Summary
제시된 자궁 경부 조작 방법은 정관 수술을받은 수컷과 암컷을 번식시킬 필요없이 생쥐에서 가임신을 유도 할 수 있습니다. 비수술적 배아 이식과 비수술적 인공수정의 성공을 위해서는 가임신유도가 필요하며, 이 두 가지 모두 제시되어 있다.
Abstract
배아 이식 또는 인공 수정으로 임신을 성공적으로 유지하려면 암컷 수용자 마우스를 가임신 상태로 유도해야 합니다. 암컷 마우스는 전통적으로 정관 수술을 받은 수컷과 하룻밤 사이에 짝을 이루고 다음날 아침 교미 플러그의 존재를 평가합니다. 가임신한 암컷 생산의 효율성을 높이기 위해 자궁경부 조작 기술이 생쥐의 비수술적 배아 이식 또는 인공 수정 기술과 함께 사용하도록 표준화되었습니다. 작은 플라스틱 막대의 뭉툭한 끝을 질로 삽입하여 자궁 경부에 접촉시키고 트리머와의 접촉으로 30 초 동안 진동합니다. 절차는 빠르며 마취 나 진통이 필요하지 않습니다. 이 기술은 가임신 한 여성을 생산하는 신뢰성과 예측 가능성을 높이고 정관 수술 된 남성에 대한 요구 사항을 완전히 제거합니다. CD1 마우스의 경우, 자궁 경부 조작을 이용한 가임신 유도의 효율은 발정기의 암컷의 경우 83%였지만(N = 76), 발정기의 암컷의 38%만이 정관 절제술을 받은 수컷에 의해 막혔습니다(N = 24). CD1 마우스에서의 인공 수정은 호르몬과의 발정 동기화, 자궁 경부 조작 및 정자의 자궁 이식에 의해 수행되었다. 자궁 경부 조작 (N = 76)을받은 인공 수정 수혜자의 임신율은 72 %이고 평균 새끼 크기는 8.3 마리였습니다. 이 방법은 또한 비수술적 배아 이식을 위한 가임신한 여성을 생산하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 자궁 경부 조작으로 가임신을 유도하는 것은 비수술적 보조 생식 기술을 수행할 때 정관 수술을 받은 남성과 교미하는 것보다 편리하고 효율적인 대안입니다. 자궁 경부 조작을 사용하면 필요한 동물의 수를 줄이고 외과적으로 변형된 수컷의 필요성을 제거함으로써 보조 생식 기술에 대한 3R(대체, 감소 및 개선) 이점을 제공합니다.
Introduction
보조 생식 기술은 유전자 변형 마우스 모델의 생산뿐만 아니라 냉동 보존에서 균주의 회수, 손상된 건강 상태에서 균주의 재유도, 연령 일치 코호트 생산을 포함한 전략적 동물 사육장 관리에 사용됩니다. 생쥐의 모든 보조 생식 기술은 배아 발달을 위해 가임신한 여성 수용자를 사용해야 합니다. 역사적으로 가임신한 수혜자는 외과적으로 정관 수술을 받았거나 유전적으로 불임인 불임 수컷과 교미하여 생성되었으며 교미 플러그의 존재 여부는 다음 날 아침1. 최근에, 마우스의 음파 자극을 위한 프로토콜이 전핵 또는 2세포 마우스 배아의 외과적 이식을 위해 개발되었다2. 우리는 또한 인공 수정 및 배반포의 비수술적 배아 이식에 사용하기 위한 자궁경부 조작(CM) 프로토콜을 개발했습니다. 이 절차를 사용하는 근거는 필요한 동물 수를 3R 줄이고(더 이상 수컷 마우스가 필요하지 않음) 사용된 기술을 개선(더 이상 수컷 마우스에 대한 외과적 정관 절제술이 필요하지 않음)을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜에 대한 설명에는 CM을 일반 워크플로에 통합하는 데 도움이 되는 관련 보조 재생 기술이 포함됩니다. CM 방법의 전반적인 목표는 인공 수정 및 배아 이식을 포함한 보조 생식 기술을 위해 가임신 암컷 생성에서 수컷 마우스의 사용을 대체하는 것입니다.
여기에 설명된 CM 프로토콜은 생쥐의 인공 수정을 돕기 위해 처음 개발되었습니다. 인공 수정 프로토콜은 원래 설명한 대로 50%의 임신율을 달성했으며 평균 새끼 크기는 7마리였습니다3. CD1 수용자 마우스는 수정 전 47시간 간격으로 임신한 암말 혈청 성선 자극 호르몬(PMSG) 및 인간 융모막 성선 자극 호르몬(hCG)을 포함한 저용량의 호르몬과 발정 동기화되었습니다. 발정 동기화의 장점은 정상 근무 시간 동안 프로토콜을 사용할 수 있다는 것입니다. 암컷은 인공 수정 직후 정관 수술을 받은 수컷과 짝을 이루었고, 교미 플러그의 존재로 짝짓기를 확인했다. 수혜자와의 짝짓기 비율의 불일치는 절차의 어려움으로 보고되었습니다. 따라서 가임신을 유도하기 위해 짝짓기에 대한 대안을 모색했습니다.
본 연구는 가임신한 여성의 생산 효율을 높이기 위한 표준화된 CM 기술을 제시합니다. 발정기나 발정기에 있는 암컷의 경우 작은 플라스틱 막대의 뭉툭한 끝을 질로 삽입하여 자궁경부에 접촉시키고 트리머와 접촉하여 30초 동안 진동합니다. 절차는 와이어 탑 케이지에서 수행됩니다. 마취나 진통이 필요하지 않습니다. CM 기술은 정관 수술을받은 남성과 교미 할 필요없이 비 외과 적 인공 수정 후 새끼를 낳을 수있는 가짜 임신 여성을 생산하는 데 편리합니다. CM은 또한 배아 이식의 수혜자로서 가임신 여성의 생산에도 사용될 수 있습니다. 구체적으로, CM 기술은 여기에 설명된 바와 같이 비수술적 배아 이식과 쌍을 이룰 수 있습니다. 비수술적 방법은 생쥐4,5 및 래트 6,7에서 배반포 단계 배아의 배아 이식에 효과적인 것으로 나타났습니다. 이 비수술적 방법은 수술적 방법에 대한 효과적인 대안이기 때문에 기술의 3R 개선으로 간주됩니다. 이전 연구에 따르면, 스트레스의 척도로서 분변 코르티코스테론 수치는 시술의 비수술적 특성이 설치류의 스트레스 수준을 증가시키지 않는다는 것을 나타냅니다 7,8. 이 절차는 외과적 배아 이식보다 기술적으로 덜 까다롭고 수행 속도가 훨씬 빠릅니다. 배아가 자궁으로 옮겨지면 자궁 발달을위한 올바른 단계의 배아가 옮겨 져야합니다. 생쥐의 경우, 배반포는 성교 후 2.5일 후(dpc) 가임신 수혜자에게 옮겨집니다.
여기에 설명된 두 가지 비수술적 기술의 경우 호르몬 투여 시기와 CM 기술이 다릅니다. 발정과 관련된 CM 절차의시기는 pseudopregnant recipients의 생산을위한 자연 교미를 대체하기 때문에 성공에 중요합니다. 정관 수술을 받은 남성이 가임신을 유도할 필요가 없도록 함으로써 이 절차는 필요한 동물의 수를 줄이고 외과적으로 변형된 남성의 필요성을 제거함으로써 3R의 이점을 제공합니다. 절차 자체는 빠르며 (30 초) 마취 나 진통이 필요하지 않습니다. 이 기술은 보조 생식을 위해 가임신 여성을 생산하는 신뢰성과 예측 가능성을 크게 높입니다.
Protocol
동물 관리 및 사용에 대한 모든 적용 가능한 국제적, 국가적, 제도적 지침을 따랐습니다. 동물을 대상으로 한 연구에서 수행된 모든 절차는 ParaTechs Corporation 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 윤리 기준에 따라 수행되었으며 미국 보건복지부, 국립 보건원, 공중 보건 서비스, 실험실 동물 복지국에서 규정한 표준에 따라 수행되었습니다. 본 연구에는 >8주령의 수컷 및 암컷 CD1(ICR)과 암컷 C57Bl/6J 마우스를 사용하였다. 동물들은 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료 표 참조).
1. CD1 마우스에서 인공 수정과 함께 사용하기 위한 자궁경부 조작 절차
- 1일과 3일에 암컷 마우스의 동기화된 배란
- 동물 사육장 암주기 시작 0.5시간 전 1일째에 복강내 주사(IP)로 암컷 마우스에 2.5IU PMSG( 재료 표 참조)를 주사합니다.
참고: 각 남성 기증자는 10명의 여성 수혜자에게 충분한 정자를 제공합니다. - 동물 사육장 암흑 주기가 시작되기 1시간 전 3일째에 IP 주사로 암컷에게 2.5IU hCG( 재료 표 참조)를 주입합니다.
참고: 주사 타이밍, 정자 이식 및 빛주기는 서로에 대해 매우 중요합니다. 이 프로토콜의 모든 절차에 대해 지정된 시간은 12시간의 명암 주기를 기준으로 합니다.
- 동물 사육장 암주기 시작 0.5시간 전 1일째에 복강내 주사(IP)로 암컷 마우스에 2.5IU PMSG( 재료 표 참조)를 주사합니다.
- 4일째에 신선한 정자의 수집 및 용량
- 파라핀 오일 하의 60mm 조직 배양 접시에 정자 사전 배양 배지(PM, 표 참조) 500μL 방울을 준비합니다. 남성 기증자 1 인당 한 접시를 준비하십시오. 정자를 채취하기 전에 37°C 및 5%CO2 에서 최소 30분 동안 평형을 이룹니다.
- 동물 사육장 조명 주기가 시작된 후 1시간 후에 기관 지침에 따라 수컷을 안락사시킵니다. 각 남성은 10 개의 인공 수정에 충분한 정자를 제공합니다.
- 마우스에서 cauda 부고환을 빠르게 해부합니다. 해부 가위와 톱니 집게를 사용하여 방광 위의 횡 복부 절개를 수행하십시오.
- 고환 지방 패드는 방광의 양쪽에 있습니다. 구부러진 집게로 고환 지방 패드 중 하나를 잡고 체강에서 고환과 부고환을 제거합니다. cauda 부고환을 고환 바로 아래에 있는 평평한 타원형 관 구조로 식별합니다.
- 구부러진 집게로 꼬리 부고환을 잡고 작고 각진 가위를 사용하여 절제합니다. 두 cauda 부고환을 모두 제거하고 흡수 조직으로 옮겨 해부 현미경으로 지방과 혈액을 제거합니다.
- 37°C에서 파라핀 오일 하에 평형화된 PM 500μL 방울에 두 개의 꼬리 부환을 넣습니다. 작은 가위로 6 개의 절개를하여 조직을 자릅니다. 한 명 이상의 남성 기증자를 사용하는 경우 각 정자 샘플에 대해 각 기증자로부터 하나의 부고환을 사용하여 샘플 간의 변동을 줄입니다.
- 접시를 부드럽게 휘젓고 정자가 3분 동안 조직에서 나오도록 하여 분당 한 번 소용돌이칩니다. 모든 티슈를 제거하십시오.
- 정자 샘플을 37°C 및 5%CO2 에서 45분 내지 1시간 동안 인큐베이션하여 용량화시킨다.
- 선택 사항: 정자 수를 측정하고 혈구계를 사용하여 현미경으로 운동성을 평가합니다. 계산을 위해 필요에 따라 PM에서 정자를 희석하십시오.
- 세포학적 평가에 의한 발정 주기 동기화 확인
- 미리 적신 작은 면봉(재료 표 참조)을 사용하여 면봉을 조직에 대고 굴려 질벽에서 질 세포를 부드럽게 수집하고 현미경 슬라이드에 멸균수 20μL 방울을 묻힌 다음 자연 건조합니다.
- 명시야 조명과 함께 100x 배율을 사용하는 현미경에서 각질화된 상피 세포의 존재를 평가합니다. 발정 또는 후기 발정기의 암컷은 각질화된 상피 세포가 존재하며 자궁경부 조작을 위해 선택해야 합니다.
- 선택 사항: 수정 전에 여성 수혜자의 체중을 기록합니다.
- 자궁 경부 조작 (CM) 수행
- 수정하기 약 0.5시간 전에 수혜자 암컷을 와이어 랙이 있는 케이지 위에 올려 마우스가 케이지 바 표면을 "잡을" 수 있도록 합니다. 엄지와 집게 손가락을 사용하여 꼬리 밑 부분을 잡고 꼬리를 위쪽으로 기울이면서 동물을 안정시킵니다 (그림 1).
알림: 핸들링 기술이 올바르게 수행될 때 마우스는 절차가 진행되는 동안 움직이지 않습니다. 마우스가 제자리에서 벗어나면 부드럽게 위치를 조정하고 계속하십시오. 공격적인 동물이 수혜자로 선택되면 절차가 진행되는 동안 동물이 농축 터널에 들어갈 수 있도록 허용하면 진정 될 수 있습니다. 터널을 사용하는 것은 선택 사항이지만 이 절차 중에 주의를 산만하게 하여 연구원이 동물을 다루는 데 도움이 될 수 있습니다. - 작은 플라스틱 막대의 뭉툭한 끝을 질로 삽입하여 자궁경부에 닿도록 하고 트리머로 접촉하여 30초 동안 진동합니다(재료 표 참조).
알림: 트리머를 시작하기 전에 로드를 제자리에 놓으십시오. 절차 중에 둘 다 한 손에 잡힙니다. 마취나 진통이 필요하지 않습니다.
- 수정하기 약 0.5시간 전에 수혜자 암컷을 와이어 랙이 있는 케이지 위에 올려 마우스가 케이지 바 표면을 "잡을" 수 있도록 합니다. 엄지와 집게 손가락을 사용하여 꼬리 밑 부분을 잡고 꼬리를 위쪽으로 기울이면서 동물을 안정시킵니다 (그림 1).
- 인공 수정을 위한 비수술적 정자 이식
- 40μL로 설정된 P200 피펫에 수정 장치(재료 표 참조)를 놓고 보호 커버를 제거합니다.
- 용량화된 정자 샘플의 분취량을 37°C 및 5%CO2에서 접시로부터 제거하고, 37°C에서 오일 없이 35 mm 조직 배양 접시로 옮긴다. 정자 샘플은 즉시 이식에 사용됩니다.
참고: 정자는 CO2 인큐베이터 외부에서 빠르게 운동성을 잃습니다. 용량화된 정자 샘플을 가능한 한 37°C 및 5%CO2 에 보관하십시오. - 피펫 플런저를 첫 번째 정지 지점까지 누르고 카테터 팁을 37°C에서 정자 샘플로 내린 다음 정자를 이동 장치에 천천히 로드합니다. 덩어리를 피하십시오. 흡수 조직을 사용하여 수정 장치 외부에서 잔류 오일을 제거합니다. 피펫을 따로 보관하십시오.
알림: 파라핀 오일이 자궁 뿔로 옮겨지는 것은 피해야 합니다. 흡수 조직을 사용하여 수정 장치 외부에서 잔류 오일을 제거합니다. - 받는 사람 암을 와이어 랙 케이지 상단에 놓습니다. CM에 사용된 것과 동일한 핸들링 기술을 사용하여 마우스를 제자리에 고정합니다. 엄지와 집게 손가락을 사용하여 꼬리 밑 부분을 잡고 꼬리를 위쪽으로 기울여 동물을 안정시킵니다.
- 작은 검경( 재료 표 참조)을 질에 넣습니다.
- 수정 장치 카테터를 검경, 자궁경부를 통해 자궁에 삽입합니다. 장치 허브가 검경에 접촉하면 피펫 플런저를 첫 번째 정지 지점까지 눌러 정자를 분배합니다. 여분의 공기가 자궁 뿔로 전달되지 않도록하십시오.
알림: 카테터의 위치가 올바르지 않으면 자궁경부 주변 조직에 부딪혀 구부러지고 결국 구부러집니다. 첫 번째 시도에서 카테터가 자궁경부를 통해 미끄러지지 않으면 카테터를 부드럽게 뒤로 빼내고 성공할 때까지 다시 시도합니다. 검경의 위치를 변경해야 할 수도 있습니다. - 장치와 검경을 제거하십시오. 시술 후 모니터링이 필요하지 않습니다.
- 선택 사항: 10-12일에 임신 확인
- 체중 증가를 사용하여 임신 상태를 확인하십시오. 체중 증가는 긴장에 따라 다르지만 최소 1-2g의 증가는 임신과 관련이 있습니다.
그림 1: 자궁경부 조작을 위한 마우스 잡기 기술. 마우스는 와이어 케이지 상단에 놓여 있으며 뒷다리 앞쪽의 꼬리와 양쪽에서 안정됩니다. 작은 플라스틱 막대의 뭉툭한 끝은 자궁 경부에 접촉하기 위해 질로 삽입되고 트리머와의 접촉에 의해 진동됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. CD1 마우스에서 자궁경부 조작과 함께 사용하기 위한 비수술적 배아 이식 절차
- 1일째 및 3일째에 암컷 마우스의 동기화된 배란
- 동물 사육장 조명 주기 시작 후 약 6시간 후인 1일에 IP 주사로 암컷 마우스에 2.5IU PMSG를 주입합니다.
- PMSG 주사 후 47시간 간격 또는 동물 사육장 조명 주기 시작 후 약 5시간 간격으로 3일에 IP 주사로 암컷에게 2.5IU hCG를 주사합니다.
- 세포학적 평가를 통한 발정 주기 동기화 확인
- CM 약 1시간 전인 3일차에 잠재적인 수혜자에 대해 세포학을 수행합니다. 미리 적신 작은 면봉을 사용하여 면봉을 조직에 대고 굴려 질벽에서 질 세포를 부드럽게 채취하고 현미경 슬라이드에 멸균수 20μL 방울을 묻힌 다음 자연 건조합니다.
- 명시야 조명과 함께 100x 배율을 사용하는 현미경에서 각질화된 상피 세포의 존재를 평가합니다. 발정 또는 후기 발정기의 암컷은 각질화된 상피 세포가 존재하며 자궁경부 조작을 위해 선택해야 합니다.
- 선택 사항: 잠재적인 여성 배아 수혜자의 체중을 기록합니다.
- CM 수행
- 동물 사육장 암흑 주기가 시작되기 1시간 전인 3일째에 수혜자 암컷을 철사 선반이 있는 케이지 위에 올려 동물이 케이지 바 표면을 "잡을" 수 있도록 합니다. 집게 손가락과 엄지 손가락을 사용하여 꼬리 밑 부분을 잡은 다음 동물을 안정시키면서 꼬리를 위쪽으로 기울입니다 (그림 1).
알림: 핸들링 기술이 올바르게 수행될 때 마우스는 절차가 진행되는 동안 움직이지 않습니다. 마우스가 제자리에서 벗어나면 부드럽게 위치를 조정하고 계속합니다. 공격적인 동물이 수혜자로 선택되면 절차가 진행되는 동안 동물이 농축 터널에 들어갈 수 있도록 허용하면 진정 될 수 있습니다. - 작은 플라스틱 막대의 뭉툭한 끝을 질적으로 삽입하여 자궁 경부에 닿게하고 트리머와 접촉하여 30 초 동안 진동시킵니다.
알림: 트리머를 시작하기 전에 로드를 제자리에 놓으십시오. 절차 중에 둘 다 한 손에 잡힙니다. 마취나 진통이 필요하지 않습니다.
- 동물 사육장 암흑 주기가 시작되기 1시간 전인 3일째에 수혜자 암컷을 철사 선반이 있는 케이지 위에 올려 동물이 케이지 바 표면을 "잡을" 수 있도록 합니다. 집게 손가락과 엄지 손가락을 사용하여 꼬리 밑 부분을 잡은 다음 동물을 안정시키면서 꼬리를 위쪽으로 기울입니다 (그림 1).
- 6일째 비수술적 배아 이식
- M2 배지 20μL 방울( 재료 표 참조)을 조직 배양 접시의 뚜껑에 놓습니다.
참고: 뚜껑은 테두리가 더 짧기 때문에 선택되며, 따라서 방울에 있는 배아에 접근하는 데 편리합니다. 자궁 뿔에 기름을 넣으면 배아 이식에 부정적인 영향을 미치는 것으로 보이므로 M2 방울 위에 파라핀 기름을 바르지 마십시오. - 현미경 및 반사 조명을 사용하여 표준 배아 처리 피펫을 사용하여 10-20개의 배반포를 배지 방울에 로드합니다(재료 표 참조).
참고: 이식할 최적의 배아 수는 마우스 균주와 배아가 겪은 조작에 따라 다릅니다. 조작되지 않은 건강한 배아의 경우 10-15개의 배아를 이식하는 것으로 충분해야 합니다. 재유도 또는 유전자 변형 배아의 경우 더 많은 배아를 이식하는 것이 적절합니다. - 비수술적 배아 이식 장치(재료 표 참조)를 1.8μL로 설정된 P2 피펫에 고정합니다. 보호 카테터 덮개를 제거합니다.
- 피펫의 플런저를 첫 번째 정지 지점까지 누르고 카테터의 끝을 매체로 내린 다음 배아를 장치의 카테터 끝으로 천천히 당깁니다. 매체에서 팁을 제거합니다.
참고: 낮은 배율로 배아를 시각화하면 배아를 장치에 더 쉽게 로드할 수 있습니다. 배아가 방울에 흩어져 있는 경우 접시를 좌우로 부드럽게 흔들어 방울 중앙에 배아를 집중시키거나 배아 처리 피펫을 사용하여 위치를 변경합니다. - 피펫 부피를 2.0 μL로 설정하여 카테터 끝에 작은 기포를 생성합니다. 마우스 케이지 근처에 배아가 적재 된 피펫을 부드럽게 놓습니다.
- 받는 사람 암을 와이어 랙 케이지 상단에 놓습니다. CM에 사용된 것과 동일한 처리 기술을 사용하여 마우스를 제자리에 고정합니다. 집게 손가락과 엄지 손가락을 사용하여 꼬리 밑 부분을 잡은 다음 꼬리를 위쪽으로 기울여 동물을 안정시킵니다.
- 작은 검경( 재료 표 참조)을 질에 넣습니다.
- 이식 장치 카테터를 검경, 자궁경부를 통해 자궁에 삽입합니다. 장치 허브가 검경에 접촉하면 피펫 플런저를 첫 번째 정지 지점까지 눌러 배아를 분주합니다. 여분의 공기가 자궁 뿔로 전달되지 않도록하십시오.
- 피펫 플런저를 풀지 않고 장치와 검경을 제거하십시오. 시술 후 모니터링이 필요하지 않습니다.
- M2 배지 20μL 방울( 재료 표 참조)을 조직 배양 접시의 뚜껑에 놓습니다.
Representative Results
전기9 및 소닉10 자궁 경부 자극이 쥐의 가임신을 유도하는 데 사용되었기 때문에 이 연구는 생쥐에서 사용할 수 있는 표준화된 기계적 절차를 제시합니다. 질 세포학은 발정의 다양한 단계에서 여성의 식별을 도울 수 있습니다. 여성의 가임신을 확인하기 위해 이와 동일한 방법이 사용되었습니다. 먼저, 암컷의 세포학 프로파일을 발정 주기 동안, 임신 중, 교미 또는 CM에 의해 유도된 가임신 동안 CD1 및 C57Bl/6 마우스에 대해 비교했습니다. 세포는 명시야 조명으로 100x 배율 하에서 관찰되었습니다. 관찰된 세포에는 백혈구, 유핵 상피 세포 및 핵 각질화 상피 세포가 포함되었습니다. 발정 주기 단계의 결정은 각 세포 유형11,12의 상대적 백분율에 기초하였다. 발정은 각질화 된 상피 세포의 우세를 특징으로합니다. 발정이 끝나면 metestrus가 시작되고 백혈구가 나타나기 시작하지만 각질화 된 상피 세포는 덜 분명해집니다. Diestrus는 중등도에서 낮은 세포성을 가지고 있으며 백혈구가 우세하고 유핵 상피 세포가 나타나기 시작합니다. 발정기는 백혈구의 손실, 유핵 상피 세포의 증가 및 각질화 된 상피 세포의 출현으로 구별됩니다. 발정 후 발정이 시작되고주기가 계속됩니다.
기준선 프로파일을 개발하기 위해 짝짓기 전에 각 여성(CD1의 경우 N = 20, C57Bl/6의 경우 N = 20)에 대해 최소 2회의 전체 발정 주기 동안 질 세포학을 기록했습니다. 주기 길이와 개별 프로파일은 마우스마다 다양했습니다. 그러나 예상되는 일반적인 추세가 관찰되었습니다. CD1 및 C57Bl/6 마우스의 발정 주기의 평균 길이는 3.8일이었고, 범위는 3-5일이었다. 자연 교미가 일어나기 전날, 모든 암컷 쥐는 발정기에 있었다. 짝짓기 후, 발정 사이클링이 재개될 때까지 성교 후 1.5일 후에 세포학을 다시 수행했습니다. 그림 2 는 정관 수술을 받은 수컷과 교미된 가임신 CD1 및 C57Bl/6 암컷의 세포학적 프로필을 보여줍니다.
그림 2: 가임신한 암컷 마우스의 세포학적 프로파일. 백혈구, 유핵 상피 세포 및 각질화 상피 세포에 대한 각 세포 유형의 평균 백분율은 (A) CD1 (N = 20) 및 (B) C57Bl/6 (N = 20) 마우스에 대한 성교 후 일수(DPC)의 함수로서 나타내었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 작업에서는 가임신 여성 생산의 효율성을 높이기 위해 CM 기술이 표준화되었습니다. 발정기나 발정기에 있는 암컷의 경우 작은 플라스틱 막대의 뭉툭한 끝을 질로 삽입하여 자궁경부에 접촉시키고 트리머와 접촉하여 30초 동안 진동합니다. 절차는 와이어 탑 케이지에서 수행됩니다. 마취나 진통이 필요하지 않습니다. CM 절차의 효과를 결정하기 위해 정관 수술을 받은 수컷과 교미한 후 및 CM 후(총 N = 40) 암컷 CD1(N = 20) 및 C57Bl/6(N = 20) 마우스에 대해 질 세포학을 비교했습니다. CM에 의해 유도 된 유사 임신의 세포 학적 프로파일은 그림 3에 나타난 바와 같이 교미에 의해 유도 된 유사 임신의 프로파일과 유사했다.
그림 3: 자궁경부 조작(CM) 후 가임신한 암컷 마우스의 세포학적 프로파일. 백혈구, 유핵 상피 세포 및 각질화 상피 세포에 대한 각 세포 유형의 백분율은 성교 후 일수(DPC) 또는 자궁경부 조작 후 일수(DPCM)의 함수로 표시됩니다. CD1 및 C57Bl/6 마우스(N=40)에 대한 평균 세포 유형 백분율을 나타내었다 (A) 정관 수술을 받은 수컷과 교배하였거나 (B) CM 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
CM 기술이 보조 생식을 위한 임신을 확립하기에 충분한지 확인하기 위해 CM은 CD1 여성에서 비수술적 인공 수정(NSAI) 프로토콜의 일부로 수행되었습니다. 인공 수정 프로토콜에는 정자 이식 전에 저용량의 호르몬 PMSG 및 hCG와 암컷의 발정 동기화가 포함되었습니다. CM은 정자 이식 직전에 수행되었습니다. CD1 마우스의 경우,이 기술로 발정기 (N = 76)의 암컷에 대해 CM을 사용한 유사 임신 유도의 효율은 83 %였다. 대조 실험에서 발정기에 있는 암컷의 38%만이 정관 수술을 받은 수컷에 의해 막혔습니다(N = 24). 자궁 경부 조작 (N = 76)을받은 인공 수정 수혜자는 임신율이 72 %이고 평균 새끼 크기는 8.3 마리였습니다. 따라서 CM에 의한 가임신 유도는 NSAI를 수행 할 때 정관 수술을받은 남성과의 교미를 편리하고 효율적으로 대체합니다. CM을 사용하여 신선한 CD1 배반포의 비수술적 배아 이식을 위해 발정기에 CD1 수용자(N = 4)를 준비하면 100% 임신율이 나타났습니다. 9-15 마리의 배아를 이식 한 결과 출생률이 45 %이고 평균 새끼 크기가 6 마리 인 건강한 새끼 3 마리가 나왔습니다. 비교해 보면, 가임신을 유도하기 위해 정관 수술을 받은 수컷과 교배된 CD1 수용자(N = 20)는 20개의 신선한 B6C3F2 배반포를 이식한 후 80%의 임신율과 46%의 출생률을 보였습니다.
보조 생식술에 대한 결과는 균주에 따라 다를 가능성이 높은데, 과배란을 위한 호르몬 투여 용량 및 시기와 같은 변수가 균주에 따라 달라지는 것으로 밝혀졌기때문이다 13. 또한, 수혜자의 연령과 체중과 같은 요인들이 호르몬에 대한 반응에 영향을 미칠 수 있다14. 이 연구에서는 인공 수정을 위한 CM 시술을 시행할 때 후기 발정기나 발정기의 암컷만 반응하는 것으로 나타났다. 일반적으로, 한 집단에서 이용 가능한 수혜자의 수를 늘리기 위해, 암컷은 먼저 낮은 용량의 호르몬과 발정-동기화된다3. 2.5IU의 PMSG 및 hCG를 사용한 발정 동기화는 이 연구에서 11-14주령 CD1 암컷(N = 27)에 대해 78% 효과적이었고 18-32주령 C57Bl/6 암컷(N = 22)에 대해 60% 효과적이었습니다. CD1 여성에 대한 자궁경부 조작을 사용한 가임신 유도의 효율은 이 기술을 사용하여 발정기에 있는 여성의 경우 83%(N = 76), 발정기에 있는 C57Bl/6 여성의 경우 82%(N = 100)였습니다.
Discussion
3R은 1959년 Russel과 Burch가 "The Principles of Humane Experimental Technique"15에서 설명한 바와 같이 연구에서 동물을 사용하기 위한 윤리적 틀입니다. 3R은 동물 사용의 대체, 감소 및 개선을 나타냅니다. 여기에 강조 표시된 프로토콜은 3R과 일치합니다. 자궁 경부 조작 기술은 더 이상 가임신 한 암컷을 생산하기 위해 수컷을 사용할 필요가 없으므로 필요한 동물의 수를 줄입니다. 이 기술은 또한 남성에게 정관 수술을 시행할 필요가 없으므로 통증과 고통을 줄여 세련미를 제공합니다. 여기에 기술된 보조 생식술(인공 수정과 배아 이식)은 비수술적이며, 따라서 둘 다 수술적 대안으로 인한 통증과 괴로움8을 줄임으로써 3R의 개선을 제공한다.
가임신한 암컷의 사용은 생쥐에서 보조 생식을 할 때 새끼의 회복을 위해 필요하다1. CM 절차는 pseudopregnant 여성을 생산하는 효과적인 방법이지만, 수혜자 여성의 발정주기 단계의 동기화는 프로세스의 중요한 첫 번째 단계입니다. 발정 동기화는 잠재적인 수혜자를 준비하기 위해 식민지에 필요한 암컷의 수를 크게 줄이고 필요에 따라 시간 제한이 있는 가임신 암컷을 생산하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저용량의 호르몬을 사용하는 것은 CD1 마우스에서 살아있는 깔짚의 회복에 해로운 영향을 미치지 않는 것으로 보입니다. 이식된 배아 또는 정자에 대해 최고 품질의 수용자 여성을 생산하는 호르몬 및 농도 조합을 찾기 위해 다른 균주와 함께 주의를 기울여야 합니다. PMSG와 hCG를 사용하여 동기화를 이룰 수 있지만16, 과배란된 암컷을 생성하는 용량은 지속적인 임신에 적합하지 않을 수 있다17.
암컷이 발정기에 있는지 확인하기 위해이 연구에서 세포 학적 평가가 수행되었습니다. 발정기는 또한 질 개구부11,18의 관찰에 의해 평가될 수 있다. 이 방법은 매우 유용하며 단독으로 또는 확인으로 사용할 수 있지만 세포학을 사용하는 것보다 주관적입니다. 염색이 없는 질 세포학은 각질화된 상피 세포를 쉽게 식별할 수 있기 때문에 발정기에 있는 암컷을 선택하는 데 빠르고 효과적입니다. 이 프로토콜에서는 잠재적인 수용자를 결정하기 위해 CM 전에 세포학적 평가를 수행합니다. CM 전에 세포학을 수행하는 것이 중요한데, 그 이유는 절차가 질 부위에서 벗겨진 세포를 단편화하는 경향이 있어 식별을 어렵게 만들기 때문입니다. 가임신 또는 임신에 대한 세포학적 평가는 연속 3일 동안 CM 후 3.5-11.5일(dpcm)에 수행할 수 있습니다. 발정 순환 여성의 프로필은 각질화 된 상피 세포의 상당한 침윤으로 최소 1 일이 있어야합니다. 가임신/임산부는 연속 3일 동안 디스트러스 프로필(대부분 세포 수가 낮을 수 있는 백혈구)을 표시해야 합니다.
CM 기술의 개발을 통해 일부 마우스는 다른 마우스보다 절차를 더 잘 수용하는 것으로 나타났습니다. CD1 암컷 마우스는 차분한 성격과 뛰어난 양육 본능 때문에 훌륭한 후보입니다. 이 균주는 다루기 쉽고 CM 및 비수술적 보조 생식 기술 중에 잘 수행됩니다. C57Bl/6 마우스는 더 공격적이고 덜 양육하는 경향이 있습니다. 이 프로토콜은 CM을 사용하여 가임신한 C57Bl/6 여성을 효과적으로 생산했지만 절차를 일관되게 허용할 가능성이 적었습니다. 이것은 CM 동안 발정 단계와 다소 관련이있는 것으로 보였고, 발정기 또는 발정기의 암컷은 더 수용적이었습니다. 동물이 들어갈 수 있도록 농축 튜브를 사용하면 절차를 위해 질에 접근 할 수 있고 여성을 진정시키는 데 도움이되었습니다. 절차 자체는 여성을 완전히 제지하지 않으므로 동물은 언제든지 빠져 나갈 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 동물의 위치를 변경하고 절차를 계속할 수 있습니다. 여성이 떠나면 시술의 타이밍이 멈추고 시술이 재개되면 재개됩니다. 시술의 성공에 결정적인 것은 발정주기의 단계 (후기 발정 및 발정)와 자궁 경부와 막대의 접촉입니다. 트리머의 진동은 표준화 된 CM을 제공합니다. 자궁 경부와의 접촉을 보장하기 위해 막대에 부드러운 압력이 가해지며 막대의 앞뒤로 작은 움직임으로 자궁 경부에 대한 막대의 위치가 보장됩니다.
CM의 사용은 정자 이식 전에 발정 주기의 올바른 단계에 있는 암컷을 선택할 수 있고 프로토콜이 더 이상 정관 수술을 받은 수컷과의 교미에 달려 있지 않기 때문에 NSAI 프로토콜을 개선했습니다. 인공 수정 발정 주기 동기화는 난모세포 성숙이 4일째 아침에 정자 이식에 해당하도록 시간이 정해집니다. 프로토콜의 성공에 중요한 것은 수정이 일어날 수 있도록 배란시기를 조정하는 것입니다. 체외 수정에 사용되는 타이밍에 대해 제안된 바와 같이 예상되는 정자 이식 15-17시간 전에 hCG를 투여하도록 주의해야 합니다. 정자 샘플의 품질은 인공 수정의 결과에 직접적인 영향을 미칩니다. 용량화된 신선한 정자가 가장 잘 수행됩니다. 양질의 냉동 보존 정자는 생체 내에서 수정 된 배아를 생산할 수 있습니다. 그러나 자궁 뿔로 옮겨진 잔류 동결 방지제가 착상을 억제할 수 있으므로 해동된 정자를 직접 전달할 때는 주의해야 합니다(미공개 관찰).
배아 이식과 함께 CM을 사용하는 것은 개념적으로 쉬운 적응입니다. 발정 주기 동기화는 수신자 풀을 생성하는 데 필요한 암컷의 수를 줄입니다. CM 이전에 발정 단계를 결정하면 의사 임신 수혜자를 얻을 가능성이 높아집니다. 이 방법의 한 가지 단점은 배아 이식시 수혜자의 세포학이 유동 단계에 있다는 것입니다. 여성이 발정기에서 가임신 프로필로 전환하는 경우 모든 세포 유형이 존재하며, 가임신은 세포학이 며칠 동안 추적되는 경우에만 분명해집니다. CD1 및 C57Bl/6 마우스에 대한 발정기에서 가임신으로의 전환 성공(>80%)을 기반으로 이 방법은 배아 이식 수혜자에게 적합할 것으로 예상됩니다. 예비 결과는 제한된 비수술적 배아 이식으로 좋은 성공을 보여줍니다. 일반적으로, 비수술적 배아 이식의 효율은 외과적 기법4,5의 효율과 비슷하며, 비수술적 이식은 배반포 단계에서 외과적 배아 이식을 대체할 수 있다. 초기 단계의 배아의 경우, 배반포 단계까지의 배아 배양이 필요합니다. 그러나, 외과적 이식이 선호되는 경우, 적절한 유사임신 수혜자에게 필요한 정확한 타이밍에 CM 기법을 적용할 수 있다2. 일반적으로 배아 수혜자는 배아보다 1일 덜 진행됩니다. 예를 들어, 배반포는 기증자로부터 3.5dpc로 수확되어 2.5dpc 수혜자에게 전달됩니다. 따라서 CM은 수혜자가 배아보다 덜 발달 된 의사 임신 상태가되도록 수행해야합니다.
결론적으로, 여기에 설명된 CM 기술은 마우스에 대한 다른 보조 생식 기술과의 통합에 대한 탁월한 가능성을 보여줍니다. 우리는 비수술적 기술을 사용하여 인공 수정 및 배아 이식을 위한 성공적인 프로토콜을 제공했습니다. 조합하여 CM 기술은 (1) 정관 수술을 받은 수컷의 필요성을 제거하여 동물 수를 줄이고 (2) 수술 기술을 비수술적 대안으로 대체하여 기술을 개선하는 등 3R의 이점을 제공합니다.
Disclosures
Barbara Stone과 Sarah Srodulski는 모두 미국 켄터키주 렉싱턴에 있는 ParaTechs Corporation에서 근무하고 있습니다. ParaTechs는 마우스용 mNSET 장치를 제조할 수 있는 독점적인 라이선스 권한을 보유하고 있습니다. ParaTechs Corp는 비수술적 배아 이식 및 비수술적 인공 수정에 각각 사용할 수 있는 mNSET 및 mC&I 장치를 개발 및 판매하고 있습니다.
Acknowledgments
이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 R43OD020304에 따라 국립 보건원(National Institutes of Health)의 연구 인프라 프로그램 사무국장실(Office of the Office of Research Infrastructure Programs)과 수상 번호 R44MH122117에 따라 국립 보건원(National Institutes of Health)의 국립 정신 건강 연구소(National Institute of Mental Health)의 지원을 받았습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blastocyst stage embryos | |||
| CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
| Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
| Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
| Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
| human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
| Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
| Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
| Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
| mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
| Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
| Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
| Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
| Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
| Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
| Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
| Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
| Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
| Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
| Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
| Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
| Wire bar topped mouse cage |
References
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