Summary
La méthode de manipulation cervicale présentée peut induire une pseudogrossesse chez la souris sans avoir besoin de reproduire des femelles avec des mâles vasectomisés. L’induction de la pseudogrossesse est nécessaire pour le succès du transfert d’embryons non chirurgical et de l’insémination artificielle non chirurgicale, qui sont également présentés.
Abstract
Pour réussir à maintenir la grossesse avec transfert d’embryons ou insémination artificielle, les souris receveuses doivent être induites dans un état de pseudo-enceinte. Les souris femelles sont traditionnellement appariées pendant la nuit avec des mâles vasectomisés, et le lendemain matin, la présence d’un bouchon de copulation est évaluée. Pour augmenter l’efficacité de la production de femelles pseudo-gravides, une technique de manipulation cervicale a été normalisée pour être utilisée en combinaison avec des techniques non chirurgicales de transfert d’embryons ou d’insémination artificielle chez la souris. L’extrémité émoussée d’une petite tige en plastique est insérée par voie vaginale pour entrer en contact avec le col de l’utérus et vibre pendant 30 s par contact avec une tondeuse. La procédure est rapide et ne nécessite pas d’anesthésie ou d’analgésie. Cette technique augmente la fiabilité et la prévisibilité de la production de femelles pseudo-gravides et élimine entièrement le besoin de mâles vasectomisés. Pour les souris CD1, l’efficacité de l’induction de pseudogrossesse par manipulation cervicale était de 83% pour les femelles dans l’oestrus (N = 76), mais seulement 38% des femelles dans l’oestrus ont été bouchées par des mâles vasectomisés (N = 24). L’insémination artificielle chez les souris CD1 a été réalisée par synchronisation de l’oestrus avec les hormones, manipulation cervicale et transfert utérin de sperme. Les receveuses d’insémination artificielle recevant une manipulation cervicale (N = 76) avaient un taux de grossesse de 72 % et une portée moyenne de 8,3 petits. Cette méthode peut également être utilisée pour produire des femelles pseudo-gravides pour le transfert d’embryons non chirurgical. Par conséquent, induire une pseudogrossesse par manipulation cervicale est une alternative pratique et efficace à l’accouplement avec un mâle vasectomisé lors de l’exécution de techniques de procréation assistée non chirurgicales. L’utilisation de la manipulation cervicale offre des avantages 3R (remplacement, réduction et raffinement) pour les techniques de procréation assistée en réduisant le nombre d’animaux nécessaires et en éliminant la nécessité de modifier chirurgicalement les mâles.
Introduction
Les technologies de procréation assistée sont utilisées pour la production de modèles de souris génétiquement modifiés, ainsi que pour la récupération de souches issues de la cryoconservation, la redérivation de souches à partir d’un état de santé compromis et la gestion stratégique des vivariums, y compris la production de cohortes appariées selon l’âge. Toutes les techniques de procréation assistée chez la souris nécessitent l’utilisation de receveuses pseudo-enceintes pour le développement de l’embryon. Historiquement, les receveuses pseudo-enceintes ont été générées par accouplement avec des mâles stériles, qui sont soit vasectomisés chirurgicalement, soit génétiquement infertiles, et la présence d’un bouchon de copulation est évaluée le lendemain matin1. Récemment, un protocole de stimulation sonique chez la souris a été développé pour le transfert chirurgical d’embryons de souris pronucléaires ou bicellulaires2. Nous avons également développé un protocole de manipulation cervicale (CM) pour une utilisation avec l’insémination artificielle et le transfert d’embryons non chirurgical de blastocystes. La raison d’être de l’utilisation de la procédure est de fournir une réduction de 3R du nombre d’animaux requis (ne nécessitant plus de souris mâles) et un raffinement des techniques utilisées (ne nécessitant plus la procédure de vasectomie chirurgicale pour les souris mâles). La description de ce protocole comprend la technique de procréation assistée associée pour faciliter l’intégration de la MC dans les flux de travail normaux. L’objectif global de la méthode CM est de remplacer l’utilisation de souris mâles dans la génération de femelles pseudo-gravides pour les techniques de procréation assistée, y compris l’insémination artificielle et le transfert d’embryons.
Le protocole CM décrit ici a d’abord été développé pour aider à l’insémination artificielle chez la souris. Le protocole d’insémination artificielle, tel que décrit à l’origine, a atteint un taux de grossesse de 50%, avec une portée moyenne de 7 petits3. Les souris receveuses de CD1 ont été synchronisées avec une faible dose d’hormones, y compris la gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG) et la gonadotrophine chorionique humaine (hCG), à un intervalle de 47 heures avant l’insémination. Un avantage de la synchronisation œstrale était qu’elle permettait l’utilisation du protocole pendant les heures normales de travail. Les femelles ont été jumelées avec des mâles vasectomisés immédiatement après l’insémination artificielle, et l’accouplement a été confirmé par la présence d’un bouchon de copulation. L’incohérence du taux d’accouplement avec les receveurs a été signalée comme une difficulté dans la procédure. Par conséquent, des alternatives à l’accouplement ont été recherchées pour l’induction de la pseudogrossesse.
La présente étude présente une technique de MC standardisée pour augmenter l’efficacité de la production de femelles pseudo-gravides. Pour les femelles en oestrus ou proestrus, l’extrémité émoussée d’une petite tige en plastique est insérée par voie vaginale pour entrer en contact avec le col de l’utérus et vibre pendant 30 s par contact avec une tondeuse. La procédure est effectuée sur une cage à dessus métallique. Aucune anesthésie ou analgésie n’est nécessaire. La technique CM est pratique pour produire des femelles pseudo-gravides, qui peuvent produire des portées après une insémination artificielle non chirurgicale sans avoir besoin de s’accoupler avec des mâles vasectomisés. La CM peut également être utilisée pour la production de femelles pseudo-gravides en tant que receveuses de transfert d’embryons. Plus précisément, la technique de MC peut être associée à un transfert d’embryons non chirurgical, comme décrit ici. Les méthodes non chirurgicales se sont révélées efficaces pour le transfert embryonnaire d’embryons au stade de blastocyste chez la souris4,5 et le rat 6,7. Comme cette méthode non chirurgicale est une alternative efficace aux méthodes chirurgicales, elle est considérée comme un raffinement 3R de la technique. D’après des recherches antérieures, les niveaux de corticostérone fécale, en tant que mesure du stress, indiquent que la nature non chirurgicale de la procédure n’augmente pas les niveaux de stress chez les rongeurs 7,8. Les procédures sont moins difficiles techniquement que le transfert d’embryons chirurgical et sont beaucoup plus rapides à réaliser. Comme les embryons sont transférés dans l’utérus, les embryons du bon stade de développement utérin doivent être transférés. Pour les souris, les blastocystes sont transférés à des receveuses pseudo-enceintes 2,5 jours après le coït (dpc).
Pour les deux techniques non chirurgicales décrites ici, le moment de l’administration de l’hormone et la technique de MC diffèrent. Le moment de la procédure de MC par rapport à l’oestrus est important pour le succès, car il remplace l’accouplement naturel pour la production de receveuses pseudo-gravides. En éliminant la nécessité pour les mâles vasectomisés d’induire une pseudogrossesse, cette procédure offre des avantages 3R en réduisant le nombre d’animaux nécessaires et en éliminant la nécessité de modifier chirurgicalement les mâles. La procédure elle-même est rapide (30 s) et ne nécessite pas d’anesthésie ou d’analgésie. La technique augmente considérablement la fiabilité et la prévisibilité de la production de femelles pseudo-gravides pour la procréation assistée.
Protocol
Toutes les directives internationales, nationales et institutionnelles applicables pour le soin et l’utilisation des animaux ont été suivies. Toutes les procédures effectuées dans les études impliquant des animaux étaient conformes aux normes éthiques du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la ParaTechs Corporation et menées conformément aux normes dictées par l’Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health, Public Health Service, United States Department of Health and Human Services. Des souris CD1(ICR) mâles et femelles et des souris C57Bl/6J femelles âgées de >8 semaines ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus de sources commerciales (voir le tableau des matériaux).
1. Procédure de manipulation cervicale à utiliser avec l’insémination artificielle chez les souris CD1
- Ovulation synchronisée des souris femelles aux jours 1 et 3
- Injecter 2,5 UI de PMSG à des souris femelles (voir le tableau des matériaux) par injection intrapéritonéale (IP) le jour 1, 0,5 h avant le début du cycle sombre du vivarium.
NOTE: Chaque donneur masculin fournira suffisamment de sperme pour 10 receveuses. - Injecter aux femelles 2,5 UI d’hCG (voir le tableau des matériaux) par injection IP le jour 3, 1 h avant le début du cycle sombre du vivarium.
REMARQUE: Les moments des injections, le transfert de spermatozoïdes et le cycle de lumière les uns par rapport aux autres sont très importants. Les temps spécifiés pour toutes les procédures de ce protocole sont basés sur un cycle lumière/obscurité de 12 h.
- Injecter 2,5 UI de PMSG à des souris femelles (voir le tableau des matériaux) par injection intrapéritonéale (IP) le jour 1, 0,5 h avant le début du cycle sombre du vivarium.
- Collecte et capacitation du sperme frais le jour 4
- Préparer une goutte de 500 μL de milieu de pré-incubation du sperme (PM, voir le tableau des matériaux) dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm sous huile de paraffine. Préparez un plat par donneur masculin. Équilibrer pendant au moins 30 minutes à 37 °C et 5% de CO2 avant le prélèvement de spermatozoïdes.
- À 1 h après le début du cycle lumineux du vivarium, euthanasier le(s) mâle(s) selon les directives de l’établissement. Chaque mâle fournira suffisamment de spermatozoïdes pour 10 inséminations artificielles.
- Disséquer rapidement les épididymes de la caudale de la souris. Effectuer une incision abdominale transversale au-dessus de la vessie à l’aide de ciseaux de dissection et de pinces dentées.
- Les coussinets graisseux testiculaires sont situés de chaque côté de la vessie. Saisissez l’un des coussinets graisseux testiculaires avec une pince incurvée et retirez le testicule et l’épididyme de la cavité corporelle. Identifier l’épididyme cauda comme une structure tubulaire ovale plate juste en dessous du testicule.
- Tenez la queue épididyme avec une pince incurvée et réséquez à l’aide de petits ciseaux inclinés. Retirez les deux épididymes cauda et transférez-les dans un tissu absorbant pour éliminer la graisse et le sang au microscope à dissection.
- Placer deux épididymes de cauda dans chaque goutte de 500 μL de particules équilibrées sous huile de paraffine à 37 °C. Coupez le tissu en faisant six incisions à l’aide de petits ciseaux. Si plus d’un donneur masculin est utilisé, utilisez un épididyme de chaque donneur pour chaque échantillon de sperme afin de réduire la variation entre les échantillons.
- Faites tourner doucement le plat et laissez le sperme sortir du tissu pendant 3 minutes, en tourbillonnant une fois par minute. Retirez tous les mouchoirs.
- Incuber l’échantillon de sperme pendant 45 min à 1 h à 37 °C et 5% de CO2 pour le capaciter.
- Facultatif : Mesurez le nombre de spermatozoïdes et évaluez la motilité au microscope à l’aide d’un hémocytomètre. Pour le comptage, diluez le sperme dans PM au besoin.
- Confirmation de la synchronisation du cycle œstral par évaluation cytologique
- À l’aide d’un petit écouvillon préhumidifié (voir le tableau des matières), prélever doucement les cellules vaginales de la paroi vaginale en roulant l’écouvillon contre le tissu, les étaler en une goutte de 20 μL d’eau stérile sur une lame de microscope et les sécher à l’air.
- Au microscope utilisant un grossissement 100x avec éclairage en fond clair, évaluer la présence de cellules épithéliales cornées. Les femelles en oestrus ou en proestrus tardif auront des cellules épithéliales cornées présentes et devraient être sélectionnées pour la manipulation cervicale.
- Facultatif : Noter le poids des receveuses avant l’insémination.
- Effectuer la manipulation cervicale (CM)
- Environ 0,5 heure avant l’insémination, placez une femelle receveuse sur le dessus d’une cage à l’aide d’un support métallique, permettant à la souris de « saisir » la surface de la barre de la cage. Saisissez près de la base de la queue à l’aide du pouce et de l’index et inclinez la queue vers le haut tout en stabilisant l’animal (figure 1).
REMARQUE: La souris restera immobile pendant toute la durée de la procédure lorsque la technique de manipulation est exécutée correctement. Si la souris se déplace, repositionnez-la doucement et continuez. Si un animal agressif est choisi comme receveur, permettre à l’animal d’entrer dans un tunnel d’enrichissement pendant la procédure peut être apaisant. L’utilisation du tunnel est facultative, mais elle peut aider les chercheurs à manipuler les animaux en fournissant une distraction pendant cette procédure. - Insérez l’extrémité émoussée d’une petite tige de plastique (voir le tableau des matières) par voie vaginale au contact avec le col de l’utérus et vibrez pendant 30 s par contact avec une tondeuse (voir le tableau des matières).
REMARQUE: Placez la tige en position avant de démarrer la tondeuse. Les deux sont tenus dans une main pendant la procédure. Aucune anesthésie ou analgésie n’est nécessaire.
- Environ 0,5 heure avant l’insémination, placez une femelle receveuse sur le dessus d’une cage à l’aide d’un support métallique, permettant à la souris de « saisir » la surface de la barre de la cage. Saisissez près de la base de la queue à l’aide du pouce et de l’index et inclinez la queue vers le haut tout en stabilisant l’animal (figure 1).
- Transfert de sperme non chirurgical pour insémination artificielle
- Placez le dispositif d’insémination (voir le tableau des matériaux) sur une pipette P200 réglée à 40 μL et retirez le couvercle de protection.
- Retirer une partie aliquote de l’échantillon de sperme capacité de la capsule à 37 °C et 5 % de CO2 et la transférer dans une boîte de culture tissulaire de 35 mm sans huile à 37 °C. L’échantillon de sperme sera utilisé immédiatement pour le transfert.
REMARQUE: Les spermatozoïdes perdront rapidement leur motilité à l’extérieur de l’incubateur de CO2 . Conserver l’échantillon de sperme capacité à 37 °C et 5% CO2 autant que possible. - Appuyez sur le piston de la pipette jusqu’à la première butée, abaissez l’extrémité du cathéter dans l’échantillon de sperme à 37 °C et chargez lentement le sperme dans le dispositif de transfert. Évitez les touffes. Retirez l’huile résiduelle de l’extérieur du dispositif d’insémination à l’aide d’un tissu absorbant. Réserver la pipette.
REMARQUE: Le transfert d’huile de paraffine à la corne utérine doit être évité. Retirez l’huile résiduelle de l’extérieur du dispositif d’insémination à l’aide d’un tissu absorbant. - Placez la femelle receveuse sur le dessus de la cage métallique. Maintenir la souris en position en utilisant la même technique de manipulation utilisée pour le CM; Saisir près de la base de la queue à l’aide du pouce et de l’index, et incliner la queue vers le haut tout en stabilisant l’animal.
- Placez le petit spéculum (voir le tableau des matériaux) dans le vagin.
- Insérez le cathéter du dispositif d’insémination dans le spéculum, à travers le col de l’utérus et dans l’utérus. Une fois que le concentrateur de l’appareil entre en contact avec le spéculum, distribuez le sperme en appuyant sur le piston de la pipette jusqu’au premier but. Évitez le transfert d’air supplémentaire dans la corne utérine.
REMARQUE: Si le cathéter n’est pas positionné correctement, il frappera le tissu entourant le col de l’utérus, le faisant fléchir et éventuellement se plier. Si le cathéter ne glisse pas à travers le col de l’utérus à la première tentative, reculez doucement le cathéter et réessayez jusqu’à ce qu’il réussisse. Un repositionnement du spéculum peut être nécessaire. - Retirez l’appareil et spéculum. Aucune surveillance post-procédure n’est requise.
- Facultatif : Bilan de grossesse les jours 10 à 12
- Utilisez le gain de poids pour déterminer l’état de la grossesse. Le gain de poids dépendra de la tension, mais une augmentation d’au moins 1-2 g est corrélée à la grossesse.
Figure 1: La technique de tenue de la souris pour la manipulation cervicale. La souris repose sur une cage métallique et est stabilisée à la queue et des deux côtés à l’avant des pattes postérieures. L’extrémité émoussée d’une petite tige de plastique est insérée par voie vaginale pour entrer en contact avec le col de l’utérus et vibre au contact d’une tondeuse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
2. Procédure de transfert d’embryons non chirurgical à utiliser avec la manipulation cervicale chez les souris CD1
- Ovulation synchronisée des souris femelles aux jours 1 et 3
- Injecter 2,5 UI de PMSG à des souris femelles par injection IP le jour 1, environ 6 h après le début du cycle lumineux du vivarium.
- Injecter aux femelles 2,5 UI d’hCG par injection IP le jour 3, à un intervalle de 47 heures après l’injection de PMSG ou environ 5 h après le début du cycle lumineux du vivarium.
- Confirmation de la synchronisation du cycle œstral par évaluation cytologique
- Le jour 3, environ 1 h avant le CM, effectuez une cytologie sur les receveurs potentiels. À l’aide d’un petit écouvillon pré-humidifié, prélever doucement les cellules vaginales de la paroi vaginale en roulant l’écouvillon contre le tissu, les étaler en une goutte de 20 μL d’eau stérile sur une lame de microscope et sécher à l’air.
- Au microscope utilisant un grossissement 100x avec éclairage en fond clair, évaluer la présence de cellules épithéliales cornées. Les femelles en oestrus ou en proestrus tardif auront des cellules épithéliales cornées présentes et devraient être sélectionnées pour la manipulation cervicale.
- Facultatif : Enregistrez le poids des receveuses potentielles d’embryons.
- Exécution du CM
- Le jour 3, 1 h avant le début du cycle sombre du vivarium, placez une femelle receveuse sur le dessus d’une cage avec un support métallique, permettant à l’animal de « saisir » la surface de la barre de la cage. Saisissez près de la base de la queue à l’aide de l’index et du pouce, puis inclinez la queue vers le haut tout en stabilisant l’animal (figure 1).
REMARQUE: La souris restera immobile pendant toute la durée de la procédure lorsque la technique de manipulation est exécutée correctement. Si la souris se déplace, repositionnez-la doucement et continuez. Si un animal agressif est choisi comme receveur, permettre à l’animal d’entrer dans un tunnel d’enrichissement pendant la procédure peut être apaisant. - Insérez l’extrémité émoussée d’une petite tige de plastique par voie vaginale pour entrer en contact avec le col de l’utérus, et faites-la vibrer pendant 30 s par contact avec une tondeuse.
REMARQUE: Placez la tige en position avant de démarrer la tondeuse. Les deux sont tenus dans une main pendant la procédure. Aucune anesthésie ou analgésie n’est nécessaire.
- Le jour 3, 1 h avant le début du cycle sombre du vivarium, placez une femelle receveuse sur le dessus d’une cage avec un support métallique, permettant à l’animal de « saisir » la surface de la barre de la cage. Saisissez près de la base de la queue à l’aide de l’index et du pouce, puis inclinez la queue vers le haut tout en stabilisant l’animal (figure 1).
- Transfert d’embryons non chirurgical au jour 6
- Déposer une goutte de 20 μL de milieu M2 (voir le tableau des matières) sur le couvercle d’une boîte de culture tissulaire.
REMARQUE: Le couvercle est choisi car il a un bord plus court et, par conséquent, est pratique pour accéder aux embryons dans la goutte. Ne superposez à aucun moment l’huile de paraffine sur la goutte de M2, car l’introduction d’huile dans la corne utérine semble affecter négativement le transfert d’embryons. - Au microscope et à l’aide d’un éclairage réfléchissant, charger 10 à 20 blastocystes dans la goutte moyenne à l’aide d’une pipette de manipulation d’embryons standard (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE: Le nombre optimal d’embryons à transférer dépend de la souche de souris et de toute manipulation que les embryons ont subie. Pour les embryons sains non manipulés, le transfert de 10 à 15 embryons devrait suffire. Pour la redérivation ou les embryons génétiquement modifiés, le transfert d’un plus grand nombre d’embryons est approprié. - Fixez le dispositif de transfert d’embryons non chirurgical (voir le tableau des matériaux) sur une pipette P2 réglée à 1,8 μL. Retirez le couvercle du cathéter de protection.
- Appuyez sur le piston de la pipette jusqu’à la première butée, abaissez l’extrémité du cathéter dans le milieu et tirez lentement les embryons dans l’extrémité du cathéter du dispositif. Retirez l’embout du support.
REMARQUE: La visualisation des embryons sous faible grossissement permettra de charger plus facilement les embryons dans le dispositif. Si les embryons sont dispersés dans la goutte, secouez doucement le plat d’un côté à l’autre pour concentrer les embryons au centre de la goutte, ou repositionnez-les à l’aide d’une pipette de manipulation d’embryons. - Réglez le volume de la pipette à 2,0 μL pour générer une petite bulle d’air à l’extrémité du cathéter. Posez délicatement la pipette avec les embryons chargés près de la cage de la souris.
- Placez la femelle receveuse sur le dessus de la cage métallique. Tenez la souris en position en utilisant la même technique de manipulation utilisée pour la CM; Saisissez près de la base de la queue à l’aide de l’index et du pouce, puis inclinez la queue vers le haut tout en stabilisant l’animal.
- Placez un petit spéculum (voir le tableau des matériaux) dans le vagin.
- Insérez le cathéter du dispositif de transfert dans le spéculum, à travers le col de l’utérus et dans l’utérus. Une fois que le concentrateur de l’appareil entre en contact avec le spéculum, distribuez les embryons en appuyant sur le piston de la pipette jusqu’à la première butée. Évitez le transfert d’air supplémentaire dans la corne utérine.
- Sans relâcher le piston de la pipette, retirez l’appareil et le spéculum. Aucune surveillance post-procédure n’est requise.
- Déposer une goutte de 20 μL de milieu M2 (voir le tableau des matières) sur le couvercle d’une boîte de culture tissulaire.
Representative Results
Comme la stimulation cervicale électrique9 et sonique10 a été utilisée pour induire une pseudogrossesse chez le rat, ce travail présente une procédure mécanique standardisée qui peut être utilisée chez la souris. La cytologie vaginale peut aider à identifier les femmes à différents stades de l’œstrus. Pour confirmer la pseudogrossesse chez les femmes, cette même méthode a été utilisée. Tout d’abord, les profils cytologiques des femelles ont été comparés pour les souris CD1 et C57Bl/6 tout au long des cycles œstrals, pendant la gestation et pendant la pseudo-grossesse induite par l’accouplement ou la CM. Des écouvillonnages vaginaux ont été prélevés sur les femelles et colorés à l’aide d’un système de coloration Papanicolaou (voir le tableau des matériaux). Les cellules ont été observées sous un grossissement de 100x avec un éclairage en fond clair. Les cellules observées comprenaient des leucocytes, des cellules épithéliales nucléées et des cellules épithéliales cornées anucléées. La détermination du stade du cycle œstral était basée sur le pourcentage relatif de chaque type de cellule11,12. L’œstrus est caractérisé par la prédominance des cellules épithéliales cornées. À la fin de l’oestrus, le metestrus commence et les leucocytes commencent à apparaître, tandis que les cellules épithéliales cornées deviennent moins évidentes. Diestrus a une cellularité modérée à faible, avec des leucocytes prédominants et des cellules épithéliales nucléées commençant à apparaître. Le proestrus se distingue par la perte de leucocytes, une augmentation des cellules épithéliales nucléées et l’apparition de cellules épithéliales cornées. Après le proestrus, l’oestrus commence et le cycle continue.
Pour établir un profil de base, la cytologie vaginale a été enregistrée pendant au moins deux cycles œstraux complets pour chaque femelle (N = 20 pour CD1, N = 20 pour C57Bl/6) avant l’accouplement. La longueur du cycle et les profils individuels variaient d’une souris à l’autre; toutefois, les tendances générales attendues ont été observées. La durée moyenne d’un cycle œstral pour les souris CD1 et C57Bl/6 était de 3,8 jours, avec une plage de 3 à 5 jours. La veille de l’accouplement naturel, toutes les souris femelles étaient en proestrus. Après l’accouplement, la cytologie a été effectuée à nouveau 1,5 jour après le coït (dpc) jusqu’à ce que le cycle œstral reprenne. La figure 2 montre le profil cytologique des femelles pseudo-gravides CD1 et C57Bl/6 accouplées avec des mâles vasectomisés.
Figure 2 : Profil cytologique de souris femelles pseudogravides. Les pourcentages moyens de chaque type de cellule pour les leucocytes, les cellules épithéliales nucléées et les cellules épithéliales cornifiées sont indiqués en fonction des jours après le coït (DPC) pour les souris (A) CD1 (N = 20) et (B) C57Bl/6 (N = 20). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Dans ce travail, une technique de MC a été normalisée pour augmenter l’efficacité de la production de femelles pseudo-gravides. Pour les femelles en oestrus ou proestrus, l’extrémité émoussée d’une petite tige en plastique est insérée par voie vaginale pour entrer en contact avec le col de l’utérus et vibre pendant 30 s par contact avec une tondeuse. La procédure est effectuée sur une cage à dessus métallique. Aucune anesthésie ou analgésie n’est nécessaire. Pour déterminer l’efficacité de la procédure de CM, la cytologie vaginale a été comparée pour les souris femelles CD1 (N = 20) et C57Bl/6 (N = 20) après l’accouplement avec des mâles vasectomisés et après CM (N total = 40). Le profil cytologique de la pseudogrossesse induite par la CM était similaire au profil de la pseudogrossesse induite par l’accouplement, comme le montre la figure 3.
Figure 3 : Profil cytologique de souris femelles pseudo-gravides après manipulation cervicale (CM). Le pourcentage de chaque type de cellule pour les leucocytes, les cellules épithéliales nucléées et les cellules épithéliales cornées est indiqué en fonction des jours après le coït (DPC) ou des jours après la manipulation cervicale (DPCM). Les pourcentages moyens de type cellulaire sont indiqués pour les souris CD1 et C57Bl/6 (N = 40) (A) accouplées avec des mâles vasectomisés ou (B) après CM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Pour déterminer si la technique de MC est suffisante pour établir une grossesse pour la procréation assistée, la CM a été réalisée dans le cadre d’un protocole d’insémination artificielle non chirurgicale (INSN) chez les femelles CD1. Le protocole d’insémination artificielle comprenait la synchronisation de l’oestrus des femelles avec une faible dose des hormones PMSG et hCG avant le transfert de spermatozoïdes. La CM a été réalisée juste avant le transfert de sperme. Pour les souris CD1, l’efficacité de l’induction de pseudogrossesse à l’aide de la MC pour les femelles dans l’oestrus (N = 76) avec cette technique était de 83%. Dans une expérience témoin, seulement 38 % des femelles de l’oestrus ont été bouchées par des mâles vasectomisés (N = 24). Les receveuses d’insémination artificielle recevant une manipulation cervicale (N = 76) avaient un taux de grossesse de 72% et une portée moyenne de 8,3 petits. Ainsi, l’induction de la pseudogrossesse par CM est un remplacement pratique et efficace de l’accouplement avec un mâle vasectomisé lors de la réalisation d’un INS. L’utilisation de la MC pour préparer les receveurs de CD1 (N = 4) dans l’oestrus pour le transfert embryonnaire non chirurgical de blastocystes CD1 frais a entraîné un taux de grossesse de 100%. Le transfert de 9 à 15 embryons a donné trois portées saines avec un taux de natalité de 45% et une portée moyenne de 6 petits. En comparaison, les receveuses de CD1 (N = 20) qui ont été accouplées avec des mâles vasectomisés pour induire une pseudogrossesse avaient un taux de grossesse de 80% et un taux de natalité de 46% après le transfert de 20 blastocystes B6C3F2 frais.
Les résultats des techniques de procréation assistée seront probablement spécifiques à la souche, car des variables telles que la dose et le moment de l’administration d’hormones pour la superovulation se sont révélées dépendantes de la souche13. En outre, des facteurs tels que l’âge et le poids du receveur peuvent affecter la réaction aux hormones14. Dans ce travail, lors de l’exécution de la procédure de MC pour l’insémination artificielle, seules les femelles en fin de proestrus ou d’oestrus se sont avérées réactives. En général, pour augmenter le nombre de receveurs disponibles dans une population, les femelles sont d’abord synchronisées de l’oestrus avec une faible dose d’hormones3. La synchronisation de l’œstrus avec 2,5 UI de PMSG et d’hCG était efficace à 78 % chez les femelles CD1 âgées de 11 à 14 semaines (N = 27) et à 60 % chez les femelles C57Bl/6 âgées de 18 à 32 semaines (N = 22) dans ce travail. L’efficacité de l’induction de pseudogrossesse par manipulation cervicale sur les femelles CD1 était de 83% pour les femelles dans l’oestrus (N = 76) et de 82% (N = 100) pour les femelles C57Bl/6 dans l’oestrus avec cette technique.
Discussion
Les 3R sont un cadre éthique pour l’utilisation des animaux en recherche, tel que décrit en 1959 par Russel et Burch dans « The Principles of Humane Experimental Technique »15. Les 3R représentent le remplacement, la réduction et le raffinement de l’utilisation des animaux. Les protocoles mis en évidence ici sont alignés sur les 3R. La technique de manipulation cervicale réduit le nombre d’animaux nécessaires en n’exigeant plus l’utilisation de mâles pour produire des femelles pseudo-gravides. La technique élimine également le besoin d’effectuer des vasectomies sur les mâles, offrant ainsi un raffinement en réduisant la douleur et la détresse. Les techniques de procréation assistée décrites ici (insémination artificielle et transfert d’embryons) sont non chirurgicales et offrent donc un raffinement des 3R en réduisant la douleur et la détresse8causées par leurs alternatives chirurgicales.
L’utilisation de femelles pseudo-gravides est nécessaire pour la récupération des petits lors de la procréation assistée chez la souris1. La procédure CM est une méthode efficace pour produire des femelles pseudo-gravides, mais la synchronisation de la phase du cycle œstral des femelles receveuses est une première étape critique du processus. La synchronisation œstreuse peut réduire considérablement le nombre de femelles nécessaires dans la colonie pour préparer les receveuses potentielles et aide à produire des femelles pseudo-gravides chronométrées à la demande. L’utilisation d’une faible dose d’hormones ne semble pas avoir d’effets délétères sur la récupération des portées vivantes chez les souris CD1. Il faut prendre soin avec d’autres souches de trouver la combinaison d’hormones et de concentration qui produit les femelles receveuses de la meilleure qualité pour les embryons ou les spermatozoïdes transférés. La synchronisation peut être réalisée en utilisant la PMSG et l’hCG16, mais les doses qui produisent des femelles surovulées peuvent ne pas être appropriées pour une grossesse prolongée17.
Pour déterminer si une femelle est dans l’oestrus, une évaluation cytologique a été effectuée dans ce travail. La phase œstrale peut également être évaluée par l’observation de l’ouverture vaginale11,18. Bien que cette méthode soit extrêmement utile et puisse être utilisée seule ou comme confirmation, elle est plus subjective que l’utilisation de la cytologie. La cytologie vaginale sans coloration est à la fois rapide et efficace pour choisir les femelles dans l’oestrus car les cellules épithéliales cornées peuvent être facilement identifiées. Dans ce protocole, l’évaluation cytologique est effectuée avant la CM afin de déterminer les receveurs potentiels. Il est important d’effectuer une cytologie avant la CM, car la procédure a tendance à fragmenter les cellules détachées de la région vaginale, rendant ainsi l’identification difficile. L’évaluation cytologique de la pseudogrossesse ou de la grossesse peut être effectuée 3,5 à 11,5 jours après la CM (dpcm) pendant 3 jours consécutifs. Le profil d’une femelle cycliste œstrale devrait avoir au moins 1 jour avec une infiltration considérable de cellules épithéliales cornées. Les femmes pseudo-enceintes/enceintes doivent présenter un profil diestrus (principalement des leucocytes avec un nombre de cellules potentiellement faible) pendant 3 jours consécutifs.
Grâce au développement de la technique CM, certaines souris se sont avérées plus réceptives à la procédure que d’autres. Les souris femelles CD1 sont d’excellentes candidates en raison de leur nature calme et de leur excellent instinct nourricier. Cette souche est facile à manipuler et fonctionne bien pendant les techniques de MC et de procréation assistée non chirurgicale. Les souris C57Bl/6 ont tendance à être plus agressives et moins nourricières. Bien que ce protocole ait effectivement produit des femelles pseudo-gravides C57Bl/6 utilisant la CM, elles étaient moins susceptibles d’être systématiquement permissives à l’égard de la procédure. Cela semblait être quelque peu corrélé avec la phase œstrale pendant la MC. Les femelles en oestrus ou proestrus étaient plus réceptives. L’utilisation d’un tube d’enrichissement pour que l’animal puisse entrer a permis d’accéder au vagin pour la procédure et a aidé à calmer la femelle. La procédure elle-même ne retient pas complètement la femelle, de sorte que l’animal peut s’éloigner à tout moment. Si cela se produit, l’animal peut être repositionné et la procédure peut alors être poursuivie. Le moment de la procédure s’arrête si la femme s’éloigne et reprend lorsque la procédure est reprise. La phase du cycle œstral (proestrus tardif et oestrus) et le contact de la tige avec le col de l’utérus sont essentiels au succès de la procédure. La vibration de la tondeuse fournit une CM standardisée. Pour assurer le contact avec le col de l’utérus, une légère pression est appliquée sur la tige et le positionnement de la tige contre le col de l’utérus est assuré par de petits mouvements de va-et-vient de la tige.
L’utilisation de la CM a amélioré le protocole NSAI, car les femelles dans la phase correcte du cycle œstral peuvent être choisies avant le transfert de spermatozoïdes, et le protocole n’est plus subordonné à l’accouplement avec des mâles vasectomisés. La synchronisation du cycle œstral de l’insémination artificielle est programmée de telle sorte que la maturation ovocytaire corresponde au transfert de spermatozoïdes le matin du jour 4. Le succès du protocole est essentiel à l’adaptation du moment de l’ovulation de manière à ce que la fécondation puisse avoir lieu. Il faut prendre soin d’administrer l’hCG 15-17 h avant le transfert de sperme prévu, comme cela est suggéré pour les moments utilisés pour la fécondation in vitro 1. La qualité de l’échantillon de sperme affectera directement le résultat de l’insémination artificielle. Les spermatozoïdes frais qui ont été capacités seront les plus performants. Des spermatozoïdes cryoconservés de bonne qualité peuvent produire des embryons fécondés in vivo. Cependant, des précautions doivent être prises avec le transfert direct de spermatozoïdes décongelés, car les cryoprotecteurs résiduels transférés dans la corne utérine peuvent inhiber l’implantation (observations non publiées).
L’utilisation de la MC en conjonction avec le transfert d’embryons est conceptuellement une adaptation facile. La synchronisation du cycle œstruel réduit le nombre de femelles nécessaires à la production du pool de destinataires. La détermination du stade œstral avant la MC augmente la probabilité d’obtenir des receveuses pseudo-enceintes. Un inconvénient de la méthode est que la cytologie des receveurs au moment du transfert d’embryons est à un stade de flux. Tous les types de cellules sont présents si la femelle passe du profil œstrus au profil pseudo-grossesse, et la pseudogrossesse ne devient évidente que si la cytologie est suivie pendant plusieurs jours. Sur la base du succès (>80%) de la transition de l’oestrus à la pseudogrossesse pour les souris CD1 et C57Bl/6, cette méthode devrait convenir aux receveuses de transfert d’embryons. Les résultats préliminaires montrent un bon succès avec un transfert limité d’embryons non chirurgicaux. En général, l’efficacité du transfert d’embryons non chirurgical est comparable à celle de la technique chirurgicale4,5, et le transfert non chirurgical peut remplacer les transferts d’embryons chirurgicaux au stade de blastocyste. Pour les embryons à un stade précoce, une culture embryonnaire jusqu’au stade de blastocyste est nécessaire. Cependant, si un transfert chirurgical est préféré, il est possible d’adapter la technique de MC au bon moment nécessaire pour les receveuses pseudo-enceintes appropriées2. En général, les receveurs d’embryons sont 1 jour moins avancés que l’embryon. Par exemple, les blastocystes sont récoltés à 3,5 dpc de donneurs et transférés à 2,5 dpc receveurs. Par conséquent, la CM devra être effectuée de manière à ce que la receveuse soit dans un état de pseudo-grossesse moins développé que les embryons.
En conclusion, la technique de MC décrite ici est très prometteuse pour l’intégration avec d’autres techniques de procréation assistée pour les souris. Nous avons fourni des protocoles efficaces pour l’insémination artificielle et le transfert d’embryons en utilisant des techniques non chirurgicales. En combinaison, la technique CM offre des avantages 3R, y compris (1) une réduction du nombre d’animaux en éliminant le besoin de mâles vasectomisés et (2) un raffinement des techniques en remplaçant les techniques chirurgicales par des alternatives non chirurgicales.
Disclosures
Barbara Stone et Sarah Srodulski sont toutes deux employées chez ParaTechs Corporation, Lexington, KY, États-Unis. ParaTechs détient les droits de licence exclusifs pour la fabrication du dispositif mNSET pour les souris. ParaTechs Corp a développé et vend les dispositifs mNSET et mC&I, qui peuvent être utilisés respectivement pour le transfert d’embryons non chirurgical et l’insémination artificielle non chirurgicale.
Acknowledgments
La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le Bureau du directeur, Bureau des programmes d’infrastructure de recherche, des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution R43OD020304 et l’Institut national de la santé mentale des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution R44MH122117. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blastocyst stage embryos | |||
| CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
| Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
| Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
| Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
| human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
| Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
| Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
| Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
| mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
| Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
| Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
| Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
| Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
| Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
| Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
| Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
| Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
| Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
| Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
| Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
| Wire bar topped mouse cage |
References
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