Summary
Den presenterade cervikala manipulationsmetoden kan inducera pseudograviditet hos möss utan behov av avelkvinnor med vasektomerade män. Induktion av pseudograviditet krävs för framgång av icke-kirurgisk embryoöverföring och icke-kirurgisk artificiell insemination, vilka båda också presenteras.
Abstract
För att framgångsrikt upprätthålla graviditet med embryoöverföring eller artificiell insemination måste kvinnliga mottagarmöss induceras till ett pseudogravid tillstånd. Kvinnliga möss paras traditionellt över natten med vasektomerade män, och följande morgon bedöms närvaron av en kopulationsplugg. För att öka effektiviteten vid produktion av pseudogravida kvinnor har en cervikal manipulationsteknik standardiserats för att användas i kombination med icke-kirurgisk embryoöverföring eller artificiell inseminationsteknik hos möss. Den trubbiga änden av en liten plaststav sätts in vaginalt för att komma i kontakt med livmoderhalsen och vibreras i 30 s genom kontakt med en trimmer. Förfarandet är snabbt och kräver inte anestesi eller analgesi. Denna teknik ökar tillförlitligheten och förutsägbarheten för att producera pseudogravida kvinnor och eliminerar helt kravet på vasektomerade män. För CD1-möss var effektiviteten av pseudograviditetsinduktion med cervikal manipulation 83% för kvinnor i estrus (N = 76) men endast 38% av kvinnorna i estrus pluggades av vasektomerade män (N = 24). Artificiell insemination hos CD1-möss utfördes genom estrussynkronisering med hormoner, cervikal manipulation och livmoderöverföring av spermier. Mottagare av artificiell insemination som fick cervikal manipulation (N = 76) hade en graviditetsfrekvens på 72% och en genomsnittlig kullstorlek på 8,3 valpar. Denna metod kan också användas för att producera pseudogravida kvinnor för icke-kirurgisk embryoöverföring. Därför är inducering av pseudograviditet genom cervikal manipulation ett bekvämt och effektivt alternativ till parning med en vasektomerad hane när man utför icke-kirurgiska assisterade reproduktionstekniker. Användning av cervikal manipulation ger 3R (ersättning, reduktion och förfining) fördelar för assisterad reproduktionsteknik genom att minska antalet djur som krävs och eliminera behovet av kirurgiskt förändrade män.
Introduction
Assisterad reproduktionsteknik används för produktion av genetiskt modifierade musmodeller, liksom återvinning av stammar från kryokonservering, rehärledning av stammar från en nedsatt hälsostatus och strategisk vivariumhantering, inklusive produktion av åldersmatchade kohorter. Alla assisterade reproduktionstekniker hos möss kräver användning av pseudogravida kvinnliga mottagare för embryoutveckling. Historiskt sett har pseudogravida mottagare genererats genom parning med sterila hanar, som antingen är kirurgiskt vasektomerade eller genetiskt infertila, och närvaron av en kopulationsplugg bedöms följande morgon1. Nyligen har ett protokoll för sonisk stimulering hos möss utvecklats för kirurgisk överföring av pronukleära eller tvåcelliga musembryon2. Vi har också utvecklat ett cervikal manipulationsprotokoll (CM) för användning med artificiell insemination och icke-kirurgisk embryoöverföring av blastocyster. Anledningen till användningen av förfarandet är att ge en 3R-minskning av antalet djur som krävs (kräver inte längre hanmöss) och en förfining av de använda teknikerna (som inte längre kräver kirurgisk vasektomiprocedur för hanmöss). Beskrivningen av detta protokoll inkluderar tillhörande assisterad reproduktionsteknik för att underlätta integrationen av CM i normala arbetsflöden. Det övergripande målet med CM-metoden är att ersätta användningen av hanmöss vid generering av pseudogravida honor för assisterad befruktning, inklusive artificiell insemination och embryoöverföring.
CM-protokollet som beskrivs här utvecklades först för att hjälpa till med artificiell insemination hos möss. Det artificiella inseminationsprotokollet, som ursprungligen beskrivits, uppnådde en graviditetshastighet på 50%, med en genomsnittlig kullstorlek på 7 valpar3. CD1-mottagarmöss var estrous synkroniserade med en låg dos hormoner, inklusive serumgonadotropin (PMSG) och humant koriongonadotropin (hCG), vid ett 47-timmarsintervall före insemination. En fördel med estrous synkronisering var att det tillät användning av protokollet under normal arbetstid. Kvinnor parades med vasektomerade män omedelbart efter artificiell insemination, och parning bekräftades av närvaron av en kopulationsplugg. Inkonsekvens i parningshastigheten med mottagare rapporterades som en svårighet i proceduren. Därför söktes alternativ till parning för induktion av pseudograviditet.
Den aktuella studien presenterar en standardiserad CM-teknik för att öka effektiviteten vid produktion av pseudogravida kvinnor. För kvinnor i estrus eller proestrus sätts den trubbiga änden av en liten plaststav vaginalt in för att komma i kontakt med livmoderhalsen och vibreras i 30 s genom kontakt med en trimmer. Förfarandet utförs på en trådtoppad bur. Ingen anestesi eller analgesi krävs. CM-tekniken är lämplig för att producera pseudogravida kvinnor, som kan producera kullar efter icke-kirurgisk artificiell insemination utan behov av parning med vasektomerade män. CM kan också användas för produktion av pseudogravida kvinnor som mottagare av embryoöverföring. Specifikt kan CM-tekniken paras ihop med icke-kirurgisk embryoöverföring, som beskrivs här. Icke-kirurgiska metoder har visat sig vara effektiva för embryoöverföring av embryon i blastocyststadiet hos mus 4,5 och råtta 6,7. Eftersom denna icke-kirurgiska metod är ett effektivt alternativ till kirurgiska metoder anses det vara en 3R-förfining av tekniken. Baserat på tidigare forskning indikerar fekala kortikosteronnivåer, som ett mått på stress, att procedurens icke-kirurgiska karaktär inte ökar stressnivåerna hos gnagare 7,8. Ingreppen är mindre tekniskt utmanande än kirurgisk embryoöverföring och är mycket snabbare att utföra. När embryon överförs till livmodern måste embryon i rätt stadium för livmoderutveckling överföras. För möss överförs blastocyster till 2,5 dagar post coitum (dpc) pseudogravida mottagare.
För de två icke-kirurgiska tekniker som beskrivs här skiljer sig tidpunkten för hormonadministrering och CM-tekniken. Tidpunkten för CM-proceduren i förhållande till estrus är viktig för framgång, eftersom den ersätter naturlig parning för produktion av pseudogravida mottagare. Genom att eliminera behovet av vasektomerade män för att inducera pseudograviditet, ger denna procedur 3R-fördelar genom att både minska antalet djur som krävs och eliminera behovet av kirurgiskt förändrade män. Förfarandet i sig är snabbt (30 s) och kräver inte anestesi eller analgesi. Tekniken ökar kraftigt tillförlitligheten och förutsägbarheten för att producera pseudogravida kvinnor för assisterad befruktning.
Protocol
Alla tillämpliga internationella, nationella och institutionella riktlinjer för vård och användning av djur följdes. Alla procedurer som utfördes i studier på djur var i enlighet med de etiska normerna från ParaTechs Corporation Institutional Animal Care and Use Committee och genomfördes enligt de standarder som dikterats av Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health, Public Health Service, United States Department of Health and Human Services. Manliga och kvinnliga CD1 (ICR) och kvinnliga C57Bl / 6J möss i åldern >8 veckor gamla användes för den aktuella studien. Djuren erhölls från kommersiella källor (se Materialförteckning).
1. Cervikal manipulationsprocedur för användning med artificiell insemination hos CD1-möss
- Synkroniserad ägglossning av kvinnliga möss på dag 1 och dag 3
- Injicera honmöss med 2,5 IE PMSG (se Materialtabell) genom intraperitoneal injektion (IP) dag 1, 0,5 timmar före starten av vivariums mörka cykel.
OBS: Varje manlig donator kommer att ge tillräckligt med spermier för 10 kvinnliga mottagare. - Injicera honorna med 2,5 IE hCG (se Materialtabell) genom IP-injektion på dag 3, 1 timme före starten av vivarium dark cycle.
OBS: Tidpunkterna för injektionerna, spermaöverföringen och ljuscykeln i förhållande till varandra är mycket viktiga. De tider som anges för alla procedurer i detta protokoll är baserade på en 12 timmars ljus/mörk cykel.
- Injicera honmöss med 2,5 IE PMSG (se Materialtabell) genom intraperitoneal injektion (IP) dag 1, 0,5 timmar före starten av vivariums mörka cykel.
- Insamling och kapacitering av färska spermier på dag 4
- Bered en 500 μl droppe spermieförinkubationsmedium (PM, se materialförteckning) i en 60 mm vävnadsodlingsskål under paraffinolja. Förbered en maträtt per manlig donator. Balansera i minst 30 minuter vid 37 °C och 5 %CO2 före spermauppsamling.
- Vid 1 h efter starten av vivariumljuscykeln, avliva hanen/hanarna enligt institutionella riktlinjer. Varje man kommer att ge tillräckligt med spermier för 10 artificiella inseminationer.
- Dissekera snabbt cauda epididymides från musen. Utför ett tvärgående buksnitt ovanför urinblåsan med hjälp av dissektion sax och tandad pincett.
- Testikelfettkuddarna är placerade på vardera sidan av urinblåsan. Ta tag i en av testikelfettkuddarna med böjda pincett och ta bort testiklarna och bitestiklarna från kroppshålan. Identifiera cauda epididymis som en platt oval rörformig struktur strax under testiklarna.
- Håll cauda epididymis med böjda pincett och resektera med en liten, vinklad sax. Ta bort båda cauda epididymiderna och överför dem till en absorberande vävnad för att avlägsna fett och blod under ett dissekerande mikroskop.
- Placera två cauda bitestiklar i varje 500 μl droppe ekvilibrerad PM under paraffinolja vid 37 °C. Skär vävnaden genom att göra sex snitt med en liten sax. Om mer än en manlig donator används, använd en epididymis från varje donator för varje spermaprov för att minska variationen mellan proverna.
- Snurra försiktigt skålen och låt spermierna lämna vävnaden i 3 minuter, virvla en gång i minuten. Ta bort alla vävnader.
- Inkubera spermaprovet i 45 minuter till 1 timme vid 37 °C och 5 %CO2 till kapacitering.
- Valfritt: Mät spermieantalet och bedöma rörligheten under ett mikroskop med hjälp av en hemocytometer. För räkning, späd spermierna i PM efter behov.
- Bekräftelse av estrous cykelsynkronisering genom cytologisk utvärdering
- Använd en liten, förfuktad pinne (se materialförteckning), samla försiktigt vaginala celler från vaginalväggen genom att rulla pinnen mot vävnaden, smörj dem i en 20 μL droppe sterilt vatten på ett mikroskopglas och lufttorka.
- Under ett mikroskop med 100x förstoring med ljusfältbelysning, utvärdera för närvaron av kornade epitelceller. Kvinnor i estrus eller sen brunst kommer att ha kornade epitelceller närvarande och bör väljas för cervikal manipulation.
- Valfritt: Anteckna vikten på de kvinnliga mottagarna före insemination.
- Utföra cervikal manipulation (CM)
- Cirka 0,5 h före insemination, placera en mottagande hona på toppen av en bur med ett galler, så att musen kan "ta tag i" burstångens yta. Ta tag i svansbasen med tummen och pekfingret och vinkla svansen uppåt medan djuret stabiliseras (figur 1).
Musen kommer att hålla sig stilla under hela proceduren när hanteringstekniken utförs korrekt. Om musen rör sig ur sitt läge flyttar du försiktigt och fortsätter. Om ett aggressivt djur väljs som mottagare kan det vara lugnande att låta djuret gå in i en anrikningstunnel under proceduren. Att använda tunneln är valfritt, men det kan hjälpa forskare att hantera djuren genom att ge en distraktion under denna procedur. - Sätt in den trubbiga änden av en liten plaststav (se Materialförteckning) vaginalt i kontakt med livmoderhalsen och vibrera i 30 s genom kontakt med en trimmer (se Materialförteckning).
OBS: Placera stången på plats innan trimmern startas. Båda hålls i ena handen under proceduren. Ingen anestesi eller analgesi krävs.
- Cirka 0,5 h före insemination, placera en mottagande hona på toppen av en bur med ett galler, så att musen kan "ta tag i" burstångens yta. Ta tag i svansbasen med tummen och pekfingret och vinkla svansen uppåt medan djuret stabiliseras (figur 1).
- Icke-kirurgisk spermaöverföring för artificiell insemination
- Placera inseminationsanordningen (se materialförteckning) på en P200-pipett inställd på 40 μl och ta bort skyddskåpan.
- Ta bort en alikvot av det kapacitaterade spermaprovet från skålen vid 37 °C och 5 %CO2 och överför den till en 35 mm vävnadsodlingsskål utan olja vid 37 °C. Spermaprovet kommer att användas omedelbart för överföring.
OBS: Spermierna kommer att förlora rörligheten snabbt utanför CO2-inkubatorn . Håll det kapaciterade spermaprovet vid 37 °C och 5%CO2 så mycket som möjligt. - Tryck pipettkolven till första stoppet, sänk kateterspetsen i spermaprovet vid 37 °C och ladda långsamt spermierna i överföringsanordningen. Undvik klumpar. Ta bort kvarvarande olja från inseminationsanordningens utsida med hjälp av en absorberande vävnad. Lägg pipetten åt sidan.
OBS: Överföring av paraffinolja till livmoderhornet måste undvikas. Ta bort kvarvarande olja från inseminationsanordningens utsida med hjälp av en absorberande vävnad. - Placera mottagarhonan på gallerburens topp. Håll musen på plats med samma hanteringsteknik som används för CM; Ta tag i svansens bas med tummen och pekfingret och vinkla svansen uppåt medan du stabiliserar djuret.
- Placera det lilla spekulumet (se materialförteckning) i slidan.
- Sätt in inseminationsenhetens kateter i spekulum, genom livmoderhalsen och in i livmodern. När enhetens nav kommer i kontakt med spekulum, fördela spermierna genom att trycka pipettkolven till det första stoppet. Undvik överföring av extra luft till livmoderhornet.
OBS: Om katetern inte är korrekt placerad kommer den att träffa vävnaden som omger livmoderhalsen, vilket gör att den böjer sig och så småningom böjs. Om katetern inte glider genom livmoderhalsen vid första försöket, försiktigt tillbaka katetern och försök igen tills den lyckas. Ompositionering av spekulum kan vara nödvändigt. - Ta bort enheten och spekulum. Ingen övervakning krävs efter proceduren.
- Valfritt: Graviditetskontroll dag 10-12
- Använd viktökning för att bestämma graviditetsstatus. Viktökning kommer att vara belastningsberoende, men en ökning med minst 1-2 g korrelerar med graviditet.
Figur 1: Mushållningstekniken för cervikal manipulation. Musen vilar på en trådbur topp och är stabiliserad i svansen och på båda sidor på framsidan av bakbenen. Den trubbiga änden av en liten plaststav sätts in vaginalt för att komma i kontakt med livmoderhalsen och vibreras genom kontakt med en trimmer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Icke-kirurgisk embryoöverföringsprocedur för användning med cervikal manipulation hos CD1-möss
- Synkroniserad ägglossning av honmössen på dag 1 och dag 3
- Injicera honmöss med 2,5 IE PMSG genom IP-injektion på dag 1, cirka 6 timmar efter starten av vivariumljuscykeln.
- Injicera honorna med 2,5 IE hCG genom IP-injektion dag 3, med 47 timmars intervall efter PMSG-injektionen eller cirka 5 timmar efter starten av vivarium-ljuscykeln.
- Bekräftelse av estrous cykelsynkronisering genom cytologisk utvärdering
- På dag 3, ca 1 h före CM, utför cytologi på de potentiella mottagarna. Använd en liten, förfuktad vattpinne, samla försiktigt vaginala celler från vaginalväggen genom att rulla pinnen mot vävnaden, smörj dem i en 20 μL droppe sterilt vatten på ett mikroskopglas och lufttorka.
- Under ett mikroskop med 100x förstoring med ljusfältbelysning, utvärdera för närvaron av kornade epitelceller. Kvinnor i estrus eller sen brunst kommer att ha kornade epitelceller närvarande och bör väljas för cervikal manipulation.
- Valfritt: Anteckna vikten av potentiella kvinnliga embryomottagare.
- Utför CM
- På dag 3, 1 h före starten av vivarium mörk cykel, placera en mottagande kvinna på toppen av en bur med ett galler, så att djuret kan "gripa" burstångens yta. Ta tag i svansbasen med pekfingret och tummen och vinkla sedan svansen uppåt medan djuret stabiliseras (figur 1).
Musen kommer att hålla sig stilla under hela proceduren när hanteringstekniken utförs korrekt. Om musen rör sig ur sitt läge flyttar du försiktigt och fortsätter. Om ett aggressivt djur väljs som mottagare kan det vara lugnande att låta djuret gå in i en anrikningstunnel under proceduren. - Sätt in den trubbiga änden av en liten plaststav vaginalt för att komma i kontakt med livmoderhalsen och vibrera den i 30 s genom kontakt med en trimmer.
OBS: Placera stången på plats innan trimmern startas. Båda hålls i ena handen under proceduren. Ingen anestesi eller analgesi krävs.
- På dag 3, 1 h före starten av vivarium mörk cykel, placera en mottagande kvinna på toppen av en bur med ett galler, så att djuret kan "gripa" burstångens yta. Ta tag i svansbasen med pekfingret och tummen och vinkla sedan svansen uppåt medan djuret stabiliseras (figur 1).
- Icke-kirurgisk embryoöverföring på dag 6
- Placera en droppe M2 medium på 20 μl (se Materialförteckning) på locket på en vävnadsodlingsskål.
OBS: Locket väljs eftersom det har en kortare kant och därmed är bekvämt för att komma åt embryon i droppen. Lägg aldrig paraffinolja över droppen M2, eftersom införandet av olja i livmoderhornet verkar påverka embryoöverföringen negativt. - Under ett mikroskop och med reflekterande belysning, ladda 10-20 blastocyster i mediedroppen med en vanlig embryohanteringspipett (se materialförteckning).
OBS: Det optimala antalet embryon att överföra beror på musstammen och eventuella manipulationer som embryona har genomgått. För friska omanipulerade embryon bör överföring av 10-15 embryon vara tillräcklig. För rederivation eller genetiskt modifierade embryon är det lämpligt att överföra fler embryon. - Fäst den icke-kirurgiska embryoöverföringsanordningen (se Materialförteckning) på en P2-pipett inställd på 1,8 μl. Ta bort skyddskateterlocket.
- Tryck pipettens kolv till det första stoppet, sänk kateterns spets i mediet och dra långsamt embryon in i enhetens kateterspets. Ta bort spetsen från mediet.
OBS: Visualisering av embryon under låg förstoring möjliggör enklare laddning av embryon i enheten. Om embryona är utspridda i droppen, skaka försiktigt skålen från sida till sida för att koncentrera embryona i mitten av droppen, eller flytta dem med en embryohanteringspipett. - Ställ in pipettvolymen på 2,0 μL för att generera en liten luftbubbla vid kateterns spets. Lägg försiktigt pipetten med embryon laddade nära musburet.
- Placera mottagarhonan på gallerburens topp. Håll musen på plats med samma hanteringsteknik som används för CM; Ta tag i svansens botten med pekfingret och tummen och vinkla sedan svansen uppåt medan du stabiliserar djuret.
- Placera ett litet spekulum (se materialförteckning) i slidan.
- Sätt in överföringsenhetens kateter i spekulum, genom livmoderhalsen och in i livmodern. När enhetens nav kommer i kontakt med spekulum, fördela embryona genom att trycka pipettkolven till det första stoppet. Undvik överföring av extra luft till livmoderhornet.
- Utan att släppa pipettkolven, ta bort enheten och spekulum. Ingen övervakning krävs efter proceduren.
- Placera en droppe M2 medium på 20 μl (se Materialförteckning) på locket på en vävnadsodlingsskål.
Representative Results
Eftersom elektrisk9 och sonisk10 cervikal stimulering har använts för att inducera pseudograviditet hos råttor, presenterar detta arbete en standardiserad mekanisk procedur som kan användas i möss. Vaginal cytologi kan hjälpa till vid identifiering av kvinnor i olika stadier av estrous. För att bekräfta pseudograviditet hos kvinnor användes samma metod. Först jämfördes cytologiprofiler för honor för CD1- och C57Bl/6-möss under hela brunstcyklerna, under graviditeten och under pseudograviditet inducerad av parning eller CM. Vaginala swabs togs från honorna och färgades med hjälp av ett Papanicolaou-färgningssystem (se materialtabell). Cellerna observerades under 100x förstoring med ljusfältbelysning. De observerade cellerna inkluderade leukocyter, kärnförsedda epitelceller och enukleatkornade epitelceller. Bestämningen av estrous cykelstadiet baserades på den relativa procentandelen av varje celltyp11,12. Estrus kännetecknas av övervägande av kornade epitelceller. När estrus slutar börjar metestrus och leukocyter börjar dyka upp, medan cornified epitelceller blir mindre uppenbara. Diestrus har måttlig till låg cellularitet, med leukocyter dominerande och kärnförsedda epitelceller som börjar dyka upp. Proestrus kännetecknas av förlusten av leukocyter, en ökning av kärnförsedda epitelceller och utseendet av kornade epitelceller. Efter proestrus börjar estrus, och cykeln fortsätter.
För att utveckla en baslinjeprofil registrerades vaginal cytologi under minst två hela eströsa cykler för varje hona (N = 20 för CD1, N = 20 för C57Bl/6) före parning. Cykellängderna och de individuella profilerna varierade mellan mössen; De förväntade allmänna trenderna observerades dock. Den genomsnittliga längden på en estrous cykel för CD1 och C57Bl / 6 möss var 3,8 dagar, med ett intervall på 3-5 dagar. Dagen innan naturlig parning inträffade var alla kvinnliga möss i proestrus. Efter parning utfördes cytologi igen 1,5 dagar efter coitum (dpc) tills estrous cykling återupptogs. Figur 2 visar den cytologiska profilen för pseudogravida CD1- och C57Bl/6-honor parade med vasektomerade hanar.
Figur 2: Cytologisk profil för pseudogravida honmöss. De genomsnittliga procentandelarna av varje celltyp för leukocyter, kärnförsedda epitelceller och kornförda epitelceller visas som en funktion av dagar efter coitum (DPC) för (A) CD1 (N = 20) och (B) C57Bl/6 (N = 20) möss. Klicka här för att se en större version av denna figur.
I detta arbete har en CM-teknik standardiserats för att öka effektiviteten vid produktion av pseudogravida kvinnor. För kvinnor i estrus eller proestrus sätts den trubbiga änden av en liten plaststav vaginalt in för att komma i kontakt med livmoderhalsen och vibreras i 30 s genom kontakt med en trimmer. Förfarandet utförs på en trådtoppad bur. Ingen anestesi eller analgesi krävs. För att bestämma effektiviteten av CM-proceduren jämfördes vaginal cytologi för kvinnliga CD1 (N = 20) och C57Bl / 6 (N = 20) möss efter parning med vasektomerade män och efter CM (totalt N = 40). Den cytologiska profilen för pseudograviditet inducerad av CM liknade profilen för pseudograviditet inducerad genom parning, som visas i figur 3.
Figur 3: Cytologisk profil för pseudogravida honmöss efter cervikal manipulation (CM). Procentandelen av varje celltyp för leukocyter, kärnepitelceller och kornade epitelceller visas som en funktion av dagar efter coitum (DPC) eller dagar efter cervikal manipulation (DPCM). De genomsnittliga celltypsprocenterna visas för CD1- och C57Bl/6-mössen (N = 40), (A) parade med vasektomerade hanar eller (B) efter CM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
För att avgöra om CM-tekniken är tillräcklig för att fastställa graviditet för assisterad reproduktion utfördes CM som en del av ett icke-kirurgiskt artificiellt inseminationsprotokoll (NSAI) hos CD1-kvinnor. Det artificiella inseminationsprotokollet inkluderade brunstsynkronisering av honorna med en låg dos av hormonerna PMSG och hCG före spermieöverföring. CM utfördes strax före spermaöverföringen. För CD1-möss var effektiviteten av pseudograviditetsinduktion med CM för kvinnor i estrus (N = 76) med denna teknik 83%. I ett kontrollexperiment pluggades endast 38% av kvinnorna i estrus av vasektomerade män (N = 24). De mottagare av artificiell insemination som fick cervikal manipulation (N = 76) hade en graviditetsfrekvens på 72% och en genomsnittlig kullstorlek på 8,3 valpar. Således är induktion av pseudograviditet av CM en bekväm och effektiv ersättning för parning med en vasektomerad man vid utförande av NSAI. Användning av CM för att förbereda CD1-mottagare (N = 4) i estrus för icke-kirurgisk embryoöverföring av färska CD1-blastocyster resulterade i en 100% graviditetsfrekvens. Överföringen av 9-15 embryon gav tre friska kullar med 45% födelsetal och en genomsnittlig kullstorlek på 6 valpar. I jämförelse hade CD1-mottagarna (N = 20) som parades med vasektomerade män för att inducera pseudograviditet en 80% graviditetsfrekvens och en 46% födelsetal efter överföringen av 20 färska B6C3F2-blastocyster.
Resultaten för assisterad befruktning kommer sannolikt att vara stamspecifika, eftersom variabler som dos och tidpunkt för hormonadministrering för superovulation har visat sig vara stamberoende13. Dessutom kan faktorer som mottagarens ålder och vikt påverka reaktionen på hormoner14. I detta arbete, när man utförde CM-proceduren för artificiell insemination, befanns endast kvinnor i sen proestrus eller estrus vara lyhörda. I allmänhet, för att öka antalet tillgängliga mottagare i en population, är honorna först brunstsynkroniserade med en låg dos hormoner3. Brunstsynkronisering med 2,5 IE PMSG och hCG var 78% effektiv för 11-14 veckor gamla CD1-honor (N = 27) och 60% effektiv för 18-32 veckor gamla C57Bl/6-honor (N = 22) i detta arbete. Effektiviteten av pseudograviditetsinduktion med cervikal manipulation på CD1-kvinnor var 83% för kvinnor i estrus (N = 76) och 82% (N = 100) för C57Bl/6-kvinnor i estrus med denna teknik.
Discussion
3R är en etisk ram för djuranvändning i forskning, som beskrevs 1959 av Russel och Burch i "The Principles of Humane Experimental Technique"15. 3R representerar ersättning, minskning och förfining i djuranvändning. Protokollen som markeras här är i linje med 3R. Den cervicala manipulationstekniken minskar antalet djur som behövs genom att inte längre kräva användning av män för att producera pseudogravida kvinnor. Tekniken eliminerar också behovet av att utföra vasektomier på männen, vilket ger förfining genom att minska smärta och nöd. De assisterade reproduktionstekniker som beskrivs här (artificiell insemination och embryoöverföring) är icke-kirurgiska och ger därför båda en 3R-förfining genom att minska smärta och ångest8orsakad av deras kirurgiska alternativ.
Användningen av pseudogravida kvinnor är nödvändig för återhämtning av valpar vid assisterad reproduktion hos möss1. CM-proceduren är en effektiv metod för att producera pseudogravida kvinnor, men synkroniseringen av fasen i brunstcykeln hos mottagarhonorna är ett kritiskt första steg i processen. Estrous synkronisering kan drastiskt minska antalet honor som behövs i kolonin för att förbereda potentiella mottagare och hjälper till att producera tidsinställda pseudogravida honor på begäran. Användning av en låg dos hormoner verkar inte orsaka några skadliga effekter på återhämtningen av levande kullar hos CD1-möss. Försiktighet måste iakttas med andra stammar för att hitta den hormon- och koncentrationskombination som ger de bästa mottagarhonorna för de överförda embryona eller spermierna. Synkronisering kan uppnås med PMSG och hCG16, men doser som producerar superovulerade honor kanske inte är lämpliga för en långvarig graviditet17.
För att avgöra om en kvinna är i estrus utfördes en cytologisk utvärdering i detta arbete. Estrousfasen kan också utvärderas genom observation av vaginalöppningen11,18. Även om denna metod är extremt användbar och kan användas av sig själv eller som bekräftelse, är den mer subjektiv än användningen av cytologi. Vaginal cytologi utan färgning är både snabb och effektiv för att välja kvinnor i estrus eftersom kornade epitelceller lätt kan identifieras. I detta protokoll utförs den cytologiska utvärderingen före CM för att bestämma potentiella mottagare. Det är viktigt att utföra cytologi före CM, eftersom proceduren tenderar att fragmentera cellerna som sloughed från vaginalområdet, vilket gör identifieringen svår. Cytologisk utvärdering för pseudograviditet eller graviditet kan utföras 3,5-11,5 dagar efter CM (dpcm) i 3 dagar i följd. Profilen för en estrous cyklande kvinna bör ha minst 1 dag med betydande infiltration av kornade epitelceller. Pseudogravida/dräktiga honor bör uppvisa en diestrusprofil (mestadels leukocyter med potentiellt lågt cellantal) under 3 dagar i följd.
Genom utvecklingen av CM-tekniken visade sig vissa möss vara mer mottagliga för proceduren än andra. CD1 kvinnliga möss är utmärkta kandidater på grund av deras lugna natur och utmärkta vårdande instinkter. Denna stam är lätt att hantera och fungerar bra under CM och icke-kirurgisk assisterad reproduktionsteknik. C57Bl/6-möss tenderar att vara mer aggressiva och mindre vårdande. Även om detta protokoll effektivt producerade pseudogravida C57Bl/6-honor med CM, var de mindre benägna att vara konsekvent tillåtande för proceduren. Detta tycktes korrelera något med estrousfasen under CM. Kvinnor i estrus eller proestrus var mer mottagliga. Användningen av ett anrikningsrör för djuret att komma in tillät tillgång till vagina för proceduren och hjälpte till att lugna kvinnan. Förfarandet i sig hindrar inte helt kvinnan, så djuret kan dra sig bort när som helst. Om detta inträffar kan djuret omplaceras, och proceduren kan sedan fortsättas. Tidpunkten för proceduren stannar om kvinnan går bort och återupptas när proceduren återupptas. Avgörande för procedurens framgång är fasen av estrouscykeln (sen proestrus och estrus) och stångens kontakt med livmoderhalsen. Trimmerens vibrationer ger standardiserad CM. För att säkerställa kontakt med livmoderhalsen appliceras försiktigt tryck på stången, och stångens placering mot livmoderhalsen säkerställs med små fram och tillbaka rörelser av stången.
Användningen av CM har förbättrat NSAI-protokollet, eftersom honor i rätt fas av estrouscykeln kan väljas före spermieöverföring, och protokollet är inte längre beroende av parning med vasektomerade män. Den artificiella inseminationen estrous cykel synkronisering är tidsinställd så att oocytmognad motsvarar spermieöverföring på morgonen dag 4. Avgörande för protokollets framgång är anpassningen av tidpunkten för ägglossningen så att befruktning kan ske. Försiktighet måste iakttas för att administrera hCG 15-17 h före förväntad spermieöverföring, vilket föreslås för de tidpunkter som används för in vitro-fertilisering 1. Kvaliteten på spermaprovet kommer direkt att påverka resultatet av artificiell insemination. Färska spermier som har kapacitaterats kommer att fungera bäst. Kryokonserverade spermier av god kvalitet kan producera befruktade embryon in vivo. Försiktighet bör dock iakttas vid direkt överföring av tinade spermier, eftersom kvarvarande kryoprotektiva medel som överförs till livmoderhornet kan hämma implantation (opublicerade observationer).
Användningen av CM i samband med embryoöverföring är konceptuellt en enkel anpassning. Estrous cykelsynkronisering minskar antalet honor som behövs för att producera mottagarpoolen. Bestämning av estrousstadiet före CM ökar sannolikheten för att erhålla pseudogravida mottagare. En nackdel med metoden är att mottagarens cytologi vid tidpunkten för embryoöverföringen befinner sig i ett flödesstadium. Alla celltyper är närvarande om honan övergår från estrus till pseudograviditetsprofilen, och pseudograviditet blir uppenbar endast om cytologin spåras i flera dagar. Baserat på framgången (>80%) med övergången från brunst till pseudograviditet för CD1- och C57Bl/6-möss förväntas denna metod vara lämplig för embryoöverföringsmottagare. De preliminära resultaten visar goda framgångar med begränsad icke-kirurgisk embryoöverföring. I allmänhet är effektiviteten hos icke-kirurgisk embryoöverföring jämförbar med den för kirurgisk teknik4,5, och icke-kirurgisk överföring kan ersätta kirurgiska embryoöverföringar i blastocyststadiet. För embryon i tidigare stadium krävs embryoodling till blastocyststadiet. Om en kirurgisk överföring föredras är det dock möjligt att anpassa CM-tekniken till rätt tidpunkt som behövs för lämpliga pseudogravida mottagare2. I allmänhet är embryomottagarna 1 dag mindre avancerade än embryot. Till exempel skördas blastocyster vid 3,5 dpc från givare och överförs till 2,5 dpc-mottagare. Därför måste CM utföras så att mottagaren är i ett mindre utvecklat pseudogravid tillstånd än embryon.
Sammanfattningsvis visar CM-tekniken som beskrivs här utmärkt löfte för integration med andra assisterade reproduktionstekniker för möss. Vi har tillhandahållit framgångsrika protokoll för artificiell insemination och embryoöverföring med hjälp av icke-kirurgiska tekniker. I kombination ger CM-tekniken 3R-fördelar, inklusive (1) en minskning av antalet djur genom att eliminera behovet av vasektomerade män och (2) en förfining av tekniker genom att ersätta kirurgiska tekniker med icke-kirurgiska alternativ.
Disclosures
Barbara Stone och Sarah Srodulski är båda anställda på ParaTechs Corporation, Lexington, KY, USA. ParaTechs har exklusiva licensrättigheter att tillverka mNSET-enheten för möss. ParaTechs Corp har utvecklat och säljer mNSET- och mC&I-enheterna, som kan användas för icke-kirurgisk embryoöverföring respektive icke-kirurgisk artificiell insemination.
Acknowledgments
Forskningen som rapporteras i denna publikation stöddes av Office of the Director, Office of Research Infrastructure Programs, vid National Institutes of Health under Award Number R43OD020304 och National Institute of Mental Health vid National Institutes of Health under Award Number R44MH122117. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blastocyst stage embryos | |||
| CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
| Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
| Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
| Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
| human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
| Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
| Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
| Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
| mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
| Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
| Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
| Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
| Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
| Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
| Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
| Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
| Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
| Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
| Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
| Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
| Wire bar topped mouse cage |
References
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, fourth edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2014).
- Wake, Y., et al. Successful induction of pseudopregnancy using sonic vibration in mice. Scientific Reports. 13 (1), 3604 (2023).
- Stone, B. J., Steele, K. H., Fath-Goodin, A. A rapid and effective nonsurgical artificial insemination protocol using the NSET device for sperm transfer in mice without anesthesia. Transgenic Research. 24 (4), 775-781 (2015).
- Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. BioTechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Stone, B. J., et al. A nonsurgical embryo transfer technique for fresh and cultured blastocysts in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (5), 488-495 (2020).
- Steele, K. H., et al. Nonsurgical embryo transfer device compared with surgery for embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 17-21 (2013).
- Terkel, J., Witcher, J. A., Adler, N. T. Evidence for "memory" of cervical stimulation for the promotion of pregnancy in rats. Hormones and Behavior. 24 (1), 40-49 (1990).
- Kaneko, T., Endo, M., Tsunoda, S., Nakagawa, Y., Abe, H. Simple induction of pseudopregnancy by artificial stimulation using a sonic vibration in rats. Scientific Reports. 10 (1), 2729 (2020).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Luo, C., et al. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (4), 471-478 (2011).
- Gates, A. H. Viability and developmental capacity of eggs from immature mice treated with gonadotrophins. Nature. 177 (4512), 754-755 (1956).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co., Ltd. London, UK. (1959).
- Hasegawa, A., et al. Efficient and scheduled production of pseudopregnant female mice for embryo transfer by estrous cycle synchronization. Journal of Reproduction and Development. 63 (6), 539-545 (2017).
- Beaumont, H. M., Smith, A. F. Embryonic mortality during the pre- and post-implantation periods of pregnancy in mature mice after superovulation. Journal of Reproduction and Fertility. 45 (3), 437-448 (1975).
- Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
