Summary
Sunulan servikal manipülasyon yöntemi, vazektomize erkeklerle üreme dişilerine gerek kalmadan farelerde yalancı gebeliği indükleyebilir. Yalancı gebelik indüksiyonu, her ikisi de sunulan ameliyatsız embriyo transferi ve ameliyatsız suni tohumlamanın başarısı için gereklidir.
Abstract
Embriyo transferi veya suni tohumlama ile hamileliği başarılı bir şekilde sürdürmek için, dişi alıcı fareler psödogebe duruma sokulmalıdır. Dişi fareler geleneksel olarak gece boyunca vazektomize edilmiş erkeklerle eşleştirilir ve ertesi sabah bir çiftleşme tıkacının varlığı değerlendirilir. Yalancı gebe dişilerin üretilmesinin etkinliğini artırmak için, farelerde cerrahi olmayan embriyo transferi veya suni tohumlama teknikleri ile birlikte kullanılmak üzere bir servikal manipülasyon tekniği standardize edilmiştir. Küçük bir plastik çubuğun kör ucu, rahim ağzına temas edecek şekilde vajinal yoldan sokulur ve bir düzeltici ile temas ettirilerek 30 saniye boyunca titreştirilir. İşlem hızlıdır ve anestezi veya analjezi gerektirmez. Bu teknik, yalancı gebe dişilerin üretilmesinin güvenilirliğini ve öngörülebilirliğini arttırır ve vazektomize erkek gereksinimini tamamen ortadan kaldırır. CD1 fareleri için, servikal manipülasyon kullanılarak yalancı gebelik indüksiyonunun etkinliği östrusta sahip dişiler için% 83 idi (N = 76), ancak kızgınlıktaki dişilerin sadece% 38'i vazektomize erkekler tarafından tıkandı (N = 24). CD1 farelerinde suni tohumlama, hormonlarla östrus senkronizasyonu, servikal manipülasyon ve spermin uterus transferi ile gerçekleştirildi. Servikal manipülasyon (N = 76) alan suni tohumlama alıcılarının gebelik oranı% 72 ve ortalama yavru büyüklüğü 8.3 yavru idi. Bu yöntem, cerrahi olmayan embriyo transferi için yalancı gebe dişiler üretmek için de kullanılabilir. Bu nedenle, servikal manipülasyon ile yalancı gebeliği indüklemek, cerrahi olmayan yardımcı üreme teknikleri uygularken vazektomili bir erkekle çiftleşmeye uygun ve etkili bir alternatiftir. Servikal manipülasyonun kullanılması, gerekli hayvan sayısını azaltarak ve cerrahi olarak değiştirilmiş erkeklere olan ihtiyacı ortadan kaldırarak yardımcı üreme teknikleri için 3R (değiştirme, azaltma ve iyileştirme) faydaları sağlar.
Introduction
Yardımcı üreme teknolojileri, genetiği değiştirilmiş fare modellerinin üretiminin yanı sıra kriyoprezervasyondan suşların geri kazanılması, suşların tehlikeye atılmış bir sağlık durumundan yeniden türetilmesi ve yaşa uygun kohortların üretimi de dahil olmak üzere stratejik vivaryum yönetimi için kullanılır. Farelerde tüm yardımcı üreme teknikleri, embriyo gelişimi için psödogebe kadın alıcıların kullanılmasını gerektirir. Tarihsel olarak, psödogebe alıcılar, cerrahi olarak vazektomize edilmiş veya genetik olarak kısır olan steril erkeklerle çiftleştirilerek üretilmiştir ve bir çiftleşme tıkacının varlığı ertesi sabahdeğerlendirilir 1. Son zamanlarda, pronükleer veya iki hücreli fare embriyolarının cerrahi transferi için farelerde sonik stimülasyon için bir protokol geliştirilmiştir2. Ayrıca suni tohumlama ve blastosistlerin cerrahi olmayan embriyo transferi ile kullanım için bir servikal manipülasyon (CM) protokolü geliştirdik. Prosedürün kullanılmasının gerekçesi, gerekli hayvan sayısında 3R'lik bir azalma (artık erkek fareler gerektirmeyen) ve kullanılan tekniklerin iyileştirilmesini (artık erkek fareler için cerrahi vazektomi prosedürünü gerektirmeyen) sağlamaktır. Bu protokolün açıklaması, CM'nin normal iş akışlarına entegrasyonuna yardımcı olmak için ilgili yardımcı üreme tekniğini içerir. CM yönteminin genel amacı, suni tohumlama ve embriyo transferi de dahil olmak üzere yardımcı üreme teknikleri için yalancı gebe dişilerin oluşturulmasında erkek farelerin kullanımının yerini almaktır.
Burada açıklanan CM protokolü ilk olarak farelerde suni tohumlamaya yardımcı olmak için geliştirilmiştir. Suni tohumlama protokolü, başlangıçta açıklandığı gibi, ortalama 7 yavru büyüklüğü ile %50'lik bir gebelik oranına ulaşmıştır3. CD1 alıcı fareleri, döllenmeden 47 saat önce hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG) ve insan koryonik gonadotropin (hCG) dahil olmak üzere düşük dozda hormonlarla senkronize edildi. Kızgınlık senkronizasyonunun bir avantajı, protokolün normal çalışma saatlerinde kullanılmasına izin vermesiydi. Dişiler, suni tohumlamadan hemen sonra vazektomize edilmiş erkeklerle eşleştirildi ve çiftleşme, bir çiftleşme tıkacının varlığı ile doğrulandı. Alıcılarla çiftleşme oranındaki tutarsızlık, prosedürde bir zorluk olarak bildirildi. Bu nedenle, yalancı gebeliğin indüksiyonu için çiftleşmeye alternatifler arandı.
Bu çalışma, psödogebe kadınların üretim etkinliğini artırmak için standart bir CM tekniği sunmaktadır. Kızgınlık veya proöstrus hastası dişiler için, küçük bir plastik çubuğun kör ucu rahim ağzına temas edecek şekilde vajinal yoldan sokulur ve bir düzeltici ile temas ettirilerek 30 saniye boyunca titreştirilir. İşlem tel kaplı bir kafes üzerinde gerçekleştirilir. Anestezi veya analjezi gerekmez. CM tekniği, vazektomize erkeklerle çiftleşmeye gerek kalmadan cerrahi olmayan suni tohumlamadan sonra yavru üretebilen yalancı gebe dişiler üretmek için uygundur. CM ayrıca embriyo transferinin alıcıları olarak psödogebe kadınların üretimi için de kullanılabilir. Spesifik olarak, CM tekniği, burada açıklandığı gibi cerrahi olmayan embriyo transferi ile eşleştirilebilir. Farelerde4,5 ve sıçanlarda 6,7 blastosist evresindeki embriyoların embriyo transferi için cerrahi olmayan yöntemlerin etkili olduğu gösterilmiştir. Bu cerrahi olmayan yöntem, cerrahi yöntemlere etkili bir alternatif olduğundan, tekniğin 3R iyileştirmesi olarak kabul edilir. Önceki araştırmalara dayanarak, fekal kortikosteron seviyeleri, stresin bir ölçüsü olarak, prosedürün cerrahi olmayan doğasının kemirgenlerde stres seviyelerini artırmadığını göstermektedir 7,8. Prosedürler cerrahi embriyo transferinden teknik olarak daha az zorlayıcıdır ve gerçekleştirilmesi çok daha hızlıdır. Embriyolar rahime transfer edilirken rahim gelişimi için doğru aşamadaki embriyoların transfer edilmesi gerekir. Fareler için blastosistler, koitumdan (dpc) 2.5 gün sonra psödogebe alıcılara transfer edilir.
Burada tarif edilen iki cerrahi olmayan teknik için, hormon uygulamasının zamanlaması ve CM tekniği farklıdır. CM prosedürünün östrusa göre zamanlaması, psödogebe alıcıların üretimi için doğal çiftleşmenin yerini aldığı için başarı için önemlidir. Bu prosedür, vazektomize erkeklerin yalancı gebeliği indükleme ihtiyacını ortadan kaldırarak, hem gerekli hayvan sayısını azaltarak hem de cerrahi olarak değiştirilmiş erkeklere olan ihtiyacı ortadan kaldırarak 3R fayda sağlar. İşlemin kendisi hızlıdır (30 sn) ve anestezi veya analjezi gerektirmez. Teknik, yardımlı üreme için yalancı gebe dişilerin üretilmesinin güvenilirliğini ve öngörülebilirliğini büyük ölçüde artırır.
Protocol
Hayvanların bakımı ve kullanımı için geçerli tüm uluslararası, ulusal ve kurumsal yönergelere uyulmuştur. Hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalarda gerçekleştirilen tüm prosedürler, ParaTechs Corporation Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin etik standartlarına uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Laboratuvar Hayvanları Refahı Ofisi, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Halk Sağlığı Servisi, Amerika Birleşik Devletleri Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı tarafından belirlenen standartlar altında yürütülmüştür. Bu çalışma için >8 haftalık erkek ve dişi CD1 (ICR) ve dişi C57Bl / 6J fareler kullanıldı. Hayvanlar ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bkz.
1. CD1 farelerinde suni tohumlama ile kullanım için servikal manipülasyon prosedürü
- Dişi farelerin 1. ve 3. günde senkronize yumurtlaması
- Dişi farelere, vivaryum karanlık döngüsünün başlamasından 0.5 saat önce, 1. günde intraperitoneal enjeksiyon (IP) ile 2.5 IU PMSG (Malzeme Tablosuna bakınız) enjekte edin.
NOT: Her erkek donör, 10 kadın alıcı için yeterli sperm sağlayacaktır. - Dişilere 2.5 IU hCG enjekte edin (Malzeme Tablosuna bakınız) 3. günde, vivaryum karanlık döngüsünün başlamasından 1 saat önce IP enjeksiyonu ile.
NOT: Enjeksiyonların zamanlamaları, sperm transferi ve birbirine göre ışık döngüsü çok önemlidir. Bu protokoldeki tüm prosedürler için belirtilen süreler, 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsüne dayanmaktadır.
- Dişi farelere, vivaryum karanlık döngüsünün başlamasından 0.5 saat önce, 1. günde intraperitoneal enjeksiyon (IP) ile 2.5 IU PMSG (Malzeme Tablosuna bakınız) enjekte edin.
- 4. günde taze spermin toplanması ve kapasitasyonu
- Parafin yağı altında 60 mm'lik bir doku kültürü kabında 500 μL'lik bir sperm ön inkübasyon ortamı (PM, Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın. Erkek donör başına bir yemek hazırlayın. Sperm toplamadan önce 37 ° C'de ve% 5 CO2'de en az 30 dakika dengeleyin.
- Vivaryum ışık döngüsünün başlamasından 1 saat sonra, erkek(ler)i kurumsal yönergelere göre ötenazi yapın. Her erkek 10 suni tohumlama için yeterli sperm sağlayacaktır.
- Kauda epididimitlerini fareden hızlıca inceleyin. Diseksiyon makası ve dişli forseps kullanarak mesanenin üzerinde enine bir karın kesisi yapın.
- Testis yağ yastıkçıkları mesanenin her iki yanında bulunur. Testis yağ yastıkçıklarından birini kavisli forseps ile kavrayın ve testisi ve epididimi vücut boşluğundan çıkarın. Kauda epididimini testisin hemen altında düz oval tübüler bir yapı olarak tanımlayın.
- Kauda epididimini kavisli forseps ile tutun ve küçük, açılı makas kullanarak rezeke edin. Her iki kauda epididimitini de çıkarın ve diseksiyon mikroskobu altında yağ ve kanı çıkarmak için bunları emici bir dokuya aktarın.
- 37 ° C'de parafin yağı altında her 500 μL dengelenmiş PM damlasına iki kauda epididimid yerleştirin. Küçük makas kullanarak altı kesi yaparak dokuyu kesin. Birden fazla erkek donör kullanılıyorsa, numuneler arasındaki varyasyonu azaltmak için her sperm örneği için her donörden bir epididim kullanın.
- Çanağı yavaşça döndürün ve spermin dakikada bir kez dönerek 3 dakika boyunca dokudan çıkmasına izin verin. Tüm dokuları çıkarın.
- Sperm örneğini 37 ° C'de 45 dakika ila 1 saat inkübe edin ve% 5CO2 kapasitasyon için.
- İsteğe bağlı: Sperm sayısını ölçün ve bir hemositometre kullanarak mikroskop altında hareketliliği değerlendirin. Saymak için, spermi gerektiği gibi PM'de seyreltin.
- Sitolojik değerlendirme ile östrus döngüsü senkronizasyonunun doğrulanması
- Küçük, önceden nemlendirilmiş bir bez kullanarak (Malzeme Tablosuna bakınız), çubuğu dokuya doğru yuvarlayarak vajinal hücreleri vajinal duvardan nazikçe toplayın, bunları bir mikroskop lamı üzerinde 20 μL'lik bir steril su damlasına sürün ve havayla kurutun.
- Parlak alan aydınlatması ile 100x büyütme kullanan bir mikroskop altında, kornifiye epitel hücrelerinin varlığını değerlendirin. Östrus veya geç proöstrustaki dişilerde kornifiye epitel hücreleri bulunur ve servikal manipülasyon için seçilmelidir.
- İsteğe bağlı: Tohumlamadan önce dişi alıcıların ağırlığını kaydedin.
- Servikal manipülasyonun (CM) gerçekleştirilmesi
- Tohumlamadan yaklaşık 0,5 saat önce, farenin kafes çubuğu yüzeyini "tutmasına" izin vererek, bir alıcı dişiyi bir tel ızgara ile bir kafesin üstüne yerleştirin. Başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanarak kuyruğun tabanına yakın bir yerde kavrayın ve hayvanı sabitlerken kuyruğu yukarı doğru eğin (Şekil 1).
NOT: Kullanım tekniği doğru bir şekilde gerçekleştirildiğinde fare prosedür süresince hareketsiz kalacaktır. Fare yerinden çıkarsa, yavaşça yeniden konumlandırın ve devam edin. Alıcı olarak agresif bir hayvan seçilirse, işlem sırasında hayvanın bir zenginleştirme tüneline girmesine izin vermek sakinleştirici olabilir. Tüneli kullanmak isteğe bağlıdır, ancak bu prosedür sırasında dikkat dağıtıcı bir unsur sağlayarak araştırmacıların hayvanları ele almalarına yardımcı olabilir. - Küçük bir plastik çubuğun kör ucunu (bkz. Malzeme Tablosu) rahim ağzı ile temas edecek şekilde vajinal olarak yerleştirin ve bir düzeltici ile temas ederek 30 saniye boyunca titreştirin (bkz.
NOT: Düzelticiyi çalıştırmadan önce çubuğu yerine yerleştirin. İşlem sırasında her ikisi de tek elle tutulur. Anestezi veya analjezi gerekmez.
- Tohumlamadan yaklaşık 0,5 saat önce, farenin kafes çubuğu yüzeyini "tutmasına" izin vererek, bir alıcı dişiyi bir tel ızgara ile bir kafesin üstüne yerleştirin. Başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanarak kuyruğun tabanına yakın bir yerde kavrayın ve hayvanı sabitlerken kuyruğu yukarı doğru eğin (Şekil 1).
- Suni tohumlama için ameliyatsız sperm transferi
- Tohumlama cihazını (bkz. Malzeme Tablosu) 40 μL'ye ayarlanmış bir P200 pipetine yerleştirin ve koruyucu kapağı çıkarın.
- Kapasitif sperm örneğinin bir alikotunu 37 °C ve% 5 CO2'de tabaktan çıkarın ve 37 ° C'de yağsız 35 mm'lik bir doku kültürü kabına aktarın. Sperm örneği transfer için hemen kullanılacaktır.
NOT: Sperm, CO2 inkübatörünün dışında hızla hareketliliğini kaybedecektir. Kapasitif sperm örneğini mümkün olduğunca 37 °C'de ve %5CO2'de tutun. - Pipet pistonunu ilk durağa kadar bastırın, kateter ucunu 37 °C'de sperm örneğine indirin ve spermi yavaşça transfer cihazına yükleyin. Herhangi bir topaklanmadan kaçının. Emici bir doku kullanarak tohumlama cihazının dışındaki artık yağı çıkarın. Pipeti bir kenara koyun.
NOT: Parafin yağının rahim boynuzuna transferinden kaçınılmalıdır. Emici bir doku kullanarak tohumlama cihazının dışındaki artık yağı çıkarın. - Alıcı dişi tel ızgara kafesinin üstüne yerleştirin. CM için kullanılan aynı tutma tekniğini kullanarak fareyi yerinde tutun; Başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanarak kuyruğun tabanına yakın bir yerde kavrayın ve hayvanı dengelerken kuyruğu yukarı doğru eğin.
- Küçük spekulumu ( Malzeme Tablosuna bakınız) vajinaya yerleştirin.
- Tohumlama cihazı kateterini spekuluma, serviksten ve uterusa yerleştirin. Cihaz hub'ı spekuluma temas ettiğinde, pipet pistonunu ilk durağa kadar bastırarak spermi dağıtın. Rahim boynuzuna fazladan hava transferinden kaçının.
NOT: Kateter doğru yerleştirilmezse, rahim ağzını çevreleyen dokuya çarparak esnemesine ve sonunda bükülmesine neden olur. Kateter ilk denemede rahim ağzından kaymazsa, kateteri nazikçe geri çekin ve başarılı olana kadar tekrar deneyin. Spekulumun yeniden konumlandırılması gerekebilir. - Cihazı ve spekulumu çıkarın. İşlem sonrası izleme gerekmez.
- İsteğe bağlı: 10-12. günlerde gebelik kontrolü
- Hamilelik durumunu belirlemek için kilo alımını kullanın. Kilo alımı zorlanmaya bağlı olacaktır, ancak en az 1-2 g'lık bir artış hamilelikle ilişkilidir.
Şekil 1: Servikal manipülasyon için fare tutma tekniği. Fare bir tel kafesin tepesine dayanır ve kuyrukta ve arka ayakların önünde her iki tarafta stabilize edilir. Küçük bir plastik çubuğun kör ucu, rahim ağzına temas edecek şekilde vajinal yoldan sokulur ve bir düzeltici ile temas ettirilerek titreştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. CD1 farelerinde servikal manipülasyon ile kullanım için cerrahi olmayan embriyo transferi prosedürü
- Dişi farelerin 1. ve 3. günde senkronize yumurtlaması
- Dişi farelere, vivaryum ışık döngüsünün başlamasından yaklaşık 6 saat sonra, 1. günde IP enjeksiyonu ile 2.5 IU PMSG enjekte edin.
- Dişilere 3. günde, PMSG enjeksiyonundan 47 saat sonra veya vivaryum ışık döngüsünün başlamasından yaklaşık 5 saat sonra IP enjeksiyonu ile 2.5 IU hCG enjekte edin.
- Sitolojik değerlendirme ile östrus döngüsü senkronizasyonunun doğrulanması
- 3. günde, CM'den yaklaşık 1 saat önce, potansiyel alıcılar üzerinde sitoloji yapın. Küçük, önceden nemlendirilmiş bir bez kullanarak, swabı dokuya doğru yuvarlayarak vajinal hücreleri vajinal duvardan nazikçe toplayın, bunları bir mikroskop lamı üzerinde 20 μL'lik bir steril su damlasına sürün ve havayla kurutun.
- Parlak alan aydınlatması ile 100x büyütme kullanan bir mikroskop altında, kornifiye epitel hücrelerinin varlığını değerlendirin. Östrus veya geç proöstrustaki dişilerde kornifiye epitel hücreleri bulunur ve servikal manipülasyon için seçilmelidir.
- İsteğe bağlı: Potansiyel dişi embriyo alıcılarının ağırlığını kaydedin.
- CM'yi Gerçekleştirme
- 3. günde, vivaryum karanlık döngüsünün başlamasından 1 saat önce, hayvanın kafes çubuğu yüzeyini "tutmasına" izin vererek, bir alıcı dişi bir tel raflı bir kafesin üstüne yerleştirin. İşaret parmağını ve başparmağı kullanarak kuyruğun tabanına yakın bir yerde kavrayın ve ardından hayvanı sabitlerken kuyruğu yukarı doğru eğin (Şekil 1).
NOT: Kullanım tekniği doğru bir şekilde gerçekleştirildiğinde fare prosedür süresince hareketsiz kalacaktır. Fare yerinden çıkarsa, yavaşça yeniden konumlandırın ve devam edin. Alıcı olarak agresif bir hayvan seçilirse, işlem sırasında hayvanın bir zenginleştirme tüneline girmesine izin vermek sakinleştirici olabilir. - Küçük bir plastik çubuğun kör ucunu rahim ağzına temas edecek şekilde vajinal yoldan sokun ve bir düzeltici ile temas ettirerek 30 saniye boyunca titreştirin.
NOT: Düzelticiyi çalıştırmadan önce çubuğu yerine yerleştirin. İşlem sırasında her ikisi de tek elle tutulur. Anestezi veya analjezi gerekmez.
- 3. günde, vivaryum karanlık döngüsünün başlamasından 1 saat önce, hayvanın kafes çubuğu yüzeyini "tutmasına" izin vererek, bir alıcı dişi bir tel raflı bir kafesin üstüne yerleştirin. İşaret parmağını ve başparmağı kullanarak kuyruğun tabanına yakın bir yerde kavrayın ve ardından hayvanı sabitlerken kuyruğu yukarı doğru eğin (Şekil 1).
- 6. günde ameliyatsız embriyo transferi
- Bir doku kültürü kabının kapağına 20 μL'lik bir damla M2 ortamı ( Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin.
NOT: Kapak, daha kısa bir kenara sahip olduğu için seçilmiştir ve bu nedenle damladaki embriyolara erişmek için uygundur. Rahim boynuzuna yağ verilmesi embriyo transferini olumsuz yönde etkilediği için hiçbir zaman parafin yağını M2 damlasının üzerine koymayın. - Mikroskop altında ve yansıtıcı aydınlatma kullanarak, standart bir embriyo işleme pipeti kullanarak orta damlaya 10-20 blastosist yükleyin (bkz.
NOT: Transfer edilecek en uygun embriyo sayısı, fare suşuna ve embriyoların geçirdiği manipülasyonlara bağlıdır. Manipüle edilmemiş sağlıklı embriyolar için 10-15 embriyonun transfer edilmesi yeterli olacaktır. Üreme veya genetiği değiştirilmiş embriyolar için daha fazla embriyo transferi uygundur. - Ameliyatsız embriyo transfer cihazını (Malzeme Tablosuna bakın) 1,8 μL'ye ayarlanmış bir P2 pipetine sabitleyin. Koruyucu kateter kapağını çıkarın.
- Pipetin pistonunu ilk durağa kadar bastırın, kateterin ucunu ortama indirin ve embriyoları yavaşça cihazın kateter ucuna çekin. Ucu ortamdan çıkarın.
NOT: Embriyoların düşük büyütme altında görüntülenmesi, embriyoların cihaza daha kolay yüklenmesini sağlayacaktır. Embriyolar damlaya dağılmışsa, embriyoları damlanın ortasına konsantre etmek için tabağı bir yandan diğer yana hafifçe sallayın veya bir embriyo işleme pipeti kullanarak yeniden konumlandırın. - Kateterin ucunda küçük bir hava kabarcığı oluşturmak için pipet hacmini 2,0 μL'ye ayarlayın. Pipeti, fare kafesinin yanına yüklenen embriyolarla yavaşça yerleştirin.
- Alıcı dişi tel ızgara kafesinin üstüne yerleştirin. CM için kullanılan aynı kullanım tekniğini kullanarak fareyi yerinde tutun; İşaret parmağını ve başparmağı kullanarak kuyruğun tabanına yakın bir yerde kavrayın ve ardından hayvanı sabitlerken kuyruğu yukarı doğru eğin.
- Vajinaya küçük bir spekulum yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Transfer cihazı kateterini spekuluma, serviksten ve uterusa yerleştirin. Cihaz hub'ı spekuluma temas ettiğinde, pipet pistonunu ilk durağa kadar bastırarak embriyoları dağıtın. Rahim boynuzuna fazladan hava transferinden kaçının.
- Pipet pistonunu serbest bırakmadan cihazı ve spekulumu çıkarın. İşlem sonrası izleme gerekmez.
- Bir doku kültürü kabının kapağına 20 μL'lik bir damla M2 ortamı ( Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin.
Representative Results
Sıçanlarda yalancı gebeliği indüklemek için elektriksel9 ve sonik10 servikal stimülasyon kullanıldığından, bu çalışma farelerde kullanılabilecek standart bir mekanik prosedür sunmaktadır. Vajinal sitoloji, kızgınlığın çeşitli aşamalarında kadınların tanımlanmasına yardımcı olabilir. Kadınlarda yalancı gebeliği doğrulamak için aynı yöntem kullanıldı. İlk olarak, dişiler için sitoloji profilleri, östrus siklusları boyunca, hamilelik sırasında ve çiftleşme veya CM tarafından indüklenen yalancı gebelik sırasında CD1 ve C57Bl / 6 fareleri için karşılaştırıldı. Hücreler, parlak alan aydınlatması ile 100x büyütme altında gözlemlendi. Gözlenen hücreler arasında lökositler, çekirdekli epitel hücreleri ve annükleat kornifiye epitel hücreleri vardı. Kızgınlık döngüsü aşamasının belirlenmesi, her hücre tipinin11,12 nispi yüzdesine dayanıyordu. Östrus, kornifiye epitel hücrelerinin baskınlığı ile karakterizedir. Kızgınlık sona erdiğinde, metestrus başlar ve lökositler ortaya çıkmaya başlarken, kornifiye epitel hücreleri daha az belirgin hale gelir. Diestrus, lökositlerin baskın olduğu ve çekirdekli epitel hücrelerinin ortaya çıkmaya başladığı orta ila düşük hücreselliğe sahiptir. Proöstrus, lökositlerin kaybı, çekirdekli epitel hücrelerinde bir artış ve kornifiye epitel hücrelerinin görünümü ile ayırt edilir. Proöstrus sonrası östrus başlar ve döngü devam eder.
Bir başlangıç profili geliştirmek için, çiftleşmeden önce her dişi için en az iki tam östrus döngüsü (CD1 için N = 20, C57Bl / 6 için N = 20) vajinal sitoloji kaydedildi. Döngü uzunlukları ve bireysel profiller fareler arasında değişiyordu; ancak beklenen genel eğilimler gözlenmiştir. CD1 ve C57Bl / 6 fareleri için bir kızgınlık döngüsünün ortalama uzunluğu 3.8 gündü ve 3-5 gün aralığındaydı. Doğal çiftleşme gerçekleşmeden bir gün önce, tüm dişi fareler proöstrus dönemindeydi. Çiftleşmeden sonra, östrus döngüsü devam edene kadar koitumdan (dpc) 1.5 gün sonra sitoloji tekrar yapıldı. Şekil 2 , vazektomize erkeklerle çiftleşen psödogebe CD1 ve C57Bl/6 dişilerinin sitolojik profilini göstermektedir.
Şekil 2: Yalancı gebe dişi fareler için sitolojik profil. Lökositler, çekirdekli epitel hücreleri ve kornifiye epitel hücreleri için her hücre tipinin ortalama yüzdeleri, (A) CD1 (N = 20) ve (B) C57Bl / 6 (N = 20) fareler için koitum sonrası günlerin (DPC) bir fonksiyonu olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu çalışmada, yalancı gebe dişilerin üretilmesinin verimliliğini artırmak için bir CM tekniği standartlaştırılmıştır. Kızgınlık veya proöstrus hastası dişiler için, küçük bir plastik çubuğun kör ucu rahim ağzına temas edecek şekilde vajinal yoldan sokulur ve bir düzeltici ile temas ettirilerek 30 saniye boyunca titreştirilir. İşlem tel kaplı bir kafes üzerinde gerçekleştirilir. Anestezi veya analjezi gerekmez. CM prosedürünün etkinliğini belirlemek için, vazektomize erkeklerle çiftleşmeden sonra ve CM'den sonra (toplam N = 40) dişi CD1 (N = 20) ve C57Bl / 6 (N = 20) fareler için vajinal sitoloji karşılaştırıldı. CM tarafından indüklenen yalancı gebeliğin sitolojik profili, Şekil 3'te gösterildiği gibi, çiftleşmenin neden olduğu yalancı gebelik profiline benzerdi.
Şekil 3: Servikal manipülasyon (CM) sonrası psödogebe dişi fareler için sitolojik profil. Lökositler, çekirdekli epitel hücreleri ve kornifiye epitel hücreleri için her hücre tipinin yüzdesi, koitum sonrası günlerin (DPC) veya servikal manipülasyondan sonraki günlerin (DPCM) bir fonksiyonu olarak gösterilir. Ortalama hücre tipi yüzdeleri, CD1 ve C57Bl / 6 fareleri (N = 40) (A) vazektomize erkeklerle çiftleşti veya (B) CM'den sonra gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
CM tekniğinin yardımcı üreme için gebelik oluşturmak için yeterli olup olmadığını belirlemek için, CD1 kadınlarında cerrahi olmayan suni tohumlama (NSAI) protokolünün bir parçası olarak CM yapıldı. Suni tohumlama protokolü, sperm transferinden önce dişilerin düşük dozda PMSG ve hCG hormonları ile kızgınlık senkronizasyonunu içeriyordu. Sperm transferinden hemen önce CM yapıldı. CD1 fareleri için, bu teknikle östrus (N = 76) dişiler için CM kullanılarak psödogebelik indüksiyonunun etkinliği% 83 idi. Bir kontrol deneyinde, östrustaki kadınların sadece% 38'i vazektomize erkekler tarafından tıkanmıştır (N = 24). Servikal manipülasyon (N = 76) alan suni tohumlama alıcıları% 72 gebelik oranına ve ortalama 8.3 yavru büyüklüğüne sahipti. Bu nedenle, CM tarafından psödogeliğin indüksiyonu, NSAI yapılırken vazektomili bir erkekle çiftleşmenin uygun ve etkili bir alternatifidir. Kızgınlıkta CD1 alıcılarını (N = 4) taze CD1 blastosistlerinin cerrahi olmayan embriyo transferi için hazırlamak için CM kullanmak% 100 gebelik oranı ile sonuçlandı. 9-15 embriyonun transferi, %45 doğum oranına ve ortalama 6 yavru büyüklüğüne sahip üç sağlıklı yavru verdi. Buna karşılık, yalancı gebeliği indüklemek için vazektomize erkeklerle çiftleştirilen CD1 alıcıları (N = 20), 20 taze B6C3F2 blastosistinin transferinden sonra% 80 gebelik oranına ve% 46 doğum oranına sahipti.
Süperovulasyon için hormon uygulamasının dozu ve zamanlaması gibi değişkenlerin suşa bağlı olduğu bulunduğundan, yardımcı üreme tekniklerinin sonuçları muhtemelen suşa özgü olacaktır13. Ek olarak, alıcının yaşı ve kilosu gibi faktörler hormonlara reaksiyonu etkileyebilir14. Bu çalışmada, suni tohumlama için CM prosedürü uygulanırken, sadece geç proöstrus veya östrustaki dişilerin yanıt verdiği bulunmuştur. Genel olarak, bir popülasyondaki mevcut alıcıların sayısını artırmak için, dişiler önce düşük dozda hormon3 ile östrus senkronize edilir. Bu çalışmada 2.5 IU PMSG ve hCG ile östrus senkronizasyonu 11-14 haftalık CD1 kadınlarda (N = 27) %78 ve 18-32 haftalık C57Bl / 6 kadınlarda (N = 22) %60 etkiliydi. Bu teknikle CD1 kadınlarda servikal manipülasyon kullanılarak psödogebelik indüksiyonunun etkinliği östruslu kadınlarda %83 (N=76) ve östrusta C57Bl/6 dişilerde %82 (N=100) idi.
Discussion
3R, 1959'da Russel ve Burch tarafından "İnsancıl Deneysel Tekniğin İlkeleri"15'te tanımlandığı gibi, araştırmalarda hayvan kullanımı için etik bir çerçevedir. 3R, hayvan kullanımında değiştirme, azaltma ve arıtmayı temsil eder. Burada vurgulanan protokoller 3R ile uyumludur. Servikal manipülasyon tekniği, artık yalancı gebe dişiler üretmek için erkeklerin kullanılmasını gerektirmeyerek ihtiyaç duyulan hayvan sayısını azaltır. Teknik aynı zamanda erkeklerde vazektomi yapma ihtiyacını ortadan kaldırır, böylece ağrı ve sıkıntıyı azaltarak incelik sağlar. Burada tarif edilen yardımcı üreme teknikleri (suni tohumlama ve embriyo transferi) cerrahi değildir ve bu nedenle her ikisi de cerrahi alternatiflerinin neden olduğu ağrı ve sıkıntıyı8azaltarak 3R'lik bir iyileştirme sağlar.
Farelerde yardımcı üreme yapılırken yavruların iyileşmesi için psödogebe dişilerin kullanılması gereklidir1. CM prosedürü, psödogebe dişilerin üretilmesi için etkili bir yöntemdir, ancak alıcı dişilerin kızgınlık döngüsünün fazının senkronizasyonu, süreçte kritik bir ilk adımdır. Öströz senkronizasyon, potansiyel alıcıları hazırlamak için kolonide ihtiyaç duyulan dişi sayısını büyük ölçüde azaltabilir ve talep üzerine zamanlanmış psödogebe dişilerin üretilmesine yardımcı olabilir. Düşük dozda hormon kullanmak, CD1 farelerinde canlı yavruların geri kazanılması üzerinde herhangi bir zararlı etkiye neden olmamaktadır. Transfer edilen embriyolar veya spermler için en kaliteli alıcı dişileri üreten hormon ve konsantrasyon kombinasyonunu bulmak için diğer suşlara özen gösterilmelidir. Senkronizasyon, PMSG ve hCG16 kullanılarak sağlanabilir, ancak süperovule dişiler üreten dozlar, sürekli bir hamilelik için uygun olmayabilir17.
Bir dişinin kızgınlık geçirip geçirmediğini belirlemek için bu çalışmada sitolojik bir değerlendirme yapıldı. Kızgınlık fazı, vajinal açıklığın11,18 gözlemlenmesiyle de değerlendirilebilir. Bu yöntem son derece yararlı olmasına ve kendi başına veya doğrulama olarak kullanılabilmesine rağmen, sitolojinin kullanımından daha özneldir. Boyamasız vajinal sitoloji, kızgınlıkta dişileri seçmek için hem hızlı hem de etkilidir, çünkü kornifiye epitel hücreleri kolayca tanımlanabilir. Bu protokolde, potansiyel alıcıları belirlemek için CM'den önce sitolojik değerlendirme yapılır. CM'den önce sitoloji yapmak önemlidir, çünkü prosedür vajinal bölgeden dökülen hücreleri parçalama eğilimindedir, bu da tanımlamayı zorlaştırır. Yalancı gebelik veya gebelik için sitolojik değerlendirme, KM'den (dpcm) 3.5-11.5 gün sonra art arda 3 gün boyunca yapılabilir. Östrus bisikletli bir dişinin profili, kornifiye epitel hücrelerinin önemli ölçüde infiltrasyonu ile en az 1 güne sahip olmalıdır. Yalancı gebe / hamile kadınlar, art arda 3 gün boyunca bir diestrus profili (çoğunlukla potansiyel olarak düşük hücre sayılarına sahip lökositler) göstermelidir.
CM tekniğinin geliştirilmesiyle, bazı farelerin prosedüre diğerlerinden daha açık olduğu bulundu. CD1 dişi fareler, sakin doğaları ve mükemmel besleyici içgüdüleri nedeniyle mükemmel adaylardır. Bu suşun kullanımı kolaydır ve CM ve cerrahi olmayan yardımcı üreme teknikleri sırasında iyi performans gösterir. C57Bl / 6 fareleri daha agresif ve daha az besleyici olma eğilimindedir. Bu protokol, CM kullanarak psödogebe C57Bl / 6 kadınlarını etkili bir şekilde üretirken, prosedüre tutarlı bir şekilde izin verme olasılıkları daha düşüktü. Bu, CM sırasında östrus fazı ile bir şekilde ilişkili görünüyordu. Östrus veya proöstrustaki dişiler daha alıcıydı. Hayvanın girmesi için bir zenginleştirme tüpünün kullanılması, prosedür için vajinaya erişime izin verdi ve dişinin sakinleşmesine yardımcı oldu. Prosedürün kendisi dişiyi tam olarak kısıtlamaz, böylece hayvan herhangi bir zamanda çekilebilir. Bu meydana gelirse, hayvan yeniden konumlandırılabilir ve prosedüre devam edilebilir. Dişi uzaklaşırsa prosedürün zamanlaması durur ve prosedür devam ettirildiğinde devam eder. İşlemin başarısı için kritik olan, östrus döngüsünün fazı (geç proöstrus ve östrus) ve çubuğun serviks ile temasıdır. Düzelticinin titreşimi standartlaştırılmış CM sağlar. Serviks ile teması sağlamak için çubuğa hafif bir basınç uygulanır ve çubuğun rahim ağzına karşı konumlandırılması, çubuğun küçük ileri geri hareketleriyle sağlanır.
CM kullanımı NSAI protokolünü geliştirmiştir, çünkü östrus döngüsünün doğru fazındaki dişiler sperm transferinden önce seçilebilir ve protokol artık vazektomize erkeklerle çiftleşmeye bağlı değildir. Suni tohumlama östrus döngüsü senkronizasyonu, oosit olgunlaşması 4. günün sabahı sperm transferine karşılık gelecek şekilde zamanlanır. Protokolün başarısı için kritik olan, yumurtlama zamanlamasının döllenmenin gerçekleşebileceği şekilde uyarlanmasıdır. İn vitro fertilizasyon için kullanılan zamanlamalar için önerildiği gibi, beklenen sperm transferinden 15-17 saat önce hCG uygulanmasına özen gösterilmelidir1. Sperm örneğinin kalitesi suni tohumlamanın sonucunu doğrudan etkileyecektir. Kapasitif hale getirilmiş taze spermler en iyi performansı gösterecektir. İyi kalitede dondurularak saklanmış sperm, in vivo olarak döllenmiş embriyolar üretebilir. Bununla birlikte, uterus boynuzuna aktarılan artık kriyoprotektanlar implantasyonu engelleyebileceğinden, çözülmüş spermin doğrudan transferine dikkat edilmelidir (yayınlanmamış gözlemler).
CM'nin embriyo transferi ile birlikte kullanılması kavramsal olarak kolay bir adaptasyondur. Öströz döngü senkronizasyonu, alıcı havuzunu oluşturmak için gerekli olan dişi sayısını azaltır. CM'den önce östrus evresinin belirlenmesi, psödogebe alıcıların elde edilme olasılığını artırır. Yöntemin bir dezavantajı, embriyo transferi sırasında alıcıların sitolojisinin bir akış aşamasında olmasıdır. Dişi östrustan psödogebelik profiline geçiyorsa tüm hücre tipleri mevcuttur ve psödogebelik ancak sitoloji birkaç gün izlenirse belirgin hale gelir. CD1 ve C57Bl/6 fareler için östrustan psödogebeliğe geçişin başarısına (%>80) dayanarak, bu yöntemin embriyo transferi alıcıları için uygun olması beklenmektedir. Ön sonuçlar, sınırlı cerrahi olmayan embriyo transferi ile iyi bir başarı göstermektedir. Genel olarak, cerrahi olmayan embriyo transferinin etkinliği, cerrahi teknikle4,5 karşılaştırılabilir ve cerrahi olmayan transfer, blastosist aşamasında cerrahi embriyo transferlerinin yerini alabilir. Daha erken evre embriyolar için blastosist aşamasına embriyo kültürü gereklidir. Bununla birlikte, cerrahi bir transfer tercih edilirse, CM tekniğini uygun psödogebe alıcılar için gereken doğru zamanlamaya uyarlamak mümkündür2. Genel olarak, embriyo alıcıları embriyodan 1 gün daha az ilerlemiştir. Örneğin, blastokistler donörlerden 3.5 dpc'de toplanır ve 2.5 dpc alıcılarına aktarılır. Bu nedenle, CM'nin, alıcının embriyolardan daha az gelişmiş bir psödogebe durumunda olacağı şekilde yapılması gerekecektir.
Sonuç olarak, burada özetlenen CM tekniği, fareler için diğer yardımcı üreme teknikleriyle entegrasyon için mükemmel bir umut vaat etmektedir. Suni tohumlama ve embriyo transferi için ameliyatsız teknikler kullanılarak başarılı protokoller sağladık. Kombinasyon halinde, CM tekniği, (1) vazektomili erkeklere olan ihtiyacı ortadan kaldırarak hayvan sayısında bir azalma ve (2) cerrahi teknikleri cerrahi olmayan alternatiflerle değiştirerek tekniklerin iyileştirilmesi dahil olmak üzere 3R avantajları sağlar.
Disclosures
Barbara Stone ve Sarah Srodulski, ParaTechs Corporation, Lexington, KY, ABD'de çalışmaktadır. ParaTechs, fareler için mNSET cihazını üretmek için münhasır lisans haklarına sahiptir. ParaTechs Corp, sırasıyla ameliyatsız embriyo transferi ve ameliyatsız suni tohumlama için kullanılabilen mNSET ve mC&I cihazlarını geliştirmiş ve satmıştır.
Acknowledgments
Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Araştırma Altyapısı Programları Ofisi Direktörlüğü Ofisi tarafından R43OD020304 Numaralı Ödül ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü tarafından R44MH122117 Numaralı Ödül ile desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmeyebilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blastocyst stage embryos | |||
| CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
| Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
| Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
| Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
| human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
| Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
| Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
| Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
| mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
| Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
| Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
| Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
| Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
| Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
| Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
| Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
| Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
| Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
| Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
| Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
| Wire bar topped mouse cage |
References
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, fourth edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2014).
- Wake, Y., et al. Successful induction of pseudopregnancy using sonic vibration in mice. Scientific Reports. 13 (1), 3604 (2023).
- Stone, B. J., Steele, K. H., Fath-Goodin, A. A rapid and effective nonsurgical artificial insemination protocol using the NSET device for sperm transfer in mice without anesthesia. Transgenic Research. 24 (4), 775-781 (2015).
- Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. BioTechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Stone, B. J., et al. A nonsurgical embryo transfer technique for fresh and cultured blastocysts in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (5), 488-495 (2020).
- Steele, K. H., et al. Nonsurgical embryo transfer device compared with surgery for embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 17-21 (2013).
- Terkel, J., Witcher, J. A., Adler, N. T. Evidence for "memory" of cervical stimulation for the promotion of pregnancy in rats. Hormones and Behavior. 24 (1), 40-49 (1990).
- Kaneko, T., Endo, M., Tsunoda, S., Nakagawa, Y., Abe, H. Simple induction of pseudopregnancy by artificial stimulation using a sonic vibration in rats. Scientific Reports. 10 (1), 2729 (2020).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Luo, C., et al. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (4), 471-478 (2011).
- Gates, A. H. Viability and developmental capacity of eggs from immature mice treated with gonadotrophins. Nature. 177 (4512), 754-755 (1956).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co., Ltd. London, UK. (1959).
- Hasegawa, A., et al. Efficient and scheduled production of pseudopregnant female mice for embryo transfer by estrous cycle synchronization. Journal of Reproduction and Development. 63 (6), 539-545 (2017).
- Beaumont, H. M., Smith, A. F. Embryonic mortality during the pre- and post-implantation periods of pregnancy in mature mice after superovulation. Journal of Reproduction and Fertility. 45 (3), 437-448 (1975).
- Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
