Summary
该协议提出了一种通过串测试快速诊断 幽门螺杆菌 胃感染的非侵入性方法，并使用定量聚合酶链反应（qPCR）确定其对克拉霉素和左氧氟沙星的抗生素耐药性。
Abstract
幽门螺杆菌是一种主要的人类病原体，感染了全球约一半的人口，并且由于其抗生素耐药性的增加而正在成为严重的健康威胁。它是慢性活动性胃炎、消化性溃疡病和胃癌的病原体，已被国际癌症研究机构列为 I 组致癌物。因此，快速准确地诊断幽门螺杆菌并测定其抗生素耐药性对于有效根除该细菌病原体具有重要意义。目前，幽门螺杆菌的诊断方法主要包括尿素呼气试验（UBT）、抗原试验、血清抗体试验、胃镜检查、快速尿素酶试验（RUT）和细菌培养。其中，前三种检测方法是非侵入性的，这意味着它们很容易进行测试。然而，细菌不能通过这些技术回收;因此，不能进行耐药性测试。最后三种是侵入性检查，但它们成本高昂，需要高技能，并且有可能对患者造成损害。因此，一种无创、快速、同步的幽门螺杆菌检测和耐药性检测方法对于临床上有效根除幽门螺杆菌非常重要。该协议旨在提出一种涉及串测试与定量聚合酶链反应（qPCR）相结合的特定程序，以快速检测幽门螺杆菌感染和抗生素耐药性。与细菌培养不同，该方法可以轻松、快速、无创地诊断幽门螺杆菌感染状态和耐药性。具体来说，我们使用qPCR检测幽门螺杆菌感染的rea以及分别编码对克拉霉素和左氧氟沙星的耐药性的23S rRNA和gyrA基因突变。与常规使用的培养技术相比，该方案提供了一种无创、低成本和省时的技术来检测幽门螺杆菌感染并使用 qPCR 确定其抗生素耐药性。
Introduction
幽门螺杆菌 是一种螺旋形、高度运动的革兰氏阴性细菌，主要生活在胃的幽门区域1。它是一种常见的病原体，感染全球近 50% 的人口2。大多数 幽门螺杆菌 感染者没有临床表现，大多数在感染几年后会发展出不同的疾病，包括慢性胃炎、消化性溃疡、胃溃疡和胃癌3。在几项基于不同人群的研究中，已经证明了消除 幽门螺杆菌 预防胃癌和癌前病变的有效性4，5。因此，世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构建议将根除 幽门螺杆菌 作为预防措施6。
使用无创方法识别 幽门螺杆菌 感染是大多数无症状消化不良患者治疗的关键组成部分。尿素呼气试验 （UBT）、 幽门螺杆菌 粪便抗原试验 （SAT） 和血清学检测是流行的无创技术。其中，UBT是侵入性最小且最准确的程序。UBT使用幽 门螺杆菌中大量存在的脲酶将同位素标记的尿素水解成氨和二氧化碳（13C或14C）。相比之下，免疫层析（ICA）7 方便、简单且无创取样。但是，测试的准确性受多种因素的影响，例如粪便样本的质量、温度以及样本采集和测试之间的间隔。另一种基于免疫反应的测试是血清 幽门螺杆菌 抗体测试，该测试可检测患者血清中的抗体。然而，该测试不适合治疗后分析，因为抗体在细菌被清除后很长时间仍然存在8。另一个主要缺点是这些方法仅诊断 幽门螺杆菌 感染，不允许进行耐药性测试来指导基于敏感性的治疗。
对于侵入性检查方法，需要通过内镜检查取胃活检组织，然后进行组织学，脲酶快速测试和细菌培养。由于多种因素，这些测试方法也非常有限。目前，这些技术仅限于老年患者、癌前或恶性疾病高风险患者以及胃食管反流病或幽门螺杆菌感染一线治疗失败的患者9。其次，由于幽门螺杆菌独特的生长特性，细菌培养的成功率仅达到50%10。因此，分子检测方法为克服侵入性检测方法的高要求和指导基于敏感性的治疗提供了新的希望。在分子检测方法中，定量PCR近年来取得了巨大的发展。与传统PCR不同，qPCR不需要凝胶电泳，通过在退火阶段添加引物和探针来准确定量样品中的DNA/RNA。用于检测幽门螺杆菌感染和耐药性的qPCR试剂盒现已上市。然而，每种方法都有其局限性;因此，应结合患者的症状、体征、病史、其他实验室检查和对治疗的反应来考虑患者的临床诊断和治疗。
目前，治疗 幽门螺杆菌 感染的主要方法是服用抗生素，但最近，由于抗生素耐药性的增加，治疗这些感染变得越来越困难。随后，全球观察到 幽门螺杆 菌治疗效果显着下降，使 幽门螺杆 菌根除成为一个主要的公共卫生问题11。
克拉霉素和左氧氟沙星是用于治疗幽门螺杆菌引起的感染的两种广谱抗生素，但一些研究报告了幽门螺杆菌分离株对这两种药物的广泛耐药性。A2143G、A2142G 和 A2142C 是在 2.9 kb 23S rRNA 基因中发现的众多点突变中的三种，它们通过阻止大环内酯类药物结合而导致克拉霉素耐药。同时，左氧氟沙星耐药基因的突变位点主要位于gyrA基因12的6个突变位点（A260T、C261A、T261G、G271A、G271T、A272G）。这些基于基因突变的耐药机制的发现导致幽门螺杆菌的检测逐渐转变为基于培养的研究到分子检测。
总体而言，临床迫切需要一种无创、有效且同步的诊断方法来检测 幽门螺杆菌 感染和耐药性。采用串试验与qPCR相结合的方法，克服采样困难，达到不同引物探针同时检测 幽门螺杆菌 感染和耐药性的目的。
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Protocol
本研究是根据中国广州南方医科大学广东省人民医院伦理委员会建立的伦理考虑进行的（批准文号：KY-Q-2022-384-02）。本研究纳入了18-60岁年龄段的患者。检测前2周内服用抗生素、抗菌中药、质子泵抑制剂（PPI）或H2 受体拮抗剂等药物的患者未纳入本研究。那些在过去3个月内接受过 幽门螺杆菌 治疗的患者也被排除在这项研究之外。那些有严重心脏，肝脏，肾脏问题，严重神经病变或精神疾病的人也不允许参加这项研究。这项研究没有包括孕妇和哺乳期母亲。本研究中使用的用品（试剂、化学品、设备和软件）的详细信息在 材料表中给出。
1.胃液采样的串试验
- 要求患者在采集样本前禁食过夜。
- 第二天，打开弦测试套件，取出胶囊，并按住弦末端的环。
- 将绳子粘在患者的脸颊上，并要求他们将胶囊放在靠近喉咙后部的舌头上，然后喝一口水吞咽。
- 让胶囊溶解在患者的胃中，从而暴露胶囊内的绳子以吸收胃粘液。
- 请训练有素的助手在患者吞咽胶囊 1 小时后小心地拉出绳子。
- 切下浸泡在胃液中的绳子（40厘米）的下端，将其放入TSE（Tris/盐水/ EDTA）样品保存溶液中，然后在室温（RT）下将其送到临床实验室，以便随后检测 幽门螺杆菌 并使用qPCR测定抗生素耐药性谱。
2. 脱氧核糖核酸提取
- 将携带标本的收集管放在试管架上，正确标记，并涡旋10秒。
- 将 32 孔板（核酸提取或纯化试剂盒）倒置数次以重悬磁珠。短暂涡旋10秒后，小心地从板上取下铝箔密封。
- 将每个样品和 幽门螺杆菌 DNA 中的 200 μL 胃液作为阳性对照转移到单独的孔中。
- 将32孔板置于核酸提取机的相应样品槽中，用于自动DNA提取。
- DNA提取和确认后，通过qPCR对阳性样本启动克拉霉素和左氧氟沙星的抗生素耐药性检测。
- 将过量的胃液和提取的DNA样品置于-20°C，以便长期储存和将来使用。
- 在生物安全柜中执行所有这些步骤以避免任何污染。
3. qPCR 用于检测 幽门螺杆菌 和抗生素耐药性（克拉霉素和左氧氟沙星）
- 进行 qPCR 以检测 幽门螺杆菌 及其基因组中可疑的抗生素耐药性突变。
- 将qPCR反应混合物（幽门螺杆菌 核酸检测试剂盒）在冰上解冻，并通过轻弹和旋转进行混合，以防止试剂损失。
- 对于 32 孔板上的每个样品，将 20 μL PCR 反应混合物（基因分型反应预混料 [含有 Taq 酶、脱氧核糖核苷三磷酸、反应缓冲液和氯化镁]，与尿素 A 正向和反向引物以及 尿素 A 探针）和 5 μL 提取的 DNA 混合。
- 在 qPCR 机器上运行 32 孔 qPCR 板。对热循环仪进行编程：反应混合物将首先在42°C和95°C（均一个循环）下依次反应2分钟;然后，在95°C下循环40次，变性10秒，在58°C下退火和延伸45秒。
- 将荧光信号采集设置为FAM（幽门螺杆菌），将数据采集设置为扩增延长周期。反应完成后，保存数据以供将来的结果分析。
- 使用特定的qPCR软件分析数据，因为仪器将自动选择基线阈值。
- 如果幽门螺杆菌的检测结果为阳性，机器将自动对样本开始耐药性检测。将试剂盒替换为幽门螺杆菌 （qPCR） 试剂盒中 23S rRNA 基因和 gyrA 基因突变的检测试剂盒。
注意：试剂盒（幽门螺杆菌 [qPCR] 中 23S rRNA 基因和 gyrA 基因突变的检测试剂）包括 PCR 反应混合物（基因分型反应预混料 [含有 Taq 酶、脱氧核糖核苷三磷酸、反应缓冲液、氯化镁]、引物和探针）。所有负质控产品均为无菌纯化水。幽门螺杆菌核酸检测试剂盒中的阳性质量控制产物是灭活幽门螺杆菌标准微球（ATCC 43504）。试剂盒中的强幽门螺杆菌阳性和弱阳性质控产物（幽门螺杆菌23S rRNA基因和gyrA基因突变的检测试剂）是含有靶基因和突变基因的灭活幽门螺杆菌菌株的DNA。同样，根据实际情况，所有诊断标准，包括幽门螺杆菌感染或耐药性的存在，都设置为CT ≤35，并具有典型的S形曲线。弱质控品的浓度为1.0 x 103拷贝/mL，而强质控品的浓度为1.0 x 108拷贝/mL。
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Representative Results
qPCR检测胃液中 幽门螺杆菌 感染和抗生素耐药性
我们通过扩增尿素A基因进行qPCR检测幽门螺杆菌感染，并通过靶向23S rRNA基因和gyrA基因的点突变来确定其抗生素耐药性谱（表1）。所有三组qPCR实验的质控CT值均在推荐范围内，表明样品在实验时均处于正常状态，检测结果可靠。本研究选取了5个不同测试结果（S1-S5）的样品来表征实验方案的可靠性。S1代表没有感染的幽门螺杆菌代表性菌株，而S2-S5样本是感染幽门螺杆菌的样本，具有不同的耐药结果（图1）。我们将系统设置为不对未感染幽门螺杆菌的样本进行进一步的耐药性测试，因此在系统测试显示幽门螺杆菌阴性结果后，S1样本没有进入耐药性测试。幽门螺杆菌感染阳性样本中，S2 CT值均在检出范围内，表明样本为幽门螺杆菌阳性，对克拉霉素和左氧氟沙星表现出双重耐药性，建议临床医生自行选择其他治疗方法。S3 CT值在幽门螺杆菌感染和左氧氟沙星耐药试验检测范围内，克拉霉素耐药试验未检出CT值，表明S3样本来自左氧氟沙星耐药患者。同样，S4样本CT值在幽门螺杆菌感染和克拉霉素耐药检测范围内，而左氧氟沙星耐药CT值未检出，表明该患者对克拉霉素耐药，建议服用左氧氟沙星治疗。最后，S5样本测试显示CT值仅在检测幽门螺杆菌感染的检测范围内，表明该患者对两种抗生素都敏感，可以使用两种药物中的任何一种进行治疗。与同时检测幽门螺杆菌感染和耐药性的细菌培养方法相比，该方法在不对患者造成损害的情况下安全有效地检测幽门螺杆菌感染和耐药性，可用于指导医生制定适当的治疗方案。
图 1：通过 qPCR 检测胃液中的 幽门螺杆菌 及其抗生素耐药性。
（A） 幽门螺杆菌 感染的定量PCR扩增，（B）克拉霉素耐药性的检测，以及（C）左氧氟沙星耐药性的检测。“S”代表样本。“S1”是幽 门螺杆菌 感染阴性的样本，也进行了抗生素耐药性检测;“S2”是 幽门螺杆菌感染的样本，对克拉霉素和左氧氟沙星均具有耐药性;“S3”也是 幽门螺杆菌阳性样本，但克拉霉素敏感且左氧氟沙星耐药;“S4”也是 幽门螺杆菌阳性样本，但克拉霉素耐药且左氧氟沙星易感;“S5”是 幽门螺杆菌阳性样本，但对克拉霉素和左氧氟沙星均敏感。弱质控品的浓度为1.0 x 103 拷贝/mL，而强质控品的浓度为1.0 x 108 拷贝/mL。 请点击此处查看此图的大图。
| 样本 | 幽门螺杆菌 | 克拉霉素 | 左氧氟沙星 | |||
| +/- | 电脑断层扫描 | +/- | 电脑断层扫描 | +/- | 电脑断层扫描 | |
| S1 | - | U | - | U | - | U |
| S2 | + | 22.61 | + | 22.77 | + | 23 |
| S3 | + | 28.32 | - | U | + | 30.18 |
| S4 | + | 28.76 | + | 27.67 | - | U |
| S5 | + | 31.59 | - | U | - | U |
表1：表显示了检测 幽门螺杆菌 感染和对克拉霉素和左氧氟沙星耐药的qPCR结果。 该表列出了 幽门螺杆菌 感染的定性结果，23S rRNA基因突变的检测表明分离株对克拉霉素耐药，以及 gyrA 基因突变的检测表明分离株对左氧氟沙星耐药。+/−，定性结果;+，阳性结果;−，阴性结果。
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Discussion
幽门螺杆菌 检测可以使用侵入性和非侵入性方法进行13。常用的侵入性技术，如组织病理学、快速尿素酶检测、聚合酶链反应 （PCR） 和细菌培养，需要内镜检查和活检。血清学检测、尿素呼气试验和酶联免疫吸附试验 （ELISA） 被推荐用于非侵入性操作14。虽然非侵入性方法易于操作、经济且对患者更舒适，但幽 门螺杆 菌的分离和培养以进行额外的测定，例如菌株鉴定和抗生素敏感性测试，需要侵入性测试。随着目前抗生素耐药性的上升，以前使用的抗生素变得无效，因此无法治疗由耐药幽 门螺杆 菌分离株引起的感染。在这种情况下，可能需要检索 幽门螺杆菌 进行抗生素敏感性测试，以选择最有可能成功消除耐药细菌的抗生素。
常规进行的基于培养的药敏试验，如琼脂稀释法和依普洛米试验（E-test）有几个局限性：它们很耗时，因为 幽门螺杆菌 是一种生长缓慢的细菌，成本高，基于技能，并且需要侵入性技术。交替不同的基于分子的技术，如荧光原位杂交（FISH）技术和qPCR，可用于鉴定几种突变，例如编码克拉霉素15，16耐药性的23S rRNA基因。选取幽 门螺杆菌 23S rRNA抗性基因的3点突变位点（A2142G、A2143G、A2142C）和喹诺酮类抗生素 gyrA 耐药基因的6点突变位点（A260T、C261A、T261G、G271A、G271T、A272G）设计引物和探针，分别确定对克拉霉素和左氧氟沙星的耐药性。
绳子测试起源于ENTEO-TEST，使用连接到高吸水性尼龙绳的胶囊，吞咽该尼龙绳以收集胃分泌物17。目前，串试验已被用于诊断结核病18，区分高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）与传统肺炎克雷伯菌19，鉴定革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌和酵母菌，以及从胃液中诊断幽门螺杆菌20。在这项研究中，我们将字符串测试（一种微创技术）与qPCR相结合，用于在临床环境中识别幽门螺杆菌感染，并通过靶向先前报道的幽门螺杆菌基因组中的耐药性编码突变来进行敏感性测试。我们之所以选择尿素A基因，是因为它是幽门螺杆菌特有的管家基因，没有与其他生物发生交叉反应的潜在风险。所有幽门螺杆菌分离株都必须具有尿素A基因才能在人体胃中存活，敲除实验表明，没有尿素A基因的幽门螺杆菌不具备在胃中定植的能力。
对于qPCR，质量控制标准非常重要。在 幽门螺杆菌的qPCR检测中，质控标准的要求如下：质控品阴性（FAM检测途径中荧光信号无增加，无典型S型扩增曲线，CT值>35.00或无明显信号）;阳性质控产品（FAM检测途径的荧光信号生长曲线呈S形曲线，CT值≤35.00），必须同时满足上述要求;否则，测试将被视为无效，需要再次进行。此外，对于 幽门螺杆菌 对抗生素（克拉霉素和左氧氟沙星）耐药性的qPCR检测，除了区分阳性和阴性结果的CT值更改为耐药性检测的30.00外，其他要求与上述相同。值得注意的是，本文无法获得有关引物和探针的序列信息，因为它涉及商业产权。
为了为每位患者选择更有效的抗生素，由于全球抗菌素耐药性增加，以及不同地理区域之间耐药性模式的差异，调查幽门螺杆菌的当地患病率及其抗生素耐药性概况至关重要。我们研究的主要局限性在于样本量非常小，没有覆盖中国不同的地理区域来显示幽门螺杆菌感染的患病率及其完整的抗生素耐药性特征，但串测试技术已经发展良好，通过将其与qPCR相结合，我们实现了幽门螺杆菌的同时诊断。感染和耐药性检测。这些结果表明，这种方法可以在世界不同地区更大规模地使用。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
这项工作得到了深圳市三明医学项目的支持（批准号）。SZSM201510050）和广东省基础与应用基础研究基金（批准号：2022A1515220023）。广东省人民医院高层次人才研究基金（No.KJ012021097）和中国国家自然科学基金（81871734，82072380，82272423）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin | |
| ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20163220767 | Fluorescent quantitative PCR amplification |
| ABI 7500 software | Thermo Fisher Scientific | Data Analysis | |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | Biosafety cabinet |
| DNA extraction kit | Daan Gene | ||
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. | |
| H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Testing for H. pylori infection | |
| Stream SP96 automated nucleic acid extractor | Daan Gene | SEDA 20140104 | For DNA extraction |
| String test kit | Hongmed Infagen | It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube | |
| Ultra-low temperature freezers (DW-YL450) | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C for storing reagents |
| Vortex-5 | Kylin-bell | For mixing reagent |
References
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