Summary
Die vorgestellte Methode zur Manipulation des Gebärmutterhalses kann bei Mäusen eine Pseudoschwangerschaft induzieren, ohne dass Weibchen mit vasektomierten Männchen verpaart werden müssen. Die Induktion einer Pseudoschwangerschaft ist Voraussetzung für den Erfolg des nicht-chirurgischen Embryotransfers und der nicht-chirurgischen künstlichen Befruchtung, die beide ebenfalls vorgestellt werden.
Abstract
Um die Schwangerschaft mit Embryotransfer oder künstlicher Befruchtung erfolgreich aufrechtzuerhalten, müssen weibliche Empfängermäuse in einen pseudoschwangeren Zustand versetzt werden. Weibliche Mäuse werden traditionell über Nacht mit vasektomierten Männchen gepaart und am nächsten Morgen wird das Vorhandensein eines Kopulationspfropfens beurteilt. Um die Effizienz der Produktion von pseudoschwangeren Weibchen zu erhöhen, wurde eine Technik zur Manipulation des Gebärmutterhalses standardisiert, die in Kombination mit nicht-chirurgischen Embryotransfer- oder künstlichen Befruchtungstechniken bei Mäusen eingesetzt werden kann. Das stumpfe Ende eines kleinen Plastikstäbchens wird vaginal eingeführt, um den Gebärmutterhals zu berühren, und wird durch Kontakt mit einem Trimmer 30 s lang in Schwingung versetzt. Das Verfahren ist schnell und erfordert keine Anästhesie oder Analgesie. Diese Technik erhöht die Zuverlässigkeit und Vorhersagbarkeit der Produktion von pseudoträchtigen Weibchen und eliminiert vollständig die Notwendigkeit von vasektomierten Männchen. Bei CD1-Mäusen betrug die Effizienz der Pseudoschwangerschaftsinduktion durch Manipulation des Gebärmutterhalses 83 % für Weibchen im Östrus (N = 76), aber nur 38 % der Weibchen im Östrus wurden durch vasektomierte Männchen verstopft (N = 24). Die künstliche Befruchtung bei CD1-Mäusen wurde durch Brunstsynchronisation mit Hormonen, Manipulation des Gebärmutterhalses und den Transfer von Spermien in die Gebärmutter durchgeführt. Künstliche Befruchtungsempfänger, die eine Gebärmutterhalsmanipulation erhielten (N = 76), hatten eine Trächtigkeitsrate von 72% und eine durchschnittliche Wurfgröße von 8,3 Welpen. Diese Methode kann auch verwendet werden, um pseudoschwangere Frauen für den nicht-chirurgischen Embryotransfer zu erzeugen. Daher ist die Induktion einer Pseudoschwangerschaft durch Manipulation des Gebärmutterhalses eine bequeme und effiziente Alternative zur Paarung mit einem vasektomierten Männchen, wenn nicht-chirurgische assistierte Reproduktionstechniken durchgeführt werden. Die Manipulation des Gebärmutterhalses bietet 3R-Vorteile (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung) für Techniken der assistierten Reproduktion, indem sie die Anzahl der erforderlichen Tiere reduziert und die Notwendigkeit chirurgisch veränderter Männchen eliminiert.
Introduction
Technologien der assistierten Reproduktion werden für die Herstellung genetisch veränderter Mausmodelle sowie für die Rückgewinnung von Stämmen aus der Kryokonservierung, die Ableitung von Stämmen aus einem beeinträchtigten Gesundheitszustand und das strategische Vivariumsmanagement, einschließlich der Produktion altersgerechter Kohorten, eingesetzt. Alle Techniken der assistierten Reproduktion bei Mäusen erfordern den Einsatz von pseudoschwangeren Empfängerinnen für die Embryonalentwicklung. In der Vergangenheit wurden pseudoschwangere Empfängerinnen durch Paarung mit sterilen Männchen erzeugt, die entweder chirurgisch vasektomiert oder genetisch unfruchtbar sind, und das Vorhandensein eines Kopulationspfropfens wird am nächsten Morgen beurteilt1. Kürzlich wurde ein Protokoll für die akustische Stimulation in Mäusen für den chirurgischen Transfer von pronukleären oder zweizelligen Mausembryonen entwickelt2. Wir haben auch ein Protokoll zur Manipulation des Gebärmutterhalses (CM) für die künstliche Befruchtung und den nicht-chirurgischen Embryotransfer von Blastozysten entwickelt. Der Grund für die Anwendung des Verfahrens besteht darin, die Anzahl der benötigten Tiere um 3R zu reduzieren (keine männlichen Mäuse mehr erforderlich) und die verwendeten Techniken zu verfeinern (keine chirurgische Vasektomie mehr für männliche Mäuse erforderlich). Die Beschreibung dieses Protokolls beinhaltet die damit verbundene Technik der assistierten Reproduktion, um die Integration von CM in normale Arbeitsabläufe zu unterstützen. Das übergeordnete Ziel der CM-Methode ist es, die Verwendung männlicher Mäuse bei der Erzeugung pseudoschwangerer Weibchen für Techniken der assistierten Reproduktion, einschließlich künstlicher Befruchtung und Embryotransfer, zu ersetzen.
Das hier beschriebene CM-Protokoll wurde ursprünglich entwickelt, um die künstliche Befruchtung bei Mäusen zu unterstützen. Das ursprünglich beschriebene Protokoll der künstlichen Befruchtung erreichte eine Trächtigkeitsrate von 50 % bei einer durchschnittlichen Wurfgröße von 7 Welpen3. CD1-Empfängermäuse wurden in einem Intervall von 47 Stunden vor der Besamung mit einer niedrigen Dosis von Hormonen, einschließlich Serumgonadotropin (PMSG) und humanem Choriongonadotropin (hCG), mit einer niedrigen Dosis von Hormonen synchronisiert. Ein Vorteil der Brunstsynchronisation war, dass sie die Nutzung des Protokolls während der normalen Arbeitszeit ermöglichte. Die Weibchen wurden unmittelbar nach der künstlichen Befruchtung mit vasektomierten Männchen gepaart, und die Paarung wurde durch das Vorhandensein eines Kopulationspfropfens bestätigt. Inkonsistenz in der Paarungsrate mit Empfängern wurde als Schwierigkeit im Verfahren angegeben. Daher wurde nach Alternativen zur Paarung gesucht, um eine Pseudoschwangerschaft einzuleiten.
In der vorliegenden Studie wird eine standardisierte CM-Technik vorgestellt, um die Effizienz der Produktion von pseudoträchtigen Weibchen zu erhöhen. Bei Frauen in der Brunst oder im Proöstrus wird das stumpfe Ende eines kleinen Plastikstäbchens vaginal eingeführt, um den Gebärmutterhals zu berühren, und durch Kontakt mit einem Trimmer 30 s lang in Schwingung versetzt. Der Eingriff wird an einem drahtgebundenen Käfig durchgeführt. Es ist keine Anästhesie oder Analgesie erforderlich. Die CM-Technik eignet sich für die Produktion von pseudoträchtigen Weibchen, die nach einer nicht-chirurgischen künstlichen Befruchtung Würfe produzieren können, ohne dass eine Paarung mit vasektomierten Männchen erforderlich ist. CM kann auch für die Erzeugung von pseudoschwangeren Frauen als Empfängerinnen des Embryotransfers verwendet werden. Insbesondere kann die CM-Technik mit einem nicht-chirurgischen Embryotransfer kombiniert werden, wie hier beschrieben. Nicht-chirurgische Methoden haben sich für den Embryotransfer von Embryonen im Blastozystenstadium bei Mäusen 4,5und Ratten als wirksam erwiesen 6,7. Da diese nicht-chirurgische Methode eine effektive Alternative zu chirurgischen Methoden darstellt, gilt sie als 3R-Verfeinerung der Technik. Basierend auf früheren Forschungen deutet der fäkale Corticosteronspiegel als Maß für Stress darauf hin, dass der nicht-chirurgische Charakter des Verfahrens das Stressniveau bei Nagetieren nicht erhöht 7,8. Die Verfahren sind technisch weniger anspruchsvoll als der chirurgische Embryotransfer und viel schneller durchzuführen. Wenn die Embryonen in die Gebärmutter übertragen werden, müssen Embryonen im richtigen Stadium für die Entwicklung der Gebärmutter übertragen werden. Bei Mäusen werden Blastozysten 2,5 Tage nach dem Koitum (dpc) auf pseudoschwangere Empfängerinnen übertragen.
Bei den beiden hier beschriebenen nicht-chirurgischen Techniken unterscheidet sich der Zeitpunkt der Hormongabe und der CM-Technik. Der Zeitpunkt des CM-Eingriffs in Bezug auf die Brunst ist wichtig für den Erfolg, da er die natürliche Paarung für die Produktion von pseudoschwangeren Empfängerinnen ersetzt. Durch den Wegfall der Notwendigkeit von vasektomierten Männchen, eine Pseudoschwangerschaft herbeizuführen, bietet dieses Verfahren 3R-Vorteile, indem es sowohl die Anzahl der erforderlichen Tiere reduziert als auch die Notwendigkeit chirurgisch veränderter Männchen eliminiert. Der Eingriff selbst ist schnell (30 Sekunden) und erfordert keine Anästhesie oder Analgesie. Die Technik erhöht die Zuverlässigkeit und Vorhersagbarkeit der Produktion von pseudoträchtigen Weibchen für die assistierte Reproduktion erheblich.
Protocol
Alle geltenden internationalen, nationalen und institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren wurden befolgt. Alle Verfahren, die in Studien mit Tieren durchgeführt wurden, entsprachen den ethischen Standards des ParaTechs Corporation Institutional Animal Care and Use Committee und wurden nach den Standards des Office of Laboratory Animal Welfare, der National Institutes of Health, des Public Health Service und des United States Department of Health and Human Services durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden männliche und weibliche CD1(ICR)- und weibliche C57Bl/6J-Mäuse im Alter von >8 Wochen verwendet. Die Tiere stammten aus kommerziellen Quellen (siehe Materialtabelle).
1. Verfahren zur Manipulation des Gebärmutterhalses bei künstlicher Befruchtung bei CD1-Mäusen
- Synchronisierter Eisprung weiblicher Mäuse an Tag 1 und Tag 3
- Weiblichen Mäusen werden 2,5 I.E. PMSG (siehe Materialtabelle) per intraperitonealer Injektion (IP) an Tag 1, 0,5 Stunden vor Beginn des Vivarium-Dunkelzyklus, injiziert.
HINWEIS: Jeder männliche Spender stellt genügend Sperma für 10 weibliche Empfänger zur Verfügung. - Injizieren Sie den Weibchen 2,5 I.E. hCG (siehe Materialtabelle) per IP-Injektion am Tag 3, 1 Stunde vor Beginn des Vivarium-Dunkelzyklus.
HINWEIS: Der Zeitpunkt der Injektionen, des Spermientransfers und des Lichtzyklus im Verhältnis zueinander ist sehr wichtig. Die für alle Verfahren in diesem Protokoll angegebenen Zeiten basieren auf einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus.
- Weiblichen Mäusen werden 2,5 I.E. PMSG (siehe Materialtabelle) per intraperitonealer Injektion (IP) an Tag 1, 0,5 Stunden vor Beginn des Vivarium-Dunkelzyklus, injiziert.
- Entnahme und Kapazitation von frischem Sperma am 4. Tag
- Bereiten Sie einen 500-μl-Tropfen Spermien-Vorinkubationsmedium (PM, siehe Materialtabelle) in einer 60-mm-Gewebekulturschale unter Paraffinöl zu. Bereiten Sie ein Gericht pro männlichem Spender zu. Vor der Samenentnahme mindestens 30 Minuten bei 37 °C und 5 % CO2 ausgleichen.
- 1 Stunde nach Beginn des Vivarium-Lichtzyklus wird das Männchen gemäß den institutionellen Richtlinien eingeschläfert. Jedes Männchen liefert genug Sperma für 10 künstliche Befruchtungen.
- Sezieren Sie schnell die Cauda-Nebenhoden von der Maus. Führen Sie einen quer verlaufenden Bauchschnitt oberhalb der Blase mit einer Präparierschere und einer Zahnzange durch.
- Die Hodenfettpolster befinden sich auf beiden Seiten der Blase. Fassen Sie eines der Hodenfettpolster mit einer gebogenen Pinzette und entfernen Sie Hoden und Nebenhoden aus der Körperhöhle. Identifizieren Sie den Nebenhoden der Cauda als eine flache, ovale, röhrenförmige Struktur direkt unter dem Hoden.
- Halten Sie den Nebenhoden mit einer gebogenen Pinzette fest und resezieren Sie ihn mit einer kleinen, abgewinkelten Schere. Entfernen Sie beide Cauda-Nebenhoden und übertragen Sie sie in ein saugfähiges Gewebe, um Fett und Blut unter einem Präpariermikroskop zu entfernen.
- Zwei Cauda-Nebenhoden werden in jeden 500-μl-Tropfen äquilibriertes Feinstaub unter Paraffinöl bei 37 °C gegeben. Schneiden Sie das Gewebe, indem Sie mit einer kleinen Schere sechs Schnitte machen. Wenn mehr als ein männlicher Spender verwendet wird, verwenden Sie für jede Samenprobe einen Nebenhoden von jedem Spender, um die Variation zwischen den Proben zu reduzieren.
- Schwenken Sie die Schale vorsichtig und lassen Sie das Sperma 3 Minuten lang aus dem Gewebe austreten, wobei Sie es einmal pro Minute schwenken. Entferne alle Taschentücher.
- Die Samenprobe wird für 45 min bis 1 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
- Optional: Messen Sie die Spermienzahl und beurteilen Sie die Beweglichkeit unter dem Mikroskop mit einem Hämozytometer. Für die Zählung verdünnen Sie die Spermien nach Bedarf in PM.
- Bestätigung der Brunstzyklussynchronisation durch zytologische Auswertung
- Sammeln Sie mit einem kleinen, vorbefeuchteten Tupfer (siehe Materialtabelle) vorsichtig Vaginalzellen von der Vaginalwand, indem Sie den Tupfer gegen das Gewebe rollen, schmieren Sie sie in einen 20-μl-Tropfen sterilen Wassers auf einem Objektträger und trocknen Sie sie an der Luft.
- Unter einem Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung und Hellfeldbeleuchtung auf das Vorhandensein von verhornten Epithelzellen untersuchen. Weibchen in der Brunst oder im späten Proöstrus haben verhornte Epithelzellen und sollten für die Manipulation des Gebärmutterhalses ausgewählt werden.
- Optional: Notieren Sie das Gewicht der Empfängerinnen vor der Insemination.
- Durchführung der zervikalen Manipulation (CM)
- Etwa 0,5 Stunden vor der Besamung wird ein Empfängerweibchen mit einem Drahtgestell auf einen Käfig gelegt, so dass die Maus die Oberfläche der Käfigstange "greifen" kann. Fassen Sie mit Daumen und Zeigefinger in der Nähe des Schwanzansatzes und winkeln Sie den Schwanz nach oben, während Sie das Tier stabilisieren (Abbildung 1).
HINWEIS: Die Maus hält für die Dauer des Vorgangs still, wenn die Handhabungstechnik korrekt ausgeführt wird. Wenn sich die Maus aus der Position bewegt, positionieren Sie sie vorsichtig neu und fahren Sie fort. Wenn ein aggressives Tier als Empfänger ausgewählt wird, kann es beruhigend sein, das Tier während des Eingriffs in einen Anreicherungstunnel treten zu lassen. Die Nutzung des Tunnels ist optional, kann den Forschern jedoch beim Umgang mit den Tieren helfen, indem er während dieses Vorgangs für Ablenkung sorgt. - Führen Sie das stumpfe Ende eines kleinen Plastikstäbchens (siehe Materialtabelle) vaginal in Kontakt mit dem Gebärmutterhals ein und vibrieren Sie es 30 s lang durch Kontakt mit einem Trimmer (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Bringen Sie die Stange in Position, bevor Sie den Trimmer starten. Beide werden während des Eingriffs in einer Hand gehalten. Es ist keine Anästhesie oder Analgesie erforderlich.
- Etwa 0,5 Stunden vor der Besamung wird ein Empfängerweibchen mit einem Drahtgestell auf einen Käfig gelegt, so dass die Maus die Oberfläche der Käfigstange "greifen" kann. Fassen Sie mit Daumen und Zeigefinger in der Nähe des Schwanzansatzes und winkeln Sie den Schwanz nach oben, während Sie das Tier stabilisieren (Abbildung 1).
- Nicht-chirurgischer Spermientransfer für die künstliche Befruchtung
- Setzen Sie das Befruchtungsgerät (siehe Materialtabelle) auf eine P200-Pipette, die auf 40 μl eingestellt ist, und entfernen Sie die Schutzabdeckung.
- Ein Aliquot der kapazitiven Samenprobe wird bei 37 °C und 5 %CO2 aus der Schale entnommen und bei 37 °C in eine 35 mm große Gewebekulturschale ohne Öl überführt. Die Samenprobe wird sofort für den Transfer verwendet.
HINWEIS: Die Spermien verlieren außerhalb des CO2 - Inkubators schnell an Beweglichkeit. Bewahren Sie die kapazitive Samenprobe so weit wie möglich bei 37 °C und 5 % CO2 auf . - Drücken Sie den Pipettenkolben bis zum ersten Anschlag, senken Sie die Katheterspitze bei 37 °C in die Spermienprobe und laden Sie die Spermien langsam in das Transfergerät. Vermeiden Sie Klumpen. Entfernen Sie das restliche Öl von der Außenseite des Besamungsgeräts mit einem saugfähigen Tuch. Lege die Pipette beiseite.
HINWEIS: Die Übertragung von Paraffinöl auf das Gebärmutterhorn muss vermieden werden. Entfernen Sie das restliche Öl von der Außenseite des Besamungsgeräts mit einem saugfähigen Tuch. - Legen Sie die Empfängerbuchse auf die Oberseite des Gitterkäfigs. Halten Sie die Maus in Position, indem Sie die gleiche Handhabungstechnik verwenden, die für den CM verwendet wird. Fassen Sie mit Daumen und Zeigefinger in der Nähe des Schwanzansatzes und winkeln Sie den Schwanz nach oben, während Sie das Tier stabilisieren.
- Führen Sie das kleine Spekulum (siehe Materialtabelle) in die Vagina ein.
- Führen Sie den Katheter des Inseminationsgeräts in das Spekulum, durch den Gebärmutterhals und in die Gebärmutter ein. Sobald der Gerätehub das Spekulum berührt, geben Sie das Sperma ab, indem Sie den Pipettenkolben bis zum ersten Anschlag drücken. Vermeiden Sie die Übertragung von zusätzlicher Luft in das Gebärmutterhorn.
HINWEIS: Wenn der Katheter nicht richtig positioniert ist, trifft er auf das Gewebe, das den Gebärmutterhals umgibt, wodurch er sich biegt und schließlich biegt. Wenn der Katheter beim ersten Versuch nicht durch den Gebärmutterhals gleitet, ziehen Sie den Katheter vorsichtig zurück und wiederholen Sie den Versuch, bis er erfolgreich ist. Eine Neupositionierung des Spekulums kann notwendig sein. - Entfernen Sie das Gerät und das Spekulum. Eine Überwachung nach dem Eingriff ist nicht erforderlich.
- Optional: Schwangerschaftscheck an den Tagen 10-12
- Verwenden Sie die Gewichtszunahme, um den Schwangerschaftsstatus zu bestimmen. Die Gewichtszunahme hängt von der Belastung ab, aber eine Zunahme von mindestens 1-2 g korreliert mit der Schwangerschaft.
Abbildung 1: Die Maus-Haltetechnik für die Manipulation des Gebärmutterhalses. Die Maus ruht auf einem Drahtkäfig und ist am Schwanz und beidseitig an der Vorderseite der Hinterbeine stabilisiert. Das stumpfe Ende eines kleinen Kunststoffstäbchens wird vaginal eingeführt, um den Gebärmutterhals zu berühren, und wird durch den Kontakt mit einem Trimmer in Schwingung versetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
2. Nicht-chirurgisches Embryotransferverfahren zur Anwendung bei Gebärmutterhalsmanipulation bei CD1-Mäusen
- Synchronisierter Eisprung der weiblichen Mäuse an Tag 1 und Tag 3
- Injizieren Sie weiblichen Mäusen 2,5 I.E. PMSG durch IP-Injektion an Tag 1, etwa 6 Stunden nach Beginn des Vivarium-Lichtzyklus.
- Injizieren Sie den Weibchen 2,5 I.E. hCG per IP-Injektion an Tag 3, in einem Intervall von 47 Stunden nach der PMSG-Injektion oder etwa 5 Stunden nach Beginn des Vivarium-Lichtzyklus.
- Bestätigung der Synchronisierung des Östruszyklus durch zytologische Untersuchung
- Führen Sie am 3. Tag, ca. 1 Stunde vor der CM, eine Zytologie bei den potenziellen Empfängern durch. Entnehmen Sie mit einem kleinen, vorbefeuchteten Tupfer vorsichtig Vaginalzellen von der Vaginalwand, indem Sie den Tupfer gegen das Gewebe rollen, schmieren Sie sie in einen 20-μl-Tropfen steriles Wasser auf einem Objektträger und trocknen Sie sie an der Luft.
- Unter einem Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung und Hellfeldbeleuchtung auf das Vorhandensein von verhornten Epithelzellen untersuchen. Weibchen in der Brunst oder im späten Proöstrus haben verhornte Epithelzellen und sollten für die Manipulation des Gebärmutterhalses ausgewählt werden.
- Optional: Notieren Sie das Gewicht der potentiellen Empfängerinnen des weiblichen Embryos.
- Durchführen des CM
- Setzen Sie am 3. Tag, 1 Stunde vor Beginn des Vivarium-Dunkelzyklus, ein Empfängerweibchen auf einen Käfig mit einem Drahtgestell, so dass das Tier die Oberfläche der Käfigstange "greifen" kann. Fassen Sie mit dem Zeigefinger und dem Daumen in der Nähe des Schwanzansatzes und winkeln Sie dann den Schwanz nach oben, während Sie das Tier stabilisieren (Abbildung 1).
HINWEIS: Die Maus hält für die Dauer des Vorgangs still, wenn die Handhabungstechnik korrekt ausgeführt wird. Wenn sich die Maus aus der Position bewegt, positionieren Sie sie vorsichtig neu und fahren Sie fort. Wenn ein aggressives Tier als Empfänger ausgewählt wird, kann es beruhigend sein, das Tier während des Eingriffs in einen Anreicherungstunnel treten zu lassen. - Führen Sie das stumpfe Ende eines kleinen Plastikstäbchens vaginal ein, um den Gebärmutterhals zu berühren, und vibrieren Sie ihn 30 Sekunden lang durch Kontakt mit einem Trimmer.
HINWEIS: Bringen Sie die Stange in Position, bevor Sie den Trimmer starten. Beide werden während des Eingriffs in einer Hand gehalten. Es ist keine Anästhesie oder Analgesie erforderlich.
- Setzen Sie am 3. Tag, 1 Stunde vor Beginn des Vivarium-Dunkelzyklus, ein Empfängerweibchen auf einen Käfig mit einem Drahtgestell, so dass das Tier die Oberfläche der Käfigstange "greifen" kann. Fassen Sie mit dem Zeigefinger und dem Daumen in der Nähe des Schwanzansatzes und winkeln Sie dann den Schwanz nach oben, während Sie das Tier stabilisieren (Abbildung 1).
- Nicht-chirurgischer Embryotransfer am 6. Tag
- Geben Sie einen 20-μl-Tropfen M2-Medium (siehe Materialtabelle) auf den Deckel einer Gewebekulturschale.
HINWEIS: Der Deckel wurde gewählt, da er einen kürzeren Rand hat und somit bequem für den Zugang zu den Embryonen im Tropfen ist. Tragen Sie zu keinem Zeitpunkt Paraffinöl über den Tropfen M2 auf, da das Einbringen von Öl in das Gebärmutterhorn den Embryotransfer negativ zu beeinflussen scheint. - Unter dem Mikroskop und mit reflektierender Beleuchtung werden 10-20 Blastozysten mit einer Standardpipette für die Embryonenhandhabung in den Mediumtropfen geladen (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die optimale Anzahl der zu übertragenden Embryonen hängt vom Mausstamm und den Manipulationen ab, denen die Embryonen unterzogen wurden. Für gesunde, unmanipulierte Embryonen sollte der Transfer von 10-15 Embryonen ausreichen. Bei Rederivation oder genetisch veränderten Embryonen ist der Transfer von mehr Embryonen angemessen. - Befestigen Sie das nicht-chirurgische Embryotransfergerät (siehe Materialtabelle) auf einer P2-Pipette, die auf 1,8 μl eingestellt ist. Entfernen Sie die schützende Katheterabdeckung.
- Drücken Sie den Kolben der Pipette bis zum ersten Anschlag, senken Sie die Spitze des Katheters in das Medium und ziehen Sie die Embryonen langsam in die Katheterspitze des Geräts. Entfernen Sie die Spitze vom Medium.
HINWEIS: Die Visualisierung der Embryonen unter geringer Vergrößerung ermöglicht ein einfacheres Laden der Embryonen in das Gerät. Wenn die Embryonen im Tropfen verstreut sind, schütteln Sie die Schale vorsichtig von einer Seite zur anderen, um die Embryonen in der Mitte des Tropfens zu konzentrieren, oder positionieren Sie sie mit einer Pipette zur Handhabung von Embryonen. - Stellen Sie das Pipettenvolumen auf 2,0 μl ein, um eine kleine Luftblase an der Spitze des Katheters zu erzeugen. Legen Sie die Pipette vorsichtig mit den geladenen Embryonen in die Nähe des Mäusekäfigs.
- Legen Sie die Empfängerbuchse auf die Oberseite des Gitterkäfigs. Halten Sie die Maus in Position, indem Sie die gleiche Handhabungstechnik verwenden, die für CM verwendet wird. Fassen Sie mit dem Zeigefinger und dem Daumen in der Nähe des Schwanzansatzes und winkeln Sie dann den Schwanz nach oben, während Sie das Tier stabilisieren.
- Legen Sie ein kleines Spekulum (siehe Materialtabelle) in die Vagina.
- Führen Sie den Katheter des Transfergeräts in das Spekulum, durch den Gebärmutterhals und in die Gebärmutter ein. Sobald der Gerätehub das Spekulum berührt, dosieren Sie die Embryonen, indem Sie den Pipettenkolben bis zum ersten Anschlag drücken. Vermeiden Sie die Übertragung von zusätzlicher Luft in das Gebärmutterhorn.
- Ohne den Pipettenkolben loszulassen, entfernen Sie das Gerät und das Spekulum. Eine Überwachung nach dem Eingriff ist nicht erforderlich.
- Geben Sie einen 20-μl-Tropfen M2-Medium (siehe Materialtabelle) auf den Deckel einer Gewebekulturschale.
Representative Results
Da elektrische9 undsonic 10 zervikale Stimulation verwendet wurden, um eine Pseudoschwangerschaft bei Ratten zu induzieren, wird in dieser Arbeit ein standardisiertes mechanisches Verfahren vorgestellt, das bei Mäusen angewendet werden kann. Die vaginale Zytologie kann bei der Identifizierung von Frauen in verschiedenen Stadien des Östrus helfen. Um eine Pseudoschwangerschaft bei Frauen zu bestätigen, wurde die gleiche Methode angewendet. Zunächst wurden die zytologischen Profile der Weibchen für CD1- und C57Bl/6-Mäuse während der Brunstzyklen, während der Schwangerschaft und während der durch Paarung oder CM induzierten Pseudoschwangerschaft verglichen. Den Weibchen wurden Vaginalabstriche entnommen und mit einem Papanicolaou-Färbesystem gefärbt (siehe Materialtabelle). Die Zellen wurden unter 100-facher Vergrößerung mit Hellfeldbeleuchtung beobachtet. Zu den beobachteten Zellen gehörten Leukozyten, kernhaltige Epithelzellen und ankernhaltige verhornte Epithelzellen. Die Bestimmung des Östruszyklusstadiums basierte auf dem relativen Prozentsatz jedes Zelltyps11,12. Die Brunst ist durch die Dominanz von verhornten Epithelzellen gekennzeichnet. Wenn die Brunst endet, beginnt der Metestrus und Leukozyten beginnen zu erscheinen, während verhornte Epithelzellen weniger sichtbar werden. Diestrus hat eine moderate bis niedrige Zellularität, wobei Leukozyten überwiegen und kernhaltige Epithelzellen zu erscheinen beginnen. Der Proöstrus zeichnet sich durch den Verlust von Leukozyten, eine Zunahme der kernhaltigen Epithelzellen und das Auftreten von verhornten Epithelzellen aus. Nach der Proöstrus beginnt die Brunst, und der Zyklus setzt sich fort.
Um ein Basisprofil zu erstellen, wurde die vaginale Zytologie für mindestens zwei volle Brunstzyklen für jedes Weibchen (N = 20 für CD1, N = 20 für C57Bl/6) vor der Paarung aufgezeichnet. Die Zykluslängen und individuellen Profile variierten zwischen den Mäusen; Es wurden jedoch die erwarteten allgemeinen Trends beobachtet. Die durchschnittliche Länge eines Östruszyklus für die CD1- und C57Bl/6-Mäuse betrug 3,8 Tage, mit einer Spanne von 3-5 Tagen. Am Tag vor der natürlichen Paarung befanden sich alle weiblichen Mäuse im Proöstrus. Nach der Paarung wurde die Zytologie 1,5 Tage nach dem Koitum (dpc) erneut durchgeführt, bis der Brunstzyklus wieder einsetzte. Abbildung 2 zeigt das zytologische Profil von pseudoschwangeren CD1- und C57Bl/6-Weibchen, die mit vasektomierten Männchen gepaart wurden.
Abbildung 2: Zytologisches Profil für pseudoschwangere weibliche Mäuse. Die durchschnittlichen Prozentsätze jedes Zelltyps für Leukozyten, kernhaltige Epithelzellen und verhornte Epithelzellen sind als Funktion der Tage nach dem Koitum (DPC) für (A) CD1 (N = 20) und (B) C57Bl/6 (N = 20) Mäuse dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
In dieser Arbeit wurde eine CM-Technik standardisiert, um die Effizienz der Produktion von pseudoschwangeren Weibchen zu erhöhen. Bei Frauen in der Brunst oder im Proöstrus wird das stumpfe Ende eines kleinen Plastikstäbchens vaginal eingeführt, um den Gebärmutterhals zu berühren, und durch Kontakt mit einem Trimmer 30 s lang in Schwingung versetzt. Der Eingriff wird an einem drahtgebundenen Käfig durchgeführt. Es ist keine Anästhesie oder Analgesie erforderlich. Um die Wirksamkeit des CM-Verfahrens zu bestimmen, wurde die vaginale Zytologie für weibliche CD1 (N = 20) und C57Bl/6 (N = 20) Mäuse nach Paarung mit vasektomierten Männchen und nach CM (Gesamt N = 40) verglichen. Das zytologische Profil der durch CM induzierten Pseudoschwangerschaft ähnelte dem Profil der durch Paarung induzierten Pseudoschwangerschaft, wie in Abbildung 3 dargestellt.
Abbildung 3: Zytologisches Profil für pseudoschwangere weibliche Mäuse nach Gebärmutterhalsmanipulation (CM). Der prozentuale Anteil jedes Zelltyps an Leukozyten, kernhaltigen Epithelzellen und verhornten Epithelzellen wird als Funktion der Tage nach dem Koitum (DPC) oder den Tagen nach der zervikalen Manipulation (DPCM) dargestellt. Die durchschnittlichen Zelltyp-Prozentsätze sind für die CD1- und C57Bl/6-Mäuse (N = 40) (A) mit vasektomierten Männchen oder (B) nach CM dargestellt . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Um festzustellen, ob die CM-Technik ausreicht, um eine Schwangerschaft für die assistierte Reproduktion festzustellen, wurde die CM im Rahmen eines nicht-chirurgischen Protokolls für künstliche Befruchtung (NSAI) bei CD1-Frauen durchgeführt. Das Protokoll der künstlichen Befruchtung beinhaltete die Brunstsynchronisation der Weibchen mit einer niedrigen Dosis der Hormone PMSG und hCG vor dem Spermientransfer. Die CM wurde kurz vor dem Spermientransfer durchgeführt. Bei CD1-Mäusen betrug die Effizienz der Pseudoschwangerschaftsinduktion mittels CM für Weibchen im Östrus (N = 76) mit dieser Technik 83%. In einem Kontrollexperiment wurden nur 38% der Frauen in der Brunst von vasektomierten Männern verstopft (N = 24). Die Empfängerinnen der künstlichen Befruchtung, die eine Gebärmutterhalsmanipulation erhielten (N = 76), hatten eine Trächtigkeitsrate von 72% und eine durchschnittliche Wurfgröße von 8,3 Welpen. Daher ist die Induktion einer Pseudoschwangerschaft durch CM ein bequemer und effizienter Ersatz für die Paarung mit einem vasektomierten Männchen bei der Durchführung von NSAI. Die Verwendung von CM zur Vorbereitung von CD1-Empfängern (N = 4) in der Brunst auf den nicht-chirurgischen Embryotransfer von frischen CD1-Blastozysten führte zu einer Schwangerschaftsrate von 100%. Der Transfer von 9-15 Embryonen ergab drei gesunde Würfe mit einer Geburtenrate von 45% und einer durchschnittlichen Wurfgröße von 6 Welpen. Im Vergleich dazu hatten die CD1-Empfängerinnen (N = 20), die mit vasektomierten Männchen gepaart wurden, um eine Pseudoschwangerschaft zu induzieren, eine Schwangerschaftsrate von 80 % und eine Geburtenrate von 46 % nach dem Transfer von 20 frischen B6C3F2-Blastozysten.
Die Ergebnisse für Techniken der assistierten Reproduktion werden wahrscheinlich stammspezifisch sein, da sich Variablen wie die Dosis und der Zeitpunkt der Hormongabe für den Superovulationszeitraum als stammabhängig erwiesen haben13. Darüber hinaus können Faktoren wie das Alter und das Gewicht des Empfängers die Reaktion auf Hormone beeinflussen14. In dieser Arbeit wurde bei der Durchführung des CM-Verfahrens zur künstlichen Befruchtung festgestellt, dass nur Frauen mit spätem Proöstrus oder Östrus ansprechbar waren. Um die Anzahl der verfügbaren Empfänger in einer Population zu erhöhen, werden die Weibchen im Allgemeinen zunächst mit einer niedrigen Hormondosis östrossynchronisiert3. Die Brunstsynchronisation mit 2,5 IE PMSG und hCG war in dieser Arbeit zu 78 % für 11-14 Wochen alte CD1-Hündinnen (N = 27) und zu 60 % für 18-32 Wochen alte C57Bl/6-Hündinnen (N = 22) wirksam. Die Effizienz der Pseudoschwangerschaftsinduktion durch Manipulation des Gebärmutterhalses bei CD1-Weibchen betrug 83 % für Frauen in der Brunst (N = 76) und 82 % (N = 100) für C57Bl/6-Frauen in der Brunst mit dieser Technik.
Discussion
Die 3R sind ein ethischer Rahmen für die Verwendung von Tieren in der Forschung, wie er 1959 von Russel und Burch in "The Principles of Humane Experimental Technique"15 beschrieben wurde. Die 3R stehen für Ersatz, Reduzierung und Verfeinerung der Tiernutzung. Die hier hervorgehobenen Protokolle stimmen mit den 3R überein. Die Technik der Gebärmutterhalsmanipulation reduziert die Anzahl der benötigten Tiere, da keine Männchen mehr eingesetzt werden müssen, um pseudoträchtige Weibchen zu produzieren. Die Technik macht auch die Durchführung von Vasektomien bei den Männern überflüssig und sorgt so für Verfeinerung durch die Verringerung von Schmerzen und Leiden. Die hier beschriebenen Techniken der assistierten Reproduktion (künstliche Befruchtung und Embryotransfer) sind nicht-chirurgisch und bieten daher eine 3R-Verfeinerung, indem sie die Schmerzen und Leiden8reduzieren, die durch ihre chirurgischen Alternativen verursacht werden.
Die Verwendung von pseudoträchtigen Weibchen ist für die Genesung von Jungtieren bei der Durchführung der assistierten Reproduktion bei Mäusen erforderlich1. Das CM-Verfahren ist eine effektive Methode zur Erzeugung pseudoschwangerer Weibchen, aber die Synchronisierung der Phase des Brunstzyklus der Empfängerweibchen ist ein kritischer erster Schritt in diesem Prozess. Die Brunstsynchronisation kann die Anzahl der Weibchen, die in der Kolonie benötigt werden, um potenzielle Empfänger vorzubereiten, drastisch reduzieren und hilft bei der zeitgesteuerten Produktion von pseudoträchtigen Weibchen auf Abruf. Die Verwendung einer niedrigen Hormondosis scheint bei CD1-Mäusen keine schädlichen Auswirkungen auf die Erholung lebender Würfe zu haben. Bei anderen Stämmen muss darauf geachtet werden, die Hormon- und Konzentrationskombination zu finden, die die besten Empfängerfrauen für die übertragenen Embryonen oder Spermien hervorbringt. Die Synchronisierung kann mit PMSG und hCG16 erreicht werden, aber Dosen, die zu superovulierten Frauen führen, sind möglicherweise nicht für eine anhaltende Schwangerschaft geeignet17.
Um festzustellen, ob sich ein Weibchen im Östrus befindet, wurde in dieser Arbeit eine zytologische Untersuchung durchgeführt. Die Östrusphase kann auch durch die Beobachtung der Vaginalöffnung11,18 beurteilt werden. Diese Methode ist zwar äußerst hilfreich und kann allein oder als Bestätigung verwendet werden, ist aber subjektiver als die Anwendung der Zytologie. Die vaginale Zytologie ohne Färbung ist sowohl schnell als auch effektiv für die Auswahl von Frauen in der Brunst, da verhornte Epithelzellen leicht identifiziert werden können. In diesem Protokoll wird die zytologische Untersuchung vor der CM durchgeführt, um potenzielle Empfänger zu bestimmen. Es ist wichtig, vor der CM eine Zytologie durchzuführen, da das Verfahren dazu neigt, die aus dem Vaginalbereich abgelösten Zellen zu fragmentieren, was die Identifizierung erschwert. Die zytologische Untersuchung auf Pseudoschwangerschaft oder Schwangerschaft kann 3,5-11,5 Tage nach der CM (dpcm) an 3 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt werden. Das Profil eines östros Cycling-Weibchens sollte mindestens 1 Tag mit erheblicher Infiltration von verhornten Epithelzellen aufweisen. Pseudoschwangere/trächtige Weibchen sollten an 3 aufeinanderfolgenden Tagen ein Diestrusprofil (meist Leukozyten mit potenziell niedriger Zellzahl) aufweisen.
Durch die Entwicklung der CM-Technik wurde festgestellt, dass einige Mäuse empfänglicher für das Verfahren sind als andere. CD1-Mäuse sind aufgrund ihres ruhigen Wesens und ihres ausgezeichneten Fürsorgeinstinkts ausgezeichnete Kandidaten. Diese Sorte ist einfach zu handhaben und eignet sich gut für die CM und nicht-chirurgische assistierte Reproduktionstechniken. C57Bl/6-Mäuse neigen dazu, aggressiver und weniger fürsorglich zu sein. Während dieses Protokoll effektiv pseudoschwangere C57Bl/6-Weibchen mit CM produzierte, war es weniger wahrscheinlich, dass sie das Verfahren konsequent akzeptierten. Dies schien in gewisser Weise mit der Brunstphase während der CM zu korrelieren. Frauen in Östrus oder Proöstrus waren empfänglicher. Die Verwendung eines Anreicherungsschlauchs, in den das Tier eindringen konnte, ermöglichte den Zugang zur Vagina für den Eingriff und half, das Weibchen zu beruhigen. Der Eingriff selbst hält das Weibchen nicht vollständig zurück, so dass sich das Tier jederzeit zurückziehen kann. In diesem Fall kann das Tier umgelagert und die Prozedur fortgesetzt werden. Der Zeitpunkt des Eingriffs stoppt, wenn das Weibchen weggeht, und setzt ihn fort, wenn der Eingriff wieder aufgenommen wird. Entscheidend für den Erfolg des Eingriffs sind die Phase des Brunstzyklus (späte Proöstrus und Östrus) und der Kontakt des Stäbchens mit dem Gebärmutterhals. Die Vibration des Trimmers sorgt für eine standardisierte CM. Um den Kontakt mit dem Gebärmutterhals zu gewährleisten, wird sanfter Druck auf den Stab ausgeübt und die Positionierung des Stabes am Gebärmutterhals durch kleine Hin- und Herbewegungen des Stabes sichergestellt.
Die Verwendung von CM hat das NSAI-Protokoll verbessert, da Weibchen in der richtigen Phase des Brunstzyklus vor dem Spermientransfer ausgewählt werden können und das Protokoll nicht mehr von der Paarung mit vasektomierten Männchen abhängt. Die Synchronisierung des Östruszyklus der künstlichen Befruchtung ist so getaktet, dass die Reifung der Eizellen dem Spermientransfer am Morgen des 4. Tages entspricht. Entscheidend für den Erfolg des Protokolls ist die Anpassung des Zeitpunkts des Eisprungs, damit eine Befruchtung stattfinden kann. Es muss darauf geachtet werden, hCG 15-17 Stunden vor dem erwarteten Spermientransfer zu verabreichen, wie es für die für die In-vitro-Fertilisation verwendeten Zeitpunkte vorgeschlagen wird1. Die Qualität der Samenprobe wirkt sich direkt auf das Ergebnis der künstlichen Befruchtung aus. Frische Spermien, die kapazitiv sind, werden die beste Leistung erbringen. Kryokonservierte Spermien von guter Qualität können in vivo befruchtete Embryonen hervorbringen. Bei der direkten Übertragung von aufgetauten Spermien ist jedoch Vorsicht geboten, da verbleibende Kryoprotektoren, die auf das Gebärmutterhorn übertragen werden, die Einnistung hemmen können (unveröffentlichte Beobachtungen).
Die Verwendung von CM in Verbindung mit dem Embryotransfer ist konzeptionell eine einfache Anpassung. Die Synchronisierung des Brunstzyklus reduziert die Anzahl der Weibchen, die für die Produktion des Empfängerpools erforderlich sind. Die Bestimmung des Östrusstadiums vor CM erhöht die Wahrscheinlichkeit, pseudoschwangere Empfängerinnen zu erhalten. Ein Nachteil der Methode ist, dass sich die Zytologie der Empfängerinnen zum Zeitpunkt des Embryotransfers in einem Stadium des Wandels befindet. Alle Zelltypen sind vorhanden, wenn das Weibchen vom Brunst- in das Pseudoschwangerschaftsprofil übergeht, und eine Pseudoschwangerschaft wird nur offensichtlich, wenn die Zytologie über mehrere Tage verfolgt wird. Basierend auf dem Erfolg (>80%) des Übergangs von der Brunst zur Pseudoschwangerschaft bei CD1- und C57Bl/6-Mäusen wird erwartet, dass diese Methode für Empfängerinnen des Embryotransfers geeignet ist. Die vorläufigen Ergebnisse zeigen gute Erfolge bei begrenztem nicht-chirurgischem Embryotransfer. Im Allgemeinen ist die Effizienz des nicht-chirurgischen Embryotransfers mit der der chirurgischen Technikvergleichbar 4,5, und der nicht-chirurgische Transfer kann den chirurgischen Embryotransfer im Blastozystenstadium ersetzen. Für Embryonen im Frühstadium ist eine Embryokultur bis zum Blastozystenstadium erforderlich. Wenn jedoch ein chirurgischer Transfer bevorzugt wird, ist es möglich, die CM-Technik an das richtige Timing anzupassen, das für geeignete pseudoschwangere Empfängerinnen erforderlich ist2. Im Allgemeinen sind die Embryonenempfänger 1 Tag weniger fortgeschritten als der Embryo. Zum Beispiel werden Blastozysten mit 3,5 dpc von Spendern entnommen und an 2,5 dpc-Empfänger übertragen. Daher muss die CM so durchgeführt werden, dass sich die Empfängerin in einem weniger entwickelten pseudoschwangeren Zustand befindet als die Embryonen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene CM-Technik ein hervorragendes Potenzial für die Integration mit anderen Techniken der assistierten Reproduktion bei Mäusen darstellt. Wir haben erfolgreiche Protokolle für die künstliche Befruchtung und den Embryotransfer mit nicht-chirurgischen Techniken bereitgestellt. In Kombination bietet die CM-Technik 3R-Vorteile, darunter (1) eine Reduzierung der Anzahl der Tiere durch den Wegfall der Notwendigkeit von vasektomierten Männchen und (2) eine Verfeinerung der Techniken durch den Ersatz chirurgischer Techniken durch nicht-chirurgische Alternativen.
Disclosures
Barbara Stone und Sarah Srodulski sind beide bei der ParaTechs Corporation, Lexington, KY, USA, beschäftigt. ParaTechs besitzt die exklusiven Lizenzrechte für die Herstellung des mNSET-Geräts für Mäuse. ParaTechs Corp hat die mNSET- und mC&I-Geräte entwickelt und vertreibt sie, die für den nicht-chirurgischen Embryotransfer bzw. die nicht-chirurgische künstliche Befruchtung verwendet werden können.
Acknowledgments
Die in dieser Veröffentlichung vorgestellte Forschung wurde vom Büro des Direktors, Office of Research Infrastructure Programs, der National Institutes of Health unter der Award-Nummer R43OD020304 und des National Institute of Mental Health der National Institutes of Health unter der Award-Nummer R44MH122117 unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blastocyst stage embryos | |||
| CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
| Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
| Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
| Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
| human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
| Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
| Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
| Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
| mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
| Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
| Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
| Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
| Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
| Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
| Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
| Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
| Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
| Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
| Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
| Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
| Wire bar topped mouse cage |
References
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