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गैर-सर्जिकल भ्रूण हस्तांतरण या कृत्रिम गर्भाधान से पहले पुरुष की आवश्यकता के बिना मादा चूहों में छद्म गर्भावस्था को प्रेरित करना

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65477
Automatic Translation
1, 1
1ParaTechs Corporation

Summary

प्रस्तुत गर्भाशय ग्रीवा हेरफेर विधि चूहों में छद्म गर्भावस्था को प्रेरित कर सकती है, बिना प्रजनन मादाओं को वैसक्टोमाइज्ड पुरुषों के साथ प्रजनन की आवश्यकता के बिना। गैर-सर्जिकल भ्रूण हस्तांतरण और गैर-सर्जिकल कृत्रिम गर्भाधान की सफलता के लिए छद्म गर्भावस्था का प्रेरण आवश्यक है, दोनों भी प्रस्तुत किए गए हैं।

Abstract

भ्रूण हस्तांतरण या कृत्रिम गर्भाधान के साथ गर्भावस्था को सफलतापूर्वक बनाए रखने के लिए, महिला प्राप्तकर्ता चूहों को एक छद्म गर्भवती अवस्था में प्रेरित किया जाना चाहिए। मादा चूहों को पारंपरिक रूप से रात भर वैसक्टोमाइज्ड पुरुषों के साथ जोड़ा जाता है, और अगली सुबह, एक कॉपुलेशन प्लग की उपस्थिति का आकलन किया जाता है। छद्म गर्भवती महिलाओं के उत्पादन की दक्षता बढ़ाने के लिए, चूहों में गैर-सर्जिकल भ्रूण हस्तांतरण या कृत्रिम गर्भाधान तकनीकों के संयोजन में उपयोग करने के लिए एक ग्रीवा हेरफेर तकनीक को मानकीकृत किया गया है। एक छोटी प्लास्टिक रॉड के कुंद सिरे को गर्भाशय ग्रीवा से संपर्क करने के लिए योनि से डाला जाता है और ट्रिमर के संपर्क से 30 सेकंड तक कंपन होता है। प्रक्रिया त्वरित है और संज्ञाहरण या एनाल्जेसिया की आवश्यकता नहीं है। यह तकनीक छद्म गर्भवती महिलाओं के उत्पादन की विश्वसनीयता और पूर्वानुमान को बढ़ाती है और पूरी तरह से वैसक्टोमाइज्ड पुरुषों की आवश्यकता को समाप्त करती है। सीडी 1 चूहों के लिए, गर्भाशय ग्रीवा हेरफेर का उपयोग करके स्यूडोप्रेग्नेंसी प्रेरण की दक्षता एस्ट्रस (एन = 76) में महिलाओं के लिए 83% थी, लेकिन एस्ट्रस में केवल 38% महिलाओं को वैसक्टोमाइज्ड पुरुषों (एन = 24) द्वारा प्लग किया गया था। सीडी 1 चूहों में कृत्रिम गर्भाधान हार्मोन, गर्भाशय ग्रीवा हेरफेर और शुक्राणु के गर्भाशय हस्तांतरण के साथ एस्ट्रस सिंक्रनाइज़ेशन द्वारा किया गया था। गर्भाशय ग्रीवा हेरफेर (एन = 76) प्राप्त करने वाले कृत्रिम गर्भाधान प्राप्तकर्ताओं की गर्भावस्था दर 72% थी और औसत कूड़े का आकार 8.3 पिल्ले था। इस विधि का उपयोग गैर-सर्जिकल भ्रूण हस्तांतरण के लिए छद्म गर्भवती महिलाओं का उत्पादन करने के लिए भी किया जा सकता है। इसलिए, गर्भाशय ग्रीवा के हेरफेर द्वारा छद्म गर्भावस्था को प्रेरित करना गैर-शल्य चिकित्सा सहायता प्राप्त प्रजनन तकनीकों का प्रदर्शन करते समय एक वैसक्टोमाइज्ड पुरुष के साथ संभोग करने का एक सुविधाजनक और कुशल विकल्प है। गर्भाशय ग्रीवा हेरफेर का उपयोग करने से आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करके और शल्य चिकित्सा से परिवर्तित पुरुषों की आवश्यकता को समाप्त करके सहायक प्रजनन तकनीकों के लिए 3आर (प्रतिस्थापन, कमी और शोधन) लाभ प्रदान करता है।

Introduction

सहायक प्रजनन प्रौद्योगिकियों का उपयोग आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल के उत्पादन के साथ-साथ क्रायोप्रिजर्वेशन से उपभेदों की वसूली, एक समझौता स्वास्थ्य स्थिति से उपभेदों की व्युत्पत्ति और रणनीतिक विवेरियम प्रबंधन के लिए किया जाता है, जिसमें आयु-मिलान वाले समूहों का उत्पादन भी शामिल है। चूहों में सभी सहायक प्रजनन तकनीकों को भ्रूण के विकास के लिए छद्म गर्भवती महिला प्राप्तकर्ताओं के उपयोग की आवश्यकता होती है। ऐतिहासिक रूप से, छद्म गर्भवती प्राप्तकर्ता बाँझ पुरुषों के साथ संभोग करके उत्पन्न होते हैं, जो या तो शल्य चिकित्सा से वासेक्टोमाइज्ड या आनुवंशिक रूप से होते हैं, और अगली सुबह1 बजे एक कॉपुलेशन प्लग की उपस्थिति का आकलन किया जाता है। हाल ही में, चूहों में सोनिक उत्तेजना के लिए एक प्रोटोकॉल प्रोन्यूक्लियर या दो-सेल माउस भ्रूण2 के सर्जिकल हस्तांतरण के लिए विकसित किया गया है। हमने कृत्रिम गर्भाधान और ब्लास्टोसिस्ट के गैर-सर्जिकल भ्रूण हस्तांतरण के साथ उपयोग के लिए एक ग्रीवा हेरफेर (सीएम) प्रोटोकॉल भी विकसित किया है। प्रक्रिया के उपयोग के लिए तर्क आवश्यक जानवरों की संख्या में 3आर की कमी प्रदान करना है (अब नर चूहों की आवश्यकता नहीं है) और उपयोग की जाने वाली तकनीकों का शोधन (अब पुरुष चूहों के लिए सर्जिकल पुरुष नसबंदी प्रक्रिया की आवश्यकता नहीं है)। इस प्रोटोकॉल के विवरण में सामान्य वर्कफ़्लो ज़ में सीएम के एकीकरण में सहायता के लिए संबद्ध सहायक प्रजनन तकनीक शामिल है। सीएम विधि का समग्र लक्ष्य कृत्रिम गर्भाधान और भ्रूण हस्तांतरण सहित सहायक प्रजनन तकनीकों के लिए छद्म गर्भवती महिलाओं की पीढ़ी में नर चूहों के उपयोग को प्रतिस्थापित करना है।

यहां वर्णित सीएम प्रोटोकॉल को पहली बार चूहों में कृत्रिम गर्भाधान के साथ सहायता के लिए विकसित किया गया था। कृत्रिम गर्भाधान प्रोटोकॉल, जैसा कि मूल रूप से वर्णित है, ने 50% की गर्भावस्था दर हासिल की, जिसमें 7 पिल्ले3 के औसत कूड़े का आकार था। सीडी 1 प्राप्तकर्ता चूहों को गर्भाधान से पहले 47 घंटे के अंतराल पर गर्भवती घोड़ी सीरम गोनाडोट्रोपिन (पीएमएसजी) और मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी) सहित हार्मोन की कम खुराक के साथ सिंक्रनाइज़ किया गया था। एस्ट्रस सिंक्रनाइज़ेशन का एक लाभ यह था कि इसने सामान्य कामकाजी घंटों के दौरान प्रोटोकॉल के उपयोग की अनुमति दी। कृत्रिम गर्भाधान के तुरंत बाद मादाओं को वैसक्टोमाइज्ड पुरुषों के साथ जोड़ा गया था, और संभोग की पुष्टि एक कॉपुलेशन प्लग की उपस्थिति से की गई थी। प्राप्तकर्ताओं के साथ संभोग दर में असंगति को प्रक्रिया में कठिनाई के रूप में रिपोर्ट किया गया था। इसलिए, छद्म गर्भावस्था के प्रेरण के लिए संभोग के विकल्प मांगे गए थे।

वर्तमान अध्ययन छद्म गर्भवती महिलाओं के उत्पादन की दक्षता बढ़ाने के लिए एक मानकीकृत सीएम तकनीक प्रस्तुत करता है। एस्ट्रस या प्रोस्ट्रस में महिलाओं के लिए, एक छोटी प्लास्टिक रॉड के कुंद छोर को गर्भाशय ग्रीवा से संपर्क करने के लिए योनि से डाला जाता है और ट्रिमर के संपर्क में आने से 30 सेकंड तक कंपन होता है। प्रक्रिया एक तार-शीर्ष पिंजरे पर की जाती है। कोई संज्ञाहरण या एनाल्जेसिया की आवश्यकता नहीं है। सीएम तकनीक छद्म गर्भवती महिलाओं के उत्पादन के लिए सुविधाजनक है, जो गैर-सर्जिकल कृत्रिम गर्भाधान के बाद वासटोमाइज्ड पुरुषों के साथ संभोग की आवश्यकता के बिना कूड़े का उत्पादन कर सकती है। सीएम का उपयोग भ्रूण हस्तांतरण के प्राप्तकर्ताओं के रूप में छद्म गर्भवती महिलाओं के उत्पादन के लिए भी किया जा सकता है। विशेष रूप से, सीएम तकनीक को गैर-सर्जिकल भ्रूण स्थानांतरण के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसा कि यहां वर्णित है। चूहों 4,5 और चूहों 6,7 में ब्लास्टोसिस्ट चरण भ्रूण के भ्रूण हस्तांतरण के लिए गैर-शल्य चिकित्सा विधियों को प्रभावी दिखाया गया है। चूंकि यह गैर-शल्य चिकित्सा विधि शल्य चिकित्सा विधियों का एक प्रभावी विकल्प है, इसलिए इसे तकनीक का 3आरएस शोधन माना जाता है। पिछले शोध के आधार पर, तनाव के उपाय के रूप में फेकल कॉर्टिकोस्टेरोन का स्तर इंगित करता है कि प्रक्रिया की गैर-सर्जिकल प्रकृति कृन्तकों में तनाव के स्तर में वृद्धि नहीं करतीहै 7,8. प्रक्रियाएं सर्जिकल भ्रूण हस्तांतरण की तुलना में कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं और प्रदर्शन करने के लिए बहुत तेज हैं। चूंकि भ्रूण को गर्भाशय में स्थानांतरित किया जाता है, इसलिए गर्भाशय के विकास के लिए सही चरण के भ्रूण को स्थानांतरित किया जाना चाहिए। चूहों के लिए, ब्लास्टोसिस्ट को 2.5 दिनों के पोस्ट कोइटम (डीपीसी) स्यूडोप्रेग्नेंट प्राप्तकर्ताओं में स्थानांतरित कर दिया जाता है।

यहां वर्णित दो गैर-शल्य चिकित्सा तकनीकों के लिए, हार्मोन प्रशासन और सीएम तकनीक का समय भिन्न होता है। एस्ट्रस के सापेक्ष सीएम प्रक्रिया का समय सफलता के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह छद्म गर्भवती प्राप्तकर्ताओं के उत्पादन के लिए प्राकृतिक संभोग को प्रतिस्थापित करता है। छद्म गर्भावस्था को प्रेरित करने के लिए वैसक्टोमाइज्ड पुरुषों की आवश्यकता को समाप्त करके, यह प्रक्रिया आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करने और शल्य चिकित्सा से परिवर्तित पुरुषों की आवश्यकता को समाप्त करके 3आर लाभ प्रदान करती है। प्रक्रिया स्वयं त्वरित (30 एस) है और संज्ञाहरण या एनाल्जेसिया की आवश्यकता नहीं है। तकनीक सहायक प्रजनन के लिए छद्म गर्भवती महिलाओं के उत्पादन की विश्वसनीयता और पूर्वानुमान को बढ़ाती है।

Protocol

जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए सभी लागू अंतरराष्ट्रीय, राष्ट्रीय और संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन किया गया। जानवरों से जुड़े अध्ययनों में की गई सभी प्रक्रियाएं पैराटेक कॉर्पोरेशन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के नैतिक मानकों के अनुसार थीं और प्रयोगशाला पशु कल्याण कार्यालय, राष्ट्रीय स्वास्थ्य, सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा, संयुक्त राज्य अमेरिका के स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग द्वारा निर्धारित मानकों के तहत आयोजित की गई थीं। वर्तमान अध्ययन के लिए >8 सप्ताह की आयु के नर और मादा सीडी 1 (आईसीआर) और मादा सी 57बीएल / 6 जे चूहों का उपयोग किया गया था। जानवरों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. सीडी 1 चूहों में कृत्रिम गर्भाधान के साथ उपयोग के लिए ग्रीवा हेरफेर प्रक्रिया।

  1. दिन 1 और दिन 3 पर मादा चूहों का सिंक्रनाइज़ ओव्यूलेशन
    1. विवेरियम अंधेरे चक्र की शुरुआत से 0.5 घंटे पहले दिन 1, 0.5 घंटे पर इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन (आईपी) द्वारा 2.5 आईयू पीएमएसजी ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ मादा चूहों को इंजेक्ट करें।
      नोट: प्रत्येक पुरुष दाता 10 महिला प्राप्तकर्ताओं के लिए पर्याप्त शुक्राणु प्रदान करेगा।
    2. विवेरियम अंधेरे चक्र की शुरुआत से 1 घंटे पहले दिन 3 पर आईपी इंजेक्शन द्वारा 2.5 आईयू एचसीजी ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ महिलाओं को इंजेक्ट करें।
      नोट: एक दूसरे के सापेक्ष इंजेक्शन, शुक्राणु हस्तांतरण और प्रकाश चक्र का समय बहुत महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में सभी प्रक्रियाओं के लिए निर्दिष्ट समय 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र पर आधारित हैं।
  2. चौथे दिन ताजा शुक्राणु का संग्रह और कैपेसाइटेशन
    1. पैराफिन तेल के तहत 60 मिमी ऊतक संवर्धन डिश में पूर्व-इनक्यूबेशन माध्यम (पीएम, सामग्री की तालिका देखें) की 500 μL बूंद तैयार करें। प्रति पुरुष दाता एक पकवान तैयार करें। शुक्राणु संग्रह से पहले 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर कम से कम 30 मिनट के लिए समतुल्यता।
    2. विवेरियम प्रकाश चक्र की शुरुआत के 1 घंटे बाद, संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार पुरुष (ओं) को इच्छामृत्यु दें। प्रत्येक पुरुष 10 कृत्रिम गर्भाधान के लिए पर्याप्त शुक्राणु प्रदान करेगा।
    3. माउस से कौडा एपिडीडिमाइड्स को जल्दी से विच्छेदित करें। विच्छेदन कैंची और टूथेड बल का उपयोग करके मूत्राशय के ऊपर एक अनुप्रस्थ पेट चीरा करें।
      1. वृषण वसा पैड मूत्राशय के दोनों ओर स्थित होते हैं। घुमावदार बल के साथ वृषण वसा पैड में से एक को पकड़ें, और शरीर की गुहा से वृषण और एपिडीडिमिस को हटा दें। टेस्टिस के ठीक नीचे एक सपाट अंडाकार ट्यूबलर संरचना के रूप में कौडा एपिडीडिमिस की पहचान करें।
      2. घुमावदार बल के साथ कौडा एपिडीडिमिस को पकड़ें, और छोटी, कोण वाली कैंची का उपयोग करके बचाव करें। दोनों कौडा एपिडीडिमाइड्स को हटा दें, और उन्हें विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत वसा और रक्त को हटाने के लिए एक शोषक ऊतक में स्थानांतरित करें।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन तेल के नीचे समतुल्य पीएम की प्रत्येक 500 μL बूंद में दो कौडा एपिडीडिमाइड रखें। छोटी कैंची का उपयोग करके छह चीरे लगाकर ऊतक को काटें। यदि एक से अधिक पुरुष दाता का उपयोग किया जाता है, तो नमूनों के बीच भिन्नता को कम करने के लिए प्रत्येक शुक्राणु नमूने के लिए प्रत्येक दाता से एक एपिडीडिमिस का उपयोग करें।
    5. धीरे से पकवान को घुमाएं, और शुक्राणु को प्रति मिनट एक बार घूमते हुए 3 मिनट के लिए ऊतक से बाहर निकलने की अनुमति दें। सभी ऊतकों को हटा दें।
    6. शुक्राणु के नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट से 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें और कैपेसिटेट करने के लिए 5% सीओ2 ।
    7. वैकल्पिक: शुक्राणुओं की संख्या को मापें, और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के तहत गतिशीलता का आकलन करें। गिनती के लिए, शुक्राणु को आवश्यकतानुसार पीएम में पतला करें।
  3. साइटोलॉजिकल मूल्यांकन द्वारा एस्ट्रस चक्र सिंक्रनाइज़ेशन की पुष्टि
    1. एक छोटे, पूर्व-नम स्वैब (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके, ऊतक के खिलाफ स्वैब को घुमाकर योनि की दीवार से योनि कोशिकाओं को धीरे से इकट्ठा करें, उन्हें माइक्रोस्कोप स्लाइड पर बाँझ पानी की 20 μL बूंद में स्मीयर करें, और हवा से सूखें।
    2. उज्ज्वल-क्षेत्र रोशनी के साथ 100x आवर्धन का उपयोग करके एक माइक्रोस्कोप के तहत, कॉर्निफाइड उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन करें। एस्ट्रस या देर से प्रोस्ट्रस में मादाओं में कॉर्निफाइड उपकला कोशिकाएं मौजूद होंगी और उन्हें गर्भाशय ग्रीवा के हेरफेर के लिए चुना जाना चाहिए।
    3. वैकल्पिक: गर्भाधान से पहले महिला प्राप्तकर्ताओं का वजन रिकॉर्ड करें।
  4. गर्भाशय ग्रीवा हेरफेर (सीएम) का प्रदर्शन
    1. गर्भाधान से लगभग 0.5 घंटे पहले, एक प्राप्तकर्ता मादा को एक तार रैक के साथ पिंजरे के शीर्ष पर रखें, जिससे माउस पिंजरे बार की सतह को "पकड़" सके। अंगूठे और फोरफिंगर का उपयोग करके पूंछ के आधार के पास पकड़ें और जानवर को स्थिर करते हुए पूंछ को ऊपर की ओर घुमाएं (चित्र 1)।
      नोट: जब हैंडलिंग तकनीक सही ढंग से की जाती है तो माउस प्रक्रिया की अवधि के लिए स्थिर रहेगा। यदि माउस स्थिति से बाहर निकलता है, तो धीरे से पुनर्स्थापित करें और जारी रखें। यदि एक आक्रामक जानवर को प्राप्तकर्ता के रूप में चुना जाता है, तो प्रक्रिया के दौरान जानवर को संवर्धन सुरंग में कदम रखने की अनुमति देना शांत हो सकता है। सुरंग का उपयोग करना वैकल्पिक है, लेकिन यह इस प्रक्रिया के दौरान व्याकुलता प्रदान करके जानवरों को संभालने में शोधकर्ताओं की सहायता कर सकता है।
    2. गर्भाशय ग्रीवा के संपर्क में आने के लिए योनि से एक छोटी प्लास्टिक रॉड (सामग्री की तालिका देखें) के कुंद सिरे को डालें, और ट्रिमर के संपर्क में 30 सेकंड तक कंपन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: ट्रिमर शुरू करने से पहले रॉड को स्थिति में रखें। प्रक्रिया के दौरान दोनों को एक हाथ में पकड़ लिया जाता है। कोई संज्ञाहरण या एनाल्जेसिया की आवश्यकता नहीं है।
  5. कृत्रिम गर्भाधान के लिए गैर-सर्जिकल शुक्राणु हस्तांतरण
    1. गर्भाधान उपकरण (सामग्री की तालिका देखें) को P200 पिपेट पर 40 μL पर सेट करें, और सुरक्षात्मक कवर को हटा दें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर डिश से कैपेसिटेटेड शुक्राणु के नमूने का एक एलिकोट निकालें, और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर तेल के बिना 35 मिमी ऊतक संस्कृति डिश में स्थानांतरित करें। शुक्राणु के नमूने को स्थानांतरण के लिए तुरंत उपयोग किया जाएगा।
      नोट: शुक्राणु सीओ2 इनक्यूबेटर के बाहर तेजी से गतिशीलता खो देगा। कैपेसिटेटेड शुक्राणु के नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर जितना संभव हो उतना रखें।
    3. पिपेट प्लंजर को पहले स्टॉप पर दबाएं, कैथेटर टिप को 37 डिग्री सेल्सियस पर शुक्राणु के नमूने में कम करें, और धीरे-धीरे शुक्राणु को ट्रांसफर डिवाइस में लोड करें। किसी भी झुरमुट से बचें। एक शोषक ऊतक का उपयोग करके गर्भाधान उपकरण के बाहरी हिस्से से अवशिष्ट तेल निकालें। पिपेट को एक तरफ रख दें।
      नोट: गर्भाशय के सींग में पैराफिन तेल के हस्तांतरण से बचा जाना चाहिए। एक शोषक ऊतक का उपयोग करके गर्भाधान उपकरण के बाहरी हिस्से से अवशिष्ट तेल निकालें।
    4. प्राप्तकर्ता मादा को वायर रैक पिंजरे के शीर्ष पर रखें। सीएम के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही हैंडलिंग तकनीक का उपयोग करके माउस को स्थिति में रखें; अंगूठे और फोरफिंगर का उपयोग करके पूंछ के आधार के पास पकड़ें, और जानवर को स्थिर करते हुए पूंछ को ऊपर की ओर घुमाएं।
    5. योनि में छोटे स्पेकुलम ( सामग्री की तालिका देखें) रखें।
    6. गर्भाधान उपकरण कैथेटर को स्पेकुलम में, गर्भाशय ग्रीवा के माध्यम से और गर्भाशय में डालें। एक बार जब डिवाइस हब स्पेकुलम से संपर्क करता है, तो पिपेट प्लंजर को पहले स्टॉप पर दबाकर शुक्राणु को वितरित करें। गर्भाशय के सींग में अतिरिक्त हवा के हस्तांतरण से बचें।
      नोट: यदि कैथेटर को सही ढंग से तैनात नहीं किया जाता है, तो यह गर्भाशय ग्रीवा के आसपास के ऊतक से टकराएगा, जिससे यह फ्लेक्स हो जाएगा और अंततः झुक जाएगा। यदि कैथेटर पहले प्रयास में गर्भाशय ग्रीवा के माध्यम से नहीं निकलता है, तो कैथेटर को धीरे से वापस बाहर निकालें, और सफल होने तक पुन: प्रयास करें। स्पेकुलम की पुनर्स्थापना आवश्यक हो सकती है।
    7. डिवाइस और स्पेकुलम को हटा दें। प्रक्रिया के बाद किसी निगरानी की आवश्यकता नहीं है।
  6. वैकल्पिक: 10-12 दिनों में गर्भावस्था की जांच
    1. गर्भावस्था की स्थिति निर्धारित करने के लिए वजन बढ़ाने का उपयोग करें। वजन बढ़ना तनाव पर निर्भर होगा, लेकिन कम से कम 1-2 ग्राम की वृद्धि गर्भावस्था से संबंधित है।

Figure 1
चित्रा 1: गर्भाशय ग्रीवा हेरफेर के लिए माउस-होल्डिंग तकनीक। माउस एक तार पिंजरे के शीर्ष पर टिका होता है और पूंछ पर और पिछले पैरों के सामने दोनों तरफ स्थिर होता है। एक छोटी प्लास्टिक रॉड के कुंद सिरे को गर्भाशय ग्रीवा से संपर्क करने के लिए योनि से डाला जाता है और ट्रिमर के संपर्क से कंपन होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. सीडी 1 चूहों में गर्भाशय ग्रीवा हेरफेर के साथ उपयोग के लिए गैर-सर्जिकल भ्रूण स्थानांतरण प्रक्रिया।

  1. दिन 1 और दिन 3 पर मादा चूहों का सिंक्रनाइज़ ओव्यूलेशन
    1. विवेरियम प्रकाश चक्र की शुरुआत के लगभग 6 घंटे बाद, दिन 1 पर आईपी इंजेक्शन द्वारा 2.5 आईयू पीएमएसजी के साथ मादा चूहों को इंजेक्ट करें।
    2. महिलाओं को तीसरे दिन आईपी इंजेक्शन द्वारा 2.5 आईयू एचसीजी के साथ इंजेक्ट करें, पीएमएसजी इंजेक्शन के बाद 47 घंटे के अंतराल पर या विवेरियम प्रकाश चक्र की शुरुआत के लगभग 5 घंटे बाद।
  2. साइटोलॉजिकल मूल्यांकन द्वारा एस्ट्रस चक्र सिंक्रनाइज़ेशन की पुष्टि करना।
    1. दिन 3 पर, सीएम से लगभग 1 घंटे पहले, संभावित प्राप्तकर्ताओं पर कोशिका विज्ञान करें। एक छोटे, पूर्व-नम स्वैब का उपयोग करके, ऊतक के खिलाफ स्वैब को घुमाकर योनि की दीवार से योनि कोशिकाओं को धीरे से इकट्ठा करें, उन्हें माइक्रोस्कोप स्लाइड पर बाँझ पानी की 20 μL बूंद में स्मीयर करें, और हवा से सूखें।
    2. उज्ज्वल-क्षेत्र रोशनी के साथ 100x आवर्धन का उपयोग करके एक माइक्रोस्कोप के तहत, कॉर्निफाइड उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन करें। एस्ट्रस या देर से प्रोस्ट्रस में मादाओं में कॉर्निफाइड उपकला कोशिकाएं मौजूद होंगी और उन्हें गर्भाशय ग्रीवा के हेरफेर के लिए चुना जाना चाहिए।
    3. वैकल्पिक: संभावित महिला भ्रूण प्राप्तकर्ताओं के वजन को रिकॉर्ड करें।
  3. सीएम का प्रदर्शन
    1. विवेरियम अंधेरे चक्र की शुरुआत से 1 घंटे पहले, एक प्राप्तकर्ता मादा को एक तार रैक के साथ पिंजरे के शीर्ष पर रखें, जिससे जानवर पिंजरे बार की सतह को "पकड़" सके। फोरफिंगर और अंगूठे का उपयोग करके पूंछ के आधार के पास पकड़ें, और फिर जानवर को स्थिर करते हुए पूंछ को ऊपर की ओर घुमाएं (चित्र 1)।
      नोट: जब हैंडलिंग तकनीक सही ढंग से की जाती है तो माउस प्रक्रिया की अवधि के लिए स्थिर रहेगा। यदि माउस स्थिति से बाहर निकलता है, तो धीरे से पुनर्स्थापित करें, और जारी रखें। यदि एक आक्रामक जानवर को प्राप्तकर्ता के रूप में चुना जाता है, तो प्रक्रिया के दौरान जानवर को संवर्धन सुरंग में कदम रखने की अनुमति देना शांत हो सकता है।
    2. गर्भाशय ग्रीवा से संपर्क करने के लिए योनि से एक छोटी प्लास्टिक रॉड के कुंद सिरे को डालें, और ट्रिमर के संपर्क में 30 सेकंड तक कंपन करें।
      नोट: ट्रिमर शुरू करने से पहले रॉड को स्थिति में रखें। प्रक्रिया के दौरान दोनों को एक हाथ में पकड़ लिया जाता है। कोई संज्ञाहरण या एनाल्जेसिया की आवश्यकता नहीं है।
  4. दिन 6 पर गैर-सर्जिकल भ्रूण स्थानांतरण
    1. ऊतक संवर्धन डिश के ढक्कन पर एम 2 माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) की 20 μL बूंद रखें।
      नोट: ढक्कन चुना जाता है क्योंकि इसमें एक छोटा रिम होता है और इस प्रकार, बूंद में भ्रूण तक पहुंचने के लिए सुविधाजनक होता है। किसी भी समय एम 2 की बूंद पर पैराफिन तेल की परत न लगाएं, क्योंकि गर्भाशय के सींग में तेल पेश करने से भ्रूण हस्तांतरण नकारात्मक रूप से प्रभावित होता है।
    2. एक माइक्रोस्कोप के तहत और चिंतनशील प्रकाश व्यवस्था का उपयोग करके, एक मानक भ्रूण हैंडलिंग पिपेट का उपयोग करके मध्यम बूंद में 10-20 ब्लास्टोसिस्ट लोड करें (सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: स्थानांतरित करने के लिए भ्रूण की इष्टतम संख्या माउस तनाव और भ्रूण के किसी भी जोड़तोड़ पर निर्भर करती है। स्वस्थ अनमैनिपुलेटेड भ्रूण के लिए, 10-15 भ्रूण को स्थानांतरित करना पर्याप्त होना चाहिए। पुनर्व्युत्पत्ति या आनुवंशिक रूप से संशोधित भ्रूण के लिए, अधिक भ्रूण का हस्तांतरण उचित है।
    3. गैर-सर्जिकल भ्रूण स्थानांतरण उपकरण (सामग्री की तालिका देखें) को 1.8 μL पर सेट किए गए P2 पिपेट पर सुरक्षित करें। सुरक्षात्मक कैथेटर कवर को हटा दें।
    4. पिपेट के प्लंजर को पहले स्टॉप पर दबाएं, कैथेटर की नोक को माध्यम में कम करें, और धीरे-धीरे भ्रूण को डिवाइस के कैथेटर टिप में खींचें। टिप को माध्यम से हटा दें।
      नोट: कम आवर्धन के तहत भ्रूण की कल्पना करना डिवाइस में भ्रूण के आसान लोडिंग की अनुमति देगा। यदि भ्रूण बूंद में बिखरे हुए हैं, तो बूंद के केंद्र में भ्रूण को केंद्रित करने के लिए पकवान को धीरे से एक तरफ से हिलाएं, या भ्रूण को संभालने वाले पिपेट का उपयोग करके उन्हें पुनर्स्थापित करें।
    5. कैथेटर की नोक पर एक छोटा सा एयर बबल उत्पन्न करने के लिए पिपेट वॉल्यूम को 2.0 μL पर सेट करें। माउस पिंजरे के पास लोड किए गए भ्रूण के साथ धीरे से पिपेट बिछाएं।
    6. प्राप्तकर्ता मादा को वायर रैक पिंजरे के शीर्ष पर रखें। सीएम के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही हैंडलिंग तकनीक का उपयोग करके माउस को स्थिति में रखें; फोरफिंगर और अंगूठे का उपयोग करके पूंछ के आधार के पास पकड़ें, और फिर जानवर को स्थिर करते हुए पूंछ को ऊपर की ओर घुमाएं।
    7. योनि में एक छोटा सा स्पेकुलम (सामग्री की तालिका देखें) रखें।
    8. स्थानांतरण उपकरण कैथेटर को स्पेकुलम में, गर्भाशय ग्रीवा के माध्यम से और गर्भाशय में डालें। एक बार जब डिवाइस हब स्पेकुलम से संपर्क करता है, तो पिपेट प्लंजर को पहले स्टॉप पर दबाकर भ्रूण को वितरित करें। गर्भाशय के सींग में अतिरिक्त हवा के हस्तांतरण से बचें।
    9. पिपेट प्लंजर को जारी किए बिना, डिवाइस और स्पेकुलम को हटा दें। प्रक्रिया के बाद किसी निगरानी की आवश्यकता नहीं है।

Representative Results

चूंकि चूहों में छद्म गर्भावस्था को प्रेरित करने के लिए विद्युत9 और सोनिक10 ग्रीवा उत्तेजना का उपयोग किया गया है, यह काम एक मानकीकृत यांत्रिक प्रक्रिया प्रस्तुत करता है जिसका उपयोग चूहों में किया जा सकता है। योनि कोशिका विज्ञान विभिन्न चरणों में महिलाओं की पहचान में सहायता कर सकता है। महिलाओं में छद्म गर्भावस्था की पुष्टि करने के लिए, यह एक ही विधि नियोजित की गई थी। सबसे पहले, महिलाओं के लिए साइटोलॉजी प्रोफाइल की तुलना सीडी 1 और सी 57बीएल /6 चूहों के लिए गर्भावस्था के दौरान, गर्भावस्था के दौरान, और संभोग या सीएम द्वारा प्रेरित छद्म गर्भावस्था के दौरान की गई थी। कोशिकाओं को उज्ज्वल-क्षेत्र रोशनी के साथ 100x आवर्धन के तहत देखा गया था। देखी गई कोशिकाओं में ल्यूकोसाइट्स, न्यूक्लियेटेड एपिथेलियल कोशिकाएं और एन्यूक्लियेट कॉर्निफाइड एपिथेलियल कोशिकाएं शामिल थीं। एस्ट्रस चक्र चरण का निर्धारण प्रत्येक सेल प्रकार11,12 के सापेक्ष प्रतिशत पर आधारित था। एस्ट्रस को कॉर्निफाइड उपकला कोशिकाओं की प्रबलता की विशेषता है। जैसे ही एस्ट्रस समाप्त होता है, मेटेस्टरस शुरू होता है, और ल्यूकोसाइट्स दिखाई देने लगते हैं, जबकि कॉर्निफाइड उपकला कोशिकाएं कम स्पष्ट हो जाती हैं। डायस्ट्रस में मध्यम से निम्न कोशिकीयता होती है, जिसमें ल्यूकोसाइट्स प्रीडोमिनेटिंग और न्यूक्लियेटेड एपिथेलियल कोशिकाएं दिखाई देने लगती हैं। प्रोस्ट्रस ल्यूकोसाइट्स के नुकसान, न्यूक्लियेटेड उपकला कोशिकाओं में वृद्धि और कॉर्निफाइड उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति से प्रतिष्ठित है। प्रोस्ट्रस के बाद, एस्ट्रस शुरू होता है, और चक्र जारी रहता है।

बेसलाइन प्रोफाइल विकसित करने के लिए, संभोग से पहले प्रत्येक महिला के लिए कम से कम दो पूर्ण एस्ट्रस चक्रों (सीडी 1 के लिए एन = 20, सी 57बीएल /6 के लिए एन = 20) के लिए योनि कोशिका विज्ञान दर्ज किया गया था। चूहों के बीच चक्र की लंबाई और व्यक्तिगत प्रोफाइल भिन्न थे; हालांकि, अपेक्षित सामान्य रुझान देखे गए थे। सीडी 1 और सी 57बीएल / 6 चूहों के लिए एक एस्ट्रस चक्र की औसत लंबाई 3.8 दिन थी, जिसमें 3-5 दिनों की सीमा थी। प्राकृतिक संभोग होने से एक दिन पहले, सभी मादा चूहे प्रोस्ट्रस में थे। संभोग के बाद, साइटोलॉजी को कोइटम (डीपीसी) के 1.5 दिन बाद फिर से किया गया जब तक कि एस्ट्रस साइक्लिंग फिर से शुरू नहीं हुई। चित्र 2 स्यूडोप्रेग्नेंट सीडी 1 और सी 57बीएल /6 महिलाओं के लिए साइटोलॉजिकल प्रोफाइल दिखाता है जो वैसक्टोमाइज्ड पुरुषों के साथ जुड़ा हुआ है।

Figure 2
चित्रा 2: छद्म गर्भवती महिला चूहों के लिए साइटोलॉजिकल प्रोफाइल। ल्यूकोसाइट्स, न्यूक्लियेटेड एपिथेलियल कोशिकाओं और कॉर्निफाइड एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए प्रत्येक सेल प्रकार के औसत प्रतिशत को (ए) सीडी 1 (एन = 20) और (बी) सी 57बीएल /6 (एन = 20) चूहों के लिए कोइटम (डीपीसी) के दिनों के कार्य के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इस काम में, छद्म गर्भवती महिलाओं के उत्पादन की दक्षता बढ़ाने के लिए एक सीएम तकनीक का मानकीकरण किया गया है। एस्ट्रस या प्रोस्ट्रस में महिलाओं के लिए, एक छोटी प्लास्टिक रॉड के कुंद छोर को गर्भाशय ग्रीवा से संपर्क करने के लिए योनि से डाला जाता है और ट्रिमर के संपर्क में आने से 30 सेकंड तक कंपन होता है। प्रक्रिया एक तार-शीर्ष पिंजरे पर की जाती है। कोई संज्ञाहरण या एनाल्जेसिया की आवश्यकता नहीं है। सीएम प्रक्रिया की प्रभावशीलता निर्धारित करने के लिए, योनि कोशिका विज्ञान की तुलना महिला सीडी 1 (एन = 20) और सी 57बीएल /6 (एन = 20) चूहों के लिए वासनयुक्त पुरुषों के साथ संभोग के बाद और सीएम (कुल एन = 40) के बाद की गई थी। सीएम द्वारा प्रेरित स्यूडोप्रेग्नेंसी की साइटोलॉजिकल प्रोफाइल संभोग से प्रेरित स्यूडोप्रेगनेंसी की प्रोफाइल के समान थी, जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है।

Figure 3
चित्रा 3: गर्भाशय ग्रीवा हेरफेर (सीएम) के बाद छद्म गर्भवती महिला चूहों के लिए साइटोलॉजिकल प्रोफाइल। ल्यूकोसाइट्स, न्यूक्लियेटेड एपिथेलियल कोशिकाओं और कॉर्निफाइड एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए प्रत्येक सेल प्रकार का प्रतिशत कोइटम (डीपीसी) या गर्भाशय ग्रीवा हेरफेर (डीपीसीएम) के दिनों के बाद के कार्य के रूप में दिखाया गया है। औसत सेल प्रकार प्रतिशत CD1 और C57Bl/6 चूहों (N = 40) (A) के लिए दिखाया गया है जो वैसक्टोमाइज्ड पुरुषों के साथ जुड़ा हुआ है या (B) CM के बाद है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या सीएम तकनीक सहायक प्रजनन के लिए गर्भावस्था स्थापित करने के लिए पर्याप्त है, सीएम को सीडी 1 महिलाओं में गैर-सर्जिकल कृत्रिम गर्भाधान (एनएसएआई) प्रोटोकॉल के हिस्से के रूप में किया गया था। कृत्रिम गर्भाधान प्रोटोकॉल में शुक्राणु हस्तांतरण से पहले हार्मोन पीएमएसजी और एचसीजी की कम खुराक के साथ महिलाओं का एस्ट्रस सिंक्रनाइज़ेशन शामिल था। शुक्राणु हस्तांतरण से ठीक पहले सीएम किया गया था। सीडी 1 चूहों के लिए, इस तकनीक के साथ एस्ट्रस (एन = 76) में महिलाओं के लिए सीएम का उपयोग करके स्यूडोप्रेग्नेंसी प्रेरण की दक्षता 83% थी। एक नियंत्रण प्रयोग में, एस्ट्रस में केवल 38% महिलाओं को वैसक्टोमाइज्ड पुरुषों (एन = 24) द्वारा प्लग किया गया था। गर्भाशय ग्रीवा हेरफेर (एन = 76) प्राप्त करने वाले कृत्रिम गर्भाधान प्राप्तकर्ताओं में 72% गर्भावस्था दर और 8.3 पिल्ले का औसत कूड़े का आकार था। इस प्रकार, सीएम द्वारा स्यूडोप्रेग्नेंसी का प्रेरण एनएसएआई करते समय एक पुरुष के साथ संभोग के लिए एक सुविधाजनक और कुशल प्रतिस्थापन है। ताजा सीडी 1 ब्लास्टोसिस्ट के गैर-सर्जिकल भ्रूण हस्तांतरण के लिए एस्ट्रस में सीडी 1 प्राप्तकर्ताओं (एन = 4) को तैयार करने के लिए सीएम का उपयोग करने के परिणामस्वरूप 100% गर्भावस्था दर हुई। 9-15 भ्रूणों के हस्तांतरण से 45% जन्म दर और 6 पिल्ले के औसत कूड़े के आकार के साथ तीन स्वस्थ कूड़े मिले। इसकी तुलना में, सीडी 1 प्राप्तकर्ता (एन = 20) जिन्हें छद्म गर्भावस्था को प्रेरित करने के लिए वैसक्टोमाइज्ड पुरुषों के साथ जोड़ा गया था, उनमें 20 ताजा बी 6 सी 3 एफ 2 ब्लास्टोसिस्ट के हस्तांतरण के बाद 80% गर्भावस्था दर और 46% जन्म दर थी।

सहायक प्रजनन तकनीकों के परिणाम संभवतः तनाव-विशिष्ट होंगे, क्योंकि सुपरओव्यूलेशन के लिए हार्मोन प्रशासन की खुराक और समय जैसे चरतनाव-निर्भर पाए गए हैं। इसके अलावा, प्राप्तकर्ता की उम्र और वजन जैसे कारक हार्मोन14 की प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं। इस काम में, कृत्रिम गर्भाधान के लिए सीएम प्रक्रिया करते समय, केवल देर से प्रोस्ट्रस या एस्ट्रस में महिलाओं को उत्तरदायी पाया गया। सामान्य तौर पर, आबादी में उपलब्ध प्राप्तकर्ताओं की संख्या बढ़ाने के लिए, महिलाओं को पहले हार्मोन3 की कम खुराक के साथ सिंक्रनाइज़ किया जाता है। पीएमएसजी और एचसीजी के 2.5 आईयू के साथ एस्ट्रस सिंक्रनाइज़ेशन इस काम में 11-14 सप्ताह की सीडी 1 महिलाओं (एन = 27) के लिए 78% प्रभावी था और 18-32 सप्ताह की सी 57बीएल /6 महिलाओं (एन = 22) के लिए 60% प्रभावी था। सीडी 1 महिलाओं पर गर्भाशय ग्रीवा हेरफेर का उपयोग करके स्यूडोप्रेग्नेंसी प्रेरण की दक्षता इस तकनीक के साथ एस्ट्रस (एन = 76) में महिलाओं के लिए 83% और सी 57बीएल /6 महिलाओं के लिए 82% (एन = 100) थी।

Discussion

3आर अनुसंधान में पशु उपयोग के लिए एक नैतिक ढांचा है, जैसा कि 1959 में रसेल और बर्च द्वारा "मानवीय प्रायोगिक तकनीक के सिद्धांत" 15 में वर्णित है। 3आर पशु उपयोग में प्रतिस्थापन, कमी और शोधन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यहां हाइलाइट किए गए प्रोटोकॉल 3आर के साथ संरेखण में हैं। गर्भाशय ग्रीवा हेरफेर तकनीक अब छद्म गर्भवती महिलाओं का उत्पादन करने के लिए पुरुषों के उपयोग की आवश्यकता नहीं होने से आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करती है। तकनीक पुरुषों पर नसबंदी करने की आवश्यकता को भी समाप्त करती है, इस प्रकार दर्द और संकट को कम करके शोधन प्रदान करती है। यहां वर्णित सहायक प्रजनन तकनीक (कृत्रिम गर्भाधान और भ्रूण हस्तांतरण) गैर-शल्य चिकित्सा हैं, और इस प्रकार, दोनों अपने शल्य चिकित्सा विकल्पों के कारण दर्द और संकटकोकम करके 3आर शोधन प्रदान करते हैं।

चूहों में सहायक प्रजनन करते समय पिल्ले की वसूली के लिए छद्म गर्भवती मादाओं का उपयोग आवश्यक है। सीएम प्रक्रिया छद्म गर्भवती महिलाओं के उत्पादन के लिए एक प्रभावी तरीका है, लेकिन प्राप्तकर्ता महिलाओं के एस्ट्रस चक्र के चरण का सिंक्रनाइज़ेशन प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है। एस्ट्रस सिंक्रनाइज़ेशन संभावित प्राप्तकर्ताओं को तैयार करने के लिए कॉलोनी में आवश्यक महिलाओं की संख्या को काफी कम कर सकता है और मांग पर समयबद्ध छद्म गर्भवती महिलाओं के उत्पादन में सहायता कर सकता है। हार्मोन की कम खुराक का उपयोग सीडी 1 चूहों में जीवित कूड़े की वसूली पर कोई हानिकारक प्रभाव नहीं डालता है। हार्मोन और एकाग्रता संयोजन को खोजने के लिए अन्य उपभेदों के साथ देखभाल की जानी चाहिए जो भ्रूण या शुक्राणु स्थानांतरित के लिए सबसे अच्छी गुणवत्ता वाली प्राप्तकर्ता महिलाओं का उत्पादन करती है। पीएमएसजी और एचसीजी16 का उपयोग करके सिंक्रनाइज़ेशन प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन सुपरवुलेटेड महिलाओं का उत्पादन करने वाली खुराक निरंतर गर्भावस्थाके लिए उपयुक्त नहीं हो सकती है।

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एक महिला एस्ट्रस में है, इस काम में एक साइटोलॉजिकल मूल्यांकन किया गया था। योनि के उद्घाटन11,18 के अवलोकन से एस्ट्रस चरण का भी मूल्यांकन किया जा सकता है। हालांकि यह विधि बेहद उपयोगी है और इसका उपयोग स्वयं या पुष्टि के रूप में किया जा सकता है, यह कोशिका विज्ञान के उपयोग से अधिक व्यक्तिपरक है। धुंधला होने के बिना योनि कोशिका विज्ञान एस्ट्रस में महिलाओं को चुनने के लिए तेजी से और प्रभावी दोनों है क्योंकि कॉर्निफाइड उपकला कोशिकाओं को आसानी से पहचाना जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, संभावित प्राप्तकर्ताओं को निर्धारित करने के लिए सीएम से पहले साइटोलॉजिकल मूल्यांकन किया जाता है। सीएम से पहले कोशिका विज्ञान करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि प्रक्रिया योनि क्षेत्र से कोशिकाओं को विभाजित करती है, इस प्रकार पहचान मुश्किल हो जाती है। स्यूडोप्रेग्नेंसी या गर्भावस्था के लिए साइटोलॉजिकल मूल्यांकन लगातार 3 दिनों के लिए सीएम (डीपीसीएम) के बाद 3.5-11.5 दिनों में किया जा सकता है। एक एस्ट्रस साइक्लिंग मादा की प्रोफ़ाइल में कॉर्निफाइड एपिथेलियल कोशिकाओं की काफी घुसपैठ के साथ कम से कम 1 दिन होना चाहिए। गर्भवती महिलाओं को लगातार 3 दिनों के लिए एक डायस्ट्रस प्रोफाइल (ज्यादातर संभावित रूप से कम सेल संख्या वाले ल्यूकोसाइट्स) प्रदर्शित करना चाहिए।

सीएम तकनीक के विकास के माध्यम से, कुछ चूहों को दूसरों की तुलना में प्रक्रिया के लिए अधिक ग्रहणशील पाया गया। सीडी 1 मादा चूहे अपने शांत स्वभाव और उत्कृष्ट पोषण प्रवृत्ति के कारण उत्कृष्ट उम्मीदवार हैं। इस तनाव को संभालना आसान है और सीएम और गैर-सर्जिकल सहायता प्राप्त प्रजनन तकनीकों के दौरान अच्छा प्रदर्शन करता है। C57Bl/6 चूहे अधिक आक्रामक और कम पोषण करने वाले होते हैं। जबकि इस प्रोटोकॉल ने प्रभावी रूप से सीएम का उपयोग करके छद्म गर्भवती सी 57बीएल / 6 महिलाओं का उत्पादन किया, उन्हें प्रक्रिया के लगातार अनुमेय होने की संभावना कम थी। यह सीएम के दौरान सबसे कठिन चरण के साथ कुछ हद तक सहसंबंधित प्रतीत होता था। जानवर के प्रवेश के लिए एक संवर्धन ट्यूब के उपयोग ने प्रक्रिया के लिए योनि तक पहुंच की अनुमति दी और मादा को शांत करने में मदद की। प्रक्रिया स्वयं मादा को पूरी तरह से नियंत्रित नहीं करती है, इसलिए जानवर किसी भी समय दूर खींच सकता है। यदि ऐसा होता है, तो जानवर को पुनर्स्थापित किया जा सकता है, और प्रक्रिया को तब जारी रखा जा सकता है। प्रक्रिया का समय बंद हो जाता है यदि महिला दूर चली जाती है और प्रक्रिया फिर से शुरू होने पर फिर से शुरू होती है। प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण एस्ट्रस चक्र (देर से प्रोस्ट्रस और एस्ट्रस) का चरण और गर्भाशय ग्रीवा के साथ रॉड का संपर्क है। ट्रिमर का कंपन मानकीकृत सीएम प्रदान करता है। गर्भाशय ग्रीवा के साथ संपर्क सुनिश्चित करने के लिए, रॉड पर कोमल दबाव लागू किया जाता है, और गर्भाशय ग्रीवा के खिलाफ रॉड की स्थिति रॉड के छोटे आगे-पीछे आंदोलनों के साथ सुनिश्चित की जाती है।

सीएम के उपयोग ने एनएसएआई प्रोटोकॉल में सुधार किया है, क्योंकि शुक्राणु स्थानांतरण से पहले एस्ट्रस चक्र के सही चरण में महिलाओं को चुना जा सकता है, और प्रोटोकॉल अब वैसक्टोमाइज्ड पुरुषों के साथ संभोग पर निर्भर नहीं है। कृत्रिम गर्भाधान एस्ट्रस चक्र सिंक्रनाइज़ेशन को इस तरह से निर्धारित किया जाता है कि अंडाणु परिपक्वता दिन 4 की सुबह शुक्राणु हस्तांतरण से मेल खाती है। प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण ओव्यूलेशन के समय का अनुकूलन है जैसे कि निषेचन हो सकता है। अपेक्षित शुक्राणु हस्तांतरण से पहले एचसीजी 15-17 घंटे का प्रशासन करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, जैसा कि इन विट्रो फर्टिलाइजेशन1 के लिए उपयोग किए जाने वाले समय के लिए सुझाया गया है। शुक्राणु के नमूने की गुणवत्ता सीधे कृत्रिम गर्भाधान के परिणाम को प्रभावित करेगी। ताजा शुक्राणु जो कैपेसिटेटेड हो चुके हैं, वे सबसे अच्छा प्रदर्शन करेंगे। अच्छी गुणवत्ता के क्रायोसंरक्षित शुक्राणु विवो में निषेचित भ्रूण का उत्पादन कर सकते हैं। हालांकि, पिघले हुए शुक्राणु के प्रत्यक्ष हस्तांतरण के साथ देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि गर्भाशय के सींग में स्थानांतरित अवशिष्ट क्रायोप्रोटेक्टेंट्स आरोपण (अप्रकाशित अवलोकन) को रोक सकते हैं।

भ्रूण हस्तांतरण के साथ संयोजन में सीएम का उपयोग वैचारिक रूप से एक आसान अनुकूलन है। एस्ट्रस चक्र सिंक्रनाइज़ेशन प्राप्तकर्ता पूल के उत्पादन के लिए आवश्यक महिलाओं की संख्या को कम करता है। सीएम से पहले एस्ट्रस चरण का निर्धारण करने से छद्म गर्भवती प्राप्तकर्ताओं को प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है। विधि का एक दोष यह है कि भ्रूण हस्तांतरण के समय प्राप्तकर्ताओं की कोशिका विज्ञान प्रवाह के एक चरण में है। सभी सेल प्रकार मौजूद होते हैं यदि मादा एस्ट्रस से स्यूडोप्रेग्नेंसी प्रोफाइल में संक्रमण कर रही है, और स्यूडोप्रेग्नेंसी केवल तभी स्पष्ट हो जाती है जब कोशिका विज्ञान को कई दिनों तक ट्रैक किया जाता है। सीडी 1 और सी 57बीएल / 6 चूहों के लिए एस्ट्रस से स्यूडोप्रेग्नेंसी में संक्रमण की सफलता (>80%) के आधार पर, यह विधि भ्रूण हस्तांतरण प्राप्तकर्ताओं के लिए उपयुक्त होने की उम्मीद है। प्रारंभिक परिणाम सीमित गैर-सर्जिकल भ्रूण हस्तांतरण के साथ अच्छी सफलता दिखाते हैं। सामान्य तौर पर, गैर-सर्जिकल भ्रूण हस्तांतरण की दक्षता सर्जिकल तकनीक4,5 के बराबर है, और गैर-सर्जिकल स्थानांतरण ब्लास्टोसिस्ट चरण में सर्जिकल भ्रूण स्थानांतरण को प्रतिस्थापित कर सकता है। पहले चरण के भ्रूण के लिए, ब्लास्टोसिस्ट चरण के लिए भ्रूण संस्कृति की आवश्यकता होती है। हालांकि, यदि एक सर्जिकल स्थानांतरण को प्राथमिकता दी जाती है, तो सीएम तकनीक को उचित छद्म गर्भवती प्राप्तकर्ताओं के लिए आवश्यक सहीसमय के अनुकूल बनाना संभव है। सामान्य तौर पर, भ्रूण प्राप्तकर्ता भ्रूण की तुलना में 1 दिन कम उन्नत होते हैं। उदाहरण के लिए, ब्लास्टोसिस्ट को दाताओं से 3.5 डीपीसी पर काटा जाता है और 2.5 डीपीसी प्राप्तकर्ताओं को स्थानांतरित किया जाता है। इसलिए, सीएम को इस तरह से करने की आवश्यकता होगी कि प्राप्तकर्ता भ्रूण की तुलना में कम विकसित छद्म गर्भवती अवस्था में हो।

अंत में, यहां उल्लिखित सीएम तकनीक चूहों के लिए अन्य सहायक प्रजनन तकनीकों के साथ एकीकरण के लिए उत्कृष्ट वादा दिखाती है। हमने गैर-सर्जिकल तकनीकों का उपयोग करके कृत्रिम गर्भाधान और भ्रूण हस्तांतरण के लिए सफल प्रोटोकॉल प्रदान किए हैं। संयोजन में, सीएम तकनीक 3 आरएस लाभ प्रदान करती है, जिसमें (1) नसबंदी पुरुषों की आवश्यकता को समाप्त करके जानवरों की संख्या में कमी और (2) गैर-शल्य चिकित्सा विकल्पों के साथ शल्य चिकित्सा तकनीकों को बदलकर तकनीकों का शोधन शामिल है।

Disclosures

बारबरा स्टोन और सारा स्रोडुलस्की दोनों पैराटेक कॉर्पोरेशन, लेक्सिंगटन, केवाई, यूएसए में कार्यरत हैं। पैराटेक के पास चूहों के लिए एमएनएसईटी डिवाइस बनाने के लिए विशेष लाइसेंसिंग अधिकार हैं। पैराटेक कॉर्प ने एमएनएसईटी और एमसी एंड आई उपकरणों को विकसित और बेचा है, जिनका उपयोग क्रमशः गैर-सर्जिकल भ्रूण हस्तांतरण और गैर-सर्जिकल कृत्रिम गर्भाधान के लिए किया जा सकता है।

Acknowledgments

इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को पुरस्कार संख्या R43OD020304 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के निदेशक कार्यालय, अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम कार्यालय और पुरस्कार संख्या R44MH122117 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय मानसिक स्वास्थ्य संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती हो।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blastocyst stage embryos
CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) CosmoBio KYD-002-EX For sperm capacitation
Embryo handling pipette Cook Medical K-FPIP-1120-10BS Flexipet is available in various diameters
Embryo handling pipette assembly Paratechs 90010
Female mice, Crl:CD1(ICR) Charles River Laboratories 22 >8 weeks old
Forceps Fine Science Tools 11053-10 Toothed, for dissection
Forceps Fine Science Tools 11052-10 Curved, for dissection
Forceps Fine Science Tools Dumont #5 Fine, for dissection
Hemocytometer Fisher Scientific 267110 Optional
human Chorionic Gonadotropin (hCG) Prospec hor-250 For estrus synchronization
Incubator, 37 °C 5% CO2 Thermo Scientific
Incubator, 37 °C, benchtop Cook K-MINC-1000
Kimwipes Kimberly-Clark 34155 Absorbant tissues
M2 medium Millipore MR-015-D Embryo handling medium
Male mice, Crl:CD1(ICR) Charles River Laboratories 22 >8 weeks old
mC&I device ParaTechs 60020 For sperm transfer, specula included
mCM rod ParaTechs 90050 Smooth, blunt, with a diameter @3 mm
Microscope Olympus SZX7 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections
Microscope ACCU-SCOPE 3032 100x magnification with bright field illumination
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-7
mNSET device ParaTechs 60010 For embryo transfer, specula included
Needles, 26 G Exel 26402
Papanicolaou Staining System VWR 76265-730 Optional
Paraffin oil Sigma-Aldrich 18512
Pipette, P200 Corning 4074 Fits the C&I device for sperm transfer
Pipette, PR-2 Rainin 17008648 Fits the NSET device for embryo transfer
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) Prospec hor-272 For estrus synchronization
Scale American Weigh Scales LB-1000
Scissors Fine Science Tools 14068-12 Dissection
Scissors Fine Science Tools 14081-09 Angled, dissection
Swabs, Constix Contec SC-4 For vaginal cytology
Syringes, 1 cc Becton Dickenson and Company 309659
Tissue culture dishes, 35 mm Falcon 353001
Tissue culture dishes, 60 mm Falcon 353004
Trimmer Wahl ChroMini T-Cut
Wire bar topped mouse cage

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References

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जीव विज्ञान अंक 197
गैर-सर्जिकल भ्रूण हस्तांतरण या कृत्रिम गर्भाधान से पहले पुरुष की आवश्यकता के बिना मादा चूहों में छद्म गर्भावस्था को प्रेरित करना
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Stone, B. J., Srodulski, S. J.… More

Stone, B. J., Srodulski, S. J. Inducing Pseudopregnancy in Female Mice Without the Need for Vasectomized Males Prior to Non-Surgical Embryo Transfer or Artificial Insemination. J. Vis. Exp. (197), e65477, doi:10.3791/65477 (2023).

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