst två anslutna trevägsventiler till behållarens R1-port (mediautbytesport).
- Anslut det resulterande utloppet till den peristaltiska pumpens huvud med hjälp av ett rör utrustat med en envägsventil (envägsventilrör).
- Anslut pumphuvudet till reaktionskammarens C4-port med hjälp av systemslangar utrustade med en envägsventil.
OBS: Denna gren kan som tillval utrustas med en trycksensor som möjliggör konstant övervakning. - Anslut reaktionskammarens port C1 till slangen med mjuk vägg och denna till motståndskanalen (liten innerdiameter).
OBS: Längden på motståndsslangen kommer i hög grad att påverka trycket i systemet. Detta bör undersökas ytterligare för att säkerställa adekvata perfusionsförhållanden. - Förläng motståndskanalen med systemslangen, skapa en returkanal och stäng den luminala cirkulationsslingan genom att ansluta till behållaren vid R5 (Figur 2C).
- Skapa en bräddavlopp genom att ansluta reaktionskammaren C3 till reservoaren R3 med systemslang.
- Fäst ett ventilationsfilter genom R2.
- Skapa en tryckdämpare genom att ansluta en spruta som innehåller luft och media till reaktionskammaren C6.
OBS: Det korrekta luft-till-media-förhållandet beror på den nödvändiga tryckdämpningen.
- Prima systemet med perfusionsmedium (Dulbeccos modifierade örnmedium [DMEM] + 10 % [v/v] fetalt bovint serum [FBS] + 1 % [v/v] penicillin-streptomycin + 1 % [v/v] amfotericin B + 30 % [v/v] dextran; se materialtabell) genom mediautbytesportarna och behållaren.
OBS: Priming av systemet minskar risken för instängda bubblor i systemet och identifierar eventuella läckor. Den rekommenderade medievolymen är cirka 100-120 ml. Volymen som används beror på dödvolymen på slangen som används för experiment.
3. Provtagning och beredning
- Samla in vänster och höger gemensamma halspulsåder, minimera direkt hantering av artärvävnaden13.
- Placera vävnaden i kalla transportmedier (DMEM+ 20 % [v/v] FBS + 2 % [v/v] penicillin-streptomycin + 1 % [v/v] amfotericin B, se materialtabell) för överföring.
- I ett skåp med laminärt flöde, ta bort överflödig bindväv och trimma ändarna av vävnaden med ett skalpellblad. Tvätta näsduken två gånger i kallt transportmedium.
- Placera vävnaden på en orbitalskakapparat i transportmedia i minst 30 minuter för noggrann tvättning.
- Anslut ett icke-förgrenat segment av artären till bioreaktorsystemet med hjälp av två hullingförsedda luer-anslutningar och fixera det på plats med hjälp av en kärlbindning (vaskulära silikonband; (se tabell 1).
OBS: Kärlbindningen ger rätt spänning och indragning för att säkra kärlet. Det ovala snittet förhindrar vävnadsskador. - Flöda försiktigt media genom artären för att verifiera öppenheten.
- Efter att ha fäst artären vid den tillverkade insatsen, fyll reaktionsutrymmet med perfusionsmedia (steg 2.4). Fyll slutligen försiktigt den luminala cirkulationsslingan med media för att eliminera eventuell kvarvarande luft från systemet.
- Anslut reaktionsutrymmet till det tidigare monterade perfusionssystemet (avsnitt 2) och slutför cirkulationen.
OBS: Det rekommenderas att utföra en kvalitetskontroll genom immunhistokemi av bearbetad vävnad. Detta identifierar eventuella skador på grund av överdriven hantering under förberedelsen.
4. Perfusionskultur och medieförändring
- Placera perfusionssystemet i en 37 °C inkubator med 5 % CO2 och anslut det sedan till en peristaltisk pump (se materialförteckning)
- Anslut eventuella ytterligare (fakultativa) insamlingssystem, t.ex. trycksensorer (se materialförteckning).
- Låt systemet vara i jämvikt över natten med ett lågt medieflöde på ~10-15 ml/min.
OBS: Inledande experiment för att bestämma pumpinställningar, medieflöde, systemtryck och optimala tryck dampinställningar krävs för att säkerställa att lämpliga villkor uppfylls. - Nästa dag, öka flödet stegvis (+1 rpm varje timme, motsvarande en ökning på ~2.5 ml/min varje timme, i det nuvarande systemet) tills den slutliga flödeshastigheten (35 ml/min) uppnås. Övervaka systemet med jämna mellanrum för läckor.
OBS: För att beräkna det exakta flödet baserat på det peristaltiska pumpvarvtalet måste användarna först utföra adekvat pumpkalibrering18. Med hjälp av formeln (1) kan volymetriskt flöde (Q) beräknas baserat på den utmatade volymen (V) inom en given tid (t). För att beräkna den uppskattade flödeshastigheten () kan vi använda den tidigare beräknade flödeshastigheten (Q) och arean av kärlets tvärsnitt (A), som beskrivs i ekvation (
2).
Nej (1)
Nej (2) - Var 3:e dag byts 50 % av mediet (~50 ml) ut genom att ansluta en spruta fylld med färskt media till mediautbytesporten närmare pumpen och en tom spruta till porten närmare behållaren för att samla upp det förbrukade mediet (figur 2).
OBS: Att använda två trevägsventiler som mediautbytesportar underlättar kontinuerlig drift av perfusionen under medieutbytet. - I slutet av experimentet skördar du vävnaden från reaktionskammaren genom att trimma ändarna som är anslutna till bioreaktorn med en steril kirurgisk sax.
- Demontera, rengör och sterilisera systemet för vidare användning.
2).
Nej (1)
Nej (2)5. Analys av prover
- Fixera det skördade provet i 4 % paraformaldehyd (PFA) över natten vid 4 °C.
- Bädda in vävnaden i optimal skärtemperatur (OCT; se materialtabell)19 och frys genom nedsänkning i isopentan kyld i flytande kväve.
- Erhåll kryosektioner med en tjocklek på 3-5 mm med hjälp av en kryostat.
- Utför immunhistokemi (hematoxylin och eosin [H&E]) och/eller immunofluorescens. Följ det typiska immunofluorescensprotokollet:
- Blockera skivorna i 1 timme i rumstemperatur med 20 % [v/v] getserum i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS; se materialförteckning).
- Inkubera skivorna över natten vid 4 °C med primär kaninantikropp mot CD31 utspädd 1:50 i PBS (se materialförteckning).
- Tvätta tre gånger med PBS i 5 min.
- Inkubera i 1 timme vid 37 °C med fluorescerande märkt sekundär antikropp mot kanin utspädd 1:200 i PBS och α-glatt muskelaktin (SMA) direkt konjugerad fluorescerande antikropp utspädd 1:200 i PBS (se materialförteckning).
- Tvätta tre gånger med PBS i 5 min.
- Färga kärnorna med DAPI utspädd 1:1 000 i PBS i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Inkubera med 0,1 % (w/v) Sudan Black (se materialtabell) i 70 % (v/v) etanol i 10 minuter vid rumstemperatur för att minska vävnadens autofluorescens.
- Tvätta servetten med rikligt med avjoniserat vatten. Montera objektglasen i monteringsmediet.
- Avbilda proverna med ett konfokalt laserskanningsmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna studie har etablerat ett mångsidigt och prisvärt perfusionssystem (EasyFlow)13. Den 3D-printade designen av systemet underlättar införandet av systemet av andra laboratorier och uppmuntrar därför till reproducerbarhet.
Den tillverkade perfusionsinsatsen är inrymd i ett 50 ml centrifugrör, vilket skapar en isolerad miljö. Med hjälp av två perfusionsinsatser kan en perfusionsslinga upprättas innehållande en reservoar och en reaktionskammare, där det biologiska provet inkuberas. Perfusionssystemet ansluts sedan till en peristaltisk pump och valfria insamlingssystem, t.ex. trycksensorer och ultraljudsapparater, för att övervaka odlingsförhållandena (figur 2).
Prover från svinens halspulsåder samlades in och bearbetades innan de odlades i perfusion i 7 dagar. För att säkerställa vävnadens kvalitet före odling utfördes preliminära experiment där proverna fixerades vid excision, efter vävnadsberedning och efter perfusion. Fluorescerande färgning för endotelmarkörer (CD31) och glatt muskulatur (αSMA) användes för att bedöma upprätthållandet av vävnadsintegritet. Exempel på välbevarade och skadade vävnader presenteras i figur 3 för jämförelse. Bilderna visar vikten av varsam hantering av vävnaden vid excision, eftersom felaktig bearbetning (överdriven sträckning, krossning etc.) kan resultera i förlust av endotelet före odlingen. Resultaten visar också vikten av att gradvis etablera perfusion för att undvika ljusskador.
H&E-färgning utfördes tillsammans med immunofluorescensfärgning (IF) för att visa bibehållen morfologi och övergripande fördelning av cellerna i kärlväggen efter 7 dagars odling (Figur 4). Tillämpningen av fysiologiska odlingsförhållanden i enheten säkerställer att lumens endoteltäckning bibehålls, att de glatta muskelcellerna i mediet anpassas och att vasa vasorum bevaras i adventitia.
Bioreaktorsystemets kompakta och modulära design möjliggör också ett brett utbud av systeminställningar. Den mindre installationen består av en enda bioreaktor och är idealisk för farmakologiska studier och lågvolymstudier (recirkulerande perfusion20, total volym på 50-70 ml). För att öka odlingens längd och minska antalet mediebyten är ett enda reservoarcirkulationssystem, som det som beskrivs i detta protokoll, eller ett konstant matningssystem mer idealiskt, eftersom de har en större volym medium i omlopp. En dubbel cirkulation21-uppställning kan etableras för att utforska experimentella miljöer där lokaliseringen av stimuli är kritisk. Den nuvarande enheten kan också kombineras med mer sofistikerade styrsystem för att möjliggöra exakt återkopplingskontroll av parametrar som pH och löst syre (figur 5).
Figur 1: EasyFlow-monteringsscheman. (A) 3D-renderade scheman som underlättar monteringen av perfusionsinsatsen. (B) Detaljerade scheman tillhandahålls för att underlätta montering av anslutningsplatserna. (C) En tvärsnittsbild av reaktionsutrymmet belyser de väsentliga komponenterna i EasyFlow-insatsen och anslutningen av vävnaden till insatsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematisk framställning av perfusionssystemets sammansättning. (A) Monterat perfusionssystem som innehåller alla viktiga komponenter, som belyser deras relativa position i en 3D-renderad miljö. Alla komponenter är inte skalenliga. (B) Individuella isometriska vyer av komponenter presenteras också. (C) En ovanifrån view av det monterade perfusionssystemet visas för att underlätta montering och anslutning av de olika komponenterna. Portarna har märkts och numrerats moturs för att navigera mellan de olika anslutningsplatserna i perfusionssystemet. Denna princip har tillämpats på reservoaren (R) och reaktionskammaren (C). De olika kanalerna som förbinder de två kamrarna har också fått namn som referens. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Vävnadsunderhåll under bearbetning. (A) Konfokalbilder visar artärens normala struktur vid skördetillfället, (B) efter rengöring och bearbetning, och (C) efter perfusionsodling, vilket visar att en välbevarad morfologi bibehålls. (D) Exempel på skadad vävnad på grund av överdriven eller felaktig hantering under bearbetningen eller (E) på grund av tillämpning av icke-fysiologiska odlingsförhållanden (dvs. abrupt initiering av högt flöde) visar utarmning av ljustäckningen och störningar av mediet. (F) Negativ kontroll indikerar färgningens specificitet. CD31: grön; αSMA: röd; DAPI: blå. Skalstaplar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Histologisk utvärdering av vävnad före och efter perfusionsodling. (A och B) Arteriell vävnad utvärderades genom histologi vid skördetillfället och (C och D) efter 7 dagars odling med bioreaktorsystemet. (A och C) H&E-färgning avslöjar bevarandet av artärväggens struktur och organisation. (B och D) Immunofluorescensfärgning av samma vävnad visar endoteltäckning, glatt muskelcellanpassning och vasa vasorum i adventitia. CD31: grön; SMA: röd; DAPI: blå. Skalstaplar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Schematisk representation av möjliga perfusionsuppställningar. Olika alternativa uppställningar kan anpassas med perfusionsinsatsen för att möjliggöra olika experimentella studier. (A) Den återcirkulerande perfusionsinstallationen minimerar den volym medium som krävs. (B) Den konstanta matningsinställningen ger en stadig tillförsel av medium till vävnaden. (C) Cirkulation med en reservoar (som beskrivs i detta dokument) ger en större volym av media för långtidsinkubationer och inkluderar en buffertzon för luftväxling och tryckjämvikt. (D) Den dubbla cirkulationsuppsättningen ger två distinkta slingor som matar den inre (inuti artären) och yttre (reaktionsutrymmet) cirkulationen oberoende av varandra. (E) Den dynamiska perfusionsinställningen inkluderar kontinuerliga gaser och pH-kontroll med en proportional-integral-derivata (PID) regulator. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Komponenter för tillverkning av insatserna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tilläggsfil 1: 3D-modell av EasyFlow-insatsen för tillverkning av 3D-utskrifter. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 2: Konstruktionsschema för den konstruerade enheten, sektionsvy, utskrift och tätningskomponenter. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo vaskulära perfusionssystem utgör en unik plattform för att studera kärlcellers funktion och beteende i deras naturliga vävnader under kontrollerade förhållanden, vilket möjliggör dissektion av komplexa processer såsom vaskulär remodelleringefter skada 22. De flesta rapporterade bioreaktorer är dock egentillverkade system baserade på specialtillverkade komponenter och är ofta svåra att replikera av andra23. Det finns alternativa kommersiella lösningar, men de saknar flexibilitet i utformningen och kan vara relativt kostsamma24.
Vi har utvecklat ett alternativt system som ger en enkel, billig och reproducerbar plattform som kan tillverkas med hjälp av 3D-utskriftstekniker med öppen källkod13. I den här artikeln beskrivs systemets konfiguration för att möjliggöra reproducerbara program av slutanvändare. Denna inställning möjliggör tillämpning av fysiologiska och patologiska förhållanden för tryck (40-180 mmHg), flödeshastighet (6-30 ml/min) och i kombination med media som efterliknar blodets viskositet, med varierande grader av skjuvspänning.
Reproducerbarhet är en viktig aspekt av den vetenskapliga processen, eftersom det gör det möjligt för forskare att validera andras resultat och bygga vidare på dem för att utveckla vår förståelse av kärlsjukdomar. Vidare är verktyg som möjliggör och främjar samarbeten mellan grupper väsentliga för att främja vetenskaplig kunskap. EasyFlow är ett exempel på sådana tillgängliga lösningar med öppen källkod som enkelt kan produceras och användas av laboratorier som arbetar med ett brett spektrum av projekt inom vaskulär vetenskap och utanför.
Vi rapporterar att denna enhetskultur upprätthåller arteriell vävnadsviabilitet i minst 7 dagar och kan användas för att modellera specifika steg av kärlsjukdom. Med hjälp av detta kan man modellera fysiologiska flödeshastigheter och tryckförhållanden13. Det är viktigt att notera att denna perfusionskultur är kostnadseffektiv på grund av de låga produktionskostnaderna och den låga volymen medium som krävs för att driva systemet.
3D-designen kan också anpassas till nya användningsområden, och nya material för utskrift kan testas. Även i sitt nuvarande format kan provförvaringsutrymmet enkelt anpassas till prover av olika storlekar genom att ändra längden på beslagen eller hålet på luerkopplingarna. Det är viktigt att notera att med tanke på anordningens modulära karaktär och dess små dimensioner kan denna bioreaktor användas i flera uppställningar (figur 5) och kan tillämpas på multiplexkulturer, där flera prover kan exponeras för olika förhållanden samtidigt i separata bioreaktorer.
Det är tänkt att användningen av systemet ska utvidgas i framtiden för att stödja odling av blodkärl från olika ursprung (t.ex. olika arter) och av olika natur (t.ex. vener, lymfatiska), och kanske tillämpas på odling av andra ihåliga vävnader (t.ex. luftstrupe, tarm). I synnerhet visar forskning att odling av vävnadskonstruerade strukturer i konstant perfusion hjälper till att homogenisera fördelningen av celler inom konstruktionen och mognaden av den resulterande vävnaden25,26. Dessutom bidrar sådd av kärltransplantat i perfusion till att uppnå en mer enhetligt cellulariserad vaskulär lumen, jämfört med statiska metoder27. Av denna anledning föreställer vi oss att systemet kommer att tillämpas på vävnadsteknik för att hjälpa till att ta itu med de nuvarande utmaningarna, vilket möjliggör framtida utveckling av reproducerbara syntetiska blodkärlssubstitut28.
Protokollet som beskrivs här presenterar några viktiga steg som är avgörande för flödeskulturens framgång. Att fastställa och övervaka lämpliga flödesförhållanden är inte trivialt och måste utföras på varje system när det installeras för första gången, för att säkerställa att odlingsförhållandena är fysiologiska. Flödet och trycket övervakades med hjälp av trycksensorer och ultraljudsundersökningar. En annan kritisk punkt är att se till att vävnaden är livskraftig och intakt i början av odlingen. Detta kräver en färsk källa, noggrann hantering och kan verifieras genom histologisk analys. Dessutom måste felsökning utföras i början av varje experiment för att identifiera eventuell bakteriell kontaminering eller medieläckagekälla.
Det är viktigt att betona att det perfusionssystem som beskrivs, även om det ger fysiologiska tryck- och flödesförhållanden, inte helt kan efterlikna de komplexa tryckvågsmönster som registrerats in vivo. Denna begränsning kan tillskrivas användningen av en peristaltisk pump och kan lösas med hjälp av mer specialiserad utrustning för att reproducera avancerade hemodynamiska tillstånd. Odling av blodkärl i en bioreaktor klarar inte heller av studier där immunsystemet eller interaktionen med andra organ är kritisk.
Avslutningsvis presenteras ett enkelt 3D-printat perfusionssystem som kan efterlikna den fysiologiska hemodynamiska miljön, vilket förväntas bidra till standardisering av ex vivo blodkärlsodlingar. Dess potential för anpassning och tillämpning på långtidsodling gör den till ett viktigt verktyg för att främja förståelsen av dessa komplexa biologiska system vid fysiologiska och patologiska tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Veterinary Pathology Centre vid University of Surrey School of Veterinary Medicine för histologiska tjänster. Vi tackar också Drs L. Dixon, A. Reis och M. Henstock från The Pirbright Institute (Pirbright, Storbritannien) för deras stöd vid anskaffningen av djurvävnader, och Department of Biochemical Sciences vid University of Surrey, särskilt det tekniska teamet, för deras fortsatta stöd. RSM stöddes av Doctoral College studentship award (University of Surrey), DM och PC stöddes av National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction of Animals in Research (anslagsnummer: NC/R001006/1 och NC/T001216/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasyFlow | - | - | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 - 3D printing | Protolabs | - | - |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound - OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt - 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | - | - | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels - Size 23 - Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
References
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: Endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Gugliandolo, E., et al. Palmitoylethanolamide and Polydatin combination reduces inflammation and oxidative stress in vascular injury. Pharmacological Research. 123, 83-92 (2017).
- Anselmino, M., et al. Catheter ablation of atrial fibrillation in patients with left ventricular systolic dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Circulation, Arrhythmia, and Electrophysiology. 7 (6), 1011-1018 (2014).
- Viola, M., et al. Subcutaneous delivery of monoclonal antibodies: How do we get there. Journal of Controlled Release. 286, 301-314 (2018).
- Kim, D. D. In vitro cellular models for nasal drug absorption studies. Drug Absorption Studies: In Situ, In Vitro and In Silico Models. , 216-234 (2008).
- Lewis, D. I. Animal experimentation: Implementation and application of the 3Rs. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (6), 675-679 (2019).
- Rouwkema, J., et al. In vitro platforms for tissue engineering: Implications for basic research and clinical translation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e164-167 (2011).
- Xu, Y., Shrestha, N., Préat, V., Beloqui, A. An overview of in vitro, ex vivo and in vivo models for studying the transport of drugs across intestinal barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113795 (2021).
- Vaghela, R., et al. Vessel grafts for tissue engineering revisited-Vessel segments show location-specific vascularization patterns in ex vivo ring assay. Microcirculation. 29 (2), e12742 (2022).
- Håkansson, J., et al. Individualized tissue-engineered veins as vascular grafts: A proof of concept study in pig. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 15 (10), 818-830 (2021).
- Saucy, F., et al. Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1. European Surgical Research. 45 (1), 50-59 (2010).
- Tosun, Z., McFetridge, P. S. Variation in cardiac pulse frequencies modulates vSMC phenotype switching during vascular remodeling. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (1), 59-70 (2015).
- Matos, R. S., Maselli, D., McVey, J. H., Heiss, C., Campagnolo, P. 3D printed bioreactor enabling the pulsatile culture of native and angioplastied large arteries. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 864580 (2022).
- Neff, L. P., et al. Vascular smooth muscle enhances functionality of tissue-engineered blood vessels in vivo. Journal of Vascular Surgery. 53 (2), 426-434 (2011).
- Boparai, K. S., Singh, R. Advances in Fused Deposition Modeling. In: Module. Refrence in Materials Science and Materials Engineering. , Elsevier. (2017).
- McKeen, L. W. Chapter 6 - Polyamides (Nylons). The Effect of Creep and Other Time Related Factors on Plastics and Elastomers (Second Edition). McKeen, L. W. , William Andrew Publishing. 197-262 (2012).
- Moradi, M., Mehrabi, O., Azdast, T., Benyounis, K. Y. Enhancement of low power CO2 laser cutting process for injection molded polycarbonate). Optics & Laser Technology. 96, 208-218 (2017).
- Ghasem, N. Computer Methods in Chemical Engineering. , CRC Press. (2021).
- Lying, F., Gazi, F., Gardner, E. Preparation of tissues and cells for infrared and raman spectroscopy and imaging. Biomedical Applications of Synchrotron Infrared Microspectroscopy.RSC Analytical Spectroscopy Monographs. (11), 147-185 (2011).
- Sassi, L., et al. A perfusion bioreactor for longitudinal monitoring of bioengineered liver constructs. Nanomaterials. 11 (2), 275 (2021).
- Haykal, S., et al. Double-chamber rotating bioreactor for dynamic perfusion cell seeding of large-segment tracheal allografts: Comparison to conventional static methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (8), 681-692 (2014).
- Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplant. 27 (9), 1375-1389 (2018).
- Wong, M. M., Hong, X., Karamariti, E., Hu, Y., Xu, Q. Generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (97), 52565 (2015).
- Alvino, V. V., et al. In vitro and in vivo preclinical testing of pericyte-engineered grafts for the correction of congenital heart defects. Journal of the American Heart Association. 9 (4), e014214 (2020).
- Nerurkar, N. L., Sen, S., Baker, B. M., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Dynamic culture enhances stem cell infiltration and modulates extracellular matrix production on aligned electrospun nanofibrous scaffolds. Acta Biomaterialia. 7 (2), 485-491 (2011).
- Engebretson, B., Mussett, Z. R., Sikavitsas, V. I. The effects of varying frequency and duration of mechanical stimulation on a tissue-engineered tendon construct. Connective Tissue Research. 59 (2), 167-177 (2018).
- Saunders, S. K., et al. Evaluation of perfusion-driven cell seeding of small diameter engineered tissue vascular grafts with a custom-designed seed-and-culture bioreactor. PLoS One. 17 (6), e0269499 (2022).
- Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Research. 7, (2018).
