Kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR)-baseret hurtig diagnose af Helicobacter pylori-infektion og antibiotikaresistens

Summary

Protokollen præsenterer en ikke-invasiv metode til hurtig diagnose af Helicobacter pylori maveinfektioner gennem strengtesten og bestemmer dens antibiotikaresistens over for clarithromycin og levofloxacin ved anvendelse af kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR).

Abstract

Helicobacter pylori er et vigtigt humant patogen, der inficerer ca. halvdelen af verdens befolkning og er ved at blive en alvorlig sundhedstrussel på grund af dets stigende antibiotikaresistens. Det er årsagsmidlet til kronisk aktiv gastritis, mavesår og mavesår og mavekræft og er blevet klassificeret som et gruppe I kræftfremkaldende stof af Det Internationale Agentur for Kræftforskning. Derfor er den hurtige og nøjagtige diagnose af H. pylori og bestemmelsen af dets antibiotikaresistens vigtig for effektiv udryddelse af dette bakterielle patogen. I øjeblikket omfatter H. pylori-diagnosemetoder hovedsageligt urinstofpustetesten (UBT), antigentesten, serumantistoftesten, gastroskopi, den hurtige ureasetest (RUT) og bakteriekultur. Blandt dem er de første tre detektionsmetoder ikke-invasive, hvilket betyder, at de er lette tests at udføre. Imidlertid kan bakterier ikke hentes gennem disse teknikker; Således kan lægemiddelresistenstest ikke udføres. De sidste tre er invasive undersøgelser, men de er dyre, kræver høje færdigheder og har potentiale til at forårsage skade på patienter. Derfor er en ikke-invasiv, hurtig og samtidig metode til H. pylori-detektion og lægemiddelresistenstest meget vigtig for effektivt at udrydde H. pylori i klinisk praksis. Denne protokol har til formål at præsentere en specifik procedure, der involverer strengtesten i kombination med kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) til hurtig påvisning af H. pylori-infektion og antibiotikaresistens. I modsætning til bakteriekulturer giver denne metode mulighed for let, hurtig, ikke-invasiv diagnose af H. pylori-infektionsstatus og lægemiddelresistens. Specifikt brugte vi qPCR til at detektere rea for H. pylori-infektion og mutationer i 23S rRNA- og gyrA-generne, som koder for resistens mod henholdsvis clarithromycin og levofloxacin. Sammenlignet med rutinemæssigt anvendte dyrkningsteknikker giver denne protokol en ikke-invasiv, billig og tidsbesparende teknik til at detektere H. pylori-infektion og bestemme dens antibiotikaresistens ved hjælp af qPCR.

Introduction

H. pylori er en spiralformet, meget bevægelig, gramnegativ bakterie, der hovedsageligt lever i pylorusregionen i maven¹. Det er et almindeligt patogen, der inficerer næsten 50% af den globale befolkning². De fleste mennesker med H. pylori-infektion har ingen kliniske manifestationer, og de fleste udvikler forskellige sygdomme efter flere års infektion, herunder kronisk gastritis, mavesår, mavesår og mavekræft³. I flere undersøgelser baseret på forskellige populationer er effekten af eliminering af H. pylori til forebyggelse af mavekræft og precancerøse læsioner blevet påvist ^4,5. Derfor har Verdenssundhedsorganisationen (WHO) International Agency for Research on Cancer anbefalet udryddelse af H. pylori som en forebyggende foranstaltning⁶.

Anvendelsen af ikke-invasive metoder til at identificere H. pylori-infektion er en nøglekomponent i behandlingen for de fleste personer med asymptomatisk dyspepsi. Urea breath test (UBT), H. pylori fækal antigen test (SAT), og serologisk test er populære noninvasive teknikker. Blandt disse er UBT den mindst påtrængende og mest nøjagtige procedure, der findes. UBT bruger urease, der er rigeligt til stede i H. pylori, til at hydrolysere isotopisk mærket urinstof til ammoniak og kuldioxid (13C eller 14C). I modsætning hertil er det immunokromatografiske assay (ICA)⁷ praktisk, enkelt og ikke-invasivt til prøveudtagning. Testens nøjagtighed påvirkes imidlertid af flere faktorer, såsom kvaliteten af afføringsprøven, temperaturen og intervallet mellem prøveindsamling og testning. En anden test baseret på immunresponset er serum H. pylori antistof test, som detekterer antistoffer i en patients serum. Denne test er imidlertid ikke egnet til efterbehandlingsanalyse, da antistofferne forbliver længe efter, at bakterierne er blevet ryddet⁸. En anden stor ulempe er, at disse metoder kun diagnosticerer H. pylori-infektion og ikke tillader lægemiddelresistenstest for at vejlede følsomhedsbaseret behandling.

Til invasive testmetoder skal gastrisk biopsivæv tages ved endoskopi og derefter udsættes for histologi, urease-hurtigtesten og bakteriekultur. Disse testmetoder er også meget begrænsede på grund af flere faktorer. I øjeblikket er disse teknikker begrænset til ældre patienter, patienter med høj risiko for precancerøs eller ondartet sygdom og patienter, der har svigtet førstelinjebehandling for gastroøsofageal reflukssygdom eller H. pylori-infektion ⁹. For det andet når succesraten for bakteriekultur kun 50% på grund af H. pyloris unikke ^{vækstegenskaber10}. Således giver molekylære detektionsmetoder nyt håb om at overvinde de høje krav til invasive detektionsmetoder og vejlede følsomhedsbaseret behandling. Blandt molekylære detektionsmetoder har kvantitativ PCR udviklet sig enormt i de senere år. qPCR kræver i modsætning til traditionel PCR ikke gelelektroforese og kvantificerer nøjagtigt DNA / RNA i prøver ved at tilføje primere og sonder på udglødningsstadiet. qPCR-sæt til påvisning af H. pylori-infektion og lægemiddelresistens er nu kommercielt tilgængelige. Ikke desto mindre har hver metode sine begrænsninger; Derfor bør patientens kliniske diagnose og behandling overvejes i forbindelse med deres symptomer, tegn, historie, andre laboratorieundersøgelser og respons på behandlingen.

I øjeblikket tager den primære metode til behandling af H.pylori-infektioner antibiotika, men på det seneste bliver det stadig vanskeligere at behandle disse infektioner på grund af stigningen i antibiotikaresistens. Efterfølgende er der observeret et signifikant fald i H. pylori-behandlingseffektiviteten globalt, hvilket gør udryddelse af H. pylori til et stort folkesundhedsproblem¹¹.

Clarithromycin og levofloxacin er de to bredspektrede antibiotika, der anvendes til behandling af infektioner forårsaget af H.pylori, men flere undersøgelser har rapporteret udbredt resistens over for disse to lægemidler i H.pylori-isolater. A2143G, A2142G og A2142C er tre af de mange punktmutationer, der findes i 2,9 kb 23S rRNA-genet, der resulterer i clarithromycinresistens ved at forhindre makrolidet i at binde. Samtidig er mutationsstederne for levofloxacinresistensgenet hovedsageligt placeret i de seks mutationssteder (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) af gyrA-genet ¹². Opdagelsen af disse resistensmekanismer baseret på genetiske mutationer har ført til et gradvist skift i påvisningen af H. pylori gennem kulturbaserede undersøgelser til molekylær testning.

Samlet set er der et presserende klinisk behov for en ikke-invasiv, effektiv og samtidig diagnostisk metode til påvisning af H. pylori-infektioner og lægemiddelresistens. Vi vedtog en kombineret strengtest og qPCR-metode for at overvinde vanskelighederne ved prøveudtagning og nå målet om samtidig påvisning af H. pylori-infektion og lægemiddelresistens ved hjælp af forskellige primerprober.

Protocol

Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med etiske overvejelser fastlagt af det etiske udvalg på Guangdong Provincial People’s Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, Kina (godkendelsesnummer: KY-Q-2022-384-02). Patienter i alderen 18-60 år blev inkluderet i denne undersøgelse. Patienter, der tog antibiotika, antibakterielle kinesiske lægemidler, lægemidler såsom protonpumpehæmmere (PPI) eller H2-receptorantagonister osv. inden for 2 uger før testning, blev ikke inkluderet i denne undersøge…

Representative Results

Påvisning af H. pylori-infektion og antibiotikaresistens i mavevæske ved qPCRVi udførte qPCR til påvisning af H. pylori-infektion ved at forstærke ureA-genet og bestemte dets antibiotikaresistensprofil ved at målrette punktmutationer i 23S rRNA-genet og gyrA-genet (tabel 1). CT-værdierne for kvalitetskontrol i alle tre grupper af qPCR-eksperimenterne lå inden for det anbefalede interval, hvilket indikerer, at prøverne alle var i normal til…

Discussion

Detektion af H. pylori kan udføres ved hjælp af både invasive og ikke-invasive metoder¹³. Almindeligt anvendte invasive teknikker såsom histopatologi, hurtig ureasetest, polymerasekædereaktion (PCR) og bakteriel dyrkning kræver endoskopi og biopsi. Serologiske tests, urinstofudåndingstest og enzymbundne immunosorbentassays (ELISA) anbefales blandt de ikke-invasive procedurer¹⁴. Mens ikke-invasive metoder er lette at udføre, økonomiske og mere behagelige fo…

Materials

23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin
ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20163220767	Fluorescent quantitative PCR amplification
ABI 7500 software	Thermo Fisher Scientific		Data Analysis
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosafety cabinet
DNA extraction kit	Daan Gene
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Testing for H. pylori infection
Stream SP96 automated nucleic acid extractor	Daan Gene	SEDA 20140104	For DNA extraction
String test kit	Hongmed Infagen		It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube
Ultra-low temperature freezers (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C for storing reagents
Vortex-5	Kylin-bell		For mixing reagent