Summary
Questo protocollo presenta la configurazione e il funzionamento di un bioreattore di nuova concezione stampato in 3D per la coltura ex vivo di vasi sanguigni in perfusione. Il sistema è progettato per essere facilmente adottato da altri utenti, pratico, economico e adattabile a diverse applicazioni sperimentali, come la biologia di base e gli studi farmacologici.
Abstract
Le malattie vascolari costituiscono la base della maggior parte delle malattie cardiovascolari (CVD), che rimangono la principale causa di mortalità e morbilità in tutto il mondo. Sono urgentemente necessari interventi chirurgici e farmacologici efficaci per prevenire e curare le malattie vascolari. In parte, la carenza di modelli traslazionali limita la comprensione dei processi cellulari e molecolari coinvolti nelle malattie vascolari. I bioreattori per colture a perfusione ex vivo forniscono una piattaforma ideale per lo studio di grandi vasi animali (compresi gli esseri umani) in un ambiente dinamico controllato, combinando la facilità della coltura in vitro e la complessità del tessuto vivo. La maggior parte dei bioreattori sono, tuttavia, realizzati su misura e quindi difficili da adottare, limitando la riproducibilità dei risultati. Questo documento presenta un sistema stampato in 3D che può essere facilmente prodotto e applicato in qualsiasi laboratorio biologico e fornisce un protocollo dettagliato per la sua configurazione, consentendo il funzionamento degli utenti. Questo innovativo e riproducibile sistema di coltura di perfusione ex vivo consente la coltura di vasi sanguigni fino a 7 giorni in condizioni fisiologiche. Ci aspettiamo che l'adozione di un bioreattore a perfusione standardizzato supporterà una migliore comprensione dei processi fisiologici e patologici nei grandi vasi sanguigni degli animali e accelererà la scoperta di nuove terapie.
Introduction
La parete vascolare esiste in uno stato stazionario reattivo, che garantisce sia la reattività agli stimoli esterni (ad esempio, variazione di pressione, vasocostrittori) sia una superficie coerente non attivante che impedisce la coagulazione del sangue e l'infiltrazione di cellule infiammatorie1. In risposta agli stimoli dipendenti dall'invecchiamento e dallo stile di vita e in caso di danno diretto, la parete vascolare attiva processi di rimodellamento come la restenosi e l'aterosclerosi, che sono noti per contribuire alle comuni malattie cardiovascolari (CVD), come l'ictus ischemico e l'infarto del miocardio2. Sebbene siano disponibili approcci interventistici come la rivascolarizzazione percutanea e lo stent per affrontare le manifestazioni avanzate della malattia vascolare, è noto che questi provocano ulteriori danni vascolari, spesso portando a recidive. Inoltre, sono disponibili solo soluzioni preventive e in fase iniziale limitate. Comprendere i meccanismi che mantengono l'omeostasi della parete vascolare e ne guidano la disfunzione è al centro dello sviluppo di nuove cure3.
Nonostante il costante sviluppo e i progressi della biologia molecolare e dell'ingegneria tissutale, gli studi sugli animali rimangono una componente cruciale degli studi di biologia vascolare. Gli studi in vivo sugli animali hanno fornito enormi informazioni sui meccanismi dell'omeostasi e della patologia vascolare; Tuttavia, queste procedure sono costose, hanno un throughput relativamente basso e pongono problemi etici sostanziali. Inoltre, gli animali di piccola taglia sono scarsamente rappresentativi della fisiologia vascolare umana e gli esperimenti sugli animali più grandi sono molto più costosi e creano ulteriori considerazioni etiche 4,5. Con la crescente domanda di soluzioni farmaceutiche e mediche per una popolazione che invecchia rapidamente, gli svantaggi dell'uso degli animali sono amplificati, con un impatto sulla riproducibilità, l'affidabilità e la trasferibilità dei risultati alla cura del paziente6.
I sistemi in vitro offrono una piattaforma semplificata per studiare i meccanismi di base, ma non riescono a ricapitolare la complessità dell'intero tessuto, le interazioni tra le cellule e la matrice extracellulare e le forze meccaniche, che sono determinanti critiche nello sviluppo delle malattie vascolari7.
Gli studi ex vivo condotti su tessuti interi mantenuti in ambienti controllati artificialmente imitano la complessità in vivo, consentendo al contempo indagini ad alto rendimento8. Data la capacità di controllare da vicino le condizioni di coltura e l'ambiente, i modelli ex vivo consentono un'ampia gamma di studi complessi e forniscono un'alternativa adeguata per ridurre l'uso di procedure animali in biologia vascolare. Le colture statiche di anelli vascolari hanno offerto spunti interessanti, ma non sono riuscite a incorporare l'elemento emodinamico cruciale9. In effetti, lo studio del sistema vascolare ex vivo pone sfide specifiche legate alle numerose forze dinamiche che si applicano alle cellule all'interno della parete dei vasi sanguigni. Stimoli come il flusso luminale, la turbolenza, lo sforzo di taglio, la pressione e la deformazione della parete hanno un impatto significativo sulla fisiopatologia dei tessuti10,11,12.
I bioreattori a perfusione sono essenziali per lo studio dell'omeostasi vascolare e del rimodellamento in risposta a lesioni o cambiamenti emodinamici13. Inoltre, la coltura di perfusione può essere utilizzata per migliorare la maturazione e la durata dei vasi sanguigni di ingegneria tissutale (TEBV), fornendo alternative adeguate per gli innesti vascolari14.
I bioreattori a perfusione disponibili in commercio sono limitati in termini di flessibilità e adattabilità e sono costosi. Molti dei bioreattori esistenti sviluppati internamente sono invece difficili da replicare in altri laboratori, a causa delle descrizioni limitate e dell'indisponibilità dei componenti 7,8,9,10,11,12 appositamente realizzati. Per superare queste limitazioni, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo bioreattore (EasyFlow), che è economico da produrre, si adatta a una vasta gamma di tessuti e consente modifiche relativamente semplici per adattarsi alle diverse esigenze di ricerca13. L'inserto è stampato in 3D e si adatta come in un coperchio di una provetta da centrifuga standard da 50 ml. Il suo design modulare e la produzione di stampa 3D lo rendono accessibile e riproducibile in diversi laboratori, oltre che facilmente modificabile per adattarsi alle diverse esigenze scientifiche. Questo protocollo descrive l'assemblaggio e il funzionamento di base del sistema del bioreattore in un ambiente di perfusione arteriosa.
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Protocol
Questo protocollo descrive l'assemblaggio e l'uso di un sistema composto da due inserti EasyFlow (bioreattore): uno che rappresenta la camera di reazione (C), contenente il campione di arteria perfusa, e uno che funge da serbatoio del terreno (R) (Figura 1 e Figura 2A). Le arterie carotidi sono state ottenute da suinetti maschi e femmine di 4-6 settimane (6-12 kg) presso il Pirbright Institute, nel Regno Unito. Le procedure sugli animali sono state eseguite ai sensi dell'Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986) (ASPA) e approvate dall'Animal Welfare and Ethical Review Board (AWERB) presso il Pirbright Institute. Gli animali sono stati alloggiati in conformità con il codice di condotta per l'alloggio e la cura degli animali allevati. Tutte le procedure sono state condotte da titolari di licenza personale che sono stati addestrati e competenti ai sensi della licenza di progetto PPL70/8852. I suinetti sono stati abbattuti secondo il metodo della tabella uno nell'ambito dell'ASPA.
1. Produzione di inserti
- Fabbricare l'inserto mediante stampa 3D, utilizzando il modello 3D fornito (File supplementare 1).
NOTA: la modellazione 3D consente di apportare facilmente modifiche al progetto per adattarle a nuove applicazioni. Per produrre l'inserto possono essere utilizzati anche materiali alternativi e tecniche di produzione alternative. A causa della complessa struttura interna, la sinterizzazione laser selettiva e la stereolitografia sono alternative appropriate15. La poliammide 12 (PA12; vedi Tabella dei materiali) è un buon materiale candidato grazie alle sue prestazioni superiori in termini di ritenzione di liquidi e resistenza a ripetuti cicli di sterilizzazione a caldo16. - Fabbricare le guarnizioni in silicone e le rondelle in policarbonato tagliando al laser17, utilizzando i disegni forniti nel file supplementare 2.
NOTA: Il taglio laser è facilmente esternalizzato e un metodo di produzione economico. Le rondelle possono essere realizzate in acciaio inossidabile, fornendo un componente più resistente per un uso ripetuto. Tutti gli altri componenti sono articoli disponibili in commercio. Un elenco completo dei materiali richiesti è fornito nella Tabella 1. I dettagli commerciali degli articoli sono inclusi nell'Indice dei Materiali.
2. Sterilizzazione, assemblaggio e adescamento del dispositivo
- Sterilizzare tutti i componenti seguendo le istruzioni nella Tabella 1.
- In condizioni di flusso laminare, assemblare due inserti fabbricati (fase 1), come mostrato nella Figura 1A.
- Assemblare il sistema di perfusione come nella Figura 2, seguendo i passaggi seguenti:
- Collegare due valvole a tre vie collegate alla porta R1 del serbatoio (porta di scambio dei fluidi).
- Collegare l'uscita risultante alla testa della pompa peristaltica utilizzando un tubo dotato di valvola unidirezionale (tubo valvola unidirezionale).
- Collegare la testa della pompa alla porta C4 della camera di reazione utilizzando un tubo di sistema dotato di una valvola unidirezionale.
NOTA: Questa diramazione può essere dotata opzionalmente di un sensore di pressione che consente un monitoraggio costante. - Collegare la porta C1 della camera di reazione al tubo a parete morbida e questa al canale di resistenza (piccolo diametro interno).
NOTA: La lunghezza del tubo di resistenza influenzerà notevolmente la pressione presente nel sistema. Questo dovrebbe essere ulteriormente studiato per garantire condizioni di perfusione adeguate. - Estendere il canale di resistenza con il tubo del sistema, creando un canale di ritorno e chiudendo il circuito di circolazione luminale collegandolo al serbatoio in R5 (Figura 2C).
- Creare un canale di troppo pieno collegando la camera di reazione C3 al serbatoio R3 con la tubazione del sistema.
- Collegare un filtro di ventilazione attraverso R2.
- Creare uno smorzatore di pressione collegando una siringa contenente aria e fluido alla camera di reazione C6.
NOTA: Il corretto rapporto aria/fluido dipenderà dalla pressione richiesta smorzamento.
- Adescare il sistema con mezzo di perfusione (terreno di coltura modificato di Dulbecco [DMEM] + 10% [v/v] siero fetale bovino [FBS] + 1% [v/v] penicillina-streptomicina + 1% [v/v] amfotericina B + 30% [v/v] destrano; vedere Tabella dei materiali) attraverso le porte di scambio dei terreni e il serbatoio.
NOTA: L'adescamento del sistema riduce il rischio di bolle intrappolate nel sistema e identifica eventuali perdite. Il volume di terreno consigliato è di circa 100-120 ml. Il volume utilizzato dipenderà dal volume morto del tubo utilizzato per la sperimentazione.
3. Raccolta e preparazione dei campioni
- Raccogliere le arterie carotidi comuni sinistra e destra, riducendo al minimo la manipolazione diretta del tessuto arterioso13.
- Posizionare il tessuto in un mezzo di trasporto freddo (DMEM+ 20% [v/v] FBS + 2% [v/v] penicillina-streptomicina + 1% [v/v] amfotericina B, vedere la tabella dei materiali) per il trasferimento.
- In una cabina a flusso laminare, rimuovere il tessuto connettivo in eccesso e tagliare le estremità del tessuto utilizzando una lama per bisturi. Lavare il tessuto due volte in mezzi di trasporto freddi.
- Posizionare il tessuto su un agitatore orbitale nei mezzi di trasporto per almeno 30 minuti per un lavaggio accurato.
- Collegare un segmento non ramificato dell'arteria al sistema del bioreattore utilizzando due connettori luer spinati e fissarlo in posizione utilizzando un legame vascolare (fascette in silicone vascolare; Tabella 1).
NOTA: Il legame del vaso fornisce la tensione e la retrazione adeguate per fissare il recipiente. La sezione ovale previene il danneggiamento dei tessuti. - Far scorrere delicatamente il terreno attraverso l'arteria per verificare la pervietà.
- Dopo aver fissato l'arteria all'inserto fabbricato, riempire lo spazio di reazione con mezzi di perfusione (passaggio 2.4). Infine, riempire delicatamente il circuito di circolazione luminale con il fluido per eliminare l'aria residua dal sistema.
- Collegare lo spazio di reazione con il sistema di perfusione precedentemente assemblato (sezione 2), completando la circolazione.
NOTA: Si consiglia di eseguire un controllo di qualità mediante immunoistochimica del tessuto trattato. In questo modo vengono identificati eventuali danni dovuti a un'eccessiva manipolazione durante la preparazione.
4. Cultura della perfusione e cambiamento dei media
- Collocare il sistema di perfusione in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 e quindi collegarlo a una pompa peristaltica (vedi Tabella dei materiali)
- Collegare eventuali sistemi di acquisizione aggiuntivi (facoltativi), come i sensori di pressione (vedere la tabella dei materiali).
- Lasciare che il sistema si equilibri durante la notte con una bassa portata del fluido di ~10-15 mL/min.
NOTA: Sono necessari esperimenti iniziali per determinare le impostazioni della pompa, il flusso del fluido, la pressione del sistema e le impostazioni ottimali degli smorzatori/morsetti di pressione per garantire che siano soddisfatte le condizioni appropriate. - Il giorno successivo, aumentare il flusso in modo incrementale (+1 rpm ogni ora, equivalente a un aumento di ~2,5 mL/min ogni ora, nel sistema attuale) fino a raggiungere la portata finale (35 mL/min). Monitorare periodicamente il sistema per verificare la presenza di perdite.
NOTA: Per calcolare la portata accurata in base alla velocità della pompa peristaltica, gli utenti devono prima eseguire un'adeguata calibrazione della pompa18. Utilizzando la formula (1), la portata volumetrica (Q) può essere calcolata in base al volume erogato (V) in un determinato tempo (t). Per calcolare la velocità di flusso stimata () possiamo utilizzare la portata (Q) precedentemente calcolata e l'area della sezione trasversale del recipiente (A), descritta nell'equazione (
2).
(1)
(2) - Ogni 3 giorni, sostituire il 50% del terreno (~50 ml) collegando una siringa piena di terreno fresco alla porta di scambio del terreno più vicina alla pompa e una siringa vuota alla porta più vicina al serbatoio per raccogliere il mezzo esausto (Figura 2).
NOTA: L'utilizzo di due valvole a tre vie come porte di scambio del fluido facilita il funzionamento continuo della perfusione durante lo scambio del fluido. - Al termine dell'esperimento, prelevare il tessuto dalla camera di reazione tagliando le estremità collegate al bioreattore utilizzando forbici chirurgiche sterili.
- Smontare, pulire e sterilizzare il sistema per un ulteriore utilizzo.
2).
(1)
(2)5. Analisi del campione
- Fissare il campione raccolto in paraformaldeide (PFA) al 4% per una notte a 4 °C.
- Incorporare il tessuto alla temperatura di taglio ottimale (OCT; vedere la tabella dei materiali)19 e congelare per immersione in isopentano raffreddato in azoto liquido.
- Ottenere sezioni criogeniche di 3-5 mm di spessore utilizzando un criostato.
- Eseguire l'immunoistochimica (ematossilina ed eosina [H&E]) e/o l'immunofluorescenza. Seguire il tipico protocollo di immunofluorescenza:
- Bloccare le fette per 1 ora a temperatura ambiente con siero di capra al 20% [v/v] in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; vedere la tabella dei materiali).
- Incubare le fette per una notte a 4 °C con anticorpo primario di coniglio contro CD31 diluito 1:50 in PBS (vedere Tabella dei materiali).
- Lavare tre volte con PBS per 5 min.
- Incubare per 1 ora a 37 °C con anticorpo secondario anti-coniglio di capra marcato con fluorescenza diluito 1:200 in PBS e anticorpo fluorescente α-actina muscolare liscia (SMA) direttamente coniugato diluito 1:200 in PBS (vedere Tabella dei materiali).
- Lavare tre volte con PBS per 5 min.
- Colorare i nuclei con DAPI diluito 1:1.000 in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Incubare con Sudan Black allo 0,1% (p/v) (vedere la tabella dei materiali) in etanolo al 70% (v/v) per 10 minuti a temperatura ambiente per ridurre l'autofluorescenza dei tessuti.
- Lavare il tessuto con abbondante acqua deionizzata. Montare le guide nel supporto di montaggio.
- Visualizzare i campioni con un microscopio a scansione laser confocale.
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Representative Results
Questo studio ha stabilito un sistema di perfusione versatile e conveniente (EasyFlow)13. Il design stampato in 3D del sistema facilita l'adozione del sistema da parte di altri laboratori e quindi incoraggia la riproducibilità.
L'inserto di perfusione fabbricato è alloggiato in una provetta da centrifuga da 50 mL, creando un ambiente isolato. Utilizzando due inserti di perfusione, è possibile creare un circuito di perfusione contenente un serbatoio e una camera di reazione, dove viene incubato il campione biologico. Il sistema di perfusione viene quindi collegato a una pompa peristaltica e a sistemi di acquisizione opzionali, come sensori di pressione e dispositivi a ultrasuoni, per monitorare le condizioni di coltura (Figura 2).
I campioni di arteria carotide suina sono stati raccolti e processati prima di essere coltivati in perfusione per 7 giorni. Per garantire la qualità del tessuto prima della coltura, sono stati eseguiti esperimenti preliminari in cui i campioni sono stati fissati al momento dell'escissione, dopo la preparazione del tessuto e dopo la perfusione. La colorazione fluorescente per i marcatori endoteliali (CD31) e della muscolatura liscia (αSMA) è stata utilizzata per valutare il mantenimento dell'integrità tissutale. Esempi di tessuti ben conservati e danneggiati sono presentati nella Figura 3 per il confronto. Le immagini mostrano l'importanza di una manipolazione delicata del tessuto al momento dell'escissione, poiché una lavorazione errata (allungamento eccessivo, schiacciamento, ecc.) può comportare la perdita dell'endotelio prima della coltura. I risultati mostrano anche l'importanza dell'instaurazione graduale della perfusione per evitare danni luminali.
La colorazione H&E è stata eseguita insieme alla colorazione a immunofluorescenza (IF) per mostrare il mantenimento della morfologia e della distribuzione complessiva delle cellule nella parete del vaso dopo 7 giorni di coltura (Figura 4). L'applicazione delle condizioni fisiologiche di coltura nel dispositivo garantisce il mantenimento della copertura endoteliale del lume, l'allineamento delle cellule muscolari lisce nei terreni e la conservazione del vasa vasa vasasorum nell'avventizia.
Il design compatto e modulare del sistema di bioreattori consente inoltre un'ampia gamma di configurazioni del sistema. La configurazione più piccola comprende un singolo bioreattore ed è ideale per studi farmacologici e a basso volume (perfusione a ricircolo20, volume totale di 50-70 mL). Per aumentare la lunghezza della coltura e ridurre il numero di cambi di terreno, è più ideale un sistema di circolazione a serbatoio singolo, come quello descritto in questo protocollo, o un sistema di alimentazione costante, in quanto hanno un volume maggiore di terreno in circolazione. È possibile stabilire una configurazione a doppia circolazione21 per esplorare ambienti sperimentali in cui la localizzazione degli stimoli è critica. L'attuale dispositivo può anche essere combinato con sistemi di controllo più sofisticati per consentire un controllo preciso del feedback di parametri come il pH e l'ossigeno disciolto (Figura 5).
Figura 1: Schemi di assemblaggio EasyFlow. (A) Schemi renderizzati in 3D che aiutano l'assemblaggio dell'inserto di perfusione. (B) Vengono forniti schemi dettagliati per facilitare il montaggio dei siti di connessione. (C) Una vista in sezione trasversale dello spazio di reazione evidenzia i componenti essenziali dell'inserto EasyFlow e la connessione del tessuto all'inserto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentazione schematica dell'assieme del sistema di perfusione. (A) Sistema di perfusione assemblato contenente tutti i componenti importanti, evidenziando la loro posizione relativa in un ambiente renderizzato in 3D. Non tutti i componenti sono scalabili. (B) Vengono presentate anche le singole viste isometriche dei componenti. (C) Viene mostrata una vista dall'alto del sistema di perfusione assemblato per facilitare l'assemblaggio e il collegamento dei diversi componenti. Le porte sono state etichettate e numerate in senso antiorario per navigare tra i vari siti di connessione attraverso il sistema di perfusione. Questo principio è stato applicato al serbatoio (R) e alla camera di reazione (C). Ai vari canali che collegano le due camere sono stati assegnati anche dei nomi di riferimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Mantenimento dei tessuti durante la lavorazione. (A) Le immagini confocali mostrano la struttura normale di un'arteria al momento del prelievo, (B) dopo la pulizia e la lavorazione e (C) dopo la coltura di perfusione, dimostrando il mantenimento di una morfologia ben conservata. (D) Esempi di tessuto danneggiato a causa di una manipolazione eccessiva o errata durante la lavorazione o (E) a causa dell'applicazione di condizioni di coltura non fisiologiche (ad esempio, l'inizio improvviso di un flusso elevato) mostrano l'esaurimento della copertura luminale e l'interruzione del terreno. (F) Il controllo negativo indica la specificità della colorazione. CD31: verde; αSMA: rosso; DAPI: blu. Barre graduate: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Valutazione istologica del tessuto prima e dopo la coltura di perfusione. (A e B) Il tessuto arterioso è stato valutato mediante istologia al momento del prelievo e (C e D) dopo 7 giorni di coltura con il sistema del bioreattore. (A e C) La colorazione H&E rivela la conservazione della struttura e dell'organizzazione della parete arteriosa. (B e D) La colorazione in immunofluorescenza dello stesso tessuto evidenzia la copertura endoteliale, l'allineamento delle cellule muscolari lisce e il vasa vasorum nell'avventizia. CD31: verde; SMA: rosso; DAPI: blu. Barre graduate: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Rappresentazione schematica di possibili configurazioni di perfusione. Con l'inserto di perfusione è possibile utilizzare varie configurazioni alternative per consentire diversi studi sperimentali. (A) La configurazione di perfusione a ricircolo riduce al minimo il volume di mezzo richiesto. (B) L'impostazione di alimentazione costante fornisce un apporto costante di terreno al tessuto. (C) La circolazione a serbatoio singolo (come descritto in questo documento) fornisce un volume maggiore di terreno per incubazioni a lungo termine e include una zona cuscinetto per il ricambio d'aria e l'equilibrio della pressione. (D) La configurazione a doppia circolazione fornisce due circuiti distinti che alimentano le circolazioni interna (all'interno dell'arteria) ed esterna (spazio di reazione) in modo indipendente. (E) La configurazione di perfusione dinamica include gas continui e controllo del pH da parte di un controller PID (proporzionale-integrale-derivativo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Componenti per la fabbricazione degli inserti. Clicca qui per scaricare questa tabella.
File supplementare 1: modello 3D dell'inserto EasyFlow per la produzione di stampa 3D. Fare clic qui per scaricare il file.
File supplementare 2: Schemi di progettazione del dispositivo costruito, della vista in sezione, della stampa e dei componenti di tenuta. Fare clic qui per scaricare il file.
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Discussion
I sistemi di perfusione vascolare ex vivo costituiscono una piattaforma unica per studiare la funzione e il comportamento delle cellule vascolari all'interno dei loro tessuti nativi in condizioni controllate, il che consente la dissezione di processi complessi come il rimodellamento vascolare post-lesione22. Tuttavia, la maggior parte dei bioreattori segnalati sono sistemi realizzati internamente basati su componenti su misura e sono spesso difficili da replicare da altri23. Esistono soluzioni commerciali alternative, ma mancano di flessibilità nella progettazione e possono essere relativamente costose24.
Abbiamo sviluppato un sistema alternativo che fornisce una piattaforma facile, economica e riproducibile che può essere prodotta utilizzando tecniche di stampa 3D open-source13. Il presente articolo descrive la configurazione del sistema per consentire applicazioni riproducibili da parte degli utenti finali. Questa configurazione consente l'applicazione di condizioni fisiologiche e patologiche di pressione (40-180 mmHg), portata (6-30 mL/min) e, in combinazione con fluidi che imitano la viscosità del sangue, con vari gradi di sforzo di taglio.
La riproducibilità è un aspetto essenziale del processo scientifico, in quanto consente ai ricercatori di convalidare le scoperte di altri e di basarsi su di esse per far progredire la nostra comprensione delle malattie vascolari. Inoltre, gli strumenti che consentono e promuovono le collaborazioni tra i gruppi sono essenziali per far progredire la conoscenza scientifica. EasyFlow rappresenta un esempio di tali soluzioni open-source e accessibili che possono essere facilmente prodotte e adottate da laboratori che lavorano su una vasta gamma di progetti nel campo delle scienze vascolari e non solo.
Segnaliamo che questa coltura del dispositivo mantiene la vitalità del tessuto arterioso per almeno 7 giorni e può essere utilizzata per modellare fasi specifiche della malattia vascolare. Usando questo, si potrebbero modellare le portate fisiologiche e le condizioni di pressione13. È importante sottolineare che questa coltura di perfusione è conveniente grazie ai bassi costi di produzione e al basso volume di terreno necessario per far funzionare il sistema.
Il design 3D può anche essere adattato a nuove applicazioni e possono essere testati nuovi materiali per la stampa. Anche nel suo formato attuale, lo spazio di alloggiamento del campione può essere facilmente adattato a campioni di diverse dimensioni modificando la lunghezza dei raccordi o il foro dei connettori luer. È importante notare che, data la natura modulare del dispositivo e le sue dimensioni ridotte, questo bioreattore può essere utilizzato in diverse configurazioni (Figura 5) e può essere applicato a colture multiplex, dove più campioni possono essere esposti a condizioni diverse contemporaneamente in bioreattori separati.
Si prevede che l'uso del sistema venga ampliato in futuro per supportare la coltura di vasi sanguigni di diversa origine (ad esempio, specie diverse) e di diversa natura (ad esempio, vene, linfatico), e forse applicato alla coltura di altri tessuti cavi (ad esempio, trachea, intestino). In particolare, la ricerca mostra che la coltura di scaffold di ingegneria tissutale in perfusione costante aiuta la distribuzione omogenea delle cellule all'interno del costrutto e la maturazione del tessuto risultante25,26. Inoltre, la semina di innesti vascolari in perfusione contribuisce a ottenere un lume vascolare più uniformemente cellularizzato, rispetto ai metodi statici27. Per questo motivo, prevediamo che il sistema venga applicato all'ingegneria tissutale per aiutare ad affrontare le sfide attuali, consentendo lo sviluppo futuro di sostituti sintetici riproducibili dei vasi sanguigni28.
Il protocollo qui descritto presenta alcuni passaggi importanti fondamentali per il successo della cultura del flusso. Stabilire e monitorare le condizioni di flusso appropriate non è banale e deve essere eseguito su ogni sistema quando viene impostato per la prima volta, per garantire che le condizioni di coltura siano fisiologiche. Il flusso e la pressione sono stati monitorati utilizzando sensori di pressione e immagini a ultrasuoni. Un altro punto critico è garantire che il tessuto sia vitale e intatto all'inizio della coltura. Ciò richiede una fonte nuova, un'attenta manipolazione e può essere verificato mediante analisi istologica. Inoltre, la risoluzione dei problemi deve essere eseguita all'inizio di ogni esperimento per identificare qualsiasi potenziale contaminazione batterica o fonte di perdita di fluidi.
È importante sottolineare che il sistema di perfusione descritto, pur fornendo condizioni fisiologiche di pressione e flusso, non è in grado di imitare completamente i complessi modelli di onde di pressione registrati in vivo. Questa limitazione è attribuibile all'utilizzo di una pompa peristaltica e può essere risolta utilizzando apparecchiature più specializzate per riprodurre condizioni emodinamiche avanzate. Anche la coltura di vasi sanguigni in un bioreattore non è in grado di affrontare studi in cui il sistema immunitario o l'interazione con altri organi sono critici.
In conclusione, viene presentato un semplice sistema di perfusione stampato in 3D in grado di imitare l'ambiente emodinamico fisiologico, che dovrebbe contribuire alla standardizzazione delle colture di vasi sanguigni ex vivo . Il suo potenziale di personalizzazione e applicazione alla coltura a lungo termine lo rende uno strumento essenziale per far progredire la comprensione di questi complessi sistemi biologici in fisiologia e condizioni patologiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Centro di Patologia Veterinaria della Scuola di Medicina Veterinaria dell'Università del Surrey per i servizi di istologia. Ringraziamo anche i dottori L. Dixon, A. Reis e M. Henstock del Pirbright Institute (Pirbright, Regno Unito) per il loro supporto nell'approvvigionamento dei tessuti animali, e il Dipartimento di Scienze Biochimiche dell'Università del Surrey, in particolare il team tecnico, per il loro continuo supporto. RSM è stato supportato dal premio di borsisteria del Doctoral College (Università del Surrey), DM e PC sono stati supportati dal Centro nazionale per la sostituzione, il perfezionamento e la riduzione degli animali nella ricerca (numeri di sovvenzione: NC/R001006/1 e NC/T001216/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasyFlow | - | - | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 - 3D printing | Protolabs | - | - |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound - OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt - 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | - | - | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels - Size 23 - Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
References
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