Summary
El método de manipulación cervical presentado puede inducir pseudoembarazo en ratones sin necesidad de reproductoras con machos vasectomizados. La inducción del pseudoembarazo es necesaria para el éxito de la transferencia embrionaria no quirúrgica y de la inseminación artificial no quirúrgica, que también se presentan.
Abstract
Para mantener con éxito el embarazo con transferencia de embriones o inseminación artificial, las hembras receptoras deben ser inducidas a un estado de pseudopreñez. Los ratones hembra se emparejan tradicionalmente durante la noche con machos vasectomizados y, a la mañana siguiente, se evalúa la presencia de un tapón de cópula. Para aumentar la eficiencia de la producción de hembras pseudopreñadas, se ha estandarizado una técnica de manipulación cervical para ser utilizada en combinación con técnicas no quirúrgicas de transferencia embrionaria o inseminación artificial en ratones. El extremo romo de una pequeña varilla de plástico se inserta por vía vaginal para entrar en contacto con el cuello uterino y se hace vibrar durante 30 s por contacto con una recortadora. El procedimiento es rápido y no requiere anestesia ni analgesia. Esta técnica aumenta la fiabilidad y la previsibilidad de la producción de hembras pseudopreñadas y elimina por completo la necesidad de machos vasectomizados. Para los ratones CD1, la eficacia de la inducción del pseudoembarazo mediante la manipulación cervical fue del 83% para las hembras en celo (N = 76), pero solo el 38% de las hembras en celo fueron tapadas por machos vasectomizados (N = 24). La inseminación artificial en ratones CD1 se realizó mediante la sincronización del celo con hormonas, la manipulación cervical y la transferencia uterina de espermatozoides. Las receptoras de inseminación artificial que recibieron manipulación cervical (N = 76) tuvieron una tasa de embarazo del 72% y un tamaño promedio de camada de 8,3 crías. Este método también se puede utilizar para producir hembras pseudopreñadas para la transferencia de embriones no quirúrgicos. Por lo tanto, la inducción de pseudoembarazo mediante manipulación cervical es una alternativa conveniente y eficiente al apareamiento con un macho vasectomizado cuando se realizan técnicas de reproducción asistida no quirúrgicas. El uso de la manipulación cervical proporciona beneficios de las 3R (reemplazo, reducción y refinamiento) para las técnicas de reproducción asistida al reducir el número de animales necesarios y eliminar la necesidad de machos alterados quirúrgicamente.
Introduction
Las tecnologías de reproducción asistida se utilizan para la producción de modelos de ratón modificados genéticamente, así como para la recuperación de cepas a partir de la criopreservación, la rederivación de cepas de un estado de salud comprometido y la gestión estratégica de los viverías, incluida la producción de cohortes de la misma edad. Todas las técnicas de reproducción asistida en ratones requieren el uso de receptoras pseudoembarazadas para el desarrollo embrionario. Históricamente, las receptoras pseudoembarazadas se han generado por apareamiento con machos estériles, que son vasectomizados quirúrgicamente o genéticamente infértiles, y la presencia de un tapón de cópula se evalúa a la mañana siguiente1. Recientemente, se ha desarrollado un protocolo de estimulación sónica en ratones para la transferencia quirúrgica de embriones pronucleares o de ratón de dos células2. También hemos desarrollado un protocolo de manipulación cervical (MC) para su uso con la inseminación artificial y la transferencia embrionaria no quirúrgica de blastocistos. La razón para el uso del procedimiento es proporcionar una reducción de 3Rs en el número de animales necesarios (ya no requiere ratones machos) y un refinamiento de las técnicas utilizadas (ya no es necesario el procedimiento de vasectomía quirúrgica para ratones machos). La descripción de este protocolo incluye la técnica de reproducción asistida asociada para ayudar a la integración de la MC en los flujos de trabajo normales. El objetivo general del método MC es sustituir el uso de ratones machos en la generación de hembras pseudopreñadas por técnicas de reproducción asistida, incluyendo la inseminación artificial y la transferencia embrionaria.
El protocolo de MC descrito aquí se desarrolló por primera vez para ayudar con la inseminación artificial en ratones. El protocolo de inseminación artificial, tal como se describió originalmente, logró una tasa de preñez del 50%, con un tamaño promedio de camada de 7 crías3. Los ratones receptores de CD1 fueron sincronizados en celo con una dosis baja de hormonas, incluyendo gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) y gonadotropina coriónica humana (hCG), en un intervalo de 47 h antes de la inseminación. Una ventaja de la sincronización estral era que permitía el uso del protocolo durante las horas normales de trabajo. Las hembras fueron emparejadas con machos vasectomizados inmediatamente después de la inseminación artificial, y el apareamiento fue confirmado por la presencia de un tapón de cópula. La inconsistencia en la tasa de apareamiento con los receptores fue reportada como una dificultad en el procedimiento. Por lo tanto, se buscaron alternativas al apareamiento para la inducción del pseudoembarazo.
En el presente estudio se presenta una técnica estandarizada de MC para aumentar la eficiencia de la producción de hembras pseudopreñadas. En el caso de las hembras en celo o celo, el extremo romo de una pequeña varilla de plástico se inserta por vía vaginal para entrar en contacto con el cuello uterino y se hace vibrar durante 30 s por contacto con una recortadora. El procedimiento se realiza en una jaula con tapa de alambre. No se requiere anestesia ni analgesia. La técnica de MC es conveniente para la producción de hembras pseudopreñadas, que pueden producir camadas después de una inseminación artificial no quirúrgica sin necesidad de apareamiento con machos vasectomizados. La MC también se puede utilizar para la producción de hembras pseudopreñadas como receptoras de la transferencia de embriones. Específicamente, la técnica de MC se puede combinar con la transferencia de embriones no quirúrgica, como se describe aquí. Los métodos no quirúrgicos han demostrado ser eficaces para la transferencia embrionaria de embriones en estadio de blastocisto en ratones 4,5y ratas 6,7. Como este método no quirúrgico es una alternativa eficaz a los métodos quirúrgicos, se considera un refinamiento de las 3R de la técnica. Con base en investigaciones previas, los niveles de corticosterona fecal, como medida de estrés, indican que la naturaleza no quirúrgica del procedimiento no aumenta los niveles de estrés en roedores 7,8. Los procedimientos son menos desafiantes técnicamente que la transferencia quirúrgica de embriones y son mucho más rápidos de realizar. A medida que los embriones se transfieren al útero, se deben transferir embriones de la etapa correcta para el desarrollo uterino. En el caso de los ratones, los blastocistos se transfieren a receptoras pseudoembarazadas 2,5 días después del coito (dpc).
Para las dos técnicas no quirúrgicas descritas aquí, el momento de la administración de la hormona y la técnica de MC difieren. El momento del procedimiento de MC en relación con el celo es importante para el éxito, ya que reemplaza el apareamiento natural para la producción de receptoras pseudoembarazadas. Al eliminar la necesidad de que los machos vasectomizados induzcan el pseudoembarazo, este procedimiento proporciona los beneficios de las 3R al reducir el número de animales necesarios y eliminar la necesidad de machos alterados quirúrgicamente. El procedimiento en sí es rápido (30 s) y no requiere anestesia ni analgesia. La técnica aumenta en gran medida la fiabilidad y la previsibilidad de la producción de hembras pseudopreñadas para reproducción asistida.
Protocol
Se siguieron todas las directrices internacionales, nacionales e institucionales aplicables para el cuidado y uso de los animales. Todos los procedimientos realizados en los estudios con animales se realizaron de acuerdo con las normas éticas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de ParaTechs Corporation y se llevaron a cabo bajo las normas dictadas por la Oficina de Bienestar de Animales de Laboratorio, Institutos Nacionales de Salud, Servicio de Salud Pública, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos y hembras CD1(ICR) y hembras C57Bl/6J de >8 semanas de edad. Los animales se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales).
1. Procedimiento de manipulación cervical para su uso con inseminación artificial en ratones CD1
- Ovulación sincronizada de ratones hembra en el día 1 y el día 3
- Inyectar a los ratones hembra 2,5 UI de PMSG (ver Tabla de materiales) mediante inyección intraperitoneal (IP) el día 1, 0,5 h antes del inicio del ciclo de oscuridad del vivario.
NOTA: Cada donante masculino proporcionará suficiente esperma para 10 receptoras femeninas. - Inyectar a las hembras con 2,5 UI de hCG (ver Tabla de Materiales) mediante inyección IP el día 3, 1 h antes del inicio del ciclo de oscuridad del vivario.
NOTA: Los tiempos de las inyecciones, la transferencia de esperma y el ciclo de luz entre sí son muy importantes. Los tiempos especificados para todos los procedimientos en este protocolo se basan en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.
- Inyectar a los ratones hembra 2,5 UI de PMSG (ver Tabla de materiales) mediante inyección intraperitoneal (IP) el día 1, 0,5 h antes del inicio del ciclo de oscuridad del vivario.
- Recolección y capacitación de espermatozoides frescos en el día 4
- Preparar una gota de 500 μL de medio de preincubación de espermatozoides (PM, ver Tabla de Materiales) en una placa de cultivo de tejidos de 60 mm bajo aceite de parafina. Prepare un plato por donante masculino. Equilibrar durante al menos 30 minutos a 37 °C y 5% de CO2 antes de la recolección de espermatozoides.
- A 1 h después del inicio del ciclo de luz del vivero, eutanasiar al macho o machos de acuerdo con las pautas institucionales. Cada macho proporcionará suficiente esperma para 10 inseminaciones artificiales.
- Disecciona rápidamente los epidídidos de la cola del ratón. Realice una incisión abdominal transversal por encima de la vejiga con tijeras de disección y pinzas dentadas.
- Las almohadillas de grasa testicular se encuentran a ambos lados de la vejiga. Sujete una de las almohadillas de grasa testicular con pinzas curvas y retire el testículo y el epidídimo de la cavidad corporal. Identifique la cola epididimaria como una estructura tubular ovalada plana justo debajo del testículo.
- Sostenga la cola epidídimo con pinzas curvas y reseque con unas tijeras pequeñas y anguladas. Retire ambos epidídimos de la cola y transfiéralos a un tejido absorbente para eliminar la grasa y la sangre bajo un microscopio de disección.
- Colocar dos epidídimos de cauda en cada gota de 500 μL de PM equilibrada bajo aceite de parafina a 37 °C. Corta el tejido haciendo seis incisiones con unas tijeras pequeñas. Si se utiliza más de un donante masculino, utilice un epidídimo de cada donante para cada muestra de esperma para reducir la variación entre muestras.
- Agite suavemente el plato y deje que los espermatozoides salgan del tejido durante 3 minutos, girando una vez por minuto. Retira todos los pañuelos.
- Incubar la muestra de semen durante 45 min a 1 h a 37 °C y 5% de CO2 para capacitar.
- Opcional: Mida el recuento de espermatozoides y evalúe la motilidad bajo un microscopio con un hemocitómetro. Para el recuento, diluya los espermatozoides en PM según sea necesario.
- Confirmación de la sincronización del ciclo estral mediante evaluación citológica
- Con un hisopo pequeño y prehumedecido (ver Tabla de materiales), recoja suavemente las células vaginales de la pared vaginal haciendo rodar el hisopo contra el tejido, úntelas en una gota de 20 μL de agua estéril en un portaobjetos de microscopio y séquelas al aire.
- Bajo un microscopio con un aumento de 100x con iluminación de campo claro, evalúe la presencia de células epiteliales cornificadas. Las hembras en celo o proestro tardío tendrán células epiteliales cornificadas presentes y deben ser seleccionadas para la manipulación cervical.
- Opcional: Registre el peso de las receptoras antes de la inseminación.
- Realización de la manipulación cervical (MC)
- Aproximadamente 0,5 h antes de la inseminación, coloque una hembra receptora en la parte superior de una jaula con una rejilla de alambre, permitiendo que el ratón "agarre" la superficie de la barra de la jaula. Agarre cerca de la base de la cola con el pulgar y el índice e incline la cola hacia arriba mientras estabiliza al animal (Figura 1).
NOTA: El mouse se mantendrá quieto durante la duración del procedimiento cuando la técnica de manipulación se realice correctamente. Si el ratón se mueve fuera de posición, cambie suavemente la posición y continúe. Si se elige a un animal agresivo como receptor, permitir que el animal entre en un túnel de enriquecimiento durante el procedimiento puede ser tranquilizador. El uso del túnel es opcional, pero puede ayudar a los investigadores en el manejo de los animales al proporcionar una distracción durante este procedimiento. - Inserte el extremo romo de una pequeña varilla de plástico (ver Tabla de Materiales) por vía vaginal para que entre en contacto con el cuello uterino y vibre durante 30 s por contacto con una recortadora (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Coloque la varilla en su posición antes de encender la recortadora. Ambos se sostienen en una mano durante el procedimiento. No se requiere anestesia ni analgesia.
- Aproximadamente 0,5 h antes de la inseminación, coloque una hembra receptora en la parte superior de una jaula con una rejilla de alambre, permitiendo que el ratón "agarre" la superficie de la barra de la jaula. Agarre cerca de la base de la cola con el pulgar y el índice e incline la cola hacia arriba mientras estabiliza al animal (Figura 1).
- Transferencia de esperma no quirúrgica para inseminación artificial
- Coloque el dispositivo de inseminación (consulte la tabla de materiales) sobre una pipeta P200 ajustada a 40 μL y retire la cubierta protectora.
- Extraer una alícuota de la muestra de semen capacitada de la placa a 37 °C y 5% de CO2, y transferirla a una placa de cultivo de tejidos de 35 mm sin aceite a 37 °C. La muestra de semen se utilizará inmediatamente para la transferencia.
NOTA: Los espermatozoides perderán motilidad rápidamente fuera de la incubadora de CO2 . Mantenga la muestra de esperma capacitada a 37 °C y 5% de CO2 tanto como sea posible. - Presione el émbolo de la pipeta hasta el primer tope, baje la punta del catéter en la muestra de esperma a 37 °C y cargue lentamente el esperma en el dispositivo de transferencia. Evite los grumos. Retire el aceite residual del exterior del dispositivo de inseminación con un pañuelo absorbente. Deje a un lado la pipeta.
NOTA: Se debe evitar la transferencia de aceite de parafina al cuerno uterino. Retire el aceite residual del exterior del dispositivo de inseminación con un pañuelo absorbente. - Coloque la hembra receptora en la parte superior de la jaula de la rejilla de alambre. Mantenga el mouse en posición utilizando la misma técnica de manejo utilizada para el CM; Agarre cerca de la base de la cola con el pulgar y el índice, e incline la cola hacia arriba mientras estabiliza al animal.
- Coloque el pequeño espéculo (ver Tabla de Materiales) en la vagina.
- Inserte el catéter del dispositivo de inseminación en el espéculo, a través del cuello uterino y dentro del útero. Una vez que el concentrador del dispositivo entre en contacto con el espéculo, dispense el esperma presionando el émbolo de la pipeta hasta el primer tope. Evite la transferencia de aire adicional al cuerno uterino.
NOTA: Si el catéter no se coloca correctamente, golpeará el tejido que rodea el cuello uterino, lo que hará que se flexione y eventualmente se doble. Si el catéter no se desliza a través del cuello uterino en el primer intento, retire suavemente el catéter y vuelva a intentarlo hasta que tenga éxito. Puede ser necesario reposicionar el espéculo. - Retire el dispositivo y el espéculo. No se requiere monitoreo posterior al procedimiento.
- Opcional: Control de embarazo en los días 10-12
- Utilice el aumento de peso para determinar el estado del embarazo. El aumento de peso dependerá de la tensión, pero un aumento de al menos 1-2 g se correlaciona con el embarazo.
Figura 1: La técnica de sostenimiento del ratón para la manipulación cervical. El ratón descansa sobre una jaula de alambre y está estabilizado en la cola y a ambos lados en la parte delantera de las patas traseras. El extremo romo de una pequeña varilla de plástico se inserta por vía vaginal para entrar en contacto con el cuello uterino y se hace vibrar por contacto con una recortadora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Procedimiento de transferencia embrionaria no quirúrgico para su uso con manipulación cervical en ratones CD1
- Ovulación sincronizada de las hembras en el día 1 y el día 3
- Inyecte a los ratones hembra 2,5 UI de PMSG mediante inyección IP el día 1, aproximadamente 6 h después del inicio del ciclo de luz del vivero.
- Inyectar a las hembras 2,5 UI de hCG mediante inyección IP el día 3, a un intervalo de 47 h después de la inyección de PMSG o aproximadamente 5 h después del inicio del ciclo de luz del vivero.
- Confirmación de la sincronización del ciclo estral mediante evaluación citológica
- El día 3, aproximadamente 1 h antes de la MC, realizar una citología a los posibles receptores. Con un hisopo pequeño y prehumedecido, recoja suavemente las células vaginales de la pared vaginal haciendo rodar el hisopo contra el tejido, úntelas en una gota de 20 μl de agua estéril en un portaobjetos de microscopio y séquelas al aire.
- Bajo un microscopio con un aumento de 100x con iluminación de campo claro, evalúe la presencia de células epiteliales cornificadas. Las hembras en celo o proestro tardío tendrán células epiteliales cornificadas presentes y deben ser seleccionadas para la manipulación cervical.
- Opcional: Registre el peso de las posibles receptoras de embriones femeninos.
- Realización del CM
- El día 3, 1 h antes del inicio del ciclo de oscuridad del vivero, coloque una hembra receptora en la parte superior de una jaula con una rejilla de alambre, permitiendo que el animal "agarre" la superficie de la barra de la jaula. Agarre cerca de la base de la cola con el índice y el pulgar, y luego incline la cola hacia arriba mientras estabiliza al animal (Figura 1).
NOTA: El mouse se mantendrá quieto durante la duración del procedimiento cuando la técnica de manipulación se realice correctamente. Si el mouse se mueve fuera de posición, vuelva a colocarlo suavemente y continúe. Si se elige a un animal agresivo como receptor, permitir que el animal entre en un túnel de enriquecimiento durante el procedimiento puede ser tranquilizador. - Inserte el extremo romo de una pequeña varilla de plástico por vía vaginal para que entre en contacto con el cuello uterino y hágalo vibrar durante 30 s por contacto con una recortadora.
NOTA: Coloque la varilla en su posición antes de encender la recortadora. Ambos se sostienen en una mano durante el procedimiento. No se requiere anestesia ni analgesia.
- El día 3, 1 h antes del inicio del ciclo de oscuridad del vivero, coloque una hembra receptora en la parte superior de una jaula con una rejilla de alambre, permitiendo que el animal "agarre" la superficie de la barra de la jaula. Agarre cerca de la base de la cola con el índice y el pulgar, y luego incline la cola hacia arriba mientras estabiliza al animal (Figura 1).
- Transferencia embrionaria no quirúrgica en el día 6
- Coloque una gota de 20 μL de medio M2 (consulte la tabla de materiales) en la tapa de una placa de cultivo de tejidos.
NOTA: Se elige la tapa porque tiene un borde más corto y, por lo tanto, es conveniente para acceder a los embriones en la gota. No coloque en ningún momento una capa de aceite de parafina sobre la gota de M2, ya que la introducción de aceite en el cuerno uterino parece afectar negativamente a la transferencia embrionaria. - Bajo un microscopio y utilizando iluminación reflectante, cargue de 10 a 20 blastocistos en la gota de medio utilizando una pipeta estándar para la manipulación de embriones (véase la Tabla de materiales).
NOTA: El número óptimo de embriones a transferir depende de la cepa de ratón y de las manipulaciones a las que se hayan sometido los embriones. Para embriones sanos no manipulados, la transferencia de 10-15 embriones debería ser suficiente. En el caso de embriones de rederivación o modificados genéticamente, es conveniente la transferencia de más embriones. - Fije el dispositivo de transferencia de embriones no quirúrgico (consulte la Tabla de materiales) en una pipeta P2 ajustada a 1,8 μL. Retire la cubierta protectora del catéter.
- Presione el émbolo de la pipeta hasta el primer tope, baje la punta del catéter en el medio y tire lentamente de los embriones hacia la punta del catéter del dispositivo. Retire la punta del medio.
NOTA: La visualización de los embriones con un aumento bajo permitirá una carga más fácil de los embriones en el dispositivo. Si los embriones están dispersos en la gota, agite suavemente el plato de lado a lado para concentrar los embriones en el centro de la gota, o recolóquelos con una pipeta de manipulación de embriones. - Ajuste el volumen de la pipeta a 2,0 μL para generar una pequeña burbuja de aire en la punta del catéter. Coloque suavemente la pipeta con los embriones cargados cerca de la jaula del ratón.
- Coloque la hembra receptora en la parte superior de la jaula de la rejilla de alambre. Mantenga el mouse en posición usando la misma técnica de manejo utilizada para CM; Agarre cerca de la base de la cola con el índice y el pulgar, y luego incline la cola hacia arriba mientras estabiliza al animal.
- Coloque un pequeño espéculo (ver Tabla de Materiales) en la vagina.
- Inserte el catéter del dispositivo de transferencia en el espéculo, a través del cuello uterino y dentro del útero. Una vez que el concentrador del dispositivo entre en contacto con el espéculo, dispense los embriones presionando el émbolo de la pipeta hasta el primer tope. Evite la transferencia de aire adicional al cuerno uterino.
- Sin soltar el émbolo de la pipeta, retire el dispositivo y el espéculo. No se requiere monitoreo posterior al procedimiento.
- Coloque una gota de 20 μL de medio M2 (consulte la tabla de materiales) en la tapa de una placa de cultivo de tejidos.
Representative Results
Dado que la estimulación cervical eléctrica9 y sónica10 se han utilizado para inducir pseudoembarazos en ratas, este trabajo presenta un procedimiento mecánico estandarizado que puede ser utilizado en ratones. La citología vaginal puede ayudar en la identificación de mujeres en varias etapas del celo. Para confirmar el pseudoembarazo en las hembras, se empleó este mismo método. En primer lugar, se compararon los perfiles citológicos de las hembras de ratones CD1 y C57Bl/6 a lo largo de los ciclos estrales, durante el embarazo y durante el pseudoembarazo inducido por apareamiento o MC. Se tomaron hisopos vaginales de las hembras y se tiñeron utilizando un sistema de tinción de Papanicolaou (ver Tabla de materiales). Las células se observaron con un aumento de 100x con iluminación de campo claro. Las células observadas incluyeron leucocitos, células epiteliales nucleadas y células epiteliales córneas anucleadas. La determinación de la etapa del ciclo estral se basó en el porcentaje relativo de cada tipo celular11,12. El estro se caracteriza por el predominio de células epiteliales cornificadas. A medida que termina el celo, comienza el metestro y comienzan a aparecer los leucocitos, mientras que las células epiteliales córneas se vuelven menos evidentes. El diestro tiene una celularidad de moderada a baja, con predominio de leucocitos y aparición de células epiteliales nucleadas. El proestro se distingue por la pérdida de leucocitos, un aumento de las células epiteliales nucleadas y la aparición de células epiteliales cornificadas. Después del celo, comienza el celo y el ciclo continúa.
Para desarrollar un perfil basal, se registró la citología vaginal durante al menos dos ciclos estrales completos para cada hembra (N = 20 para CD1, N = 20 para C57Bl/6) antes del apareamiento. La duración de los ciclos y los perfiles individuales variaron entre los ratones; sin embargo, se observaron las tendencias generales esperadas. La duración media de un ciclo estral para los ratones CD1 y C57Bl/6 fue de 3,8 días, con un rango de 3-5 días. El día antes de que se produjera el apareamiento natural, todos los ratones hembra estaban en celo. Después del apareamiento, se volvió a realizar citología 1,5 días después del coito (dpc) hasta que se reanudó el ciclo estral. En la Figura 2 se muestra el perfil citológico de hembras pseudopreñadas CD1 y C57Bl/6 apareadas con machos vasectomizados.
Figura 2: Perfil citológico de ratones hembra pseudopreñados. Los porcentajes promedio de cada tipo de célula para leucocitos, células epiteliales nucleadas y células epiteliales cornificadas se muestran en función de los días posteriores al coito (DPC) para ratones (A) CD1 (N = 20) y (B) C57Bl/6 (N = 20). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En este trabajo se ha estandarizado una técnica de MC para aumentar la eficiencia de la producción de hembras pseudopreñadas. En el caso de las hembras en celo o celo, el extremo romo de una pequeña varilla de plástico se inserta por vía vaginal para entrar en contacto con el cuello uterino y se hace vibrar durante 30 s por contacto con una recortadora. El procedimiento se realiza en una jaula con tapa de alambre. No se requiere anestesia ni analgesia. Para determinar la efectividad del procedimiento de MC, se comparó la citología vaginal de ratones hembra CD1 (N = 20) y C57Bl/6 (N = 20) después del apareamiento con machos vasectomizados y después de la MC (N total = 40). El perfil citológico del pseudoembarazo inducido por MC fue similar al perfil de pseudoembarazo inducido por apareamiento, como se muestra en la Figura 3.
Figura 3: Perfil citológico de ratones hembra pseudopreñados después de la manipulación cervical (MC). El porcentaje de cada tipo de célula para leucocitos, células epiteliales nucleadas y células epiteliales cornificadas se muestra en función de los días posteriores al coito (DPC) o los días posteriores a la manipulación cervical (DPCM). Los porcentajes promedio de tipo de célula se muestran para los ratones CD1 y C57Bl/6 (N = 40), (A) apareados con machos vasectomizados o (B) después de MC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para determinar si la técnica de MC es suficiente para establecer el embarazo para reproducción asistida, se realizó MC como parte de un protocolo de inseminación artificial no quirúrgica (NSAI) en hembras CD1. El protocolo de inseminación artificial incluyó la sincronización del celo de las hembras con una dosis baja de las hormonas PMSG y hCG antes de la transferencia de espermatozoides. La MC se realizó justo antes de la transferencia de espermatozoides. Para los ratones CD1, la eficiencia de la inducción del pseudoembarazo utilizando MC para hembras en celo (N = 76) con esta técnica fue del 83%. En un experimento de control, solo el 38% de las hembras en celo fueron taponadas por machos vasectomizados (N = 24). Las receptoras de inseminación artificial que recibieron manipulación cervical (N = 76) tuvieron una tasa de preñez del 72% y un tamaño promedio de camada de 8,3 crías. Por lo tanto, la inducción del pseudoembarazo por MC es un reemplazo conveniente y eficiente para el apareamiento con un macho vasectomizado cuando se realiza una NSAI. El uso de MC para preparar a las receptoras de CD1 (N = 4) en celo para la transferencia embrionaria no quirúrgica de blastocistos CD1 frescos dio como resultado una tasa de embarazo del 100%. La transferencia de 9-15 embriones produjo tres camadas sanas con una tasa de natalidad del 45% y un tamaño promedio de camada de 6 cachorros. En comparación, los receptores de CD1 (N = 20) que se aparearon con machos vasectomizados para inducir el pseudoembarazo tuvieron una tasa de embarazo del 80% y una tasa de natalidad del 46% después de la transferencia de 20 blastocistos B6C3F2 frescos.
Es probable que los resultados de las técnicas de reproducción asistida sean específicos de la cepa, ya que se ha encontrado que variables como la dosis y el momento de la administración de hormonas para la superovulación dependen de la cepa13. Además, factores como la edad y el peso del receptor pueden afectar la reacción a las hormonas14. En este trabajo, al realizar el procedimiento de MC para la inseminación artificial, solo se encontró que las hembras en proestro tardío o celo respondían. En general, para aumentar el número de receptores disponibles en una población, las hembras se sincronizan primero con el celo con una dosis baja dehormonas. La sincronización del celo con 2,5 UI de PMSG y hCG fue 78% efectiva para mujeres CD1 de 11-14 semanas de edad (N = 27) y 60% efectiva para mujeres C57Bl/6 de 18-32 semanas (N = 22) en este trabajo. La eficacia de la inducción del pseudoembarazo mediante manipulación cervical en hembras CD1 fue del 83% para las hembras en celo (N = 76) y del 82% (N = 100) para las hembras C57Bl/6 en celo con esta técnica.
Discussion
Las 3R son un marco ético para el uso de animales en la investigación, tal como lo describen en 1959 Russel y Burch en "The Principles of Humane Experimental Technique"15. Las 3R representan el reemplazo, la reducción y el refinamiento en el uso de animales. Los protocolos destacados aquí están alineados con las 3R. La técnica de manipulación cervical reduce el número de animales necesarios al no requerir el uso de machos para producir hembras pseudopreñadas. La técnica también elimina la necesidad de realizar vasectomías en los hombres, lo que proporciona refinamiento al reducir el dolor y la angustia. Las técnicas de reproducción asistida aquí descritas (inseminación artificial y transferencia embrionaria) son no quirúrgicas, por lo que ambas proporcionan un refinamiento de las 3R al reducir el dolor y la angustia8causados por sus alternativas quirúrgicas.
El uso de hembras pseudopreñadas es necesario para la recuperación de las crías cuando se realiza reproducción asistida en ratones1. El procedimiento de MC es un método eficaz para producir hembras pseudopreñadas, pero la sincronización de la fase del ciclo estral de las hembras receptoras es un primer paso crítico en el proceso. La sincronización estral puede reducir drásticamente el número de hembras necesarias en la colonia para preparar a los posibles receptores y ayuda a producir hembras pseudopreñadas programadas a demanda. El uso de una dosis baja de hormonas no parece causar ningún efecto deletéreo en la recuperación de camadas vivas en ratones CD1. Se debe tener cuidado con otras cepas para encontrar la combinación de hormonas y concentración que produzca las hembras receptoras de mejor calidad para los embriones o espermatozoides transferidos. La sincronización puede lograrse utilizando PMSG y hCG16, pero las dosis que producen hembras superovuladas pueden no ser apropiadas para un embarazo sostenido17.
Para determinar si una hembra se encuentra en celo, en este trabajo se realizó una evaluación citológica. La fase estral también puede ser evaluada por la observación de la abertura vaginal11,18. Si bien este método es extremadamente útil y se puede usar por sí solo o como confirmación, es más subjetivo que el uso de la citología. La citología vaginal sin tinción es rápida y eficaz para elegir hembras en celo porque las células epiteliales cornificadas se pueden identificar fácilmente. En este protocolo, la evaluación citológica se realiza antes de la MC para determinar los posibles receptores. Es importante realizar la citología antes de la MC, ya que el procedimiento tiende a fragmentar las células desprendidas de la zona vaginal, lo que dificulta su identificación. La evaluación citológica para pseudoembarazo o embarazo se puede realizar a los 3,5-11,5 días después de la MC (mcd) durante 3 días consecutivos. El perfil de una hembra ciclista en celo debe tener al menos 1 día con una infiltración considerable de células epiteliales cornificadas. Las hembras pseudogestantes/preñadas deben mostrar un perfil de diestro (en su mayoría leucocitos con un número de células potencialmente bajo) durante 3 días consecutivos.
A través del desarrollo de la técnica CM, se descubrió que algunos ratones eran más receptivos al procedimiento que otros. Los ratones hembra CD1 son excelentes candidatos debido a su naturaleza tranquila y sus excelentes instintos de crianza. Esta cepa es fácil de manejar y se comporta bien durante la MC y las técnicas de reproducción asistida no quirúrgica. Los ratones C57Bl/6 tienden a ser más agresivos y menos cariñosos. Si bien este protocolo produjo efectivamente hembras C57Bl/6 pseudoembarazadas que usaron MC, era menos probable que fueran consistentemente permisivas con el procedimiento. Esto pareció correlacionarse de alguna manera con la fase estral durante la MC. Las hembras en celo o proestro fueron más receptivas. El uso de un tubo de enriquecimiento para que el animal entrara permitió el acceso a la vagina para el procedimiento y ayudó a calmar a la hembra. El procedimiento en sí no restringe completamente a la hembra, por lo que el animal puede alejarse en cualquier momento. Si esto ocurre, el animal puede ser reposicionado y el procedimiento puede continuar. El momento del procedimiento se detiene si la hembra se aleja y se reanuda cuando se reanuda el procedimiento. Para el éxito del procedimiento son fundamentales la fase del ciclo estral (celo tardío y celo) y el contacto de la varilla con el cuello uterino. La vibración de la recortadora proporciona CM estandarizado. Para asegurar el contacto con el cuello uterino, se aplica una presión suave a la varilla, y el posicionamiento de la varilla contra el cuello uterino está asegurada con pequeños movimientos hacia adelante y hacia atrás de la varilla.
El uso de MC ha mejorado el protocolo NSAI, ya que las hembras en la fase correcta del ciclo estral pueden elegirse antes de la transferencia de esperma, y el protocolo ya no depende del apareamiento con machos vasectomizados. La sincronización del ciclo estral de la inseminación artificial se cronometra de tal manera que la maduración de los ovocitos corresponde a la transferencia de espermatozoides en la mañana del día 4. Para el éxito del protocolo es fundamental la adaptación del momento de la ovulación de modo que pueda producirse la fecundación. Se debe tener cuidado de administrar hCG 15-17 h antes de la transferencia espermática esperada, como se sugiere para los tiempos utilizados para la fertilización in vitro 1. La calidad de la muestra de semen afectará directamente al resultado de la inseminación artificial. Los espermatozoides frescos que han sido capacitados funcionarán mejor. Los espermatozoides criopreservados de buena calidad pueden producir embriones fertilizados in vivo. Sin embargo, se debe tener cuidado con la transferencia directa de espermatozoides descongelados, ya que los crioprotectores residuales transferidos al asta uterina pueden inhibir la implantación (observaciones no publicadas).
El uso de la MC junto con la transferencia embrionaria es conceptualmente una adaptación fácil. La sincronización del ciclo estral reduce el número de hembras necesarias para producir el grupo receptor. La determinación del estadio estral previo a la MC aumenta la probabilidad de obtener receptoras pseudoembarazadas. Un inconveniente del método es que la citología de las receptoras en el momento de la transferencia embrionaria se encuentra en una etapa de flujo. Todos los tipos de células están presentes si la hembra está en transición del perfil de celo al perfil de pseudoembarazo, y el pseudoembarazo se hace evidente solo si se realiza un seguimiento de la citología durante varios días. Sobre la base del éxito (>80%) de la transición del celo al pseudoembarazo en ratones CD1 y C57Bl/6, se espera que este método sea adecuado para los receptores de transferencia embrionaria. Los resultados preliminares muestran un buen éxito con la transferencia limitada de embriones no quirúrgicos. En general, la eficiencia de la transferencia embrionaria no quirúrgica es comparable a la de la técnica quirúrgica4,5, y la transferencia no quirúrgica puede sustituir a las transferencias embrionarias quirúrgicas en estadio de blastocisto. En el caso de los embriones en estadios más tempranos, se requiere el cultivo de embriones hasta el estadio de blastocisto. Sin embargo, si se prefiere una transferencia quirúrgica, es posible adaptar la técnica de MC al momento correcto necesario para las receptoras pseudoembarazadas apropiadas2. En general, los receptores de embriones están 1 día menos avanzados que el embrión. Por ejemplo, los blastocistos se recolectan a 3,5 dpc de los donantes y se transfieren a receptores de 2,5 dpc. Por lo tanto, será necesario realizar una MC de tal manera que la receptora se encuentre en un estado de pseudoembarazo menos desarrollado que los embriones.
En conclusión, la técnica de MC descrita aquí muestra una excelente promesa para la integración con otras técnicas de reproducción asistida para ratones. Hemos proporcionado protocolos exitosos para la inseminación artificial y la transferencia de embriones utilizando técnicas no quirúrgicas. En combinación, la técnica de MC proporciona ventajas de las 3R, incluyendo (1) una reducción en el número de animales al eliminar la necesidad de machos vasectomizados y (2) un refinamiento de las técnicas al reemplazar las técnicas quirúrgicas con alternativas no quirúrgicas.
Disclosures
Barbara Stone y Sarah Srodulski trabajan en ParaTechs Corporation, Lexington, KY, EE. UU. ParaTechs posee los derechos exclusivos de licencia para fabricar el dispositivo mNSET para ratones. ParaTechs Corp ha desarrollado y vende los dispositivos mNSET y mC&I, que se pueden utilizar para la transferencia de embriones no quirúrgicos y la inseminación artificial no quirúrgica, respectivamente.
Acknowledgments
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por la Oficina del Director, Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación, de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número R43OD020304 y el Instituto Nacional de Salud Mental de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número R44MH122117. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blastocyst stage embryos | |||
| CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
| Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
| Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
| Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
| human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
| Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
| Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
| Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
| mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
| Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
| Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
| Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
| Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
| Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
| Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
| Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
| Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
| Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
| Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
| Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
| Wire bar topped mouse cage |
References
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