Summary
Den cervikale manipulasjonsmetoden som presenteres, kan indusere pseudograviditet hos mus uten behov for avlshunner med vasektomerte hanner. Induksjon av pseudograviditet er nødvendig for å lykkes med ikke-kirurgisk embryooverføring og ikke-kirurgisk kunstig befruktning, som begge også presenteres.
Abstract
For vellykket opprettholdelse av graviditet med embryooverføring eller kunstig befruktning, må kvinnelige mottakermus induseres til en pseudogravid tilstand. Hunnmus er tradisjonelt parret over natten med vasektomerte hanner, og neste morgen vurderes tilstedeværelsen av en kopulasjonsplugg. For å øke effektiviteten ved å produsere pseudogravide kvinner, har en cervical manipulasjonsteknikk blitt standardisert for å brukes i kombinasjon med ikke-kirurgisk embryooverføring eller kunstig inseminasjonsteknikker hos mus. Den stumpe enden av en liten plaststang settes inn vaginalt for å kontakte livmorhalsen og vibreres i 30 s ved kontakt med en trimmer. Prosedyren er rask og krever ikke anestesi eller smertestillende. Denne teknikken øker påliteligheten og forutsigbarheten av å produsere pseudopregnant kvinner og eliminerer helt kravet til vasektomerte menn. For CD1-mus var effektiviteten av pseudograviditetsinduksjon ved hjelp av cervikal manipulasjon 83 % for kvinner i østrus (N = 76), men bare 38 % av hunnene i østrus ble plugget av vasektomerte hanner (N = 24). Kunstig inseminasjon hos CD1-mus ble utført ved østrussynkronisering med hormoner, cervikal manipulasjon og livmoroverføring av sædceller. Mottakere av kunstig inseminasjon som fikk livmorhalsmanipulasjon (N = 76) hadde en drektighetsrate på 72 % og en gjennomsnittlig kullstørrelse på 8,3 avkom. Denne metoden kan også brukes til å produsere pseudogravide hunner for ikke-kirurgisk embryooverføring. Derfor er indusering av pseudograviditet ved cervikal manipulasjon et praktisk og effektivt alternativ til parring med en vasektomert mann når man utfører ikke-kirurgiske assisterte reproduksjonsteknikker. Bruk av cervikal manipulasjon gir 3Rs (erstatning, reduksjon og forfining) fordeler for assistert reproduksjonsteknikker ved å redusere antall dyr som kreves og eliminere nødvendigheten av kirurgisk endrede hanner.
Introduction
Assistert reproduksjonsteknologi brukes til produksjon av genetisk modifiserte musemodeller, samt gjenoppretting av stammer fra kryopreservering, rederivatering av stammer fra en kompromittert helsestatus og strategisk vivariumstyring, inkludert produksjon av aldersmatchede kohorter. Alle teknikker for assistert befruktning hos mus krever bruk av pseudogravide kvinnelige mottakere for embryoutvikling. Historisk har pseudogravide mottakere blitt generert ved parring med sterile hanner, som enten er kirurgisk vasektomerte eller genetisk infertile, og tilstedeværelsen av en kopulasjonsplugg vurderes neste morgen1. Nylig har en protokoll for sonisk stimulering hos mus blitt utviklet for kirurgisk overføring av pronukleære eller tocellede museembryoer2. Vi har også utviklet en protokoll for cervixmanipulasjon (CM) for bruk ved kunstig befruktning og ikke-kirurgisk embryooverføring av blastocyster. Begrunnelsen for bruken av prosedyren er å gi en 3Rs reduksjon i antall dyr som kreves (ikke lenger krever hannmus) og en forbedring av teknikkene som brukes (ikke lenger nødvendiggjør kirurgisk vasektomi prosedyre for hannmus). Beskrivelsen av denne protokollen inkluderer tilhørende assistert befruktning teknikk for å hjelpe til med integrering av CM i normale arbeidsflyter. Det overordnede målet med CM-metoden er å erstatte bruken av hannmus i genereringen av pseudogravide hunner for assistert befruktning, inkludert kunstig befruktning og embryooverføring.
CM-protokollen beskrevet her ble først utviklet for å hjelpe til med kunstig befruktning hos mus. Den kunstige inseminasjonsprotokollen, som opprinnelig beskrevet, oppnådde en graviditetsrate på 50%, med en gjennomsnittlig kullstørrelse på 7 valper3. CD1-mottakermus var brunstsynkronisert med en lav dose hormoner, inkludert drektig mare serum gonadotropin (PMSG) og humant choriongonadotropin (hCG), med et 47 timers intervall før inseminasjon. En fordel med brunstsynkronisering var at det tillot bruk av protokollen i normal arbeidstid. Hunnene ble parret med vasektomerte hanner umiddelbart etter kunstig befruktning, og parring ble bekreftet ved tilstedeværelse av en kopieringsplugg. Inkonsistens i parringsraten med mottakere ble rapportert som en vanskelighet i prosedyren. Derfor ble det søkt alternativer til parring for induksjon av pseudograviditet.
Denne studien presenterer en standardisert CM-teknikk for å øke effektiviteten av å produsere pseudogravide kvinner. For kvinner i østrus eller proestrus settes den stumpe enden av en liten plaststang vaginalt inn for å kontakte livmorhalsen og vibreres i 30 s ved kontakt med en trimmer. Prosedyren utføres på et trådtoppet bur. Ingen anestesi eller smertestillende er nødvendig. CM-teknikken er praktisk for å produsere pseudopregnant kvinner, som kan produsere kull etter ikke-kirurgisk kunstig befruktning uten behov for parring med vasektomiserte hanner. CM kan også brukes til produksjon av pseudogravide hunner som mottakere av embryooverføring. Spesielt kan CM-teknikken kobles sammen med ikke-kirurgisk embryooverføring, som beskrevet her. Ikke-kirurgiske metoder har vist seg å være effektive for embryooverføring av blastocyststadiumembryoer hos mus 4,5og rotter 6,7. Siden denne ikke-kirurgiske metoden er et effektivt alternativ til kirurgiske metoder, regnes det som en 3Rs-forfining av teknikken. Basert på tidligere forskning indikerer fekale kortikosteronnivåer, som et mål på stress, at prosedyrens ikke-kirurgiske karakter ikke øker stressnivået hos gnagere 7,8. Prosedyrene er mindre teknisk utfordrende enn kirurgisk embryooverføring og er mye raskere å utføre. Etter hvert som embryoene overføres til livmoren, må embryoer av riktig stadium for livmorutvikling overføres. For mus overføres blastocystene til 2,5 dager etter coitum (dpc) pseudogravide mottakere.
For de to ikke-kirurgiske teknikkene som er beskrevet her, er tidspunktet for hormonadministrasjonen og CM-teknikken forskjellig. Tidspunktet for CM-prosedyren i forhold til østrus er viktig for suksess, da den erstatter naturlig parring for produksjon av pseudogravide mottakere. Ved å eliminere behovet for vasektomerte hanner for å indusere pseudograviditet, gir denne prosedyren 3Rs-fordeler ved både å redusere antall dyr som kreves og eliminere nødvendigheten av kirurgisk endrede hanner. Prosedyren i seg selv er rask (30 s) og krever ikke anestesi eller smertestillende. Teknikken øker i stor grad påliteligheten og forutsigbarheten ved å produsere pseudogravide kvinner for assistert befruktning.
Protocol
Alle gjeldende internasjonale, nasjonale og institusjonelle retningslinjer for stell og bruk av dyr ble fulgt. Alle prosedyrer utført i studier som involverte dyr var i samsvar med de etiske standardene til ParaTechs Corporation Institutional Animal Care and Use Committee og utført i henhold til standardene diktert av Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health, Public Health Service, United States Department of Health and Human Services. Mannlige og kvinnelige CD1 (ICR) og kvinnelige C57Bl / 6J mus i alderen >8 uker gammel ble brukt til denne studien. Dyrene ble hentet fra kommersielle kilder (se materialtabell).
1. Cervikal manipulasjonsprosedyre for bruk med kunstig befruktning i CD1-mus
- Synkronisert eggløsning av hunnmus på dag 1 og dag 3
- Injiser hunnmus med 2,5 IE PMSG (se materialfortegnelse) ved intraperitoneal injeksjon (IP) på dag 1, 0,5 timer før starten av den mørke vivariumsyklusen.
MERK: Hver mannlig donor vil gi nok sæd til 10 kvinnelige mottakere. - Injiser hunnene med 2,5 IE hCG (se materialfortegnelse) ved IP-injeksjon på dag 3, 1 time før starten av den mørke vivariumsyklusen.
MERK: Tidspunktet for injeksjonene, sædoverføringen og lyssyklusen i forhold til hverandre er svært viktige. Tidene som er angitt for alle prosedyrene i denne protokollen er basert på en 12 timers lys / mørk syklus.
- Injiser hunnmus med 2,5 IE PMSG (se materialfortegnelse) ved intraperitoneal injeksjon (IP) på dag 1, 0,5 timer før starten av den mørke vivariumsyklusen.
- Innsamling og kapasitering av fersk sæd på dag 4
- Forbered en 500 μL dråpe sperm pre-inkubasjonsmedium (PM, se materialtabell) i en 60 mm vevskulturskål under parafinolje. Forbered en tallerken per mannlig donor. Likevekt i minst 30 minutter ved 37 °C og 5 % CO2 før sæddannelse.
- Ved 1 time etter starten av vivarium-lyssyklusen, avlive hannen(e) i henhold til institusjonelle retningslinjer. Hver mann vil gi nok sæd til 10 kunstige inseminasjoner.
- Dissekere cauda epididymidene raskt fra musen. Utfør et tverrgående abdominal snitt over blæren ved hjelp av disseksjonsaks og tanntang.
- Testikulære fettputer er plassert på hver side av blæren. Ta tak i en av testikkelfettputene med buet tang, og fjern testiklene og bitestikkelene fra kroppshulen. Identifiser cauda epididymis som en flat oval rørformet struktur like under testis.
- Hold cauda epididymis med buede tang, og resect med små, vinklede saks. Fjern begge cauda epididymidene, og overfør dem til et absorberende vev for å fjerne fett og blod under et dissekerende mikroskop.
- Plasser to cauda bitestikler i hver 500 μL dråpe likevekts-PM under parafinolje ved 37 °C. Klipp vevet ved å lage seks snitt med liten saks. Hvis mer enn én mannlig donor brukes, bruk en bitestikkelen fra hver donor for hver sædprøve for å redusere variasjonen mellom prøvene.
- Virvle fatet forsiktig, og la sæden komme ut av vevet i 3 minutter, virvle en gang i minuttet. Fjern alle vevene.
- Inkuber sædprøven i 45 minutter til 1 time ved 37 °C og 5 % CO2 for å kapasitere.
- Valgfritt: Mål sædkvaliteten, og vurder motiliteten under et mikroskop ved hjelp av et hemocytometer. For telling, fortynn sæden i PM etter behov.
- Bekreftelse av brunstsyklussynkronisering ved cytologisk evaluering
- Bruk en liten, fuktet vattpinne (se materialfortegnelse), samle vaginale celler forsiktig fra vaginalveggen ved å rulle vattpinnen mot vevet, smør dem inn i en 20 μL dråpe sterilt vann på et mikroskopglass og lufttørk.
- Under et mikroskop ved bruk av 100x forstørrelse med lysfeltbelysning, vurder for tilstedeværelse av cornified epitelceller. Kvinner i østrus eller sen proestrus vil ha cornified epitelceller tilstede og bør velges for cervikal manipulasjon.
- Valgfritt: Registrer vekten til de kvinnelige mottakerne før inseminasjon.
- Utføre cervical manipulasjon (CM)
- Ca. 0,5 timer før inseminering, plasser en mottakerhunn på toppen av et bur med et trådstativ, slik at musen kan "gripe" burets stangoverflate. Ta tak nær roten av halen med tommel og pekefinger og vinkle halen oppover mens du stabiliserer dyret (figur 1).
MERK: Musen vil holde stille så lenge prosedyren varer når håndteringsteknikken utføres riktig. Hvis musen beveger seg ut av posisjon, flytt forsiktig og fortsett. Hvis et aggressivt dyr velges som mottaker, kan det være beroligende å la dyret gå inn i en anrikningstunnel under prosedyren. Bruk av tunnelen er valgfritt, men det kan hjelpe forskere med å håndtere dyrene ved å gi en distraksjon under denne prosedyren. - Sett den stumpe enden av en liten plaststang (se materialfortegnelse) vaginalt i kontakt med livmorhalsen, og vibrer i 30 s ved kontakt med en trimmer (se materialfortegnelse).
NOTAT: Sett stangen på plass før du starter trimmeren. Begge holdes i en hånd under prosedyren. Ingen anestesi eller smertestillende er nødvendig.
- Ca. 0,5 timer før inseminering, plasser en mottakerhunn på toppen av et bur med et trådstativ, slik at musen kan "gripe" burets stangoverflate. Ta tak nær roten av halen med tommel og pekefinger og vinkle halen oppover mens du stabiliserer dyret (figur 1).
- Ikke-kirurgisk sædoverføring for kunstig befruktning
- Plasser inseminasjonsanordningen (se materialfortegnelse) på en P200-pipette satt til 40 μL, og fjern beskyttelsesdekselet.
- Fjern en alikot av den kapasiterte sædprøven fra parabolen ved 37 °C og 5 % CO2, og overfør den til en 35 mm vevskulturfat uten olje ved 37 °C. Sædprøven vil bli brukt umiddelbart for overføring.
MERK: Sæden vil miste motilitet raskt utenfor CO2 -inkubatoren. Hold den kapasiterte sædprøven ved 37 °C og 5% CO2 så mye som mulig. - Trykk pipettestempelet til første stopp, senk kateterspissen ned i sædprøven ved 37 °C, og legg sæden sakte inn i overføringsenheten. Unngå klumper. Fjern gjenværende olje fra utsiden av inseminasjonsanordningen ved hjelp av et absorberende vev. Sett pipetten til side.
MERK: Overføring av parafinolje til livmorhornet må unngås. Fjern gjenværende olje fra utsiden av inseminasjonsanordningen ved hjelp av et absorberende vev. - Plasser mottakerhunnen på toppen av trådstativet. Hold musen på plass med samme håndteringsteknikk som brukes til CM; Ta tak nær bunnen av halen ved hjelp av tommelen og pekefingeren, og vinkle halen oppover mens du stabiliserer dyret.
- Plasser det lille spekulumet (se materialfortegnelse) i skjeden.
- Sett inn kateteret for inseminasjonsanordningen inn i spekulumet, gjennom livmorhalsen og inn i livmoren. Når enhetens nav kommer i kontakt med spekulumet, dispenserer du sæden ved å trykke på pipettestingstempelet til første stopp. Unngå overføring av ekstra luft inn i livmorhornet.
MERK: Hvis kateteret ikke er plassert riktig, vil det treffe vevet rundt livmorhalsen, noe som får det til å bøye seg og til slutt bøye seg. Hvis kateteret ikke glir gjennom livmorhalsen ved første forsøk, må du forsiktig trekke kateteret ut og forsøke på nytt til det lykkes. Reposisjonering av spekulumet kan være nødvendig. - Fjern enheten og spekulumet. Ingen overvåking etter prosedyren er nødvendig.
- Valgfritt: Graviditetskontroll på dag 10-12
- Bruk vektøkning for å bestemme graviditetsstatusen. Vektøkning vil være belastningsavhengig, men en økning på minst 1-2 g korrelerer med graviditet.
Figur 1: Museholdingsteknikken for cervikal manipulasjon. Musen hviler på en trådburtopp og stabiliseres på halen og på begge sider foran på bakbenene. Den stumpe enden av en liten plaststang settes inn vaginalt for å kontakte livmorhalsen og vibreres ved kontakt med en trimmer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Ikke-kirurgisk embryooverføringsprosedyre for bruk med cervikal manipulasjon hos CD1-mus
- Synkronisert eggløsning av hunnmusene på dag 1 og dag 3
- Injiser hunnmus med 2,5 IE PMSG ved IP-injeksjon på dag 1, ca. 6 timer etter starten av vivariumlyssyklusen.
- Injiser hunnene med 2,5 IE hCG ved IP-injeksjon på dag 3, med 47 timers intervall etter PMSG-injeksjonen eller ca. 5 timer etter starten av vivarium-lyssyklusen.
- Bekrefte brunstsyklussynkronisering ved cytologisk evaluering
- På dag 3, ca. 1 time før CM, utfør cytologi på potensielle mottakere. Bruk en liten, forfuktet vattpinne, samle forsiktig vaginale celler fra vaginalveggen ved å rulle vattpinnen mot vevet, smør dem inn i en 20 μL dråpe sterilt vann på et mikroskopglass og lufttørk.
- Under et mikroskop ved bruk av 100x forstørrelse med lysfeltbelysning, vurder for tilstedeværelse av cornified epitelceller. Kvinner i østrus eller sen proestrus vil ha cornified epitelceller tilstede og bør velges for cervikal manipulasjon.
- Valgfritt: Registrer vekten til potensielle kvinnelige embryomottakere.
- Utfører CM
- På dag 3, 1 time før starten av vivarium mørk syklus, plasser en mottakerhunn på toppen av et bur med et trådstativ, slik at dyret kan "gripe" burets stangoverflate. Ta tak nær roten av halen ved hjelp av pekefingeren og tommelen, og vinkle deretter halen oppover mens du stabiliserer dyret (figur 1).
MERK: Musen vil holde stille så lenge prosedyren varer når håndteringsteknikken utføres riktig. Hvis musen beveger seg ut av posisjon, flytter du forsiktig og fortsetter. Hvis et aggressivt dyr velges som mottaker, kan det være beroligende å la dyret gå inn i en anrikningstunnel under prosedyren. - Sett den stumpe enden av en liten plaststang vaginalt inn for å kontakte livmorhalsen, og vibrer den i 30 s ved kontakt med en trimmer.
NOTAT: Sett stangen på plass før du starter trimmeren. Begge holdes i en hånd under prosedyren. Ingen anestesi eller smertestillende er nødvendig.
- På dag 3, 1 time før starten av vivarium mørk syklus, plasser en mottakerhunn på toppen av et bur med et trådstativ, slik at dyret kan "gripe" burets stangoverflate. Ta tak nær roten av halen ved hjelp av pekefingeren og tommelen, og vinkle deretter halen oppover mens du stabiliserer dyret (figur 1).
- Ikke-kirurgisk embryooverføring på dag 6
- Legg en dråpe M2 medium på 20 μL (se materialfortegnelse) på lokket på en vevskulturskål.
MERK: Lokket er valgt da det har en kortere kant og dermed er praktisk for å få tilgang til embryoene i dråpen. Ikke på noe tidspunkt lag parafinolje over dråpen M2, da innføring av olje i livmorhornet ser ut til å påvirke embryooverføringen negativt. - Under et mikroskop og ved hjelp av reflekterende belysning, last 10-20 blastocyster inn i middels dråpe ved hjelp av en standard embryohåndteringspipette (se materialtabell).
MERK: Det optimale antall embryoer som skal overføres avhenger av musestammen og eventuelle manipulasjoner embryoene har gjennomgått. For friske umanipulerte embryoer bør overføring av 10-15 embryoer være tilstrekkelig. Ved reavledning eller genmodifiserte embryoer er overføring av flere embryoer hensiktsmessig. - Fest den ikke-kirurgiske embryooverføringsenheten (se materialfortegnelse) på en P2-pipette satt til 1,8 μL. Fjern det beskyttende kateterdekselet.
- Trykk pipettens stempel til første stopp, senk spissen av kateteret ned i mediet og trekk embryoene sakte inn i kateterspissen på enheten. Fjern spissen fra mediet.
MERK: Visualisering av embryoene under lav forstørrelse vil muliggjøre enklere lasting av embryoene inn i enheten. Hvis embryoene er spredt i dråpen, rist forsiktig fatet fra side til side for å konsentrere embryoene i midten av dråpen, eller flytt dem ved hjelp av en embryohåndteringspipette. - Sett pipettevolumet til 2,0 μL for å generere en liten luftboble på tuppen av kateteret. Legg forsiktig pipetten med embryoene lastet nær museburet.
- Plasser mottakerhunnen på toppen av trådstativet. Hold musen på plass med samme håndteringsteknikk som brukes til CM; Ta tak nær bunnen av halen ved hjelp av pekefingeren og tommelen, og vinkle deretter halen oppover mens du stabiliserer dyret.
- Plasser et lite spekulum (se Materialfortegnelse) inn i skjeden.
- Sett overføringsenhetskateteret inn i spekulumet, gjennom livmorhalsen og inn i livmoren. Når enhetens nav kommer i kontakt med spekulumet, dispenserer embryoene ved å trykke på pipettestempelet til første stopp. Unngå overføring av ekstra luft inn i livmorhornet.
- Uten å slippe pipettestempelet, fjern enheten og spekulum. Ingen overvåking etter prosedyren er nødvendig.
- Legg en dråpe M2 medium på 20 μL (se materialfortegnelse) på lokket på en vevskulturskål.
Representative Results
Siden elektrisk9 og sonisk10 cervikal stimulering har blitt brukt til å indusere pseudograviditet hos rotter, presenterer dette arbeidet en standardisert mekanisk prosedyre som kan brukes til mus. Vaginal cytologi kan hjelpe til med identifisering av kvinner i ulike stadier av brunst. For å bekrefte pseudograviditet hos kvinner ble samme metode anvendt. Først ble cytologiprofiler for hunner sammenlignet for CD1- og C57Bl/6-mus gjennom brunstsykluser, under graviditet og under pseudograviditet indusert av parring eller CM. Vaginale vattpinner ble tatt fra hunnene og farget med et Papanicolaou-fargesystem (se materialfortegnelse). Cellene ble observert under 100x forstørrelse med lysfeltbelysning. De observerte cellene inkluderte leukocytter, kjernefysiske epitelceller og anucleatkornifiserte epitelceller. Bestemmelsen av brunstsyklusstadiet var basert på den relative prosentandelen av hver celletype11,12. Estrus er preget av overvekt av cornified epitelceller. Når østrus slutter, begynner metestrus, og leukocytter begynner å vises, mens cornified epitelceller blir mindre tydelige. Diestrus har moderat til lav cellularitet, med leukocytter dominerende og kjernefysiske epitelceller begynner å vises. Proestrus utmerker seg ved tap av leukocytter, en økning i kjernefysiske epitelceller og utseendet av cornified epitelceller. Etter proestrus begynner østrus, og syklusen fortsetter.
For å utvikle en baselineprofil ble vaginal cytologi registrert i minst to fulle brunstsykluser for hver hunn (N = 20 for CD1, N = 20 for C57Bl/6) før parring. Sykluslengdene og individuelle profiler varierte blant musene; Imidlertid ble de forventede generelle trendene observert. Gjennomsnittlig lengde på en brunstsyklus for CD1- og C57Bl/6-musene var 3,8 dager, med en rekkevidde på 3-5 dager. Dagen før naturlig parring skjedde, var alle hunnmusene i proestrus. Etter parring ble cytologi utført på nytt 1,5 dager etter coitum (dpc) inntil brunstsyklingen ble gjenopptatt. Figur 2 viser cytologisk profil for pseudogravide CD1- og C57Bl/6-hunner parret med vasektomerte hanner.
Figur 2 Cytologisk profil for pseudogravide hunnmus. De gjennomsnittlige prosentandelene av hver celletype for leukocytter, kjernefysiske epitelceller og kornifiserte epitelceller er vist som en funksjon av dager etter coitum (DPC) for (A) CD1 (N = 20) og (B) C57Bl/6 (N = 20) mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I dette arbeidet har en CM-teknikk blitt standardisert for å øke effektiviteten ved å produsere pseudogravide kvinner. For kvinner i østrus eller proestrus settes den stumpe enden av en liten plaststang vaginalt inn for å kontakte livmorhalsen og vibreres i 30 s ved kontakt med en trimmer. Prosedyren utføres på et trådtoppet bur. Ingen anestesi eller smertestillende er nødvendig. For å bestemme effekten av CM-prosedyren ble vaginal cytologi sammenlignet for hunnmus av typen CD1 (N = 20) og C57Bl/6 (N = 20) etter parring med vasektomerte hanner og etter CM (totalt N = 40). Den cytologiske profilen for pseudograviditet indusert av CM var lik profilen for pseudograviditet indusert av parring, som vist i figur 3.
Figur 3 Cytologisk profil hos pseudogravide hunnmus etter cervikal manipulasjon (CM). Prosentandelen av hver celletype for leukocytter, nukleerte epitelceller og kornifiserte epitelceller er vist som en funksjon av dager etter coitum (DPC) eller dager etter cervikal manipulasjon (DPCM). Den gjennomsnittlige celletypeprosenten er vist for CD1- og C57Bl/6-musene (N = 40) (A) parret med vasektomerte hanner eller (B) etter CM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å avgjøre om CM-teknikken er tilstrekkelig til å etablere graviditet for assistert befruktning, ble CM utført som en del av en ikke-kirurgisk kunstig inseminasjon (NSAI) protokoll hos CD1-kvinner. Den kunstige inseminasjonsprotokollen inkluderte østrussynkronisering av hunnene med en lav dose av hormonene PMSG og hCG før sædoverføring. CM ble utført like før sædoverføringen. For CD1-mus var effektiviteten av pseudograviditetsinduksjon ved bruk av CM hos hunner i østrus (N = 76) med denne teknikken 83 %. I et kontrolleksperiment ble bare 38% av kvinnene i østrus plugget av vasektomerte menn (N = 24). De som fikk manipulasjon av kunstig befruktning (N = 76) hadde en drektighetsrate på 72 % og en gjennomsnittlig kullstørrelse på 8,3 valper. Dermed er induksjon av pseudograviditet ved CM en praktisk og effektiv erstatning for parring med en vasektomert mann når man utfører NSAI. Bruk av CM for å forberede CD1-mottakere (N = 4) i østrus for ikke-kirurgisk embryooverføring av ferske CD1-blastocyster resulterte i en 100% graviditetsrate. Overføringen av 9-15 embryoer ga tre friske kull med en fødselsrate på 45% og en gjennomsnittlig kullstørrelse på 6 valper. Til sammenligning hadde CD1-mottakerne (N = 20) som ble parret med vasektomerte hanner for å indusere pseudograviditet, en graviditetsrate på 80 % og en fødselsrate på 46 % etter overføring av 20 ferske B6C3F2-blastocyster.
Resultater for assistert befruktning teknikker vil trolig være belastningsspesifikke, da variabler som dose og tidspunkt for hormonadministrasjon for superovulasjon har vist seg å være belastningsavhengige13. I tillegg kan faktorer som mottakers alder og vekt påvirke reaksjonen på hormoner14. I dette arbeidet, når du utførte CM-prosedyren for kunstig befruktning, ble bare kvinner i sen proestrus eller østrus funnet å være responsive. Generelt, for å øke antall tilgjengelige mottakere i en befolkning, blir hunnene først østrussynkronisert med en lav dose hormoner3. Østrussynkronisering med 2,5 IE PMSG og hCG var 78% effektiv for 11-14 uker gamle CD1-hunner (N = 27) og 60% effektiv for 18-32 uker gamle C57Bl/6 hunner (N = 22) i dette arbeidet. Effektiviteten av pseudograviditetsinduksjon ved bruk av cervikal manipulasjon hos CD1-kvinner var 83 % for kvinner i østrus (N = 76) og 82 % (N = 100) for C57Bl/6 hunner i østrus med denne teknikken.
Discussion
3R-ene er et etisk rammeverk for dyrebruk i forskning, som beskrevet i 1959 av Russel og Burch i "The Principles of Humane Experimental Technique"15. 3R-ene representerer erstatning, reduksjon og foredling i bruk av dyr. Protokollene som er uthevet her er i samsvar med 3R-ene. Den cervikale manipulasjonsteknikken reduserer antall dyr som trengs ved ikke lenger å kreve bruk av menn for å produsere pseudopregnant kvinner. Teknikken eliminerer også behovet for å utføre vasektomi på hannene, og gir dermed raffinement ved å redusere smerte og nød. De assisterte befruktningsteknikkene som er beskrevet her (kunstig befruktning og embryooverføring) er ikke-kirurgiske, og gir dermed begge en 3Rs-forfining ved å redusere smerte og nød8forårsaket av deres kirurgiske alternativer.
Bruk av pseudopregnant kvinner er nødvendig for utvinning av valper når de utfører assistert reproduksjon hos mus1. CM-prosedyren er en effektiv metode for å produsere pseudogravide kvinner, men synkroniseringen av fasen av brunstsyklusen til mottakerhunnene er et kritisk første trinn i prosessen. Østralsynkronisering kan drastisk redusere antall hunner som trengs i kolonien for å forberede potensielle mottakere og hjelper til med å produsere tidsbestemte pseudogravide hunner på forespørsel. Bruk av en lav dose hormoner ser ikke ut til å forårsake noen skadelige effekter på utvinning av levende kull i CD1-mus. Det må utvises forsiktighet med andre stammer for å finne hormon- og konsentrasjonskombinasjonen som produserer mottakerhunnene av beste kvalitet for embryoene eller sæden som overføres. Synkronisering kan oppnås ved bruk av PMSG og hCG16, men doser som produserer superovulerte kvinner kan ikke være passende for en vedvarende graviditet17.
For å avgjøre om en kvinne er i østrus, ble det utført en cytologisk evaluering i dette arbeidet. Brunstfasen kan også evalueres ved observasjon av vaginalåpningen11,18. Selv om denne metoden er ekstremt nyttig og kan brukes alene eller som bekreftelse, er den mer subjektiv enn bruk av cytologi. Vaginal cytologi uten farging er både rask og effektiv for å velge kvinner i østrus fordi cornified epitelceller lett kan identifiseres. I denne protokollen utføres den cytologiske evalueringen før CM for å bestemme potensielle mottakere. Det er viktig å utføre cytologi før CM, da prosedyren har en tendens til å fragmentere cellene som er sloughed fra vaginalområdet, og dermed gjøre identifisering vanskelig. Cytologisk evaluering for pseudograviditet eller graviditet kan utføres 3,5-11,5 dager etter CM (dpcm) i 3 påfølgende dager. Profilen til en brunstsykling hunn bør ha minst 1 dag med betydelig infiltrasjon av cornified epitelceller. Pseudogravide / gravide kvinner bør vise en diestrusprofil (for det meste leukocytter med potensielt lave celletall) i 3 påfølgende dager.
Gjennom utviklingen av CM-teknikken ble noen mus funnet å være mer mottakelige for prosedyren enn andre. CD1-hunnmus er gode kandidater på grunn av deres rolige natur og gode pleieinstinkter. Denne belastningen er lett å håndtere og fungerer godt under CM og ikke-kirurgiske assistert reproduksjonsteknikker. C57Bl/6-mus har en tendens til å være mer aggressive og mindre pleiende. Selv om denne protokollen effektivt produserte pseudogravide C57Bl/6-kvinner ved bruk av CM, var det mindre sannsynlig at de konsekvent etterlot prosedyren. Dette syntes å korrelere noe med brunstfasen under CM. Kvinner i østrus eller proestrus var mer mottakelige. Bruken av et anrikningsrør for dyret å komme inn tillot tilgang til skjeden for prosedyren og bidro til å roe kvinnen. Prosedyren i seg selv begrenser ikke kvinnen fullt ut, slik at dyret kan trekke seg bort når som helst. Hvis dette skjer, kan dyret flyttes, og prosedyren kan deretter fortsette. Tidspunktet for prosedyren stopper hvis kvinnen går bort og gjenopptas når prosedyren gjenopptas. Kritisk for prosedyrens suksess er fasen av brunstsyklusen (sen proestrus og østrus) og kontakten av stangen med livmorhalsen. Trimmerens vibrasjon gir standardisert CM. For å sikre kontakt med livmorhalsen, påføres forsiktig trykk på stangen, og plasseringen av stangen mot livmorhalsen sikres med små frem og tilbake bevegelser av stangen.
Bruken av CM har forbedret NSAI-protokollen, da hunner i riktig fase av brunstsyklusen kan velges før sædoverføring, og protokollen er ikke lenger betinget av parring med vasektomerte hanner. Den kunstige brunstsyklussynkroniseringen er tidsbestemt slik at oocytmodning tilsvarer sædoverføring om morgenen på dag 4. Kritisk for protokollens suksess er tilpasningen av tidspunktet for eggløsning slik at befruktning kan oppstå. Det må utvises forsiktighet ved administrering av hCG 15-17 timer før forventet sædoverføring, som foreslått for tidspunktene som brukes til in vitro-fertilisering 1. Kvaliteten på sædprøven vil direkte påvirke utfallet av kunstig befruktning. Fersk sæd som har blitt kapasitert vil fungere best. Kryopreservert sæd av god kvalitet kan produsere befruktede embryoer in vivo. Imidlertid bør det utvises forsiktighet ved direkte overføring av tint sæd, da gjenværende kryobeskyttelsesmidler overført til livmorhornet kan hemme implantasjon (upubliserte observasjoner).
Bruken av CM i forbindelse med embryooverføring er konseptuelt en enkel tilpasning. Brunstsyklussynkronisering reduserer antall hunner som er nødvendig for å produsere mottakerutvalget. Bestemmelse av brunststadiet før CM øker sannsynligheten for å oppnå pseudogravide mottakere. En ulempe med metoden er at cytologien til mottakerne på tidspunktet for embryooverføring er i et stadium av fluss. Alle celletyper er tilstede hvis kvinnen overgår fra østrus til pseudograviditetsprofilen, og pseudograviditet blir bare tydelig hvis cytologien spores i flere dager. Basert på suksessen (>80%) av overgangen fra østrus til pseudograviditet for CD1- og C57Bl/6-mus, forventes denne metoden å være egnet for embryooverføringsmottakere. De foreløpige resultatene viser god suksess med begrenset ikke-kirurgisk embryooverføring. Generelt er effektiviteten av ikke-kirurgisk embryooverføring sammenlignbar med den for kirurgisk teknikk4,5, og ikke-kirurgisk overføring kan erstatte kirurgiske embryooverføringer på blastocyststadiet. For embryoer i tidligere stadier er embryokultur til blastocyststadiet nødvendig. Men hvis en kirurgisk overføring foretrekkes, er det mulig å tilpasse CM-teknikken til riktig timing som trengs for passende pseudogravide mottakere2. Generelt er embryomottakerne 1 dag mindre avanserte enn embryoet. For eksempel høstes blastocystene ved 3,5 dpc fra givere og overføres til 2,5 dpc-mottakere. Derfor må CM utføres slik at mottakeren er i en mindre utviklet pseudogravid tilstand enn embryoene.
Avslutningsvis viser CM-teknikken som er skissert her, utmerket løfte om integrering med andre assisterte reproduksjonsteknikker for mus. Vi har gitt vellykkede protokoller for kunstig inseminasjon og embryooverføring ved hjelp av ikke-kirurgiske teknikker. I kombinasjon gir CM-teknikken 3Rs-fordeler, inkludert (1) en reduksjon i antall dyr ved å eliminere behovet for vasektomerte hanner og (2) en forbedring av teknikker ved å erstatte kirurgiske teknikker med ikke-kirurgiske alternativer.
Disclosures
Barbara Stone og Sarah Srodulski er begge ansatt ved ParaTechs Corporation, Lexington, KY, USA. ParaTechs har eksklusive lisensrettigheter til å produsere mNSET-enheten for mus. ParaTechs Corp har utviklet og selger mNSET- og mC&I-enhetene, som kan brukes til henholdsvis ikke-kirurgisk embryooverføring og ikke-kirurgisk kunstig befruktning.
Acknowledgments
Forskningen rapportert i denne publikasjonen ble støttet av kontoret til direktøren, Office of Research Infrastructure Programs, av National Institutes of Health under Award Number R43OD020304 og National Institute of Mental Health av National Institutes of Health under Award Number R44MH122117. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blastocyst stage embryos | |||
| CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
| Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
| Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
| Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
| human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
| Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
| Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
| Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
| mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
| Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
| Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
| Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
| Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
| Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
| Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
| Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
| Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
| Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
| Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
| Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
| Wire bar topped mouse cage |
References
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, fourth edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2014).
- Wake, Y., et al. Successful induction of pseudopregnancy using sonic vibration in mice. Scientific Reports. 13 (1), 3604 (2023).
- Stone, B. J., Steele, K. H., Fath-Goodin, A. A rapid and effective nonsurgical artificial insemination protocol using the NSET device for sperm transfer in mice without anesthesia. Transgenic Research. 24 (4), 775-781 (2015).
- Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. BioTechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Stone, B. J., et al. A nonsurgical embryo transfer technique for fresh and cultured blastocysts in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (5), 488-495 (2020).
- Steele, K. H., et al. Nonsurgical embryo transfer device compared with surgery for embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 17-21 (2013).
- Terkel, J., Witcher, J. A., Adler, N. T. Evidence for "memory" of cervical stimulation for the promotion of pregnancy in rats. Hormones and Behavior. 24 (1), 40-49 (1990).
- Kaneko, T., Endo, M., Tsunoda, S., Nakagawa, Y., Abe, H. Simple induction of pseudopregnancy by artificial stimulation using a sonic vibration in rats. Scientific Reports. 10 (1), 2729 (2020).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Luo, C., et al. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (4), 471-478 (2011).
- Gates, A. H. Viability and developmental capacity of eggs from immature mice treated with gonadotrophins. Nature. 177 (4512), 754-755 (1956).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co., Ltd. London, UK. (1959).
- Hasegawa, A., et al. Efficient and scheduled production of pseudopregnant female mice for embryo transfer by estrous cycle synchronization. Journal of Reproduction and Development. 63 (6), 539-545 (2017).
- Beaumont, H. M., Smith, A. F. Embryonic mortality during the pre- and post-implantation periods of pregnancy in mature mice after superovulation. Journal of Reproduction and Fertility. 45 (3), 437-448 (1975).
- Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
